Dose-related selection of Pradofloxacin resistant Escherichia coli

(1)

- 1 -

Dose-related selection of Pradofloxacin- resistant Escherichia coli

Summer Eriksson

Examensarbete 10 poäng C-nivå, 2007 Biomedicinsk analytikerprogrammet

Institutionen för medicinska vetenskaper, Klinisk bakteriologi Handledare: Sara Olofsson

(2)

- 2 -

ABSTRACT

The study evaluated the Mutant Prevention Concentration (MPC) of Pradofloxacin on three Escherichia coli (E.coli) strains, 2 wildtypes and one first-step gyrA resistant mutant. We also

measured the value of AUC (Under the Concentration)/MPC that prevents growth of resistant mutants. It is of importance to reach a concentration above MPC that prevent E.coli from developing resistance against the antibiotic.

We used an in vitro kinetic model where we added bacteria? and antibiotic. The culture flask was attached to a pump with an adjustable pump-speed. This made it possible to dilute the antibiotics in a satisfying elimination half-life (t

1/2

= 7 hours) pace. Samples were removed with a syringe at different times in the study. The samples where then cultured on agar- plates to enable counting of the viable colonies after incubation.

The optimal concentration to completely eradicate both E.coli wildtypes Nu14 and MG1655 with Pradofloxacin was C

_max

≥8 times MPC and AUC/MPC then became73. Additional experiments needs to be done on the resistant mutant LM378 before we can determine the optimal concentration. But results so far indicate that the concentration of C

_max

would be about 8-12 timesMPC to completely eradicate that mutant.

Nyckelord: Fluoroquinolone, antibiotic resistance, Area Under Concentration, Mutant

Prevention Concentration, In vitro kinetic method

(3)

- 3 -

FÖRKORTNINGAR

AUC Area under koncentrationskurvan

cfu Colony forming unit

C

max

Den maximala koncentrationen

MPC Mutant Prevention Concentration.

MSW Mutant Selection Window

(4)

- 4 -

INTRODUKTION

I studien har vi gjort försök med Pradofloxacin på Escherichia coli (E.coli). Pradofloxacin ingår i antibiotikagruppen fluorokinoloner. Fluorokinolon är ett bredspektrumsantibiotika som togs fram under 1960-talet mot framförallt urinvägsinfektioner. Den första och ursprungliga kinolonen är nalidixinsyra. Till nalidixinsyra kopplades en fluoridjon, på så vis åstadkoms en bättre antibakteriell effekt med bättre farmakodynamik och mindre bieffekter (Wolfson 1989).

Grundstrukturen för fluorokinolonen kan ses i figur 1. Genom att tillsätta en fluoridjon på basstrukturen i position C-6, samt tillsätta olika molekylkombinationer på position 1, 5, 7, och 8 har mer än 10,000 analoger syntetiserats fram (Childs 2006, Lytsy 2005. Pradofloxacin är en 8-cyano-fluorokinolon och som blivit framtagen för att behandla bakterieinfektioner hos djur.

Kinoloner verkar genom att blockera två bakteriella topoisomeraser, DNA-gyras och DNA- topoisomeras IV, vilka är viktiga enzymer för replikationen och transkriptionen. Genom att bilda DNA-topoisomeras–kinolonkomplex hämmas dessa vitala cellfunktioner vilket leder till att bakterien dör. Fluorokinoloner har en koncentrationsberoende avdödande effekt, vilket betyder att en ökad dos ger en ökad effekt. Dessa antibiotika utsöndras delvis via njurarna, och det är därför nödvändigt att anpassa doseringen vid behandling av patienter med nedsatt njurfunktion, t.ex. äldre patienter (Wolfson 1989, Drlica 1997).

E. coli ingår i familjen Enterobacteriaceae och är en bakterieart som lever i de nedre

delarna av tarmarna hos varmblodiga djur; både hos fåglar och hos däggdjur. Bakterien

upptäcktes 1885 av Theodor Escherich, en tysk barnläkare och bakteriolog. E. coli är en

gramnegativ kort stav med en bredd på 1,1-1,5µm och längd på ca 2-6µm. Bakterien har visat

sig orsaka olika typer av infektioner i bland annat urinvägar, blodbanor, hjärnhinnor och

tarmar. E. coli är viktig för matsmältningen och utgör en stor del av tarmfloran. Antalet E.

(5)

- 5 -

coli bakterier i en människas avföring varierar mellan 100 miljarder och 10 biljoner per gram

feaces (Forsgren 1996).

Som gramnegativ organism är E. coli oförmögen att bilda sporer. Ett effektivt sätt att döda de aktiva bakterierna är genom pastörisering eller kokning. Som ett resultat av deras

anpassning till däggdjurs inälvor växer E. coli bäst in vivo eller i liknande miljöer jämfört med kyltempererade miljöer. Den optimala odlingstemperaturen ligger kring 37°C. Hittills har 4 olika ytantigensystem identifierats hos E. coli. Dessa benämns ”O ” (lipopolysackarid), ”K”

(kapsel), ”H” (flagell)- och ”F” (fimbrie)-antigen. Antigenerna möjliggör för bakterierna att orsaka feber (O), motstå kroppens immunförsvar (K), röra sig (H) och fästa på slemhinnor (F). Vissa E. coli-bakterier bildar så kallade enterotoxiner/gifter som orsakar diarréer. E. coli är den vanligaste urinvägspatogenen hos vuxna (~80% av infektionerna) med avseende på akuta och okomplicerade samhällsförvärvade sjukdomar, följt av Staphylococcus

saprophyticus (10% till 15%). Urinvägsinfektion är en av de vanligaste infektionerna, det

uppskattas att ca 150 miljoner människor världen över drabbas av urinvägsinfektioner, vilket orsakar en vårdnadskostnad på mer än 6 miljarder dollar (Ronald 2003, Arslan 2005).

Urinvägsinfektion uppstår då E.coli bakterier tar sig in i urinblåsan genom urinröret. Om bakterier tar sig via urinvägarna ända upp till njurarna kan de orsaka en allvarligare

urinvägsinfektion, s.k. njurbäckeninflammation. Hur svår urinvägsinfektionen blir beror på flera faktorer, bland annat antalet bakterier, hur svårbekämpade bakterierna är och hur starkt immunförsvar individen har.

Ingående studier har visat att E. coli i allt större utsträckning världen över har utvecklat resistens mot olika antibiotika. En tydlig resistensökning kan ses på en rad olika

bredspektrumantibiotika som bl.a. penicillin och trimethoprim (von Baum 2005). I takt med

ökad antibiotikakonsumtion, ökar även antalet komplexa resistensmekanismer hos patogena

bakterier. Samtidigt har läkemedelsindustrins forskning och utveckling av antibiotika minskat

(6)

- 6 -

och de flesta nya preparat är endast modifieringar av redan existerande antibiotikaklasser (Krause 1992). Antibiotikaresistensen är ett stort orosmoln då det kan leda till allvarliga konsekvenser för bl.a. svårt sjuka patienter.

Ett vanligt sätt att kategorisera antibiotika är efter deras sätt att verka. Det 5 huvudsakliga verkningssätten är; 1) Interferering av bakteriernas cellväggsuppbyggnad. Exempel på detta är β-laktamer (t.ex. penicilliner och cefalosporiner). Dessa antibiotika förhindrar enzymer att

korsbinda peptidoglycan, som är en viktig del av baktericellväggen. 2) Inhibering av proteinsyntesen; bakteriers ribosomer skiljer sig i struktur jämfört med eukaryota celler, antibiotika använder sig av dessa skillnader för att inhibera bakterietillväxten (t.ex.

tetracykliner binder till 30S-subenhet på ribosomen medan t.ex. kloramfenikol binder till 50S- subenheten) (Tenover 2006). 3) Interferering av nukleinsyrasyntesen; den antibakteriella effekten hos fluorokinoloner beror på en inhibering av DNA-syntesen. Antibiotikat orsakar en förstörande effekt på dubbelsträngat DNA genom att binda in till DNA-gyras eller DNA- topoisomeras IV under DNA-replikation/transkription (Drlica 1997). 4) Inhibering av

metaboliska processer; en vanlig antibiotikakombination är en folsyra-analog i samband med en sulfonamid 5) Upplösning av det bakteriella membranet; polymyxin utövar sin effekt genom att öka bakteriens membranpermeabilitet, vilket i sin tur leder till att innehållet läcker ut och bakterien dör (Storm 1977).

Resistens mot antibiotika kan uppstå på en rad olika sätt. Exempel på olika

resistensmekanismer som kan uppstå är; (1) Bakterier som förvärvar gener som kodar för olika enzymer, t.ex. β-laktamaser som hydrolyserar β-laktam antibiotika så att de blir inaktiva.

(2) Bakterier kan förvärva efflux-pumpar som pumpar ut antibiotika ur cellen. (3) Bakterier kan förvärva ett antal gener som förändrar deras metaboliska egenskaper, detta gör att bakterien kan producera en alternativ cellvägg som inte antibiotikamolekylen kan binda till.

(4) En fjärde resistensmekanism är då bakterier förvärvar en mutation som leder till att

(7)

- 7 -

antibiotika hindras från att ta sig in i bakterien och på så vis inte kan nå sitt mål. Detta sker då bakterierna reglerar porin-proteinerna. Förvärvad resistens utvecklas p.g.a. kromosomala mutationer. Denna typ av selektion kallas för vertikal resistensutveckling. Bakterier kan också utveckla resistens genom förärvning av nya genetiska material från andra resistenta

organismer. Detta fenomen kallas för horisontell resistensutveckling och kan uppstå mellan samma eller olika bakteriearter. Vid de genetiska utbyten ingår mekanismer som konjugation, transduktion och transformation (Tenover 2006).

För att komma till bukt med den ökande resistensutvecklingen bör antibakteriella

läkemedel endast användas då de verkligen behövs, t.ex. vid allvarliga infektioner. Dosering är också en viktig faktor, genom att optimera doseringen kan behandlingstiden förkortas och resistensutveckling förhindras. Genom att optimera så att antibiotikakoncentrationerna ligger ovanför MPC (förklaras längre ner) under hela doseringsintervallet kan teoretiskt sett

resistensutvecklingen minskas/förhindras. Detta är dock inte möjligt för alla preparat då vissa antibiotika inte går att administrera i allt för höga doser, p.g.a. farmakokinetiken och

toxiciteten. Genom att kombinera två eller flera läkemedel med olika effekter under en behandling kan problemet kringgås.

Den nedre gränsen av Mutant Selection Window (MSW) är den lägsta koncentrationen som inhiberar tillväxt av de flesta antibiotikakänsliga bakterier, den nedre gränsen ligger kring Minimum Inhibiting Concentration (MIC-värdet). Den övre gränsen av MSW är den

koncentration som hindrar tillväxten av den minst känsliga förstastegs- mutanten, denna gräns

kallas för Mutant Prevention Concentration (MPC). Antibiotikadoser inom dessa gränser

gynnar resistensutveckling (Drlica 2003). För att lättare förstå teorin kring MPC och MSW

visas därför en bild på gränserna i figur 2. MPC är nödvändigt att uppnå för att undvika

resistensutveckling. För att tillväxt skall kunna ske över MPC krävs det två eller fler

(8)

- 8 -

resistensmutationer. Då detta är sällsynt kommer få mutationer att uppstå när koncentrationer över MPC doseras. Exempelvis; om mutationsfrekvens hos en bakterie ligger kring ≤10

^-7

krävs det en bakteriepopulation på ≥10

¹⁴

för att två mutationer skall kunna uppstå. Detta är högst osannolikt då det vid kliniska fall som mest uppkommer en bakteriepopulation på 10

¹⁰

hos en infekterad patient.

I samband med att MPC undersöks, undersöks också parametern AUC/MPC, där AUC står för Area Under the Concentration Curve och är arean under koncentrationskurvan över 24h (se figur 1). AUC/MPC är en relativt ny Pharmakokinetisk/Pharmakodynamisk (PK/PD) parameter. Denna räknas ut för att undersöka om parametern noggrant kan förutse effekten av antibiotika och selektion av resistenta mutanter. Tidigare användes parametern AUC/MIC och var ett mått för effektiviteten för t.ex. fluorokinoloner. Ett index på ca 125 var något som skulle eftersträvas, dock tar AUC/MIC inte hänsyn till resistens, därför börjar man titta på AUC/MPC.

I studien använde vi oss av en in vitro kinetik modell, där det tillsätts bakterier och antibiotika. Kulturflaskan är kopplad till en pump vilket hastigheten ställs in på så att antibiotika späds ut med önskad halveringstid, i detta fall 7h då det motsvarar kinetiken för Pradofloxacin hos katter och hundar Därefter tas prover vid olika tidpunkter och odlas ut på plattor för att vi skall kunna räkna antalet bakteriekolonier. Det viktigaste är dock att

undersöka om andelen resistenta bakterier ökat eller försvunnit mellan 0 och 24h. Vi använder denna modell för att undersöka tre E. coli-stammar, varav två antibiotikakänsliga vildtyps- stammar samt en resistent förstastegs- mutant.

Syftet med studien var att optimera doseringen av Pradofloxacin mot tre E.coli-stammar.

Vi har försökt komma fram till den lägsta dosen som ger bäst effekt och som förhindrar

(9)

- 9 -

Figur 2. Bilden illustrerar övre och nedre gränserna för Mutant Selection Window;

MPC och MIC. Cmax är den maximala koncentrationen (Drlica 2003) Figur 1. Bilden illustrerar grundstrukturen

för fluoroquinolon-molekylen.

selektion av resistenta mutanter. Parametern AUC/MPC räknades ut och undersöktes för

användning somett index för att förutspå och förhindra resistensuppkomst.

(10)

- 10 -

MATERIAL OCH METOD

Provmaterial

Tre E. coli-stammar undersöktes; MG1655 och Nu14 (vildtyps-stammar), och LM378 med en gyrA-mutation. MIC och MPC-värdet för stammarna var förutbestämda. I tabell 1 visas MIC och MPC för Pradofloxacin för de olika stammarna.

Tabell 1. E. colistam och genotyp

Stammar Genotyp MIC (µg/ml) MPC (µg/ml)

NU14 wt 0,008 0,2

MG1655 wt 0,008 0,2

LM378 gyrA S83L 0,06 1,8

(11)

- 11 -

Antibiotika

Pradofloxacin tillhandahölls i 100% ren pulverform av Bayer Healthcare. Pulvret löstes i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en stamlösning med en koncentration på 500µg/ml, som användes till alla försöken.

Odlingsmedium

Som flytande medium användes Mueller-Hinton (MH) buljong (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA). Bakterierna odlades ut på plattor med Columbiaagar (Substrat avdelningen, Mikrobiologen, Uppsala, Sverige). För att detektera resistenta bakterier

användes även agarplattor innehållande Pradofloxacin. Antibiotikaplattorna tillverkades med en koncentration 4xMIC Pradofloxacin för respektive stam

In vitro kinetik modellen

Delarna i modellen bestod bland annat av en flaskhållare som hade ett utlopp och som anslöts till en pump (P-500; Pharmacia Biotech, Uppsala). I anslutning till botten på

flaskhållaren anslöts ett järnrack och ovanpå järnracket placerades ett filtermembran med en

porstorlek på 0,45µm. En flaska med en volym på 110ml med öppen botten anslöts till

flaskhållaren. Flaskan (se figur3) hade två ”armar” med varsin kork. En kork hade

silikonmembran vilket underlättade provtagningen. Den andra korken var ansluten till en

plastslang, och från en behållare tillfördes flaskan, via plastslangen, ny MH buljong. En

magnetisk omrörare var ansluten till flaskan, denna såg till att det blev en homogen blandning

av bakteriekulturen samt hindrade membranet från att täppas igen. Med hjälp av pumpen sögs

(12)

- 12 -

medium genom filtret från kulturflaskan med en given hastighet (11ml/h i detta fall, vilket ger en halveringstid på 7h), i samband med detta tillfördes ny MH-buljong i samma hastighet p.g.a. det negativa tryck som uppstod. Antibiotika som tillsattes till flaskan under försöken späddes enligt kinetikens första ordning; C(t)=C

_max

×e

^-kt

, Där C

_max

är den initiala

antibiotikakoncentrationen, C(t) är antibiotikakonc entrationen vid tiden t, k är

eliminationshastigheten och t tiden som förflutit sedan antibiotikat tillsattes. Hela proceduren utfördes i ett inkubationsrum med en temperatur på 37°C.

Försöksdesign

En bakteriekultur odlades i ca 6-7h i MH-buljong. På så sätt uppnåddes ett inokulat på

~10

⁶

cfu/ml. Till varje försök fylldes flaskan i den kinetiska modellen med ca 110 ml MH- buljong, samt 1 ml av den förberedda bakteriekulturen. Flaskan inkuberades därefter i 3,5h för att erhålla en population på ~10

⁸

cfu/ml. Ett 0hprov togs m.h.a. en sprutnål, därefter tillsattes Pradofloxacin (4, 6 och 8xMPC för vildtyps-stammar samt 6, 8, 10 och 12xMPC för LM378 ). I samband med detta sattes pumpen igång. Ytterligare prover togs vid 2, 4, 20 och 24h.

Figur 3. Bilden illustererar uppsättningen av den in vitro kinetiska metoden

(13)

- 13 -

Proverna odlades ut på Columbiaagar vid olika lämpliga spädningar. Prover som togs vid 0 och 24h odlades även ut på antibiotikaplattor (4xMIC). Plattorna inkuberades övernatt varefter kolonierna räknades. Detektionsgränsen för plattor utan antibiotika var 10cfu/ml och 1 cfu/10ml för plattor med antibiotika. Antibiotikaplattorna inkuberades i totalt 48h och kolonierna räknades både efter 24 och 48h. Tre kolonier plockades därefter från plattor med och utan antibiotika (både vid 0 och 24h), och renströks på ny Columbiaagar. Plattorna inkuberades övernatt och en koloni från varje platta sparades i -70°C. Kolonierna från utvalda utodlingsplattor gramfärgades, detta för att konfirmera E.coli. Gramfärgningen utfördes enligt Lugols metod.

MIC-bestämmning

Genom att utföra MIC-bestämning kan förändringar av bakteriens känslighet mot antibiotikat upptäckas. MIC-bestämning gjordes både på originalstammarna och på de kolonier som renstrukits från antibiotikaplattorna som utodlats med 24h prov. Tre kolonier från varje platta undersöktes.

MIC-bestämningen gjordes i en mikrotiterplatta. Pradofloxacin späddes med MH- buljong till olika koncentrationer (2, 1, 0,5; 0,25; 0,125; 0,06; 0,03; 0,016; 0,008; 0,004 och 0,002 µg/ml) och 50 µl tillfördes till brunnarna. En bakteriespädning förbereddes genom att kolonierna suspenderades i PBS till 0,5 McFarland (motsvarande 10

⁸

cfu/ml). Från

suspenderingen togs 100µl och tillfördes till 10ml PBS. 50µl av bakteriespädningen tillsattes sedan till brunnarna. En negativ (bara MH- buljong) och en positiv (MH- buljong och

bakterier) kontroll inkluderades på varje platta. Mikrotiterplattan inkuberades 16-20h i 37°C,

varefter grumligheten i brunnarna och MIC-värdet kunde bestämmas. MIC-värdet

(14)

- 14 -

definierades som den lägsta antibiotikakoncentration som inte gav någon synlig tillväxt av bakterier.

AUC/MPC

AUC räknades ut efter försöken för alla 3 stammarna med formeln:

Där C

₀

är den initiala (vilket motsvarar den maximala) koncentrationen av antibiotika, konstanten k = ln2/halveringstiden, och där C

t

är antibiotikakoncentrationen vid tiden t. För att få C

_t

-värdet användes formeln C

_t

= C

₀

*e

^-kt

.

RESULTAT

Koncentrations bestämning av antibiotikat

Bakterierna utsattes för pradofloxacin under 24h i in vitro kinetik modellen, och försök gjordes med olika startkoncentrationer (4-8xMPC för Nu14 och MG1655 med MIC:

0,008µg/ml och MPC: 0,2µg/ml; 6-12xMPC för LM378 med MIC: 0,06µg/ml och MPC:

1,8µg/ml). Andelen resistenta E.coli- bakterier var i början stor trots att de inte utsatts för Pradofloxacin, men andelen minskade dock vid alla försöken.

Figur 4 illustrerar utodlingsresultat på plattor utan antibiotika för vildtypstammen Nu14.

Kurvorna för 4, 6 och 8xMPC är medelvärden från 2 försök vardera. Resultaten visar en koncentrationsberoende effekt där 8xMPC ger bäst avdödning. Återväxt observerades efter 20 och 24h för alla kurvor.

Stapeldiagrammet i figur 5 illustrerar utodlingsresultat på antibiotikaplattor (4xMIC) för

vildtypstammen Nu14. Det var en markant minskning av de resistenta bakterierna för 24h

proverna, jämfört med 0hs proverna. I försöken gjorda med koncentrationer på 4 och 6xMPC

(15)

- 15 -

avdödades bakterierna inte helt efter 24h. Däremot var de resistenta bakterierna helt utdöda vid försöken med 8xMPC.

Figur 6 illustrerar utodlingsresultat på plattor utan antibiotika för vildtypstammen MG1655.

Kurvan för 4xMPC är medelvärden från 3 försök, kurvorna 6 och 8xMPC är medelvärden från 2 försök vardera. Inget av försöken gav en komplett avdödning av MG1655, däremot verkade koncentrationen 8xMPC hålla bakterierna på en låg jämn nivå redan efter 4h.

Figur 7 illustrerar utodlingsresultat på antibiotikaplattor (4xMIC) för vildtypstammen MG1655. Som i försöken med Nu14 visar stapeldiagrammet en lika markant minskning av MG1655-bakterierna på de plattor som utodlats med 24hs prover jämfört med 0h prover. I försöken gjorda med koncentrationer på 4 och 6xMPC avdödades bakterierna inte helt efter 24h. Däremot varr de resistenta bakterierna helt utdöda vid försöken med 8xMPC.

Figur 8 illustrerar utodlingsresultat för förstastegsmutanten LM378 på plattor utan

antibiotika. Kurvorna för 6, 8, 10 och 12xMPC är medelvärden från 2 försök vardera. Vid 1 av 2 försök avdödades bakterierna efter 20h vid 8xMPC, men en återväxt erhölls efter 24h.

Vid 10xMPC avdödades bakterierna helt efter 20h, vid ett annat försök med 10xMPC skedde detta endast vid 20h. Därefter uppträdde? en återväxt av bakterierna för alla

koncentrationerna.

Figur 9 illustrerar utodlingsresultat för förstastegs-mutanten LM378 på plattor med antibiotika. Liksom figur 8 är staplarna medelvärden från försöken med de olika

koncentrationerna. Som för de tidigare stammarna ses en markant minskning av resistenta

bakterier efter 24h jämfört med 0hs proven. Figur 9 visar att inte någon koncentration helt

avdödar bakterierna, dock är detta något missvisande då 24h proverna var vid 1 av de 2

försöken helt negativa vid 10xMPC. Koncentrationen 12xMPC lyckades aldrig helt avdöda

bakterien vid något av försöken.

(16)

- 16 -

Sammanställning av PK/PD parametrar

För varje stam jämfördes koncentrationen med lägst C

_max

eller kortast T>MPC som förhindrar uppkomst av resistens, mot den koncentrationen med högsta C

max

eller längst T>MPC som bidrar till uppkomst av mutanter (se tabell 2). Den optimala koncentrationen för stammarna Nu14 och MG1655 var ett C

max

på

8xMPC. I tabell 2 ses att 8xMPC

korresponderar mot ett T>MPC på 21hs, samt ett AUC/MPC på= 73. Då C

max

/MPC var < 8

sågs tillväxt av mutanter, samt att MIC-värdet var något förhöjd vid vissa av försöken. De

mest intressanta koncentrationerna för LM378 var ett C

max

kring 8 och 10xMPC. Tabell 2

visar även att vid C

_max

8xMPC, var T>MPC 21hs och AUC/MPC på= 73. Vid C

_max

10xMPC

var T>MPC 23h och AUC/MPC på= 92. MIC-värdet hade inte förändrats vid något av

försöken för LM378.

(17)

- 17 -

Figur 6. Bilden visar viabilitetskurvor vid koncentrationerna 4, 6 och 8xMPC av Pradofloxacin för vildtypen MG1655. De

markerade punkterna är prover tagna vid olika tidpunkter och som är utodlade på plattor utan Pradofloxacin.

Figur 4. Bilden visar viabilitetskurvor vid koncentrationerna 4, 6 och 8xMPC av Pradofloxacin för vildtypen Nu14. De markerade punkterna är prover tagna vid olika tidpunkter och som är utodlade på plattor utan Pradofloxacin.

Figur 5. Bilden visar viabilitetsstaplar vid koncentrationer 4, 6 och 8xMPC av Pradofloxacin för Nu14. Proverna som är tagna vid 0 och 24h är utodlade på plattor innehållande Pradofloxacin (4xMIC).De blå staplarna representerar utodlade 0h prov. De röda staplarna visar tillväxten från 24h prov.

Figur 7. Bilden visar viabilitetsstaplar vid koncentrationerna 4, 6 och 8xMPC av Pradofloxacin för MG1655. Proverna som är tagna vid 0 och 24h är utodlade på plattor innehållande Pradofloxacin (4xMIC). De blå staplarna representerar utodlade 0h prov. De röda staplarna visar tillväxten från 24h prov.

(18)

- 18 -

Figur 8. Bilden visar viabilitetskurvor för förstastegs- mutanten LM378 vid koncentrationerna 6, 8, 10, och 12xMPC av Pradofloxacin. De markerade punkterna är prover tagna vid olika tidpunkter och som är utodlade på plattor utan Pradofloxacin.

Figur 9. Bilden visar viabilitetsstaplar för förstastegs- mutanten LM378 vid koncentrationerba 2, 4,6 och 8xMPC av Pradofloxacin. Proverna som är tagna vid 0 och 24h är utodlade på plattor innehållande

Pradofloxacin (4xMIC). De blå staplarna visar tillväxten av bakterier som utodlats med prover som gått i 0h. De röda staplarna representerar tillväxten av bakterier som utodlats med prover som gått i 24h

.

(19)

- 19 -

Tabell 2. PK/PD parametrar i den in vitro kinetiska modellen för E.coli- stammarna Nu14, MG1655 och LM378

Stam C_max/MPC T>MPC (timmar)

AUC/MPC MIC^a

(µg/ml) Nu14

MG1655

4 14 37

0,016-0,004

0,016-0,008 Nu14

MG1655

6 18 55

0,008-0,004

0,03-0,016 Nu14

MG1655

8 21 73

-

LM378 6 18 55 0,06

LM378 8 21 73 0,06

LM378 10 23 92 0,06

LM378 12 25 110 0,06

a MIC-värde för kolonier som växte på antibiotikaplattor (4xMPC) utodlade med 24h prov.

SLUTSATS OCH DISKUSSION

Till studien användes en in vitro kinetisk metod. Denna beskrivs och illustreras av Löwdin et. al samt Gustafsson et al. Metoden är en enkel konstruktion, är relativt billig att använda, och är inte allt för tidskrävande. Ytterligare fördelar är att; under försökens gång kan

bakterieavdödningen följas med tiden, det är också lättare att simulera farmakokinetiken hos

människor än för de studier som använder sig av djurförsök (Gustafsson 2005). De problem

(20)

- 20 -

jag upplevde i början av studien var att behärskauppsättningens monteringsföljd, dock löste sig detta snabbt då en utförlig metodbeskrivning kunde följas. Ett annat problem var då flaskan råkade fyllas med lite för mycket MH-buljong i samband med att med att bakterierna tillfördes. Då fanns en risk att behållaren som tillförde ny buljong kunde kontamineras. Detta skulle kunna lösas om en av armarna på flaskan gjordes något längre och mer vertikal. De ovan nämnda problemen var inga större problem i sig.

En allmän metod att mäta resistens är via MIC-bestämmning. Då testas oftast bara en eller ett fåtal kolonier. Genom att istället odla bakterier på antibiotikaplattor blir

resistensbestämningen mycket känsligare då det odlas ut en större mängd bakterier. För att förhindra resistensutveckling tillämpas MPC. Vid 2006 gjordes en studie (Olofsson 2006) där de bl.a; använder den in vitro kinetiska metoden, undersöker dosförhållandet för

Ciprofloxacin genom att odla ut olika E.coli- stammar på antibiotikaplattor, samt titta på tiden över MPC. Studien visar att ju högre den initiala antibiotikakoncentrationen (C

max

) är, ju kortare tid krävs det över MPC för att förhindra selektion av resistenta bakterier. Genom att använda sig av doser som snabbt tar sig över MPC minskar risken för resistensutveckling.

Studier har visat att in-optimala doser av antibiotika kan vara en stark bidragande orsak till den ökande resistensenutvecklingen (Guillemot 1998, Blaser 1987). I vår studie har vi försökt optimera doseringen för Pradofloxacin. . I likhet med resultat från Olofson et al (2006) såg vi att avdödningen var koncentrationsberoende i alla våra försök. Den optimala koncentrationen för vildtyps- stammarna Nu14 och MG1655 var ett C

max

på 8xMPC (T>MPC= 21h). Vildtyps- stammarna var helt avdödade då de utodlades på plattor med antibiotika, däremot försvann inte den totala populationen då de odlades ut på plattor som saknade antibiotika (gällde även LM378). Detta fenomen har också observerats i andra studier (Marcusson 2005, Olofson 2006). Att s.k. ”persistent population” återfinns i samband med antibiotika är ett känt

fenomen, men varför olika bakteriepopulationer och behandlingar kan ge upphov till detta är

(21)

- 21 -

okänt. Ingen optimal koncentration av Pradofloxacin kunde fastslås för E. coli- stammen LM378, p.g.a. den rådande tidsbristen hann vi inte med alla planerade försök. Fler försök med C

max

koncentrationerna 8 och 10 xMPC (ev. högre) bör göras för att kunna fastställa optimala koncentrationen för denna mutant.

I studien räknade vi ut indexvärden för AUC/MPC för de olika stammarna vid de olika koncentrationerna. Detta gjordes för att undersöka vilket indexvärde av AUC/MPC som kan förhindra tillväxten av resistenta mutanter, samt för att undersöka om antibiotikans effekt kan förutses. Tidigare användes parametern AUC/MIC. Studier visar att AUC/MIC- värde kring 100-125 skall vara tillräcklig för att förhindra uppkomsten av antibiotkaresistens (Wright 2000). Detta värde verkar dock variera mycket då två studier visar att ett AUC/MIC på 29 respektive 43 är de optimala värdena för att förhindra uppkomst av resistens (Wright 2000).

Därför undersöks nu om AUC/MPC är en bättre parameter. För våra försök med

Pradofloxacin var AUC/MPC= 73 för vildtyps- stammarna Nu14 och MG1655 vid ett C

max

på 8xMPC. För LM378 verkar C

_max

hamna kring 8 och 10xMPC, vilket då ger den ett

AUC/MPC index på= 73 respektive 92. Då LM378 är en förstastegs- mutant väntas denna ha ett högre indexvärde än vildtyps-stammarna.

I studien har vi visat att en viss koncentration med ett visst värde på AUC/MPC kan

förhindra uppkomsten av resistens för vildtyp- stammarna Nu14 och MG1655. Dock bör fler

försök göras på stammen LM378.

(22)

- 22 -

ACKNOWLEDGEMENT

Jag skulle vilja tack Sara Olofsson som var en utmärkt handledare, vill också tacka hela gänget på mikrobiologens forskningsavdelning då de hela tiden livade upp vistelsen på mikrobiologen. Sist men inte minst måste substratgänget få cred.

REFERENSER

Arslan H, Azap OK, Ergönül O, et al. - Risk factors for ciprofloxacin resistance among Escherichia coli strains isolated from community-acquired urinary tract infections in Turkey.

J Antimicrob Chemother. Vol. 56(5), 914-8, 2005

Blaser J, Stone BB, Groner MC, et al. - Comparative study with enoxacin and netilmicin in a pharmacodynamic model to determine importance of ratio of antibiotic peak concentration to MIC for bactericidal activity and emergence of resistance. Antimicrob Agents Chemother.

Vol. 31, 1054-60, 1987

Childs J. Stacy - Safety of the Fluoroquinolone Antibiotics: Focus on Molecular Structure.

http://www.medscape.com/viewarticle/410202_1, 2006

Drlica K and Zhao X. - DNA Gyrase, Topoisomerase IV, and the 4-Quinolones. Microbiol Mol Biol Rev, Vol. 61, 377–392, 1997

Drlica K - The mutant selection window and antimicrobial resistance. Journal of Antimicrobial Chemotherapy Vol. 52, 11–17, 2003

Forsgren A och Kronvall G. - Klinisk Bakteriologi. s. 378-380, 1996

Guillemot D, Carbon C, Balkau B, et al. – Low Dosage and Long Treatment Duration of β- lactam: risk factors for carriage of penicillin-resistant Streptococcus pneumonaie. JAMA Vol. 279, 365-70, 1998

Gustafsson, Löwdin E, Odenholt I, Cars O et al. – Pharmacokinetic and pharmacodynamic parameters for antibacterial effects of cefotaxime and amoxicillin in an in vitro kinetic model.

Antimicrob Agents Chemother. Vol. 45, 433-8, 2001)

Http://en.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli. 20070424, 2007

Krause RM. - The origin of plagues: old and new. Science. Vol. 257, 1073-8, 1992

(23)

- 23 -

Lytsy B - Kinoloner – bot som blivit hot. Läkartidningen Vol. 102, Nr 48, 2005

Lowdin E, Odenholt I, Bengtsson S, Cars O, et al. – Pharmacodynamic effects of sub-MICs of benzylpenicillin against Streptococcus pyogenes in a newly developed in vitro kinetic model.

Antimicrob Agents Chemother. Vol. 40, 2478-82, 1996

Marcus LL, Olofsson SK, Komp Lindgren et al. Biological cost of single and multiple norfloxacin resistance mutations in Escherichia coli implicated in urinary tract infections.Antimicrob Agents Chemother. Vol. 49, 2343-51, 2005

Olofsson SK, Marcusson LL, Komp Lindgren P, et al. Selection of ciprofloxacin resistance in Escherichia coli in an in vitro kineticmodel; relation between drug exposure and mutant prevention concentration. J Antimicrob Chemother. Vol. 57 (6), 1116-21, 2006