20-X1
Goodbye E. coli
Alternativa endotoxinfria produktionssystem till Escherichia coli
Marcus Westholm, Linnéa Yuan Andersson, Milica Plavsic, Cecilia Orrenius, Jenny Eriksson, Sofia Fasth
Beställare: Affibody AB
Beställarrepresentant: Gunnar Johansson Handledare: Karin Stensjö
1MB332, Självständigt arbete imolekylär bioteknik, 15hp, vt2020 Civilingenjörsprogrammet imolekylär bioteknik
Institutionen för biologisk grundutbildning, Uppsala universitet
Abstract
Affibody is interested in replacing Escherichia coli as the production system for
Affibody®-molecules in order to reduce the amount of resources needed for the purification step. The aim of this report is to present relevant endotoxin-free alternatives that would suit production. Affibody®-molecules are proteins that have similar specificity as antibodies used in biopharmaceuticals, but have the advantage of being smaller. Since E. coli is the current production organism, the product is contaminated with immunogenic endotoxins which cause a high demand of resources during the purification process, something Affibody wants to reduce. The results presented in this report were achieved by means of a systematic literature study, divided into one general phase and two specific search phases. In the general literature search phase we were solely concerned with finding endotoxin-free expression systems. In the specific search phases the expression systems found were narrowed down in two steps based on criteria such as potential of scale-up > 1000 L, approval from the European Medicines Agency and the Food and Drug Administration, cost and productivity. Finally, only three candidates remained that met all requirements. The information found pertaining to the expression systems was presented in a spreadsheet, as were the different sources used.
The nominated endotoxin-free candidates suggested to replace E. coli are Pichia pastoris, Chinese Hamster Ovary (CHO) cells and the Baculovirus Expression Vector System (BEVS).
The candidates were then weighed against each other in an analysis based on the given criteria. We concluded that all three candidates satisfy the criteria and are suitable replacements for Affibody to use instead of E. coli.
Innehållsförteckning
1 Bakgrund 1
1.1 Syfte och mål 1
1.2 Affibody söker alternativa produktionssystem 1
1.3 Affibody®-molekyler är ett alternativ till antikroppar i biologiska läkemedel 2 1.4 Immunogena endotoxiner leder till resurskrävande rening 2
2 Projektets urvalsprocess 3
2.1 Första urvalsprocessen 3
2.2 Andra urvalsprocessen 4
3 Presentation av projektets tre slutgiltiga expressionssystem 6
3.1 Pichia pastoris 7
3.1.1 P. pastoris används för uttryck av rekombinanta proteiner 7 3.1.2 Det finns läkemedel på marknaden uttryckta i P. pastoris 8 3.1.3 P. pastoris är bra på att utsöndra protein vilket förenklar reningsprocessen 8 3.1.4 Promotorn pAOX induceras med metanol och finns naturligt i P. pastoris 8 3.1.5 Odling sker i tre faser om promotorn pAOX används 9
3.1.6 pGAP är en alternativ promotor till pAOX 10
3.1.7 pAOX är att föredra framför pGAP utifrån exempel med humant serum albumin 10 3.1.8 Syretillförsel kan vara begränsande faktor vid uppskalning av P. pastoris 10 3.1.9 Kostnaden för storskalig produktion av Affibody®-molekyler i P. pastoris är
svårbedömd 11
3.1.10 P. pastoris växer på serumfritt medium 11
3.1.11 Vissa stammar av P. pastoris är patenterade 12
3.2 BEVS – Baculovirus Expression Vector System 12
3.2.1 Baculovirus-infektionen sker i fyra stadier och producerar “occlusion bodies” 13 3.2.2 BEVS utnyttjar baculovirus förmåga att producera occlusion bodies 14 3.2.3 Expressionsvektorn kan tas fram på olika sätt 15 3.2.4 Odlingsprocessen för insektsceller kräver specifika förhållanden 16 3.2.5 BEVS går att använda för rekombinant proteinproduktion i stor skala 17
3.2.6 Faktorer som påverkar proteinproduktionen 18
3.2.7 Baculoviruset har en utvecklad genetisk verktygslåda 19 3.2.8 BEVS har en stor uppsättning promotorer för rekombinant produktion 19
3.2.9 Baculovirus har använts för vaccinproduktion 20
3.3 CHO – Chinese Hamster Ovary-celler 21
3.3.1 CHO som ledande produktionssystem av monoklonala antikroppar (mAbs) 21
3.3.2 Cellinjer är olika lämpade för produktion 21
3.3.3 Vad innebär transfektion inom produktion? 22
3.3.4 Den generella teorin bakom BAC-vektorer 22
3.3.5 Stabil och effektiv proteinproduktion i CHO-celler via BAC-vektorer 22
3.3.6 Valet av promotor spelar roll 23
3.3.7 CHO-celler har stor kapacitet 24
3.3.8 Hitta rätt medium 24
3.3.9 Det finns flera sätt för optimering av medium 25 3.3.10 Nativa proteiner renas bort för att förhindra immunreaktioner 26 3.3.11 Låg smittorisk av virus vid användning av CHO-celler 26 3.3.12 Hur mycket protein kan CHO-celler producera? 26
4 Jämförelse av de tre slutgiltiga expressionssystemen 27
4.1 P. pastoris, BEVS och CHO-celler uppfyller Affibodys krav på skalbarhet 27
4.2 Produktiviteten är högst i P. pastoris 27
4.3 Kostnaden är lägst för P. pastoris 28
4.4 Varken P. pastoris, CHO-celler eller BEVS utför hyperglykosyleringar 28 4.5 Produktionssystemen har använts för att producera EMA-godkända läkemedel 29
5 Slutsats 29
6 Författarnas bidrag 29
7 Tillkännagivanden 30
Referenser 31
Bilaga A - Hur skapar vi etiskt försvarbara läkemedel?
Bilaga B - Framtidens möjligheter Bilaga C - Projektbeställning
Bilaga D - Matris över produktionssystem i urvalsprocesserna Bilaga E - Matris över litteratur
1 Bakgrund
1.1 Syfte och mål
Denna rapport har utformats på beställning av företaget Affibody AB för att undersöka alternativa produktionssystem för Affibody®-molekyler. I dagsläget använder företaget Escherichia coli för produktionen men det resulterar i en resurskrävande rening av bland annat endotoxiner, vilket företaget vill undvika. I rapporten presenteras tre endotoxinfria alternativ till E. coli, framtagna genom en systematisk litteraturstudie i kombination med en urvalsprocess. Kriterierna för expressionssystemen i urvalsprocessen lyder enligt följande:
● utan endotoxiner
● godkända av European Medicines Agency, EMA, eller Food and Drug
Administration, FDA, d.v.s. standarder för läkemedel som säljs eller produceras i Europa respektive USA
● förekommer i tidigare läkemedelsstudier
● skalbara > 1000 L
● har serumfri tillväxt, d.v. s. tillväxt i medium utan animaliska komponenter
● saknar posttranslationella modifieringar, PTMs, som bidrar till felveckning av Affibody®-molekyler, exempelvis hyperglykosylering
● produktivitet
● kostnad.
För att uppfylla hela beställningen har även de etiska perspektiven belysts. Mer om detta går att läsa i Bilaga A. Projektgruppens förhoppning är att Affibody kommer kunna använda arbetet som beslutsunderlag inför ett eventuellt framtida byte av produktionssystem.
1.2 Affibody söker alternativa produktionssystem
Företaget, Affibody, bygger sin verksamhet på att producera Affibody®-molekyler som används för utveckling av biologiska läkemedel. Affibody®-molekylerna produceras idag rekombinant med E. coli, då det är en etablerad produktionsorganism som är lätt att arbeta med, billig samt växer snabbt. E. coli är en gramnegativ bakterie vilket bidrar till vissa fördelar men det resulterar även i restprodukter som är immunogena (Magalhães et al. 2007), d.v.s. triggar vårt immunförsvar. Dessa restprodukter är exempelvis nativa proteiner, som är specifika för E. coli och så pass olika våra mänskliga proteiner att vårt immunförsvar reagerar om vi får i oss dem. Dessutom innehåller E. coli endotoxiner som också ger ett immunsvar hos oss.
Vid produktion av Affibody®-molekyler i E. coli lyseras cellerna för utvinning av det rekombinanta proteinet. I lysatet finns det rekombinanta proteinet tillsammans med nativa proteiner och endotoxiner. För att inte dessa ska ge ett immunsvar hos patienten som får läkemedlet krävs noggrann rening. Denna rening är idag mycket resurskrävande för företaget.
För att minska det resurskrävande steget överväger företaget att byta produktionssystem till
något fritt från endotoxiner, och om möjligt, med färre immunogena nativa proteiner.
Affibody önskar även att de nya förslagen på produktionssystem är skalbara till en
industriskala på > 1000 L och att de i dagsläget redan använts för godkända läkemedel. Den fullständiga beställningen återfinns i Bilaga C.
1.3 Affibody®-molekyler är ett alternativ till antikroppar i biologiska läkemedel
De första Affibody®-molekylerna skapades för 20 år sedan, då forskare ville skapa proteiner som var mer användbara än de naturliga antikropparna som är mycket dyra att producera (Ståhl et al. 2017). Affibody®-molekyler uttrycks rekombinant och liknar antikroppar på flera sätt. Antikroppar, Abs, har hög specificitet och därmed förmåga att med hög affinitet binda till sina målmolekyler, vilket resulterat i stor användning inom läkemedelsindustrin (Friedman & Ståhl 2009). Inom läkemedelsindustrin används framförallt monoklonala antikroppar, mAbs, vilket innebär att antikropparna är identiska (Dada et al. 2017).
Nackdelen är dock att produktionen av läkemedel bestående av mAbs är mycket dyr. Det beror på vissa molekylära egenskaper såsom hög molekylvikt upp till flera hundra kDa hos mAbs. Affibody®-molekyler är istället mycket mindre, runt 6,5 kDa (Ståhl et al. 2017) vilket medför en billigare produktion. Trots att Affibody®-molekylerna är små har de fortfarande den höga specificiteten som mAbs har (Friedman & Ståhl 2009).
Ytterligare en nackdel som försvårar produktionen av mAbs är att de ofta kräver specifika posttranslationella modifieringar, PTM, som glykosylering (Dada et al. 2017), för att uppnå sin specificitet. Affibody®-molekyler behöver inga specifika PTM för att uppnå sin
specificitet.
1.4 Immunogena endotoxiner leder till resurskrävande rening
Affibody®-molekyler produceras idag med hjälp av E. coli som produktionsorganism.
Eftersom E. coli är en gramnegativ bakterie har den lipopolysackarider, LPS, på det yttre membranet. LPS består av en lipid del och kolhydrater i kedjor (Magalhães et al. 2007).
Lipiddelen sitter fast i membranet och från dessa sticker kolhydratkedjorna ut som svansar.
LPS skyddar bakterien från giftiga molekyler genom att förhindra små och hydrofoba molekyler att passera genom membranet (Bertani & Ruiz 2018). Eftersom LPS endast finns hos gramnegativa bakterier är det mänskliga immunförsvaret bra på att registrera små kvantiteter av dessa och snabbt signalera att en bakteriell infektion har uppstått i kroppen (Magalhães et al. 2007). LPS benämns således som endotoxiner när de orsakar en
immunrespons.
Att Affibody idag använder E. coli som produktionsorganism innebär att
Affibody®-molekylerna kommer vara kontaminerad av endotoxiner före reningen är gjord.
Om dessa inte renas bort kommer slutprodukten trigga ett immunsvar. Magalhães et al.
(2007) beskriver hur denna rening är svår eftersom endotoxiner är stabila när det kommer till
temperatur och pH. I artikeln beskrivs hur endotoxiner behöver utsättas för 250 °C i minst 30 min alternativt 180 °C i minst tre timmar för att inaktiveras. Vid dessa temperaturer
denatureras även de flesta proteinerna vilket är problematiskt eftersom proteinerna då förlorar sin funktion. Kort sagt är endotoxiner mer stabila än proteiner och behöver därför renas bort.
Idag använder företaget kromatografi för denna rening. LPS-rening är ett tids- och resurskrävande steg och det skulle vara fördelaktigt om Affibody kunde använda ett produktionssystem utan endotoxiner, såsom grampositiva bakterier eller eukaryota celler.
2 Projektets urvalsprocess
För att arbeta systematiskt med litteratur konstruerade gruppen en matris där alla medlemmar under arbetets gång fyllde i information om läst litteratur såsom åtkomst till källan,
information om kritisk granskning (peer review), årtal och utgivare (se Bilaga E). Syftet med litteraturmatrisen var att effektivisera sökningen samt att undvika dubbelarbete. En matris över alla funna expressionssystem kopplades till litteraturmatrisen genom ett internt referenssystem för att underlätta skrivandet av rapporten.
Gruppen valde att dela in informationssökningen i två delar: en generell samt en mer specifik sökning. Detta illustreras i Figur 1. De två urvalen beskrivs under två separata underrubriker nedan.
Figur 1. En bild över hur litteratursökningen strukturerades med två urval. De blåa fälten indikerar antalet kandidater som undersöktes i varje steg. Det gröna fältet indikerar det generella
litteratursöket och de rosa fälten indikerar det mer specifika litteratursöket. Bilden illustrerar hur litteratursökningen började generellt, och möjliga kandidater, 41 st. Därefter gjordes ett urval på 10 produktionssystemen utifrån givna kriterier. Projektgruppen undersökte dessa vidare innan slutligen tre slutkandidater valdes.
2.1 Första urvalsprocessen
Innan den första urvalsprocessen kunde äga rum utförde gruppen en generell sökning, med syftet att hitta så många endotoxinfria produktionssystem som möjligt (se Bilaga D). Gruppen
använde huvudsakligen Scopus, Google Scholar och PubMeds databaser vid sökning av litteratur. Kommentarer om klassificering, produktivitetsmått, tidigare kliniska studier, kostnad, posttranslationella modifieringar, godkännande av “European Medicines Agency”, EMA, samt amerikanska “Food and Drug Administration”, FDA, skalbarhet, reningsprocess och miljö dokumenterades gemensamt. Gruppen försökte göra tabellen så välfylld som möjligt men fokuserade på om produktionssystemen använts för att producera läkemedel godkända enligt EMA eller FDA samt om de tidigare använts i kliniska studier.
Det generella litteratursöket resulterade i 41 olika produktionssystem inom kategorierna;
bakterier, svampar, insektsceller, växtceller samt däggdjursceller. De system som saknade FDA/EMA-godkännande sållades bort direkt, liksom de som saknade information för flera av urvalskriterierna. Se Bilaga D för kommentarer kring dessa kriterier för de olika
expressionssystemen. Efter diskussion inom gruppen och med beställarrepresentanten valdes tio expressionssytem ut för specificerad litteratursökning, se Tabell 1.
Tabell 1: Tabellen visar de tio utvalda expressionssystem som återstod efter det första urvalet.
Namn Expressionssystem
Bacillus subtilis Bakterie
Corynebacterium glutamicum Bakterie
Pichia pastoris Jäst
Saccharomyces cerevisiae Jäst
Trichoderma reesei Filamentös svamp
Aspergillus niger Filamentös svamp
Baculovirus Expression Vector System, BEVS
Insektsceller i kombination med baculovirus
NS0, Murine myeloma cells Däggdjursceller Human embryonic kidney, HEK-293 Humana celler Chinese Hamster Ovary cells, CHO Däggdjursceller
2.2 Andra urvalsprocessen
För att kunna välja ut två till tre av de tio återstående expressionssystemen, vilket var vårt mål, gjorde gruppen en mer specifik litteratursökning för detaljerad information med syfte att
kunna utvärdera utifrån de uppställda kriterierna. Efter diskussion inom gruppen beslutade vi oss även för att vi ville ha en variation av expressionssystem i resultatet, alltså inte endast tre olika jästsvampar utan tre alternativ av olika kategorier, för att få mer variation och bredd.
Nedan följer motiveringar till valen av de expressionssystem som vi anser bäst uppfyller ovan nämnda kriterier.
I kategorin däggdjursceller anser projektgruppen att Chinese Hamster Ovary cells, CHO, är att föredra framför Murine myeloma cells, NS0. Båda cellinjerna används för
läkemedelsproduktion i dagsläget (Dhara et al. 2018) och skulle kunna vara lämpliga
kandidater som produktionssystem hos Affibody. Anledningen till att vi valt att fortsätta den specialiserade sökningen med CHO-celler är att dessa celler har möjlighet att uttrycka större koncentration mAbs än NS0 (Kunert & Reinhart 2016). Dessutom används CHO-celler i en större utsträckning än NS0-celler för produktion av mAbs (Dhara et al. 2018), vilket gruppen tolkar som att den medför fler fördelar. Att använda NS0 är fördelaktigt när specifika PTM som saknas i CHO-celler behövs, men då Affibody ej söker produktionssystem med specifika PTM anses den inte vara att föredra.
Vi övervägde även att fortsätta med Human Embryonic Kidney celler (HEK-293) istället för CHO-celler eftersom HEK-293-celler är humana celler. HEK-293-cellernas nativa proteiner kommer därför inte orsakar en immunorespons vilket är önskvärt för läkemedel. Däremot finns det risk för spridning av mänskliga virus i HEK-293-celler som kan innebära extra produktionskostnader (Dumont et al. 2016). Det konstaterades 2014 dessutom att HEK-293-celler relativt dyra att odla och inte lika etablerade som CHO-celler i
läkemedelsindustrin (Portolano et al. 2014). Eftersom Affibody inte har krav på att deras expressionssystem kräver några speciella PTM anser projektgruppen att HEK-293-celler är onödigt komplexa att byta till jämfört med CHO-celler.
Vid jämförelse av jästerna Saccharomyces cerevisiae och Pichia pastoris förefaller den senare vara mest lämplig för produktion av Affibody®-molekyler. P. pastoris har, enligt en studie av produktion av glykoproteiner (Tran et al. 2017), ett kortare och mindre immunogent glykosyleringsmönster samt högre mängd utsöndrat protein än S. cerevisiae: 180,3 mg/L respektive 9,5 mg/L. Båda jästerna utför glykosylering och S. cerevisiae gör dessutom N-länkad hyperglykosylering, vilket kan minska mängden utsöndrat protein samt proteinets aktivitet (Darby et al. 2012).
Vi valde att gå vidare med BEVS eftersom det är ett system som har använts i stor utsträckning och uppfyller kriterierna. Det finns flera vaccin och terapeutiska läkemedel producerade i BEVS tillgängliga på marknaden vilket innebär att de har godkänts av FDA eller EMA (Palomares et al. 2015). BEVS är även skalbar för produktion av rekombinanta proteiner i större skala och har en produktivitet som, trots längre generationstid, kan ställas mot de andra expressionssystemen som undersöktes.
Vi valde att inte gå vidare med svamparna Trichoderma reesei eller Aspergillus niger eftersom båda dessa främst används i tillverkningen av enzymer inom livsmedelsproduktion och vid framställning av organiska syror (Meyer et al. 2020). T. reesei har använts i en studie till att framställa IFNα-2b där resultatet blev en hög proteinkoncentration med hög renhet (Rantasalo et al. 2019), men vi har tyvärr inte funnit några fler fall än detta. Projektgruppen tror dock att denna svamp skulle kunna vara en intressant kandidat för Affibody i framtiden.
Mer om detta kan läsas i Bilaga B. Vidare valde vi att inte heller fortsätta med någon av bakterierna, Corynebacterium glutamicum och Bacillus subtilis, eftersom det inte gick att hitta rapporter där de använts i läkemedelsproduktion eller kliniska studier. Både C.
glutamicum och B. subtilis har dock visat potential för läkemedelsutveckling, främst eftersom de kan utsöndra protein vilket underlättar reningsprocessen (Taguchi et al. 2015, Liu X et al.
2016). C. glutamicum har dessutom använts för att producera antikroppsfragmentet ScFv (Liu X et al. 2016), vilket gör den extra intressant. Däremot har andra produktionssystem i urvalet visat större potential då de redan har varit med i kliniska studier, så båda bakterierna får ses som framtida, potentiella produktionsorganismer.
3 Presentation av projektets tre slutgiltiga expressionssystem
P. pastoris, Baculovirus Expression Vector System (BEVS) och Chinese Hamster Ovary cells (CHO) är lämpliga alternativ för Affibody vid ett byte av produktionssystem eftersom de är endotoxinfria, förekommer i tidigare kliniska studier och är skalbara. Övriga
produktionssystem återfinns i Bilaga D. I Tabell 2 sammanställs de tre utvalda systemen utifrån kriterierna endotoxinfri, skalbarhet, kostnad, produktivitet, eventuell produktion av tidigare läkemedel och möjlig tillväxt på serumfritt medium. Därefter beskrivs respektive system mer utförligt.
Tabell 2: Sammanställning av alternativa produktionssystem utifrån kriterierna endotoxinfri, skalbar över 1000 L, kostnad, produktivitet, läkemedel på marknaden och tillväxt i serumfritt medium.
P. pastoris BEVS CHO
Endotoxinfri Ja Ja Ja
Skalbar över 1000 L Ja Ja Ja
Kostnad Lägst Medel Högst
Produktivitet Högst Medel Lägst
Läkemedel på marknaden Ja, små protein Ja, vaccin Ja, antikroppar
Serumfri tillväxt Ja Ja Ja
3.1 Pichia pastoris
3.1.1 P. pastoris används för uttryck av rekombinanta proteiner
Jäst är en eukaryot, encellig organism och ger därför posttranslationella modifieringar som är mer lika människans än vad bakterier klarar av att göra. Det är bara en av många anledningar till att jäst kommit att användas i rekombinant proteinproduktion (Baghban et al. 2019). Idag finns flera kommersiella expressionssystem i jäst tillgängliga däribland S. cerevisiae och P.
pastoris (Baghban et al. 2019). Båda dessa jästsvampar har använts tidigare för
läkemedelsproduktion och klassas som GRAS, Generally Regarded As Safe, av FDA (Vogl et al. 2013, Taguchi et al. 2015), vilket resulterat i att projektgruppen har haft intresse för dessa. P. pastoris har generellt högre produktion av rekombinanta proteiner jämfört med andra jästsvampar (Tran et al. 2017). Detta exemplifieras av Schmidt (2004) som lyfter ett exempel på produktion av ett fragment av toxinet som genererar stelkramp. Toxinfragmentet uttrycktes i P. pastoris och S. cerevisiae där utbytet var 12 g/L respektive 1 g/L.
Produktiviteten kan variera med det rekombinanta proteinets storlek. Andra rekombinanta proteiner uttryckta i P. pastoris är humant serum albumin, HSA, (67 kDa (Kenanova et al.
2010)) och trypsin (24 kDa (Cunningham 1954)) (Baghban et al. 2019). Dessa proteiner har alla en molekylmassa större än Affibody®-molekyler (6,5 kDa) men också mindre proteiner som insulin glargin med en vikt på 6,1 kDa (PubChem) uttrycks i P. pastoris. Projektgruppen har beaktat proteinernas molekylvikt för att undersöka proteiner som är jämförbara med Affibody®-molekyler. P. pastoris når snabbt en hög koncentration av biomassa (Lebozec et
al. 2018) och är väl lämpad för uppskalning i produktioner över 1000 L (Buchetics et al.
2011, Looser et al. 2015, Liu W-C et al. 2016), vilket beställaren listat som ett kriterium.
3.1.2 Det finns läkemedel på marknaden uttryckta i P. pastoris
Det finns idag flera biologiska läkemedel på marknaden uttryckta i P. pastoris. Ett exempel är Semglee®, för behandling av diabetes, med den aktiva substansen insulin glargin (Tripathi
& Shrivastava 2019). Det är godkänt av EMA (2018a) och har en molekylvikt på 6,1 kDa.
Även den aktiva substansen i proteinläkemedlet Jetrea® som används vid behandling av ögonsjukdomen VMT uttrycks i P. pastoris (Walsh 2018). Läkemedlet är godkänt av EMA (2018b) och FDA (Ahmad et al. 2014) och har en molekylvikt på 27,2 kDa (Drugbank, 2012). För att kunna bli godkända av EMA har dessa läkemedel som producerats i P. pastoris genomgått samtliga faser av kliniska studier (EMA 2018a, EMA 2018b).
Det första godkända läkemedlet uttryckt i P. pastoris var Kalbitor som år 2009 godkändes av FDA (Ahmad et al. 2014). Det aktiva proteinet, ecallantide, har en molekylvikt på 7,0 kDa och motsvarar därmed massan för Affibody®-molekyler. 2011 avslog dock EMA ansökan för godkännande för försäljning av Kalbitor av okänd anledning enligt EMAs hemsida (2018c).
3.1.3 P. pastoris är bra på att utsöndra protein vilket förenklar reningsprocessen P. pastoris kan utsöndra protein vilket gör den fördelaktig att använda för rekombinant proteinproduktion. Utsöndring innebär att cellerna inte behöver lyseras vilket gör att färre nativa proteiner behöver renas bort jämfört med om cellerna lyserats. Det kommer i sin tur förenkla reningsprocessen (Bracke et al. 2018) vilket är vad Affibody önskar vid byte av produktionssystem. Det finns flera system för utsöndring i P. pastoris såsom α-MF, PHO1, PHA-E och SUC2 (Cereghino & Cregg 2000). Ahmad et al. (2014) hävdar att α-MF är det mest effektiva systemet för utsöndring av proteiner i P. pastoris. α-MF kommer
ursprungligen från S. Cerevisiae (Buchetics et al. 2011) och är ett system som med hjälp av bioteknik idag kan utnyttjas av P. pastoris. I vissa fall kan dock inte α-MF användas för utsöndring av proteiner och då är de andra systemen att föredra (Cereghino & Cregg 2000).
Schmidt (2004) menar att P. pastoris inte bara kan utsöndra proteiner utan att den är bäst av alla kända jäster på att utsöndra protein. Sambandet mellan tillväxt och utsöndring av rekombinant protein är emellertid komplext och inte helt klarlagt (Buchetics et al. 2011). En kulturs tillväxttid beror på generationstiden och cellernas metabolism och generellt når P.
pastoris snabbt en hög koncentration av biomassa. P. pastoris har en generationstid på 1,5 till 5 timmar beroende på tillväxtmedium (Cregg et al. 2009) vilket påverkar tiden för produktion och därmed även kostnaden.
3.1.4 Promotorn pAOX induceras med metanol och finns naturligt i P. pastoris
P. pastoris är metylotrof (Baghban et al. 2019) vilket innebär att den kan växa med metanol som kolkälla (Tran et al. 2017). För att kunna bryta ned alkohol har P. pastoris naturligt två gener för enzymet alkoholoxidas vars promotorer induceras med metanol; pAOX1 och
pAOX2 (Baghban et al. 2019). De två starka promotorerna har varit bidragande till att P.
pastoris kommit att bli populär inom rekombinant proteinproduktion. Eftersom P. pastoris också kan använda andra kolkällor bygger flera studier på att först låta jästen växa på en typ av medium, för att vid ett önskat tillfälle byta kolkälla till metanol och därmed inducera uttrycket av det rekombinanta proteinet (Baghban et al. 2019). Det finns tre olika varianter som passar för produktion beroende på hur de använder metanol (“Metanol utilizing”); Mut- som saknar båda AOX-promotorerna (och alltså inte uttrycker någon alkoholoxidas alls), Muts som bara har pAOX2 och Mut+ som har kvar både pAOX1 och pAOX2 (Looser et al.
2015). En överblick av dessa olika varianter presenteras i Tabell 3 nedan. Muts har långsammare tillväxthastighet än vad Mut+ har i närvaro av metanol, som gör att den är lättare att kontrollera i produktion där det lätt uppstår tillfälliga överskott av metanol (Looser et al. 2015). Kännedom om promotorernas för- och nackdelar är av betydelse för att göra ett välgrundat val. Vid uppskalning av produktion med pAOX följer ökning av mängden hanterad metanol, vilket kan komma att utgöra en brandfara särskilt i större volymer.
Tabell 3: Överblick av P. pastoris-stammarna Mut-, Muts och Mut+. De skiljer sig åt i produktivitet beroende på vilka promotorer som saknas.
pAOX1 pAOX2 Produktivitet
Mut- Saknas Saknas Lägst
Muts Saknas Finns Medel
Mut+ Finns Finns Högst
3.1.5 Odling sker i tre faser om promotorn pAOX används
Processen för produktion av rekombinant protein i P. pastoris är uppdelad i tre faser för att uppnå högsta möjliga produktionsförmåga. Fas 1 är en batch där cellerna ska tillväxa och få så stor biomassa, antal celler, som möjligt på kortast möjliga tid (Looser et al. 2015). Hur stor biomassan är i Fas 1 avgör hur stor mängd produkt som kan bildas i Fas 3 (Looser et al.
2015). Kulturen startas med en begränsad mängd substrat, näring, och fasen pågår tills näringen är slut. När största möjliga biomassa uppnåtts övergår processen till Fas 2, även den utan metanol, som innebär att näring pumpas in allteftersom och celldensiteten ökar (Looser et al. 2015). För P. pastoris med AOX-promotor är det i den tredje fasen, med metanol, som uttrycket av rekombinanta proteiner startar. Samtidigt som proteinexpressionen börjar, minskar tillväxthastigheten något eftersom expressionen kräver energi (Looser et al. 2015).
Ett problem som kan uppkomma vid bytet av kolkälla mellan andra och tredje fasen är att metanolen i Fas 3 skadar fermentationsprocessen eftersom metanolen blir toxisk i för hög koncentration (Baghban et al. 2019). Metanolen kan också vara problematisk rent praktiskt
eftersom det kan vara svårt att förvara den lättantändliga vätskan på ett säkert sätt (Juturu &
Wu 2018). Det har visat sig svårt att veta när det är mest optimalt att tillsätta metanolen i produktion med AOX-promotor för att gynna proteinproduktionen (Looser et al. 2015, Juturu
& Wu 2018)). Tidpunkten beror på produkt och design av fed-batchen (Looser et al. 2015), vilket är viktigt att ta hänsyn till om Affibody väljer pAOX i P. pastoris.
De vanligaste kolkällorna för produktion av P. pastoris är glukos, glycerol och metanol vilka kombineras olika beroende på val av promotor (Looser et al. 2015). Arbetet med att optimera produktion beror på, utöver tidigare nämnda aspekter, syretillförsel, temperatur och pH (Looser et al. 2015). Eftersom P. pastoris trivs i lågt pH (5-6) minskar det risken för kontaminering av odlingar då få andra mikroorganismer trivs i sura miljöer (Cereghino &
Cregg 2000).
3.1.6 pGAP är en alternativ promotor till pAOX
En annan promotor som används för produktion i P. pastoris är pGAP som induceras med glukos, glycerol, etanol och oleinsyra (Juturu & Wu 2018). Med GAP-promotor är
produktionen oberoende av metanol och produktionen blir då kontinuerlig eftersom jästen hela tiden växer på den kolkälla som används för att inducera uttrycket av det rekombinanta proteinet. En negativ effekt med kontinuerlig produktion kan vara, beroende på produkt, att produkten i för hög koncentration kan verka toxisk för organismen (Juturu & Wu 2018).
Looser et al. (2015) återger exempel på produktion av ett protein med AOX- respektive GAP-promotor och hur uttrycket av rekombinant protein påverkar tillväxthastigheten. För pGAP är sambandet mellan produktion av rekombinant protein och jästens tillväxthastighet linjärt, medan kurvan för AOX-promotorn snarare följer en normalfördelning vilket innebär att den jäst som växer snabbast inte nödvändigtvis är den som producerar mest protein.
3.1.7 pAOX är att föredra framför pGAP utifrån exempel med humant serum albumin Som nämnts ovan är humant serum albumin, HSA, ett protein som uttryckts rekombinant i P.
pastoris. HSA har uttryckts med hjälp av både AOX- och GAP-promotorer. En studie använde AOX-promotorn och med hjälp av fed-batchodling uttryckte HSA rekombinant i P.
pastoris (Kobayashi et al. 2000). Den specifika produktionshastigheten nådde 0,26 mgHSA/g/h. Denna studie var i liten skala och odlingen skedde med metanol som kolkälla.
Under processen var temperaturen 30 °C, syrehalten över 10 % och pH-värdet var 5,85.
Rebnegger et al. (2014) använde istället GAP promotorn och fick på 24 timmar den specifika produktionshastigheten 0,16 mgHSA/gr/h, vilket motsvarar 30 mg/L. De hade en temperatur på 25 °C, samma pH-värde men en syrehalt istället över 20 %. Dessa två studier tyder på att AOX-promotorn ger högre produktivitet. Produktiviteten påverkas dock också av vilket protein som önskas uttryckas rekombinant och gruppen kan därmed inte ge en
rekommendation till Affibody gällande val av promotor.
3.1.8 Syretillförsel kan vara begränsande faktor vid uppskalning av P. pastoris
De tillväxtbegränsande faktorerna är vanligen syretillförsel och temperatur (Buchetics et al.
2011). Temperaturen blir problematisk eftersom jästens celldelning är en exoterm process, som vid produktion i större skala, kräver kylning för att vara konstant vid den optimala tillväxttemperaturen (Buchetics et al. 2011, Liu W-C et al. 2016). För att jästen ska bryta ned glycerol och metanol krävs också en god syretillförsel (Liu W-C et al. 2016). För att öka syrehalten i fermentorn där jämvikt råder, krävs antingen att syrehalten i tilluften ökas eller att det totala trycket ökas (Liu W-C et al. 2016). I studien av Liu W-C et al. (2016) odlade de P. pastoris vid två olika lufttryck. Lufttrycket var 0,05 MPa respektive 0,1(± 0,05) MPa.
Odlingen vid det högre lufttrycket skedde utan tillskott av syrgas och gav samma resultat som odlingen vid det lägre lufttrycket med tillskott av syrgas. Sker produktionen med tillsats av syrgas medför hanteringen av syrgas dels en säkerhetsrisk och dels en kostnadsaspekt att ta med i beaktande (Liu W-C et al. 2016). En annan aspekt av säkrad syretillförsel är cellernas åtkomst till syret. I mindre skala är det möjligt att odla i skakflaskor under hela produktionen men i större skala är tankar med omrörning, “stirred tanks”, att föredra (Liu W-C et al.
2016).
3.1.9 Kostnaden för storskalig produktion av Affibody®-molekyler i P. pastoris är svårbedömd
Lebozec et al. (2018) jämför kostnaden för olika produktionssystem för produktion av Fab ACT017. Fab ACT017 är ett fragment av en antikropp som binder till antigenen och har en storlek på 45 kDa (Lebozec et al. 2018). Lebozec et al. (2018) utförde en mindre odling av protein med de olika organismerna för att sedan uppskatta Cost of Goods, CoG, vid en årlig produktion av 150 kg ACT017. I den mindre studien odlades P. pastoris under 108 h vilket gav en celldensitet på 160 g/L. Ur detta kunde sedan titern, d.v.s. koncentrationen, av ACT017 beräknas till 0,631 g/L. Detta ger ett produktivitetsmått på 6 mg/L/h. Dessa värden låg som grund för att uppskatta CoG. Författarna beräknade kostnaden med BioSolve
Software och inkluderade kostnader för kapital, material, förbrukningsvaror, arbetskraft samt övriga kostnader. De konstaterade att P. pastoris som expressionssystem skulle vara billigast, 96 €/g. Det kan jämföras med E. coli som författarna uppskattade skulle kosta 105 €/g.
Produktionskostnaden beror dock på fler faktorer, bl. a. vad för protein som uttrycks och det är därför svårt att bedömning kostnaden för just Affibody®-molekyler.
3.1.10 P. pastoris växer på serumfritt medium
P. pastoris kan växa på billigt och serumfritt medium (Cereghino & Cregg 2000, Liu W-C et al. 2016) vilket är en förutsättning för att uppskalning av produktionen inte ska vara kostsam.
Serumfritt medium innebär att det är fritt från animaliska produkter såsom blod. För storskalig produktion krävs att man odlar i bioreaktor. Det kan kräva mer arbetskraft än kultivering i skakflaskor men är ändå att föredra eftersom det möjliggör kontroll av tillväxten och syrehalten (Looser et al. 2015), se ovanstående text om syretillförseln. P. pastoris kräver att mediet innehåller en ren kolkälla (glycerol, glukos eller metanol), salter, spårämnen, biotin
och vatten (Cereghino & Cregg 2000). Salterna och spårämnena som behövs är enligt en tillverkare (Goncalves 2013) fosforsyra, kaliumsulfat, kalciumsulfat,
magnesiumsulfatheptahydrat och kaliumhydroxid. Detta innebär att P. pastoris alltså odlas på serumfritt medium. Det är fördelaktigt för att det inte ställer lika höga krav på rening vid produktion av läkemedel och är något Affibody har önskat i sin beställning.
3.1.11 Vissa stammar av P. pastoris är patenterade
Det finns idag en stor variation av stammar av P. pastoris som används för rekombinant proteinproduktion. De flesta stammarna som används idag har utvecklats från NRRL-Y 11430 (Baghban et al. 2019). Ahmed et al. (2014) beskriver de vanligaste stammarna. GS115 metaboliserar metanol snabbt eftersom den är Mut+ variant, d.v.s. har generna för både AOX1 och AOX2. En annan stam är X-33 som har framtagits för att vara prototrof, d.v.s. med förmåga att själv kunna skapa essentiella aminosyror. Andra exempel som författarna tar upp är KM71 och KM71H där promotorn pAOX1 är utslagen vilket leder till att de växer
långsammare under tillväxt på metanol. Ytterligare exempel är stammarna SMD1168 och SMD1168H, som är framtagna för att ha färre proteaser. Att ha färre proteaser är fördelaktigt, särskilt för P. pastoris som annars har höga koncentrationer av proteaser (Baghban et al.
2019). Enligt Ahmed et al. (2014) kan samtliga exempel ovan användas kommersiellt men skyddas av olika patent eller liknande. Invitrogen och Research Corporation Technologies är stora tillverkare av patenterade stammar (Juturu & Wu 2018). Stammar utvecklade från CBS7435 är dock inte patenterade (Ahmad et al. 2014, Juturu & Wu 2018). Att använda opatenterade stammar innebär att Affibody inte behöver betala licenskostnader.
3.2 BEVS – Baculovirus Expression Vector System
“Baculovirus expression vector system”, eller BEVS, är ett expressionssystem där
rekombinanta proteiner kan uttryckas med hjälp av två huvudsakliga komponenter, ett virus som vektor och insektsceller. Det är ett populärt expressionssystem som har använts för flera vaccin och andra terapeutiska läkemedel som finns på marknaden idag (Palomares et al.
2015). I princip vilket rekombinant protein som helst kan uttryckas i BEVS, men systemet används oftast för att uttrycka biologiskt aktiva eller immunogena proteiner som används i vaccin (van Oers 2011). De första studierna som uttryckte rekombinanta proteiner med hjälp av baculovirus publicerades redan 1980 (Jarvis 2009). Sedan dess har en större förståelse inom insektsbiologi, de samlade erfarenheterna samt stora tekniska framsteg bidragit till att systemet förbättrats på flera sätt och kan idag även tillämpas i stor skala inom produktion.
Figur 2: En översiktsbild av BEVS där en insektscell transfekteras med en transferplasmid som innehåller “gene of interest”, GOI, och ett baculovirus genom. Det sker sedan homolog
rekombination i insektscellen som ger en rekombinant baculovirusvektor som innehåller GOI. Vektorn renas och används för att infektera en insektscellkultur som sedan producerar det rekombinanta proteinet som GOI kodar för. Figuren modifierad från Sigma Aldrich.
3.2.1 Baculovirus-infektionen sker i fyra stadier och producerar “occlusion bodies”
För att förstå principen bakom BEVS behövs först lite kunskaper kring baculovirusets biologi. Baculovirus har två olika typer av virioner (infektiösa partiklar): “budded virions”, BV, samt “occlusion derived virions”, ODV (van Oers 2011). BVs bildas av cellmembranet och sprider infektionen mellan cellerna medan ODVs, som bildas inuti cellkärnan hos den infekterade cellen, ser till att viruset kan överleva i miljön utanför cellen och smittar mellan insekter (Contreras-Gómez et al. 2014). ODVs innesluts av komplex som kallas “occlusion bodies”, OB (Figur 3), som fungerar som ett skyddande hölje (van Oers 2011). Dessa OBs består av bland annat ett protein som heter polyhedrin (Jarvis 2009). Ett annat protein p10 hjälper till då ODVs ska ta sig ut från cellkärnan vid slutet av infektionen (van Oers 2011).
Dessa två proteiner uttrycks i stora mängder i senare stadiet av infektionen där polyhedrin kan utgöra upp till hälften av allt protein i den infekterade cellen vid det stadiet (Jarvis 2009).
Detta är mekanismen som ligger bakom principen av BEVS (Jarvis 2009, van Oers 2011).
Figur 3: Strukturen på en occlusion body som inkapslar flera ODV partiklar.
Infektionen av baculovirus sker i fyra olika faser:
1. “Immediate early phase” - I denna fas uttrycks RNAsom aktiverar gener i de följande faserna (van Oers 2011, Contreras-Gómez et al. 2014).
2. “The delayed early phase” - Här uttrycks gener associerade med replikation av viruset samt de gener som manipulerar värdcellen (Contreras-Gómez et al. 2014).
Exempelvis produceras protein som hindrar värdcellen från programmerad celldöd (van Oers 2011).
3. “The late phase” - Nukleokapsider, som består av virusets genom och ett skyddande proteinhölje, samt andra protein som ska bilda virionerna, de infektiösa partiklarna, produceras (van Oers 2011). BVs bildas (Contreras-Gómez et al. 2014).
4. “The very late phase”: ODVs bildas och stora mängder polyhedrin och p10 uttrycks (van Oers 2011). Proteaserna kitinas samt katepsin lyserar cellen (Contreras-Gómez et al. 2014)
3.2.2 BEVS utnyttjar baculovirus förmåga att producera occlusion bodies
Expressionsvektorn i BEVS är ett rekombinant baculovirus som innehåller en sekvens för det protein man vill uttrycka (Jarvis 2009). Baculovirus är en familj av virus som bland annat infekterar insekter, vilket är anledningen till att just insektsceller används för att uttrycka protein. Det är däremot helt säkert för människor eftersom viruset inte kan smitta
ryggradsdjur samtidigt som insektsceller generellt har lägre kontamineringsrisk än exempelvis mammalieceller (van Oers 2011).
BEVS utnyttjar egenskapen hos baculovirus att producera OBs genom att ersätta sekvenserna för polyhedrin och p10 med sekvensen för ett rekombinant protein som önskas uttryckas.
Eftersom polyhedrin och p10 inte behövs för produktionen av BVs som smittar mellan cellerna, och ODVs inte är nödvändiga vid användning av cellkulturer, är det inget problem att ersätta dem (Jarvis 2009, Contreras-Gómez et al. 2014). Sekvensen för det rekombinanta viruset styrs av polyhedrin-promotorn polh eller p10 promotorn p10 (Jarvis 2009,
Contreras-Gómez et al. 2014). Dessa starka promotorer gör att baculovirus kan producera stora mängder av rekombinant protein (Contreras-Gómez et al. 2014). Det är detta som är orsaken till att BEVS utvecklats som expressionssystem.
Baculovirusets genom utgör basen för vektorerna som används i BEVS (Jarvis 2009). Det mest använda baculoviruset för BEVS är AcMNVP . En av anledningarna är att det kan 1 infektera ca 25 olika fjärilsarter, vilket är fler än andra baculovirus. Det kan även infektera flera olika sorters vävnadstyper hos en specifik art (Jarvis 2009). Ett annat populärt virus, som dock inte används i lika stor utsträckning, är BmNVP (van Oers 2011). Det används för 2 att infektera silkesfjärilslarvceller och andra cellkulturer medan AcMNVP används för att infektera insektsceller vid storskalig produktion av protein, vilket då är av större intresse för Affibody (van Oers 2011). I det senare infektionsstadiet kan produktion nå en nivå på ≥ 100 mg/L rekombinant protein beroende på vilket protein som uttrycks (Jarvis 2009).
3.2.3 Expressionsvektorn kan tas fram på olika sätt
Baculovirus har relativt stora genom som gör att det inte fungerar att använda direktkloning för att inkorporera gener i vektorn (van Oers 2011). Den klassiska metoden för att ta fram en rekombinant baculovirus-vektor går ut på homolog rekombination mellan virusets genom och en transferplasmid. Transferplasmiden innehåller sekvensen för det rekombinanta proteinet man vill uttrycka, vilket illustreras ovan i Figur 2. Rekombinationen sker i insektsceller efter de har transfekterats, d.v.s. att främmande genetiskt material introduceras i cellen, med både virala genomet och transferplasmiden. Efter detta måste det rekombinanta viruset renas bort från cellerna, vilket var ett tidskrävande steg och inte effektivt (Jarvis 2009, van Oers 2011).
Detta åtgärdades när linjäriseringsbara baculovirusgenom utvecklades, d.v.s. cirkulära baculovirusvektorer som gjorts linjära, och var mycket mer effektiva (Jarvis 2009). Med dagens tekniker går framtagningen av baculovirusvektorer betydligt fortare. Det tar upp till en vecka att rena fram det rekombinanta viruset om man utgår från en färdig transferplasmid och ett baculovirusgenom (Kost & Kemp 2016). Detta är inte lika snabbt som att ta fram vektorer för expressionssystem med prokaryota organismer eller med jäst, men det är en tydlig förbättring från de tidigare metoderna som användes vid framtagning av
baculovirusvektorer med äldre tekniker.
Samtidigt som de linjäriseringsbara baculovirsgenomen togs fram, utvecklade forskaren Luckow en annan metod tillsammans med sina kollegor (Luckow et al. 1993, Jarvis 2009).
Denna metod använder sig av en “bacterial aritifical chromosome”, BAC, som innehåller baculovirusets DNA och kallas för bacmid (van Oers 2011). Det blev då möjligt att manipulera baculovirusgenomet i E.coli och var ett stort steg framåt i framtagningen av baculovirusvektorer. Metoden förlitar sig på genetisk transposition, d.v.s. att ändra geners position på kromosomer där de flyttas från en position till en annan, istället för homolog rekombination. Detta sker i en E.coli-stam som innehåller bacmid samt en hjälpande plasmid
1Ett ofta använt baculovirus. “Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus”
2Ett ofta använt baculovirus. “Bombyx mori nucleopolyhedrovirus”
(van Oers 2011). De rekombinanta baculovirus-partiklarna renas från cellerna och används för att infektera nya insektsceller för att sedan producera rekombinanta proteiner (van Oers 2011). Detta har kommersialiserats som Bac-to-Bac® av Invitrogen och producerar
baculovirus med 100% effektivitet (Jarvis 2009, Assenberg et al. 2013).
Det finns flera andra metoder utöver de nämnda för att ta fram baculovirusvektorn, såsom BaculoDirect™ eller flashBAC™ (Jarvis 2009). FlashBAC™ bygger på bacmid och har kommersialiserats av Oxford Expression Technologies Ltd. (van Oers 2011). BaculoDirect™
är en sorts kombination mellan bacmidtekniken och in vivo rekombination i insektsceller (Jarvis 2009, van Oers 2011). Det är dock svårt att avgöra vilken metod som är mest passande i Affibodys syfte, men eftersom det finns en risk att licenser tillkommer hos de
kommersialiserade metoderna kanske den traditionella metoden kan vara att föredra ur ett kostnadsperspektiv. De framtagna baculovirusvektorerna håller i 6 månader vilket gör att de kan användas i flera omgångar efter det tidskrävande första steget (Assenberg et al. 2013).
Flera modifierade baculovirusgenom och transferplasmider finns även på marknaden (Jarvis 2009).
För att sammanfatta BEVS går systemet ut på att ersätta polyhedrin- och p10-sekvensen i baculovirusgenomet med en sekvens för det rekombinanta proteinet som ska uttryckas.
Sekvensen för det rekombinanta proteinet är homolog med polyhedrin och p10-sekvensen och därför kan användas vid homolog rekombination. Baculovirusvektorn tas fram med den önskade metoden och används för att infektera insektsceller. I det senare stadiet av
infektionen kommer insektscellerna att uttrycka det rekombinanta proteiner i hög grad, och därefter kan proteinet renas fram. En översiktsbild av principen illustreras i Figur 2 med homolog rekombination som exempelmetod för framtagningen av vektorn.
3.2.4 Odlingsprocessen för insektsceller kräver specifika förhållanden
Det finns över 600 olika cellinjer isolerade från över 100 olika insektsarter (van Oers & Lynn 2010). De vanligaste insektscellerna som används är Sf-9, Sf-21 samt High Five™ (som har kommersialiserat av Invitrogen). Odlingar av Sf-9 och Sf-21 på fast medium används ofta för framtagningen och kvantifieringen av rekombinanta baculovirusvektorer (Jarvis 2009).
Insektscellerna kan växa både i suspensionskulturer och i fasta kulturer. Detta innebär att de kan användas i både forskningslabb på fast medium och i större skala i suspension vid
produktion i spinnkolvar, skakflaskor, storskaliga reaktorer eller omrörda tankar (Jarvis 2009, van Oers & Lynn 2010).
Vid användning av BEVS-systemet krävs rätta förhållanden för odlingsprocessen. Cellerna växer vid 25-30 °C, optimalt vid 27 °C, och har en generationstid på 24-30 timmar (van Oers
& Lynn 2010). De behöver ingen CO2 -inkubator då deras växtmedium är buffrat med fosfat istället för karbonat (som används för mammalieceller) (Jarvis 2009, van Oers & Lynn 2010).
Insektscellernas huvudsakliga kolkälla är glukos och vissa aminosyror behöver tillsättas i större mängd än förväntat vid proteinsyntes (van Oers & Lynn 2010). Generellt för
insektcellernas medium behövs en hög koncentration av aminosyror samt ett pH på ca 6.2 - 6.4 (van Oers & Lynn 2010). Insektsceller kan utföra flera olika posttranslationella
modifieringar. Däremot saknar de enzymer för att utföra komplex N-glykolysering och kan då vara begränsande när komplexa modifieringar krävs för ett rekombinant protein (van Oers
& Lynn 2010). Eftersom Affibody®-molekyler inte kräver komplexa modifieringar är det därför inget problem i just detta fall.
En nackdel med BEVS är att förberedelsen av vektorn är mer tidskrävande än andra system som t.ex. hos bakterier eller jäst samt att generationstiden är längre. Däremot kompenserar systemet för detta med sin relativt höga avkastning. En annan fördel med BEVS är att insektscellerna inte behöver anpassas eller modifieras efter vad som ska produceras, till skillnad från andra system där processen att modifiera celler för att optimalt producera ett visst protein kan ta lång tid (Kost & Kemp 2016).
Cellerna ställer inget krav på att mediet ska innehålla serum och på marknaden finns både medium med och utan serum. Detta är en fördel eftersom man vid storskalig
läkemedelsproduktion vill använda serumfritt medium för att undvika kontaminering av prioner och virus (Butler 2013). Det är även ett krav Affibody ställer på sina
produktionssystem. Tillverkare av insektscellsmedium inkluderar Expression Systems, Invitrogen (Gibco), HyClone, och Sigma-Aldrich (Jarvis 2009). Vid eventuellt byte av medium, exempelvis från medium innehållande serum till serumfritt medium, måste kulturen under en period vänja sig vid det nya mediet och kan inte förflyttas direkt (Kost & Kemp 2016). Enligt Gibcos manual “Growth and maintenance of insect cells” kan det ta ca tre veckor för kulturen att vänja sig vid serumfritt medium, men efter det växer de i samma hastighet som på serumbaserat medium.
3.2.5 BEVS går att använda för rekombinant proteinproduktion i stor skala När det kommer till storskalig proteinproduktion med BEVS finns det olika alternativ.
Cellerna kan odlas på en fast yta eller suspenderade, där det sistnämnda är det vanligaste alternativet för storskalig produktion. BEVS går att applicera i en storskalig produktion upp till 1000 L eller högre om så önskas (Drugmand et al. 2012). Till exempel lyckades en forskargrupp skala upp produktionen av hemagglutinin, HA, på ~62 kDa (Drugbank), ett rekombinant protein som används i produktionen av vaccinet Flublok®, från 650 L till 2500 L (Buckland et al. 2014). HA uttrycktes i insektscellerna expresSf+ som odlades i ett
serumfritt medium. Gruppen följde FDAs tillverkningsprocess “biological license application”, BLA, d.v.s. producerade HA på samma vis som det uttrycks i industrin (Buckland et al. 2014).
Uppnådda celldensiteter av insektsceller ligger generellt mellan 2-55*106 celler/mL men den optimala densiteten för produktion ligger i den lägre halvan (Contreras-Gómez et al. 2014).
Kulturer bestående av Sf-9 celler har en optimal densitet på ca. 3-4*106 celler/mL medan High Five™ ligger kring 5-6*106 celler/mL (Drugmand et al. 2012). En anledning till denna
