Cutibacterium acnes påverkan på
makrofagers uttryck av proteinet
CCL2
Cutibacterium acnes effect on macrophages expression of the protein CCL2
Victoria Öberg
Fakulteten för hälsa, natur- och teknikvetenskap Biologi
Grundnivå 15 hp
Handledare: Ann Erlandsson Examinator: Larry Greenberg 2020-06-05
1
Abstract
Prostate cancer is a common form of cancer worldwide; the reasons behind this disease are still largely unknown, and scientist are looking for informative biomarkers that are indicative of this disease.
Cutibacterium acnes, a bacterium commonly found in human tissue, including prostate cancer tissue,
has shown controversial evidence on its effects on macrophages and their consecutive production of cytokines such as CCL2, which potentially could contribute to cancer progression. The purpose of this paper is to examine if macrophages in contact with this bacterium will increase the production of CCL2. This was done by using the ELISA immunoassay method to detect the level and CCL2 production in macrophages treated with type I and type II forms of C. acnes and to compare this with untreated macrophages. The results showed that there was a significant difference between the untreated
macrophages and those treated with type I of C. acnes but not between those untreated and those treated with type II of C. acnes across all donors. The average of CCL2 production was increased on those macrophages treated with any type of C. acnes compared to the untreated macrophages, even though no significant difference was shown statistically, on all donors. In conclusion the results show that it is evident that more research is needed to determine whether CCL2 are an adequate biomarker for prostate cancer but that infiltration of C. acnes type I in macrophages will contribute to an overproduction of the cytokine CCL2.
Sammanfattning
Prostatacancer är en vanlig form av cancer som blivit ett mänskligt såväl som medicinskt problem världen över, orsakerna är ännu inte kartlagda och man letar kontinuerligt efter adekvata biomarkörer. Cutibacterium acnes är en bakterie som ingår i vår normalflora som visat kontroversiella bevis på att kunna ha en inverkan på makrofagers produktion av cytokiner, så som CCL2, som i sin tur kan påverka progression av prostatacancer. Syftet med denna undersökning är att se om makrofager producerar förhöjda nivåer av CCL2 vid närvaro av C. acnes. Undersökningen utfördes genom användandet av immunoassay metoden ELISA för att detektera proteinnivåerna av CCL2 hos makrofager behandlade med typ I och typ II av C. acnes jämfört med obehandlade makrofager. Resultatet visade att det fanns en signifikant skillnad mellan de makrofager som var obehandlade och de som var behandlade med typ I av
C. acnes men inte mellan de obehandlade och de som var behandlade med typ II av C. acnes över alla
givare. Medelvärdena för de makrofager som var behandlade med någon typ av C. acnes var dock högre än hos de obehandlade för alla givare, trots att ingen signifikant skillnad uppvisades.Det behövs därmed mer forskning innan man kan se om CCL2 kan vara en adekvat biomarkör för prostatacancer men att närvaro av C. acnes typ I i makrofager kommer leda till en överproduktion av CCL2.
2
Inledning
Prostatacancer är den vanligaste form av cancer i Sverige med en uppskattning på runt 5000 nya fall årligen (Damber, 2000). Under 2003 diagnosticerades 9000 män i Sverige med sjukdomen och samma år registrerades 2350 dödsfall i Sverige med orsak av malign prostatacancer (Lindmark, 2005). I
genomsnitt avlider 2000 män per år i Sverige av just denna sjukdom (Damber, 2000). Prostatacancer är en multifaktoriell sjukdom där riskfaktorer är både ärftlighet och livsstilsfaktorer så som diet, androgena hormoner och andra miljöfaktorer (Lindmark, 2005). Med ökad diagnostik och nya metoder för att tidigare upptäcka sjukdomen är det nu den tionde vanligaste form av cancer i världen överlag, men även den femte vanligaste förekommande typ av cancerformen hos män i världen (Damber, 2000). Mortalitet och morbiditet kopplat till prostatacancer är således ett genomgripande mänskligt och medicinskt problem världen över.
Ärftlighet har påvisats vara en bidragande faktor till ökad risk för män att drabbas. I 5-10% av alla fall med prostatacancer har man sett en tydlig koppling till släkthistorik medan resterande fall upplevs uppkomma slumpmässigt (Matikainen, 2002). Utredning av autosomal nedärvning av defekta gener som ger upphov till ökad predisposition för prostatacancer ger oss en grund i att forska om de gener som ansvarar för tumöruppkomst i prostatan. För att kunna upprätta effektiva preventiva åtgärder måste orsakerna till uppkomsten av prostatacancer kartläggas.
I flertal epidemiologiska studier har indicier så som livsstil och dess kofaktorer visats ha en koppling till ökad risk för prostatacancer, detta då fattiga länder visats ha en högre prevalens av denna typ av cancer än mer välbärgade länder (Damber, 2000). Andra orsaker som visats eventuellt påverka tumöruppkomst är inflammatoriska reaktioner och kroniska inflammationer. Karcinom har otaliga gånger observerats i områden för inflammation (Lindmark, 2005). En vanlig studie om magsår visar att det ofta är orsakat av bakterien Helicobacter pylori, vidare har det observerats att bakterien har ett starkt samband med utvecklandet av magkarcinom (Diaconu, Predescu, Moldoveanu, Pop & Fierbințeanu-Braticevici, 2017). Dessutom har det påvisats att patienter som lider av inflammatoriska tarmsjukdomar, så som ulcerös kolit, orsakat av samma bakterie har en avsevärt större risk för mag- och tarmcancer (Arnold & Müller, 2016).
Inflammation i vävnader inducerar en komplex kaskadreaktion av kemiska signaler som även påbörjar fysiologiska processer för att kunna regenerera vävnaden på stället för inflammationen. En tidig respons vid uppkomst av en inflammation är en ökad permeabilitet i det vaskulära nätverket och en aktivering av immunförsvaret som stimulerar migration av leukocyter (Rossaint, Margraf & Zarbock, 2018). Migrationen av leukocyter till området för infektionen eller skadan medieras av sekretion av proteiner, såsom kemokiner, som skapar en kemisk gradient till området. En något fördröjd respons av immunförsvaret bidrar sedan till att makrofager dominerar i området där läkning ska ske för att
framskrida läkningsprocessen. Makrofager producerar och frigör anti-inflammatoriska cytokiner som ska bidra till att hämma inflammationen och stimulera regeneration av epitel. Normalt är inflammation själv-limiterande då de anti-inflammatoriska cytokiner, som makrofager utsöndrar, dämpar inverkan av pro-inflammatoriska cytokiner (Lindmark, 2005). En abnorm reglering av denna buffert-liknande process kan leda till prolongerad inflammation, så kallat kronisk inflammation.
Kroniska inflammationer kan orsakas av mikrober såsom bakterier och virus men bland annat även parasiter och kemiska irritationer (Lindmark, 2005). Det finns ett samband mellan kronisk inflammation och risk för associerad canceruppkomst, men man har även sett att inflammation kan ha en inhiberande effekt på tumörtillväxt (Korniluk, Koper, Kemona & Dymicka-Piekarska, 2016).
Makrofager, av typ M2, är immunceller som bidrar till uppbyggnad av ny vävnad och nya celler genom sin produktion av vissa inflammatoriska proteiner (Lewis & Pollard, 2006). Indicier har visat att
abnorma mängder med tumör associerade makrofager, som antingen kan ha M1 eller M2 fenotyp, leder till sämre utkomst hos patienter med tumörer (Erlandsson et al. 2018). Ansamling av dessa, tillsammans
3 med tillväxtfaktorer, androgener och reaktiva former av syre (ROS) och kväve, kan potentiera
onkogenes i området. Prostaglandiner i exempelvis prostataepitel ger även vid inflammation ett ökat uttryck av inflammatoriska cytokiner (Lindmark, 2005).
Cytokiner är små, lätta proteiner eller peptider som ofta är pro-inflammatoriska, har dessa även en kemoattraktant aktivitet kallas dessa för kemokiner. Kroppsegna celler producerar många olika cytokiner för att mediera signaltransduktionsvägar som resulterar i en indirekt biologisk effekt, som exempelvis kemotaxis (Prieto & Cotman, 2017). Ett kemokin som på senare tid börjat undersökas i samband med sjukdomsförlopp av olika typer av cancer är CC-kemokin med ligand typ 2 (CCL2). Innan kallades även detta cytokin för MCP-1 och det klassades då om ett monocyt kemotaktiskt protein, något man numera påvisat var en felaktig klassificering. CCL2 uttrycks av flertal olika celltyper och kan uttryckas tillfälligt eller kontinuerligt av bland annat endotel, epitel, myeloida stamceller och
fibroblaster. CCL2 är en kemoattraktant för monocyter, basofiler, T-lymfocyter, NK-celler och andra vita blodkroppar som ingår i kroppens immunförsvar (Lim, Yuzhalin, Gordon-Weeks & Muschel, 2016). Produktion av detta cytokinet initieras av inflammationsstimuli så som förekomst av cytokinet interleukin-1, interleukin-4, interleukin-6, TNAα eller tillväxtfaktorer så som TGFβ eller
makrofagstimulerande faktor (Gschwandter, Derler & Midwood, 2019). CCL2 styr rekrytering av immunceller till områden för inflammation och uttrycks därmed i påverkade vävnader för att reglera homeostatiska funktioner samt driva lymfocyter från blodet till området för infektion.
I patienter med kronisk inflammation har man sett ökade nivåer av CCL2 (Lindmark, 2005). CCL2 förekommer även i abnorma mängder hos de med reumatisk artros (Lim et al. 2016). I kliniska studier av prostataepitel hos patienter med prostatacancer har man även där sett en ökad
frisättning av CCL2 i både området för tumör men även i stromala celler utanför det direkta området för tumören (Borsig, Wolf, Roblek, Lorentzen, & Heikenwalder, 2014). Detta tyder på att det finns både parakrin och autokrin funktion hos cellerna som utsöndrar CCL2 i tumörmiljön. Parakrin funktion gör att celler kan skicka signalmolekyler till kringliggande celler och autokrin funktion gör att cellen som frisätter signalmolekyler själv reagerar på detta. In vitro försök utförda på möss visar att mängden CCL2 som bildas av osteoblaster från prostatatumörer har ett samband med bildandet av metastaser men att tillsatts av CCL2 neutraliserande antikroppar visade en dämpning av detta (Borsig et al. 2014). Dock är metastas ett komplext skede som gör att det är svårt att urskilja om det är just CCL2 som är den
viktigaste aktören i förloppet.
Den mest studerade funktionen hos CCL2 är CCL2-CCR2 signalering. CCL2 binder helst till CCR2 receptorer som finns uttryckt bland annat i blodet, hjärnan, hjärtat, bukspottskörteln och thymus (Lim et al. 2016). CCL2 har påvisats kunna produceras av både stromala celler, som exempelvis av bindvävsceller i prostatan, och cancerogena celler (Lim et al. 2016). Dessa har både direkt och indirekt påverkan på vävnaden. CCL2 kan rekrytera stromala celler som har pro-tumörogena aktiviteter på samma sätt som detta cytokinet kan rekrytera leukocyter till området. CCL2 förorsakar även ett direkt uttryck av metalloproteinas, så som MMP2 och MMP9, vilket ökar invasion och interaktion med
tumörassocierade makrofager (Lim et al. 2016). Det kan även indirekt främja angiogenes för cancerceller genom CCL2-CCR2 metastatisk kaskad. Det finns lite bevis för att CCL2 hämmar
cellcykeln men CCL2-CCR2 signalering har påvisats, i in vitro försök, rekrytera myeloida celler, såsom tumörassocierade makrofager för att driva angiogenes i vävnaden (Lim et al. 2016). På så sätt kan CCL2 stimulera proliferation av tumörceller.
Det har då även visats, i in vitro försök, att denna signalering leder till rekrytering av monocyter och makrofager samt att CCL2 kan mediera en differentiering av dessa makrofager till att få en M2 liknande fenotyp. I dessa fall har även en ökad mängd M2-makrofager återfunnits i vävnader från dessa försöksgrupper (Lim et al. 2016). Den ökade infiltration av M2-makrofager i vävnad har
observerats reducerats i försök där antikroppar som kan binda CCL2, och därmed fungera
neutraliserande på dessa, har injicerats i området. Detta ledde också till en minskad tumörassocierad angiogenes och en signifikant minskning av metastas ifrån området (Lim et al. 2016). Det finns tvetydiga bevis på hur CCL2 faktiskt påverkar cancerns progression, och man pratar därmed både om
4 CCL2s antiinflammatoriska egenskaper och deras proinflammatoriska funktioner som kan vara
associerade till onkogenes. Då man i fall med bröstcancer kunnat lyfta ett samband mellan CCL2 och ökad angiogenes samt ökad stimulering av själva cytokinet undrar man nu om CCL2 kan användas som en biomarkör för just bröstcancer och prostatacancer (Borsig et al. 2014).
Vid kirurgisk avlägsnande av prostata hos män med prostatacancer har mikrobiska fynd gjorts. I några av dessa fall har bakterien Cutibacterium acnes varit predominant i den undersökta vävnaden (Oleander,Radej, Plaza, Bar & Maciejewski, 2016). I vidare studier av cancerogent epitel från prostatan hos patienter med diagnosticerad prostatacancer har det visats vara hela två gånger större chans att finna C. acnes än att inte göra detta (Lindmark, 2005). Cutibacterium acnes är en bakterie som ingår i vår normalflora, och som uppträder opportunistiskt. Preliminära data har även visats att makrofager som odlas med C. acnes uttrycker en ökad nivå av mRNA som kodar för cytokiner som ex. CCL2 (Lim et al. 2016).
Cutibacterium acnes är en fakultativ anaerob, grampositivbakterie som producerar
propionsyra i slutet av sin fermentation. Slutprodukten är det som gav bakterien sitt föregående namn,
Propionibacterium acnes. Bakterien finns i normalfloran och återfinns oftast på huden, men har även
återfunnits bland annat i munhålan och i mag- och tarmkanalen hos människor. Den orsakar acne vulgaris men bidrar även till ett flertal infektioner av vävnader kring proteser (Davidsson, 2013). Det finns olika subtyper av bakterien och de två mest undersökta är typ I och typ II, som båda har en egen variant av recA-genen. Typ I finnes oftast i fall av just acne vulgaris medan typ II återfinns något oftare i infektioner av proteser i form av biofilm och postoperativa infektioner (Davidsson, 2013).
I en undersökning av män med prostatahyperplasi återfanns C. acnes i 35% av fallen (Oleander et al. 2016). Det har i andra undersökningar visats vara typ II av C. acnes som är prevalent i infektioner i prostatan (Cohen, Shannon, McNeal, Shannon & Garrett, 2005). Bakterien har uppvisats ha både hemolytiska och cytotoxiska egenskaper och kan undvika kroppens immunförsvar genom bildning av biofilm eller intracellulär invasion. Tidigare studier har även visat att bakterien bidrar till ökad cellproliferation, minskad produktion av E-cadherin, som binder samman vävnadsceller, samt en stark produktion av interleukin-6 (Weber et al. 2019). Detta ger en hög ökning av produktionen av reaktiva former av syre som i sin tur kan leda till felaktig metylering av DNA. Om denna metylering av DNA sker i pro-onkogener kan tumörsuppressorgener bli inaktiva och därmed förlora sin förmåga att minska tumörprogressionen (Davidsson, 2013).
ELISA är en kvantitativ immunoassay, metoden används vanligtvis för att detektera proteinnivåer. Metoden används mycket i kliniska laboratorier för att kvantifiera och detektera cancermarkörer eller antikroppar som kan tyda på infektioner eller autoimmuna sjukdomar.
Sandwichmetoden går ut på att binda proteiner till mikroplattor som är preparerade med stationära, monoklonala, antikroppar som har hög specificitet till det protein man önskar undersöka. Efter detta tillsätter man enzymbundna sekundära antikroppar som har hög specificitet för proteinet som undersöks. Ett substrat tillsätts och en enzymatisk reaktion kan ske som är proportionell mot mängden av det
undersökta proteinet.
Syftet med denna uppsats är att undersöka om makrofager behandlade med C. acnes uppvisar ökade nivåer av CCL2 proteiner än obehandlade makrofager. Om så är fallet kan infektioner av
C. acnes i prostatavävnad orsaka ett kraftigt inflammationstillstånd som eventuellt kan bidra till ökad
5
Material och metod
Odling av makrofager
Blod från tre stycken, anonyma, givare erhölls viaenheten för Klinisk immunologi och
transfusionsmedicin, Uppsala Universitetssjukhus (Uppsala, Sverige). Blodet från varje givare
centrifugerades med EDTA antikoagulant tills de vita blodcellerna separerades. Detta lättcellskoncentrat (Buffy-coat) innehållande givarnas leukocyter och trombocyter isolerades för att användas i försöket. Monocyter ifrån varje erhållet lättcellskoncentrat isolerades med hjälp av Ficoll® Paque Plus (GE Healthcare, Little Calfont, UK) genom att lättcellskoncentratet späddes med lika mängd PBS innehållande 3 mM EDTA samt Ficoll Paque Plus och centrifugerades vid 900 g i 30 minuter.
Fraktionen innehållande monocyter isolerades och späddes med lika mängd fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 3mM EDTA lösning och centrifugerades vid 500 g i 10 minuter. Pellet
innehållande celler löstes i PBS/EDTA lösning och cellsuspensionen tvättades 4 gånger med PBS/EDTA med upprepad centrifugering på 200 g i 10 minuter. Cellerna slammades i RPMI 1640 utan FCS. Sedan tillsattes 2 ml cellsuspension i var brunn i en cellkulturs platta med 6 brunnar (BD Bioscience, USA). Cellsuspensionen fick fästa i 1,5 timme innan plattorna tvättades med PBS 3 gånger. RPMI 1640 med 5% FCS och 1,5 mM L-glutamin tillsattes så att brunnarna var täckta och plattorna läts odlas över natten.
M0-makrofager erhölls efter odling av monocyter i RPMI 1640 med 20% FCS. Dag två tillsattes 1,5 mM L-glutamin samt 20 ng/ml makrofag stimulerande faktor (R&D systems, Minneapolis, USA) för att stimulera mognad. Under dag 5 tvättades cellerna 2 gånger med PBS och RPMI 1640 med tillsatts av 20% FCS, lika delar PEST och L-glutamin samt 20 ng/ml makrofag stimulerande faktor och odlades vidare till dag 8.
Behandling av makrofager med C. acnes
På dag 8 resuspenderades C. acnes i RPMI 1640 med 5% FCS, 1,5 mM L-glutamin och 20 ng/ml
makrofagstimulerande faktor och antal bakterier/ml bestämdes med hjälp av Bürker kammare. Makrofag kultiveringsplattan med 6 brunnar uppskattades innehålla 2 000 000 makrofager och 2 ml uppslammade bakterier (uppskattningsvis 20 000 000 bakterier) tillsattes med lika mängd RPMI 1640 utan PEST per brunn. Dessa odlades sedan i 48 timmar. Efter odling togs mediet, filtrerades genom ett 0,22µm filter och frystes i -70℃ fram tills dag för immunoassay.
ELISA/immunoassay
ELISA analys utfördes genom erhållet kit från R&D Systems® (Quantakine® ELISA, R&D Systems®, Minneapolis, USA). Proverna späddes med RD5L kalibreringsvätska i en seriespädning. Prover och standard preparerades enligt anvisningar. I varje brunn på medföljande mikroplatta med 96 brunnar tillsattes 100 µl av provlösning. I vissa fall tillsattes dubbla volymen, detta justerades för vid analys. Standarden tillsattes i varsin brunn utan replikat medan proverna utfördes i två replikat av samma koncentration. Placering noterades. Brunnarna inkuberades i 2 timmar i rumstemperatur.
Efter inkubering tvättades brunnarna 3 gånger med erhållen tvättnings buffert (R&D Systems®, Catalog # WA126) och torkades noggrant mellan var tvättning. Humant MCP-1/CCL2 adderades tills det läts täcka brunnarna. Brunnarna inkuberades i 1 timme. Brunnarna tvättades återigen i tre omgångar och torkades noggrant mellan varje tvättning. Vid överföring av proverna till mikroplattor användes multipipetter för att minimera eventuella tidsskillnader i tillsättningen.
Det tillsattes 200 µl substratlösning i varje brunn och plattan inkuberades i 30 minuter i mörker. Efter inkuberingstiden adderade 50 µl av stopp-lösning till varje brunn. Samtliga inkuberingar genomfördes i rumstemperatur vid skak när brunnarna var täckta med en plastfilm. Plattorna avlästes i en mikroplattläsare inställd på 450 nm med en korrektion på 570 nm. Resultat registrerades.
Samtliga undersökningar utfördes av Ann Erlandsson vid Fakulteten för hälsa, natur- och teknikvetenskap på Karlstads Universitet (Karlstads universitet, Värmland, Sverige) under våren 2020.
6
Statistisk analys
Mätvärdena från ELISA (Quantakine® ELISA, R&D Systems®, Minneapolis, USA) testades för att se om dessa var normalfördelade. Då dessa inte var normalfördelade transformerades mätvärdena genom att ta 10-logaritmen av dessa för att få en jämnare spridning av data. Medelvärdet för var givare togs på alla tre behandlingsformer så att tre mätvärden fanns för var behandling (n=9).
Analys av insamlade data utfördes i SPSS. Repeated measures ANOVA, med signifikansnivå 95%, användes för att jämföra medelvärde av mängd CCL2 för var typ av behandling. Mauchly´s test of sphericity användes för att se om datan var sfärisk och därmed om testet ansågs lämpligt. Vidare kollades det på pairwise comparison för att se mellan vilka behandlingar eventuella skillnader fanns.
Resultat
Medelvärdet av mängd proteiner för de olika typer av behandlingar var större hos de makrofager som behandlats med någon typ av C. acnes än hos de makrofager som var obehandlade (Fig. 1).
Medelvärdena hos de makrofager som behandlades med typ I av C. acnes var högre än hos de behandlade med typ II av bakterien.
Det påvisades en signifikant skillnad mellan de behandlade med typ I och de behandlade med typ II av bakterien (p=0,011) i avseende på medelvärde för alla givare. Analys av medelvärde för varje behandling hos alla givare tillsammans visade en icke-signifikant Mauchly´s test of sphericity (Mauchly´s W=0,109; fg=2; P=0,331) som innebär att data ej är sfärisk och därmed lämpar sig för testet. Repeated measures ANOVA visade en signifikant behandlingseffekt (F2,4=15,574; P=0,013). Med
pairwise comparison såg man att det fanns en signifikant skillnad mellan medelvärdet för den
obehandlade gruppen och de som blivit behandlade med typ I av bakterien (P=0,047) medan det inte var signifikant skillnad mellan den obehandlade gruppen och de som blivit behandlade med typ II
(p=0,110). Mellan medelvärdet på de behandlade med typ I och de behandlade med typ II fanns en signifikant skillnad i uttrycket av CCL2-proteiner (P=0,011).
Figur 1. Medelvärde av mäng CCL2 proteiner i pg/ml från ELISA-immunoassay angivet för alla tre givare för sig och för
alla tre behandlingstyper med standardavvikelse markerat.
7
Diskussion
Resultatet som framkom av studien är att typ I av C. acnes ökar makrofagers produktion av CCL2 tagna för samtliga givare tillsammans. Även när man kollar vardera givare för sig ser man en signifikant skillnad i nivåerna av CCL2 som produceras mellan den obehandlade gruppen och de behandlade med typ I av C. acnes. Vid analys av samtliga givare samtidigt ser man inte en signifikant skillnad i uttryck av CCL2 mellan de obehandlade makrofagerna och de behandlade med typ II av C. acnes. Kollar man på medelvärde för de behandlade med typ II av C. acnes är dessa dock högre än hos de obehandlade för var givare trots att ingen signifikant skillnad uppvisades.
I en tidigare studie visades det en betydligt högre ökning av CCL2 när makrofager behandlats med C. acnes (Drott, Alexeyev, Bergström, Elgh & Olsson, 2010). Avvikelsen med vårt resultat kan vara att det är något småskaligt. För att få ett resultat som liknar det i tidigare litteratur krävs upprepade försök, med fler replikat. Kollar man på resultatet som framgick när man tog alla givare samtidigt ser man att det är en signifikant skillnad i nivåerna av proteinet CCL2 mellan de obehandlade makrofagerna och de som blivit behandlade med typ I, men att de som blivit behandlade med typ II inte skilde sig signifikant från de obehandlade makrofagerna. Här är det då svårt att dra paralleller som tyder på att bakterien kan ha inverkan på nivån av CCL2 vid prostatacancer då det i föregående studier är typ II som återfunnits i cancerogen vävnad i prostatan (Cohen et al. 2005).
Vidare kan vårt resultat vara något felaktigt då proverna behövde spädas innan immuno-assay utfördes och några utav mätvärdena var bortom spannet för avläsning är det svårt att säga om resultatet faktiskt är en korrekt representation av uttrycket av CCL2 som makrofager får vid närvaron av
C. acnes. Vissa mätvärden var över den högre gränsen för avläsning medan några var under den lägsta
gränsen för avläsning. Den uppmätta koncentrationen kan därav vara något högre, eller något lägre, i samtliga prover och göra resultatet missvisande. Under försökets gång gick en av multipipetterna sönder, och mängden som tillsattes i brunnarna kan vara något varierande och därmed kan koncentrationerna som är avlästa vara något felvisande.
De relativt stora skillnaderna mellan medelvärdet för mängden CCL2 hos de olika givarna ger upphov till funderingar kring huruvida detta endast är slumpmässigt eller om det kan vara så att det är genetiska olikheter mellan givarna som påverkar resultatet. Då givarna är anonyma är det omöjligt att veta om dessa även kan ha livsstilsfaktorer, som exempelvis rökning, eller sjukdomshistorik, så som antibiotikaanvändning, som kan påverka resultatet. Ett upprepat försök med flera givare hade kunnat göra att man utesluter detta som en påverkande variabel eller att man kan minimera dess påverkan på resultatet. Detta är något som, enligt min vetskap, inte nämns i tidigare litteratur.
Studier som utförts för att undersökt vikten av bakterie-associerade canceruppkomst ger oss en bra grund för att undersöka detta vidare. I en tidigare undersökning av uppkomsten av
magkarcinom såg man att det endast var patienter som, under histologiska endoskopier, tidigare visats ha förekomst av bakterien Helicobacter pylori som senare utvecklat magkarcinom. Utifrån de som
undersökts som inte hade denna bakterie i sin mag-tarmkanal utvecklade ingen denna typ av cancer medan 2,9% av de som hade bakterien utvecklade magcancer (Uemura et al. 2001). I en undersökning utförd av Best et al (2018) påvisades även att det förekommit negativa testsvar hos patienter som i själva verket varit infekterade med bakterien Helicobacter pylori. Detta är intressant till den utförda studien då många män med okontrollerad celltillväxt i prostatan visats ha överflöde av C. acnes (Oleander et al. 2016). I undersökningen utförd av Oleander et al (2016) hade 35 % av patienter C. acnes i vävnad från prostatan medan 50% av männen inte visades ha någon patogen eller opportunistisk bakterie i undersökt vävnad. Detta indikerar att C. acnes ensamt inte är orsaken till uppkomst och progression av
prostatacancer om det inte är, som i undersökningen av Best et al (2018), falska negativa provsvar. Tidigare indicier stöttar en hypotes om att bakterien stimulerar en ökning av produktion av interleukin-6 (Davidsson, 2013). Interleukin-6 har även påvisats stimulera en ökad produktion av just CCL2 (Gschwandter et al. 2019). Detta gör att fortsatt forskning är relevant då man teoretiskt borde se ökade nivåer av cytokinet interleukin-6 i försök där makrofager behandlas med C. acnes. Det som skapar hinder här är möjligheten att utforma ett försök med rätt miljö för att kunna läsa av både nivåer av cytokinet interleukin-6 och nivåer av cytokinet CCL2. Man kan inte säga att ökade mängder CCL2
8 ensamt utgör en risk för att utveckla eller framskrida förloppet av prostatacancer. Cutibacterium acnes är en opportunistisk bakterie som har påvisats skapa och prolongera inflammationer med sin förmåga att bidra till ökad produktion av interleukin-6 samt sina hemolytiska och cytotoxiska egenskaper på värdcellen.
Det finns för lite studier utförda om hur CCL2 produktionen i makrofager påverkas av C.
acnes för att fastställa om resultaten är adekvata. Erhållna resultat och resultat från studien utförd av
Drott et al (2010) visar på att behandling med C. acnes ger ökade nivåer av CCL2. Och då behandlingen med C. acnes gav en effekt på produktionen av CCL2, och återfunnits i prostatavävnad, är det
fortfarande relevant att fortsätta med forskningen för att se om just CCL2 kan vara en adekvat biomarkör i prostatacancer som tidiga studier har haft som syfte att undersöka (Borsig et al. 2014).
Det hade varit av intresse att närmare undersöka om den makrofagstimulerande faktor som användes vid ELISA-metoden kan ha påverkat resultatet. Tidigare indicier har påvisat att makrofag stimulerande faktor bidrar till en ökad produktion av CCL2 (Gschwandter et al. 2019). Påverkan kan vara lika stor på varje prov och därmed vara en variabel man kan bortse från, detta då den skulle påverka mängden CCL2 som produceras lika mycket för varje prov. Däremot kan det vara gynnsamt att kolla om vardera givares makrofager reagerar lika på denna behandling vid utmognad av makrofagerna. Detta för att utesluta att resultatet uppvisar skillnader på grund av genetiska olikheter mellan givarna. Detta kan även gå att utesluta vid ett upprepat försök med flertal givare samt flertal replikat, men är något som kan påverka resultatet i denna studie då utförandet är något småskaligt.
Slutsatsen som kan dras ifrån det resultat som erhållits vid denna studie är att man kan se en ökning av makrofagers uttryck av CCL2 vid behandling med typ I av C. acnes. Det hade behövts upprepade försök för att kunna utesluta att typ II inte har samma påverkan då majoriteten av givares makrofager visade en signifikant högre produktion av CCL2 oavsett vilken typ av C. acnes som den behandlats med. Tidigare forskning om CCL2s proinflammatoriska egenskaper gör att detta mycket väl kan vara ett relevant resultat för att stötta teorier om bakterie-inducerade inflammatoriska tillstånd. Vidare kan man inte se ett samband mellan CCL2 och olika typer av cancer mer än att kolla på den ökade risken för uppkomst av cancer i inflammerad vävnad. Det behövs ytterligare forskning för att kunna kartlägga om CCL2 är en aktör i progression av cancer och huruvida CCL2 skulle kunna användas som biomarkör för cancerformer. Däremot kan hypotesen att förekomsten av C. acnes i vävnad skulle vara en bidragande faktor till progression av inflammation inte förkastas.
Tillkännagivande
9
Referenser
Arnold, I.C. & Müller, A. (2016) Helicobacter pylori: Does gastritis prevent colitis? Inflammatory
intestinal diseases, 1(3) 102-122 doi: 10.1159/000445985
Best, L. M., Takwoingi, Y., Siddique, S., Selladurai, A., Gandhi, A., Low, B., Yaghoobi, M., & Gurusamy, K. S. (2018). Non-invasive diagnostic tests for Helicobacter pylori infection. The
Cochrane database of systematic reviews, 3(3), doi: 10.1002/14651858.CD012080.pub2
Borsig, L., Wolf, M.J., Roblek, M., Lorentzen, A. & Heikenwalder, M. (2014)
Inflammatory chemokines and metastasis – tracing the accessory. Oncogene, 33(25), 3217–3224. doi: doi.org/10.1038/onc.2013.272
Cohen, R.J., Shannon B.A., McNeal, J.E., Shannon, T. & Garrett, K.L. (2005)Propionibacterium acnes associated with inflammation in radical prostatectomy specimens: A possible link to cancer evolution? The Journal of Urology, 173(6), 1969–1974. doi: 10.1097/01.ju.0000158161.15277.78 Damber, J.E. (2000) Diet sannolikt av stor betydelse för uppkomst av prostatacancer.
Läkartidningen, 97, 3475–3480. Hämtad 2020-04-20 från
https://www.researchgate.net/profile/Jan-Erik_Damber/publication/242515772_Diet_sannolikt_av_stor_betydelse_for_uppkomst_av_prosta tacancer/links/54b7b8450cf24eb34f6ed2b8.pdf
Davidsson, S. (2013) Infection induced chronic inflammation and its association with prostate cancer initiation and progression. Arbetsrapport från institutionen För Hälsovetenskap Och Medicin) Örebro, Örebro universitet
Diaconu, S., Predescu, A., Moldoveanu, A., Pop, C.S. & Fierbințeanu-Braticevici, C. (2017)
Helicobacter pylori infection: old and new. J Med Life, 10(2), 112-117. Hämtad 2020-05-05 från https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5467250/
Drott, JB., Alexeyev, O., Bergström, P., Elgh, F & Olsson, J. (2010) Propionibacterium acnes infection induces upregulation of inflammatory genes and cytokine secretion in prostate epithelial cells.
BMC Microbiology, 10(126) doi: 10.1186/1471-2180-10-126
Erlandsson, A., Carlsson, J., Lundholm, M., Fält, A., Andersson, S.O., Andrén, O & Davidsson, S. (2018) M2 macrophages and regulatory T cells in lethal prostate cancer. The Prostate, 1-7. doi:10.1002/pros.23742
Gschwandter, M., Derler, R. & Midwood K.S. (2019)
More than just attractive: how CCL2 influences myeloid cell behavior beyond chemotaxis.
Frontiers In Immunology, 10. doi: 10.3389/fimmu.2019.02759
Korniluk, A., Koper, O., Kemona, H. & Dymicka-Piekarska, V. (2016) From inflammation to cancer. Ir
J Med Sci, 186(1), 57-62. doi: 10.1007/s11845-016-1464-0
Lewis, C.E. & Pollard, J.W. (2006) Distinct role of macrophages in different tumor
microenvironments. Cancer Research, 66(2) doi:10.1158/0008-5472.CAN-05-4005
Lim, S. Y., Yuzhalin, A.E., Gordon-Weeks, A. N. & Muschel, R. J. (2016)
Targeting the CCL2-CCR2 signaling axis in cancer metastasis. Oncotarget, Open Access Impact
10 Lindmark, F. (2005) Prostate cancer and inflammatory genes. (Department of Radiation Sciences,
Oncology, Umeå University, nr. 2005:991. Doktorsavhandling, Umeå Universitet
Matikainen, M. (2002) Ärftlig prostatacancer. Finska Läkarsällskapets Handlingar, 162(1).
Hämtad 2020-03-30 från https://www.fls.fi/Site/Data/884/Files/fls/flsh102/FLsH_20021_s_30-34.pdf
Oleander, A., Radej, S., Plaza, P., Bar, K & Maciejewski, R. (2016) Propionibacterium acnes infection associated with cancerous prostate hypertrophy. Pol Arch Med Wewn, 126(9), 697-699. doi: 10.20452/pamw.355
Prieto, G.A. & Cotman, C.W. (2017) Cytokines and cytokine networks target neurons to modulate long- term potentiation. Cytokine Growt Factor Rev., 34. doi: 10.1016/j.cytogfr.2017.03.005
Quantakine® ELISA, R&D Systems®, Minneapolis, USA
Hämtad 2020-04-10 från https://www.rndsystems.com/products/quantikine-colorimetric-
sandwich-elisa?gclid=CjwKCAjwkun1BRAIEiwA2mJRWYMM9TF_G0yE_qyy8w0zqIafOB7kW6yGJ1mP aUEwQbRmtTVH36lixRoChmsQAvD_BwE
Rossaint, J., Margraf, A. & Zarbock, A. (2018) Role of platelets in leukocyte recruitment and resolution of inflammation. Front Immunol, 9. doi: 10.3389/fimmu.2018.02712
Uemura, N., Okamoto, S., Yamamoto, S., Matsumura, N., Yamaguchi, S., Yamakido, M., Taniyama, K., Sasaki, N. & Schlemper, R.J. (2001) Helicobacter pylori infection and the development of gastric cancer. N Engl J Med, 345, 784-789. doi: 10.1056/NEJMoa001999
Weber, N., Biehler, K., Schwabe, K., Haarhaus, B., Quirin, K.W., Fran, U., …. Wölfle, U. (2019) Hop extract acts as an antioxidant with antimicrobial effects
against propionibacterium acnes and staphylococcus aureus. Molecules, 24(2), 223. doi: 10.3390/molecules24020223
