Examensarbete 15hp Vt 2009
Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet
Kemiska enheten 2, Biokem Forskning och utveckling Livsmedelsverket
Evaluation of specificity of a walnut antiserum and detection of English walnut (Juglans regia) in food with ELISA and Real-Time PCR
Juliana Esmeralda Fernandez Ramirez
1 ABSTRACT
Nuts of all kinds are common ingredients in food. For nut allergy sufferers the frequent use of nuts cause problems and "hidden" nuts in food products may elicit allergic reaction when such foods are consumed. Methods for detecting and quantifying walnut (and other nuts) with high sensitivity and specificity are therefore very important.
The objective of this project was to verify the specificity of a rabbit antiserum against walnut with immunodiffusion and to determine the size of the dominant walnut antigens with Western blotting. In addition, a commercial sandwich ELISA for walnut quantification was validated and compared with a qualitative real-time PCR.
The rabbit antiserum proved to be less specific but after absorption with cross-reacting nuts and seeds it showed high specificity. The ELISA kit reacted, except for walnut, with pecan and slightly with other nuts and seeds tested. The PCR showed an absolute specificity to walnut. As low levels as 2.5mg walnut/kg can be quantified with the ELISA. This is 8 to 100 fold less than with the PCR method. It is therefore concluded that the ELISA kit is more sensitive than the PCR method but the PCR method is more specific than the ELISA kit.
KEYWORDS: walnut antigens, immunodiffusion, western blotting, immunoassay, polymerase chain reaction
2 INTRODUKTION
Utan livsmedel kan vi inte överleva och människan är därför beroende av regelbunden energitillförsel via mat. Via födan får vi i oss vitaminer, fett, protein, kolhydrater och alla nödvändiga näringsämnen som behövs för att de fysiologiska processerna i kroppen ska fungera normalt. Vissa livsmedel kan orsaka allergiska reaktioner och man beräknar att ca 2- 4% av vuxna och 6-8% av barn har någon form av allergi mot livsmedel [1,2]. De
allergiframkallande ämnena, allergenerna, orsakar reaktioner som till och med kan vara livshotande hos den allergiske medan samma ämnen är helt ofarliga för den icke allergiske.
Vanliga symtom är kliande läppar och tunga och gastrointestinala symtom såsom
illamående och kräkningar. Även hudsymtom, till exempel akut urticaria, är också vanligt [1].
Ibland kan allergiker få så kallade anafylaktiska reaktioner som ger blodtrycksfall och påverkan på flera organsystem, som exempelvis andnings- och cirkulationssystemen.
Anafylaktiska reaktioner är mycket allvarliga och kan vid icke-behandling leda till döden [3].
Det är livsnödvändigt att kroppens immunförsvar skyddar oss mot farliga bakterier, virus och andra partiklar, och det bildas därför bland annat olika typer av antikroppar. Däremot är det inte nödvändigt att immunförsvaret reagerar som vid en allergisk reaktion vid ätande av till exempel nötter. De allergiska symptomen beror på att immunförsvaret uppfattar ämnen i exempelvis fisk, ägg eller nötter som främmande och försöker eliminera och bli av med ämnet. Antikropparna som bildas vid allergiska reaktioner är av IgE-typ. De binder med hög affinitet till framförallt mastceller, basofiler och eosinofiler med Fc-delen och till sitt antigen (allergenet i födan) med Fab-delen. När allergenet binds till IgE släpper cellerna ut innehållet i sin granula, såsom histamin, prostaglandiner och leukotriener, som bidrar till att eliminera allergenet. Dessa ämnen är så aggressiva att de kan skada närliggande kroppsegen vävnad och därvid ge upphov till allergiska symtom.
Bland livsmedel är jordnötter och nötter av olika slag de som orsakar flest antal anafylaktiska reaktioner. I USA och Storbritannien är prevalensen av allergiska reaktioner mot nötter och jordnötter ca 1% och exakt vilka nötter som orsakar dessa reaktioner varierar från land till land men valnöt, hasselnöt, cashewnöt och mandelnöt är de som mest orsakar allergiska reaktioner i USA. Allergi mot nötter börjar vanligtvis i barndomen och stannar då kvar livet ut [2,4].
Nötter är numera en vanlig ingrediens och finns exempelvis i bröd, glass, choklad, konfektyr och dressing. De kan även hittas odeklarerat i olika typer av livsmedel. Dessa
”gömda” nötter kan bero på korskontaminering och då har det vid tillverkningsprocessen funnits kvar rester av ett livsmedel innehållande nötter i behållare så att dessa överförts till andra livsmedel som inte ska innehålla nötter.
Valnötsträdet, som tillhör familjen Juglandaceae, växer som bäst i tempererade och milda klimatzoner och odlas numera i Sydeuropa, Ostasien, och Nordamerika. Kina var den största producenten av valnöt år 2005 och producerade 420 miljoner kilo och USA kom på andra plats med en produktion på ca 308 miljoner kilo1. Valnötter är energirika med ett
energiinnehåll på 630kcal per 100g. De är rika på fleromättade fettsyror och av valnötskärnans vikt utgör 24% protein och ca 70% lipider [5].
De 3 största valnötsarterna är Juglans regia, Juglans nigra och Juglans cinerea. Juglans regia tros ursprungligen komma från Persien och kan ibland därför kallas för Persisk valnöt, men Engelsk valnöt är den vanligaste benämningen. Jämfört med de 2 andra valnötsarterna är
1 http://www.fao.org/es/ess/top/commodity.html
3
Engelsk valnöt större, sötare och lättare att knäcka. Historiskt trodde grekerna att valnöt botade huvudskador eftersom kärnan till utseendet liknar människohjärnan [5].
Engelsk valnöt (Juglans regia) har 4 allergener som hittills identifierats och
karakteriserats. De har namngetts som Jug r 1, Jug r 2, Jug r 3 och Jug r 4 . Namnen bygger på det latinska namnet och siffrorna antyder i vilken ordning de identifierats. Jug r 1 är den första som identifierades och proteinet, 2S albumin, är 14kDa. Jug r 2 är ett vicilinliknande protein som är 44kDa och det har visats att dessa proteiner har antibakteriella egenskaper. Jug r 3 är det tredje allergenet som identifierats, en Lipid transfer protein (LTP), med en storlek på 9kDa och är det vanligaste allergenet i Italien. 2S albuminer och LTP anses hämma svamptillväxt och insektsplundring. LTP tros vara med vid utbyte av lipider mellan membraner. Jug r 4 är det senaste allergenet som identifierats och är ett
legumingruppsprotein som är 58kDa stort. Alla dessa allergener (proteiner) anses ha bra motstånd mot proteolys och denaturering [2,4].
Studier som identifierar och karakteriserar valnötsallergener är av stor betydelse för att öka olika metoders säkerhet. Kunskap om allergener kan förbättra metoders förmåga att detektera och kvantifiera valnöt. Det är speciellt viktigt att hitta ”gömda” och små mängder allergener i livsmedel.
I projektet kontrollerades specificiteten av ett kaninantisera mot valnöt (Juglans regia) genom att låta antiserat reagera med extrakt av dels valnöt och dels andra nötter/fröer. Detta gjordes med immunodiffusion. Dessutom studerades valnötens dominerande antigener, vilka
storleksbestämdes med SDS PAGE och Western blotting. Ett kommersiellt ELISA kit, som detekterar och kvantifierar valnöt, utvärderades och dess specificitet och detektionsgräns kontrollerades. Kitet jämfördes också med en kvalitativ DNA-metod, , med användning av SYBR green. Med ELISA och analyserades flera nötter/fröer och modellblandningar med olika valnötskoncentrationer. Dessutom jämfördes dessa 2 metoders förmåga att detektera livsmedel med deklarerat innehåll av valnöt och pekannöt.
MATERIAL OCH METOD Nötter/fröer och livsmedel
Alla nötter, fröer och livsmedel maldes, ca 10g av vardera, och förvarades vid 22°C, 4°C eller -22°C tills analys. Följande nötter och fröer analyserades med samtliga metoder: valnöt (Juglans regia), hasselnöt (Corylus avellana), pekannöt (Carya illinoensis), pistagenöt (Pistacia vera), bovete (Fagopyrum esculentum) och quinoa (Chenopodium quinoa). Paranöt (Bertholletia excelsa) och makadamianöt (Macadamia ternifolia) analyserades med ELISA och realtids-PCR.
Följande livsmedel med deklarerat innehåll av valnöt analyserades med ELISA och : valnötsbröd (Bonjour), valnöt- och granatäppelgryta (Prima), valnötsglass (SIA glass),
valnöttryffelägg (Annelie), valnötsost (Croknoix), lokum med nötter (Donia), sirap med nötter (kasro), valnötsolja (Chalice) och bakelse innehållande olika typer av nötter (Landings). Även följande livsmedel, med icke deklarerat innehåll av valnöt, analyserades: kokos (ICA) och chokladgodis med pekan (Annelie).
Modellblandningar
Modellblandningar gjordes för jämförelse mellan ELISA och. En valnötssuspension med en valnötskoncentration på 2,86mg/g bereddes genom att blanda valnöt med CM-celullosa (Sigma). Modellblandningar gjordes genom att späda valnötssuspensionen 25, 50, 100 och 200 gånger med Digestivesmulor (Göteborgs kex) så att 50g av varje modellblandning erhölls. Modellblandning A innehöll 0,011%, B innehöll 0,006%, C 0,003% och D 0,001%
valnöt.
4
Valnöts-DNA späddes med soja-DNA och analyserades med för att bestämma metodens detektionsgräns (Limit of detection, LOD). Valnöts-DNA, 10ng/µL, seriespäddes 10 gånger i 4 steg med soja-DNA, 10ng/µL. Spädningarna 1-5 fick då koncentrationerna 10ng/µL, 1ng/µL, 0,1ng/µL, 0,01ng/µL och 0,001ng/µL (100%, 10%, 1%, 0,1% respektive 0,01%).
Kaninantiserum
Kaninantiserat (batch. nr: 950406) mot valnöt framställdes av EC Diagnostics på uppdrag av Livsmedelsverket. Livsmedelsverket renade först fram protein från valnöt enligt Klein et al.
[6]. Därefter skickades de renade proteinerna från valnöt till EC Diagnostics och de användes till att immunisera och framställa kaninantiserum mot valnöt.
Extraktion av nötter och fröer
Av de malda nötterna och fröerna extraherades 2g med 8mL Tris/Glycin-buffert, pH 8,7.
Tris/Glycin buffert, pH 8,7 innehöll 0,1M Tris, 0,5M glycin och 0,02% natriumazid.
Extrakten fick stå i ultraljudsbad i ca 2 tim, 25°C, och därefter tillsattes Tris/Glycin buffert upp till 10mL. Proverna centrifugerades sedan vid 4°C under 10 min, 11000g, och
supernatanten filtrerades innan den överfördes till nya rör som förvarades vid 4°C och -22°C.
Immunodiffusion
Vid immunodiffusion låter man antiserum och provextrakt diffundera i en 1% agarosgel under 18-24 tim. Antikropparna kommer då att reagera med eventuellt antigen i provet och då kommer en utfällning att ske, så kallade precipitat. Bildas precipitat så innebär det en positiv reaktion.
En 0,1% lösning av renat valnötsprotein gjordes i Tris/Glycin buffert, pH 8,7 och denna fick stå i ultraljudsbad i ca 1,5 tim. En seriespädning gjordes från den 0,1% valnötslösningen så att 6 lösningar erhölls med koncentrationer från 0,1% till 0,003%.
En 1% agaroslösning bereddes innehållande Tris/Glycin buffert, pH 8,7. Lösningen delades upp i ca 11mL per rör, fick stelna och förvarades sedan vid 4C° tills användning.
Innan analys fick rören stå i vattenbad vid ca 60°C tills gelen blev klar och genomskinlig och sedan pipetterades ca 3,5mL/objektglas. Gelen på objektglasen fick stelna och förvarades i en fuktkammare, 4°C, tills användning.
Hål (2,5-3mm i diameter) stansades i gelen så att man fick 12 perifera hål och två centrerade hål på varje objektglas. Kaninantiserum mot valnöt applicerades i mitthållen, 9µL/hål, och i de perifera hålen (brunnarna 1-7 och 9-14) tillsattes 4,5µL/hål av standarderna och proverna.
För att låta prov och antisera diffundera och eventuellt precipitera fick objektglasen stå i fuktkammare över natt vid 4°C. Sedan lakades gelen med 0,9% natriumklorid under ca 60 min för att få bort icke precipiterade proteiner. Därefter pressades gelen med fuktat
filterpapper och flera lager papper i ca 30 min. Sedan fick gelen ligga i milliQ vatten i 60 min, pressades återigen 30 min och torkades slutligen med hårtork. Efter torkning färgades gelerna med 0,1% amidosvart i 10 min och sedan tvättades överskottsfärgen bort med en tvättlösning bestående av 10% ättiksyra, 70% metanol och 20% vatten. Avslutningsvis lufttorkades objektglasen.
Om det finns antikroppar som inte binder endast till valnöt utan också till andra
nötter/fröer kan antiserat adsorberas för att få det specifikare. Antiserat adsorberas då med de nöt- och fröextrakt där precipitat inte borde ha bildats. Vid adsorption fick 500µL
kaninantiserum och 25µL extrakt av varje nöt/frö stå över natt vid 4°C. Det adsorberade antiserat centrifugerades 2 min, 11 000g, innan en ny immunodiffusion utfördes. Då applicerades den adsorberade antiserat istället för den icke adsorberade kaninantiserat i mitthålen.
5 Proteinbestämning enligt Bradfordmetoden
Proteinkoncentrationen i extrakten av nötterna och fröerna bestämdes med Bradfordmetoden genom att tillsätta Coommassie brilliant Blue G-250 och mäta absorbansen vid 595nm. Från standardkurvan bestämdes proteinkoncentrationen utifrån extraktens erhållna
absorbansvärden. Extraktens proteinkoncentration bestämdes för att kunna justeras till önskade koncentrationer inför SDS PAGE.
Standardlösningar av BSA (Bovine serum albumin) gjordes utifrån Bio-Rad Protein Assay Standard II (Bio-Rad) som hade en proteinhalt på 1,4mg/mL. Standarderna späddes med vatten så att man fick slutkoncentrationerna 1,0mg/mL, 0,74mg/mL, 0,50mg/mL, 0,37mg/mL och 0,18mg/mL.
Alla extrakt späddes med Tris/Glycin buffert, pH 8,7 innan proteinbestämningen. En färglösning gjordes genom att späda färgkoncentratet Bio-Rad Dye Reagent Concentrate (Bio-Rad) 5 gånger. Därefter pipetterades 100µL av standarderna, extrakten och blank (vatten) till sitt respektive märkt rör och 5mL färglösning per rör tillsattes till alla rören.
Proverna vortexades och absorbansen mättes vid 595nm.
SDS PAGE
I ett nätverk av polyakrylamid i närvaro av Sodiumdodecylsulfat (SDS) separeras proteiner efter storlek. SDS är en detergent som ger proteinerna en negativ nettoladdning. Proteinerna med en större molmassa vandrar då långsammare och de med mindre molmassa vandrar snabbare i en polyakrylamidgel.
Efter proteinbestämning justerades proteinkoncentrationerna av extrakten först till 0,60mg/mL med Tris/Glycin buffert, pH 8,7. 100µL av den önskade proteinkoncentrationen 0,03mg/mL bestod av 5% provextrakt med 60% milliQ vatten, 25% Nowex NuPAGE®
provbuffert (Invitrogen) och 10% av 0,15mg/µL ditiotreitol (DTT). Den andra önskade slutkoncentrationen 0,070mg/mL uppnåddes med10% provextrakt, 55% milliQ vatten, 25%
provbuffert och 10% av 0,15mg/µL DTT. Proverna fick sedan stå vid 70°C i vattenbad under ca 10 min.
Gradientgelen Nowex NuPAGE® 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen), som hade 10 brunnar och en tjocklek på 1,0mm, förbereddes enligt tillverkarens instruktioner.
Elektroforesbufferten till den yttre kammaren bereddes genom att späda Nowex NuPAGE®
MES, SDS running buffer (Invitrogen) med milliQ vatten så att en 5% buffert erhölls . Elektroforesbufferten till den inre kammaren bestod av yttre elektroforesbuffert plus 0,25%
Nowex NuPAGE® antioxidant (Invitrogen).
Gelkasetten monterades i elektroforesapparaten X-cell II™ Mini-Cell (Invitrogen) så att täta kammare bildades och den inre kammaren fylldes med elektroforesbuffert tills brunnarna täcktes. I brunn 1 och 6 applicerades 10µL av storleksmarkören SeeBlue® Pre-Stained Standard (Invitrogen) och i de övriga brunnarna 25µL av proverna. Efter provapplicering fylldes den yttre kammaren med elektroforesbuffert och elektroforesen startades och fick pågå ca 1 tim vid 140V/80mA.
Efter analys lades gelen 10 min i fixeringslösning bestående av 40% vatten, 50% metanol och 10% ättiksyra, under långsam skakning. Efter fixering färgades gelen med
Commassieblått. Färglösningen bestod av 55% vatten, 20% metanol, 20% Novex stainer A (Invitrogen) och 5% Novex stainer B (Invitrogen). Först fick gelen ligga 10 min utan stainer B och därefter ca 3-4 tim tillsammans med stainer B. Slutligen fick gelen ligga i milliQ vatten i ca 8 tim. För dokumentation scannades gelen.
6 Western blotting
Vid Western blotting överfördes de separerade proteinerna elektroforetiskt till ett nitrocellulosamembran (NC-membran). Överföringen kontrollerades genom att färga proteinerna i membranet ospecifikt med Ponceau S lösning. Sedan immunofärgades membranet så att endast de band där antikropparna bundit till sitt antigen visualiserades.
Immunoblotting utfördes på 2 geler (ett gel i taget) efter polyakrylamidgelelektrofores och proverna applicerades i samma ordning på båda gelerna. Dessa geler fixerades och färgades inte, utan blotting analysen startades på en gång. Gelkasetten delades och gelen överfördes till en bit Parafilm® innan den fuktades med transferbuffert innehållande 5% koncentrerad NuPAGE® transferbuffert (Invitrogen), 0,10% NuPAGE® antioxidantlösning (Invitrogen) och 10% metanol.
På katoddelen lades 2 stycken fuktade blottingsvampar, ett fuktat filterpapper och gelen.
Allt fuktades med transferbuffert. Ovanpå gelen lades det fuktade NC-membranet, ett fuktat filterpapper och till sist 2 stycken fuktade blottingsvamparna. Blottingboxen monterades och den inre kammaren fylldes med transferbuffert så att svamparna täcktes helt. Den yttre
kammaren fylldes med vatten och blottingen startades och pågick i ca 1 tim vid 25V/190mA.
NC-membranet färgades med 0,1% Ponceaulösning under 5-10 min och sköljdes sedan 2 gånger med vatten under ca 5 min. Gelen scannades innan avfärgning med 0,9% NaCl lösning. Efter avfärgning påbörjades immunofärgningen av NC-membranet.
En spädningsbuffert, pH 7,0 bereddes innehållande 7,2 mM Na2HPO4, 2,8mM NaH2PO4, 150mM NaCl och 0,3% Tween 20. Membranet fick stå i blockeringsbuffert (0,05% gelatin i spädningsbuffert) under ca 30 min. Därefter fick den stå 10 min med 10µL av den primära antikroppen och 10mL spädningsbuffert. Till det första membranet tillsattes icke adsorberat antisera och till det andra adsorberat antisera. Membranet tvättades 4 gånger under 10 min med spädningsbuffert och sedan tillsattes 10µL av den sekundära antikroppen get antikanin IgG R-1131 (Sigma) tillsammans med 10mL spädningsbuffert under 30 min. Tvättproceduren upprepades och därefter fick membranet stå 30 min med 5µL peroxidas-antiperoxidas
komplex kanin P1291 (Sigma) och 10mL spädningsbuffert. Membranet tvättades 4 gånger under 10 min med substratbuffert, pH 7,6, innehållande 0,1mM tris (hydroxymetyl) aminometan. Substratlösning innehållande 0,14mM 4-kloro-1-naftol, 10% etanol, 89,8%
substratbuffert och 0,20% väteperoxid. Innan väteperoxid tillsattes filtrerades lösningen.
Membranet fick stå 10 min med substratlösningen och därefter sköljdes membranet 2 gånger med substratbuffert under ca 5 min. Membranet scannades slutligen för dokumentation.
ELISA
Principen för kitet, Biokits Walnut Assay Kit (cat. no. 902085J, Tepnel), bygger på en icke- kompetitiv sandwich ELISA. Brunnarna är coatade med polyklonala antikroppar som binder till valnötsantigener och bundet antigen detekteras sedan av biotinylerad antikropp. Till den biotinylerade antikroppen binder peroxidasmärkt avidin som omvandlar substratet till en färgad produkt. Stopplösning tillsätts innan absorbansen mäts vid 450nm. I kitet medföljer alla nödvändiga reagens, förutom extraktionsbuffert. Instruktioner hur den bereds medföljer.
Alla buffertar bereddes och späddes enligt tillverkarens instruktioner. Alla prover
preparerades och extraherades enligt instruktionen med undantag av att 1g prov extraherades istället för 5g. För att få ut den lilla mängd valnötsprotein som eventuellt fanns extraherades 35mL valnötsoljan med 7mL extraktionsbuffert under 48 tim, 4°C med skakning [10].
Därefter behandlades extraktet som övriga provextrakt. För att kontrollera repeterbarheten analyserades samma extrakt av modellblandning D 10 gånger och för att kontrollera
reproducerbarheten analyserades 10 olika extrakt av modellblandning D. För bestämning av kvantifieringsgränsen späddes modellblandning D 2, 4 och 8 gånger. Modellblandning D togs med som referensmaterial vid varje analys.
7 DNA-extraktion
DNA extraherades från samtliga nötter/fröer, modellblandningar och livsmedelsprover med DNeasy™ Tissue Kit (Qiagen) innehållande alla nödvändiga reagens. Vid isolering av DNA invägdes 100mg torra prov och 200mg våta prov i Lysing Matrix A rör (MP Biomedicals) med homogeniseringskulor. Vatten, 100µL, fungerade som negativ extraktionskontroll. Till varje rör tillsattes 720µL ATL buffert och därefter homogeniserades proverna ca 40 sek i homogeniseringsapparaten FastPrep FP120 (Bio101 Savant.) Efter homogenisering
centrifugerades proverna i ca 4 sek och 80µL Proteinas K tillsattes innan de vortexades och inkuberades 3 tim vid 55ºC under skak. Därefter centrifugerades proverna under ca 4 sek innan 400µL AL buffert tillsattes. Proverna vortexades och inkuberades i 10 min vid 70ºC under skak följt av centrifugering under 5 min vid 16000g. De späddes 2 gånger med etanol, vortexades och 600µL applicerades åt gången av varje prov till respektive reningskolonn.
Efter varje provapplicering centrifugerades kolonnerna under 1 min vid 6000g och placerades sedan i nya uppsamlingsrör. Därefter tillsattes 500µL AW1 buffert till varje kolonn följt av centrifugering under 1 min vid 6000g. Efter centrifugering tillsattes 500µL AW2 buffert och kolonnerna centrifugerades återigen under 3 min vid 16000g. Kolonnerna placerades i nya rör och 50µL AE elueringsbuffert tillsattes innan de fick stå 1 min i rumstemperatur följt av centrifugering under 1 min vid 6000g. Detta upprepades och 50µL AE elueringsbuffert tillsattes för andra gången och kolonnerna fick stå 1 min i rumstemperatur innan de återigen centrifugerades 1 min vid 6000g. DNA isoleringen avslutades med att centrifugatet
överfördes till nya rör som förvarades i 4ºC.
Koncentrationsmätning av DNA
Innan PCR analysen startades bestämdes provernas DNA-koncentration. Varje DNA-isolat späddes 2 gånger med 0,4M NaOH för att få enkelsträngat DNA. De vortexades ordentligt innan de centrifugerades i ca 4 sek. DNA koncentrationen bestämdes med NanoDrop® ND- 1000 (NanoDrop Technologies) enligt tillverkarens instruktioner. Spektrofotometern läste av i våglängdsområdet 220-750nm. DNA adsorberar vid 260nm och proteiner adsorberar vid 280nm och kvoten 260nm/280nm, som ska vara ca 1,8, bestämdes för att kontrollera provernas renhet. Önskad mängd DNA i reaktionen var 50ng och därför späddes samtliga DNA-isolat till en slutkoncentration på 10ng/µL med milliQ vatten inför PCR analysen.
Realtids-PCR
Med denna kvalitativa metod amplifierades 2S albumingenen (Jug r 2) i valnötens DNA.
Amplikonen var på 153bp och 2 specifika primers (Pharmacia Biotech) användes:
Primer 1: ”JUGR8F” 5´-TCT CCT TGT AGC CCT TT GT- 3´
Primer 2: ”JUGR143R” 5´ -TGG CAG TGG TTG AGG TTT- 3´
Amplifieringen följdes cykel för cykel genom att använda den fluorescerande färgen SYBR green, som binder till dubbelsträngat DNA. Fluorescensstyrkan ökade i takt med att DNA mängden ökade och för att konfirmera att DNA-produkten är 2S albumingenen bestämdes även produktens smältpunkt. Smältpunkten beror på nukleinsyrans längd, GC-innehåll och sekvens.
Mastermix och reagens iordningställdes utifrån LightCycler® FastStart DNA master SYBR green I (LFSG, Roche Applied Sciences) och LightCycler® Uracil-DNA Glycosylase (UNG, Roche Applied Sciences) enlig instruktioner. Mastermixen fick en slutvolym på 15µL/prov innehållande 1µL av vardera av primrarna JUGR8F (10µM) respektive
JUGR143R (10µM), 2µL LFSG (10x), 1,6µL MgCl2 (25mM), 0,5µL UNG och 8,9µL vatten.
Till varje glaskapillär tillsattes 15µL mastermix och 5µL prov (10ng/µL) innan de
centrifugerades kort under 15sek. Vatten fungerade som negativ kontroll och valnöts-DNA
8
som positiv kontroll. Samtliga prover analyserades i duplikat med PCR systemet
LightCycler™ System (Roche Applied Sciences). PCR parametrarna var inställda enligt följande: Taq-polymeras aktiverades vid 95°C under 10 min (ramptid: 20°C/sek) och därefter genomfördes 40 amplifieringscykler med fluorescensmätning efter varje cykel. Varje cykel bestod av denaturering under 15 sek vid 95°C, annealing under 10 sek vid 68°C och
elongering under 8 sek vid 72°C (ramptid: 20°C/sek). Smältpunkten bestämdes genom att temperaturen ökades först till 95°C och sänktes till 65°C under 15 sek (ramptid: 20°C/sek).
Den ökades slutligen till 95°C (ramptid:0,05°C/sek). Under smältpunktanalysen mättes fluorescensen kontinuerlig. PCR analysen avslutades med en nedkylningscykel under 30 sek vid 40°C (ramptid: 20°C/sek). Dataresultat analyserades med mjukvaran LightCycler 3.5 (Roche Applied Sciences).
RESULTAT Immunodiffusion
För att bestämma metodens detektionsgräns analyserades 6 standarder där det bildades tydliga precipitat ner till standard 3, vilken hade en valnötskoncentration på 0,025mg/mL (Fig. 1A).
Lägre halter av valnötsprotein gav inga precipitat. Det innebar en detektionsgräns på 250µg valnötsprotein per gram.
För att kontrollera hur specifikt kaninantiserat mot valnöt var analyserades förutom valnöt även extrakt av pekannöt, pistagenöt, hasselnöt, bovete och quinoa (Fig. 1A). Tydligt
precipitat bildades mellan valnöt och tillsatt antiserum. Något svagare precipitat bildades med de övriga nötterna och fröerna. Bovete reagerade inte alls med antiserat mot valnöt.
Fig. 1 Resultat vid kontroll av kanin antiserats detektionsgräns och specificitet. Först kontrollerades icke adsorberad antisera (A) och därefter den adsorberade antisera (B). Dessa applicerades i brunnarna 1 och 8.
Eftersom svaga precipitat bildades med extrakt från hasselnöt, pekannöt, pistagenöt och quinoa så adsorberades kaninantiserat med dessa. Immunodiffusionen upprepades och adsorberat antiserum tillsattes i brunn 1 och 8. Precipitat bildades med valnöt och den 0,1%
standardlösningen som användes som positivt kontroll (Fig. 1B). Med det adsorberade antiserat bildades inte precipitat med extrakt från hasselnöt, pekannöt, pistagenöt, och quinoa.
Bovete analyserades inte då ingen reaktion skedde med icke adsorberad serum.
SDS PAGE
Proteinbestämning enligt Bradford gjordes på extrakt av nötter och fröer. Valnöt hade en proteinkoncentration på 8,2mg/mL. Pistagenöt hade den högsta proteinkoncentrationen på 18,8mg/mL medan pekannöt hade den lägsta koncentrationen på 1,7mg/mL. Samtliga extrakt justerades till 0,03mg/mL och 0,070mg/mL innan PAGE
SDS PAGE, under reducerande betingelser, visade 3 dominerande band med molmassa 33kDa, 23kDa respektive 5kDa av valnötextrakt (Fig. 2 brunn 2 och 3). Valnöt analyserades med båda proteinkoncentrationerna. Extrakt av pekannöt, som hör till samma botaniska familj
9
(Juglandaceae) som valnöt, uppvisade 3 dominerande band med molmassa på 47kDa, 20kDa och 7kDa (brunn 4 och 5). Extrakt från bovete, quinoa, hasselnöt och pistagenöt uppvisade dominerande band som hade molmassor mellan 18-38kDa. Även svagare band med andra molmassor erhölls från samtliga nötter och fröer i gelen.
Fig. 2 Resultat efter SDS PAGE. Proteinerna separerades på en gradientgel, 4-12% Bis-Tris, som färgades med commassieblått.
Western blotting
För att kontrollera om NC-membranet hade överförda proteiner från polyakrylamidgelen färgades proteinerna ospecifikt med Ponceau S lösning. Färgningen visade att
proteinöverföringen hade fungerat (Fig. 3A). Det första membranet immunofärgades med icke adsorberat antisera och då visualiserades 4 proteiner i valnötsextraktet, med molmassorna 62kDa, 50kDa, 33kDa respektive 23kDa (Fig. 3B brunn 2 och 3). I extrakt av pekannöt
reagerade antikropparna med ett protein med en molmassa på 47kDa (brunn 4 och 5). I quinoa extraktet identifierades 2 proteiner med molmassorna 23kDa och 33kDa (brunn 8). I övriga extrakt identifierade antikropparna ett protein av vardera nöt/frö med molmassor mellan 23kDa och 38kDa (brunn 7,9 och 10).
Fig. 3 Resultat av Western blotting. Proteinöverföringen kontrollerades genom att färga NC-membranen med Ponceau S (A). Ena membranet immunofärgades med icke adsorberad antisera mot valnöt (B) och den andra med adsorberad antisera (C).
10
Det andra membranet immunofärgades med antisera som var adsorberat med extrakt från hasselnöt, pekannöt, pistagenöt och quinoa (Fig. 3C). Valnötsextraktet var det enda extrakt som gav band och dessa hade molmassorna 33kDa och 23kDa. Inga reaktioner med det adsorberade antiserat sågs i extrakt från de övriga nötterna och fröerna. Detta innebar att antiserat efter adsorption blivit specifikt för valnöt.
ELISA och Realtids-PCR
För att kontrollera hur specifikt ELISA-kitet var analyserades proteinextrakt från flera olika nötter och fröer. DNA från dessa analyserades även med PCR (Tab. 1). Proteinextrakt från bovete, paranöt och makadamianöt låg under ELISA-metodens kvantifieringsgräns som var 2,5mg/kg. Proteinextrakt från hasselnöt, kokos och pistagenöt blev positiva i nivå med andra standarden på kurvan. Quinoaextraktet korsreagerade mer i ELISA-kitet. Pekannötextraktet korsreagerade kraftigt och resultatet motsvarar 6% av resultatet för valnötsextraktet. Med PCR blev DNA från samtliga nötter/fröer negativa då fick en smältpunkt(Tm) som inte överensstämde med smältpunkten för valnöts-DNA (Tab. 1). Valnöts-DNA blev som förväntat positiv.
Tab. 1 Resultat vid kontroll av specificitet med ELISA och PCR.
Mängd valnötsantigen (mg/kg) och smältpunkt (Tm) för varje nöt/frö visas.
Oförväntade positiva resultat (P) med ELISA erhölls med andra nötter/fröer.
Prov ELISA Realtids-PCR
mg/kg Pos./Neg. Tm Pos./Neg.
Valnöt >max + 88,7 +
Pekannöt 6,22*104 P —
Quinoa 59,5 P —
Pistagenöt 6,7 P —
Kokos 6,1 P —
Hasselnöt 5,4 P —
Bovete 1,5 — —
Paranöt 0,55 — —
Makadamianöt 0,12 — —
För att kontrollera ELISA kitets repeterbarhet analyserades samma extrakt av
modellblandning D 10 gånger. Medelvärdet blev 9,99mg valnöt per kilo, standardavvikelsen 0,38 och variationskoefficienten 3,85% . Intern reproducerbarhet kontrollerades genom att analysera 10 olika extrakt av modellblandning D. Medelvärdet blev 13,79mg valnöt per kilo, standardavvikelsen 1,22 och variationskoefficienten 8,87%.
För att kontrollera den lägsta nivå som kunde kvantifieras i matris gjordes modellblandningar genom att späda valnötssuspension med kaksmulor. Alla
modellblandningar kvantifierades med ELISA. Dessutom bestämdes kvantifieringsgränsen genom att späda modellblandning D 8 gånger i buffert och den beräknade mängden valnöt i den utspädda blandningen var 1,78mg/kg (Tab. 2). Resultatet för den 8 gångers utspädda modellblandning D blev 2,4mg/kg och detta motsvarar tillverkarens angivna
kvantifieringsgräns för testkitet. Modellblandningarna analyserades också med PCR för att kontrollera detektionsgränsen i matris. För att lättare kunna jämföra PCR resultaten i matris och soja-DNA beräknades den procentuella valnötskoncentrationen. Modellblandning A fick vid teoretisk uträkning en valnötskoncentration på 0,011%, B 0,006%, C 0,003% och slutligen fick modellblandning D en valnötskoncentration på 0,001%. Valnöts-DNA detekterades i modellblandning A och D (Tab. 2).
11
Tab. 2 Resultat efter analys med ELISA och PCR av modellblandningarna. Tabellen visar vilka modellblandningar som detekterades (+) och inte detekterades (-), mängd valnötsantigen (mg/kg)
och smältpunkt (Tm). Spädningar av modellblandning D analyserades ej med PCR (0) Modellbland.
(% valnöt)
Beräknad mg valnöt/kg
Resultat ELISA
Resultat Realtids-PCR mg/kg Pos./Neg. Tm Pos./Neg.
A (0,011%) 114,0 >30 + 88,6 +
B (0,006) 57,0 26,1 + —
C (0,003) 28,5 18,5 + —
D (0,001) D (0,0005) D (0,00025) D (0,000125)
14,25 7,12 3,56 1,78
11,7 8,8 4,9 2,4
+ + + +
88,5 + 0 0 0
För att bestämma DNA-metodens LOD späddes extraherat valnöts-DNA med soja-DNA så att 5 koncentrationer erhölls och samtliga analyserades med PCR (Tab. 3). De 4 högsta
koncentrationerna blev positiva och detektionsgränsen blev därför 0,1% (0,01ng/µL valnöts DNA). Den lägsta koncentrationen var 0,01% (0,001ng/µL valnöts-DNA). Ett av duplikaten blev positivt och ett blev negativ vid analys.
Tab. 3 Resultat vid bestämning av PCR metodens LOD med olika koncentrationer av valnöts-DNA.
Valnöts-DNA (%)
Tm Pos./Neg.
100 89,5 +
10 89,6 +
1 89,5 +
0,1 89,7 +
0,01 89,4 +/-
De livsmedel som analyserades med ELISA och PCR hade deklarerat innehåll av valnöt, förutom chokladgodis som innehåll pekannöt. Oförväntade positiva (P) och negativa (N) resultat erhölls vid analys av vissa livsmedel (Tab. 4). Med ELISA kunde valnötsprotein i samtliga livsmedel kvantifieras förutom i proteinextrakt av valnötsoljan. Med PCR blev valnötsoljan negativ, dvs. den innehöll inget valnöts-DNA. Oljor innehåller vanligtvis inte protein eller DNA .
Tab. 4 Resultat vid analys av livsmedel med deklarerat innehåll av valnöt (förutom pekangodis) med ELISA och PCR.
Prov ELISA Realtids-PCR
mg/kg Pos./Neg. Tm Pos./Neg.
Valnötsbröd 3,93*104 + 88,8 +
Valnötsgryta 5,3 + N
Valnötsglass 3,89*104 + 88,6 +
Valnötstryffelägg >max + 88,3 +
Valnötsost 1,13*105 + 88,9 +
Valnötslokum 1,91*104 + 88,2 +
Sirap 103,2 P N
Sirap med nötter 1,06*105 + 88,8 +
Valnötsolja 0,28 P N
Bakelse med nötter 9,81*104 + 88,6 +
Pekangodis (choklad) 8410,1 P —
12
Vid varje PCR analys erhölls smältkurvor och topparna med en smältpunkt på 88,7°C och 89,7°C var prover med innehåll av valnöts DNA, dvs. positiva prov. Följande livsmedel blev positiva med PCR: valnötsbröd, valnötsglass, valnötstryffelägg, valnötsost, valnötslokum (Turkish delight), sirap med nötter och bakelse med nötter (Tab. 4). Övriga toppar var negativa prov, dvs. prov som inte innehöll valnöts DNA och som inte fick smältpunkter som överensstämde med smältpunkten för valnöts-DNA, 88,7°C. DNA från valnötsgryta, sirap och pekangodis blev negativa
DISKUSSION
Immunoprecipitat bildades i immunodiffusionanalyserna med valnötsextrakt och med extrakt från pekannöt, quinoa, pistagenöt och hasselnöt (korsreaktivitet). Antiserat var således inte helt specifikt. Efter adsorption reagerade antiserat enbart med valnötsextrakt vilket också visades med immunoblotting. Vid immunofärgning med icke adsorberad antisera sågs proteinband med extrakt från alla nötter/ fröer och inte endast med valnötsextrakt. Då adsorberat antisera använts sågs endast proteinband där valnötsextrakt applicerats och inte i de övriga extrakten. Detta var ytterligare ett bevis på att det adsorberade antiserat blivit specifikt.
Korsreaktivitet beror på att kaninantiserat mot valnöt innehåller polyklonala antikroppar dvs. antikroppar som binder till olika epitoper på antigenet. Proteinerna som extraherades från andra nötter/fröer, kan ha liknande epitoper som valnöt där de polyklonala antikropparna i antiserat (mot valnöt) kan binda.
Vid analys med ELISA gav pekannötextrakt positivt resultat. Det innebär att falskt positiva resultat kan fås vid analys av livsmedel innehållande pekannöt. Extrakt av hasselnöt, pistagenöt, quinoa och kokos gav svagt positiva resultat. Det är viktigt att påpeka att dessa nötter/fröer analyserades enskilt och späddes inte i matris. Därför saknar resultatet sannolikt betydelse vid användning av testkitet då dessa korsreagerande nötter/fröer förekommer i obetydliga mängder i livsmedel med odeklarerat innehåll av valnöt. Tillverkaren har också kontrollerat specificiteten och även de fick reaktivitet med samma nötter/fröer, med undantag från kokos. De fick även reaktivitet med bovete. De skulle genom adsorption kunna göra testet specifikare, vilket försöken med adsorberad antisera vid analys av nöt- och fröextrakten med både immunodiffusion och Western blotting visade. På grund av risken med
korsreaktivitet är det vanligt att kontrollera specificiteten vid lansering av nya metoder. Vid utvärdering av en sandwich ELISA med antiserum mot Jug r 1 reagerade antiserat med pekannöt och i mindre utsträckning med hasselnöt [8]. Analys med PCR gav endast positivt resultat med DNA från valnöt och negativt resultat med DNA från övriga nötter/fröer. Samma resultat erhölls då Jug r 2 användes som målsekvens och med användning av en TaqMan
”probe” istället för färgen SYBR green [9,10].
Valnötsantigenerna studerades med Western blotting. Vid immunofärgning med kaninantiserat mot valnötsprotein visualiserades 4 proteinband i valnötsextraktet med
molmassorna ca 23kDa, 33kDa, 50kDa respektive 62kDa. Storleken skiljer sig något från de 4 identifierade valnötsallergenerna, Jug r 1-4, som har molmassorna på 9kDa, 15kDa, 47kDa och 58kDa [9,11-13]. Eventuellt motsvarar 50kD antigenet det erhållna allergenet på 47kDa och antigenet med 62kDa det allergen som hade molmassan 58kDa (Fig. 3).
Vid identifieringen av allergenerna Jug r 1-4 användes patientserum innehållande IgE antikroppar som primär antikropp vid immunofärgningen [9,11-13]]. I detta arbete användes kaninantisera för identifiering av valnötens antigener. Med Western blotting kan man dels storleksbestämma allergener, dels bestämma hur stor andel patienter (med känd allergi) som reagerar med allergenet i fråga [9,11-13].
Standardavvikelsen för ELISA kitets repeterbarhet blev 0,38 och standardavvikelsen för reproducerbarheten 1,22. Variationskoefficienten blev båda gångerna <20% och utifrån dessa
13
siffror är både repeterbarheten och reproducerbarheten god. I den publicerade ELISA metoden för valnöt erhölls reproducerbarhet över flera dagar från 0,7 till 8,8% (8).
ELISA kitet detekterade valnötsprotein i samtliga modellblandningar medan valnöts-DNA påvisades med PCR endast i modellblandning A och D. Vid tidigare studier som gjorts på laboratoriet kunde valnöt med säkerhet detekteras ner till 0,01% med PCR. Detta motsvarar modellblandning A. Slumpen och/eller kontamination kan vara anledningar till att blandning D blev positiv i ett av duplikaten fastän både blandning B och C blev negativa.
Detektionsgränsen för valnöts-DNA i soja-DNA blev också 0,01% (0,001ng/µL). Spädning med soja-DNA gav ett mer korrekt resultat än om spädningen hade gjorts med vatten då riktiga prov innehåller mycket DNA. Även i studien där TaqMan ”proben” användes och Jug r 2 var målsekvens blev LOD 0,01% [10].
Totalt analyserades 11 livsmedel och av dessa hade 10 deklarerat innehåll av valnöt. Med ELISA detekterades valnöt i 9 livsmedel och med PCR detekterades valnöt i 7. Pekangodis innehöll inte valnöt. Trots detta erhölls positivt resultat med ELISA medan pekangodis blev negativt med PCR. Att pekangodis blev positiv med ELISA beror på att testkitet inte är specifikt då även extrakt av pekannöt reagerat positivt med ELISA. Detta kan bero på att pekannöt hör till samma botaniska familj som valnöt (Juglandaceae) och därför skulle kunna korsreagera. Valnötsoljan var det enda livsmedel som blev negativt med både ELISA kitet och med PCR. Oljor innehåller vanligen varken protein eller DNA. Det kan dessutom vara svårt att extrahera den eventuella lilla mängd som finns. Extraheringsmetoden modifierades för oljan för att kunna få ut alla proteiner inför ELISA analysen men den blev ändå negativ.
Då 5 olika valnötsoljor analyserades påvisades mellan 7,0 och 20,4µg protein per ml [7]. Om dessa oljor hade analyserats med ELISA kitet hade valnöt kunnat kvantifieras i dessa oljor.
Valnötsgrytan och sirapen blev båda positiva med ELISA och negativa med PCR. Båda dessa livsmedel hade väldigt låga halter valnöt (enligt ELISA resultatet). Som nämnts tidigare var PCR-metoden mindre känslig och detekterade inte lika låga halter valnöt som ELISA kitet.
Sirapen köptes i en glasburk där den var i botten och ovanpå fanns olika nötter (inklusive valnöt). Sirapen analyserades dels för sig och blandat med nötterna som var ovanpå. En liten mängd nötter kan ha diffunderat ner till sirapen och ELISA kitet kunde detektera den lilla mängden medan halten valnöt var under DNA metodens LOD.
Utifrån resultaten drogs slutsatsen att kaninantiserat mot valnöt inte var så specifik då den reagerade med andra nöt- och fröextrakt med liknande epitoper som valnötens. Antiserat blev väldigt specifik när den adsorberades mot de korsreagerande nöt- och fröextrakten. Efter att ha tolkat och granskat de resultat som erhölls vid analys av samtliga modellblandningar, nötter/fröer och livsmedel drogs slutsatsen att ELISA kitet är betydlig känsligare än den använda PCR.metoden medan PCR metoden uppvisade en absolut specificitet.
ACKNOWLEDGMENT
Det har varit ett nöje att göra mitt examensarbete på Livsmedelsverket som är en arbetsplats full med liv, kunskap och glada människor. Fortsätt så. Tack till alla på Biokem för att ha tagit emot mig, för den proffsiga handledningen och för allt ni förmedlat till mig (allt ifrån hur man immunofärgar till hur man uttalar och skiljer mellan ”anden” och anden).
Ett speciellt tack till Birgitta Kruse och Monica Ferm för allt praktisk handledning och de trevliga pratstunderna, ni är två kloka kvinnor. Jag är glad och stolt över att ha utfört mitt arbete hos er på Biokem!
14 REFERENSER
[1] Asero R, Ballmer-Weber B, Beyer K et al. IgE-Mediated food allergy diagnosis: current status and new perspectives. Molecular nutrition & food research. (2007) 51, 135 – 147 [2] Crespo J, James J, Fernandez-Rodriguez C et al. Food allergy: nuts and tree nuts. British
Journal of Nutrition. (2006) 96 (2), S95–S102
[3] Kumar A, Teuber S, Gershwin E. Why do people die of anaphylaxis?—A clinical review.
Clinical & developmental immunology. (2005) 12 (4), 281-287
[4] Roux K, Teuber S, Shridhar K, Sathe S. Tree nut allergens. International archives of allergy and immunology. (2003) 131, 234–244
[5] Wai K, Sze-Tao C, Sathe S. Walnuts (Juglans regia L): proximate composition, protein solubility, protein amino acid composition and protein in vitro digestibility. Journal of the science of food and agriculture. (2000) 80, 1393-1401
[6] Klein E, Baudner S, Günther HO. Immunchemische Bestimmung des Hasselnussproteins mit Hilfe der Elektroimmundiffusion nach Laurell. Mitteilungen der optimierten Methode.
Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung. (1985) 180, 30-35
[7] Allergenicity of gourmet nut oils processed by different methods. The journal of allergy and clinical immunology. (1997) 99 (4), 502-507
[8] Doi H, Touchata Y, shibata H et al. Reliable Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Determination of Walnut Proteins in Processed Foods. Journal of agricultural and food chemistry. (2008) 56, 7625-7630
[9] Teuber S, Jarvis K, Dandekar A et al. Identification and cloning of a complementary DNA encoding a vicilin-like proprotein, Jug r 2, from English walnut kernel (Juglans regia), a major food allergen. The Journal of allergy and clinical immunology. (1999) 104 (6), 1311-1320
[10] Brezná B, Hudecová L, Kuchta T. A novel real-time polymerase chain reaction (PCR) method for the detection of walnuts in food. European food research and technology.
(2006) 223, 373-377
[11] Teuber S, Dandekar A, Peterson W et al. Cloning and sequencing of a gene encoding a 2S albumin seed storage protein precursor from English walnut (Juglans regia), a major food allergen. The Journal of allergy and clinical immunology. (1998) 101 (6,1), 807-814 [12] Pastorello E, Farioli L, Pravettoni V et al. Lipid transfer protein and vicilin are important
walnut allergens in patients not allergic to pollen. The Journal of allergy and clinical immunology. (2004) 114 (4), 908-914
[13] Wallowitz M, Peterson W R, Uratsu S et al. Jug r 4, a Legumin Group Food Allergen from Walnut (Juglans regia Cv. Chandler). Journal of agricultural and food chemistry.
(2006) 54, 8369-8375
