Pathfinder
®Herpes Simplex-Virus Typ 1 och 2 25215 • 50 test
För identifiering och typning av Herpes Simplex-virus i direkt kliniska prov och cellkulturisolat.
INNEHÅLLSFÖRTECKNING
ordlista ... 1
syfte... 142
översikt... 142
testprincip ... 143
testreagens ... 143
varningar och försiktighetsåtgärder ... 145
provtagning och förberedelser... 145
testförfarande... 149
kvalitetskontroll ... 150
utvärdering av resultat ... 151
begränsningar ... 153
förväntade värden ... 154
särskilda egenskaper ... 154
referenser ... 159
SYFTE
Pathfinder® direkt antigendetektionssystem för herpes simplex-virus (HSV) typ 1 och 2 använder en direkt fluorescensteknik för identifiering och typning av herpes simplex-virus i direkta kliniska prov och cellkulturisolat.
Det är nödvändigt att provtagning för direkta kliniska prov och prov för cellodling sker samtidigt. Alla direkt kliniska prov som är negativa eller med otillräcklig cellkvalitet ska bekräftas genom uppföljningstest av cellkulturisolat.
ÖVERSIKT
En laboratoriediagnos på HSV-infektion har på flera sätt betydelse för behandlingen av patienten. En specifik HSV-diagnos kan leda till snabb behandling med lämpligt antiviralt medel (1, 2, 3). Förutom att ge information om behandling, kan en specifik diagnos användas för att förhindra HSV-infektion. Hos vissa gravida kvinnor med aktiv HSV vid tiden för förlossning kan kejsarsnitt minska sannolikheten för att viruset överförs till det nyfödda barnet (4).
HSV-typning har potentiell betydelse för prognos, behandling och epidemiologi. Genitala infektioner av HSV typ 2 (HSV-2) har en högre återfallsfrekvens än genitala infektioner av HSV typ 1 (HSV-1) (5). Dessutom kan HSV-1 och HSV-2 ge olika gensvar på behandling (6). Vissa epidemiologiska studier har påvisat ett samband mellan HSV-2 och livmoderhalscancer (7). Andra studier har emellertid redovisat motsatta resultat (8), varför ytterligare forskning krävs för att detta samband ska kunna vederläggas eller uteslutas. HSV-typning kan även ha betydelse för andra epidemiologiska studier av HSV-infektion.
Den för närvarande accepterade metoden för identifiering av HSV är isolering av virus i cellkultur. Metoder för cellodling amplifierar små viruskvantiteter, men kräver 1–7 dagar för att kunna utvärderas (9). Odlings- bekräftelse och typningsmetoder inbegriper biologiska tekniker som till exempel plackbildning i kycklingembryoceller (9), immunologiska tekniker som använder polyklonala antisera mot HSV-1 och HSV-2 (9) samt endonukleasrestriktionsanalys (10). Det främsta problemet med immunologisk testning, till exempel neutralisation, immunofluorescens och immuno-peroxidas, är korsreaktivitet med konventionella polyklonala antisera. Endonukleasrestriktionsanalys är en tillförlitlig teknik för typning, men den är tidskrävande och kräver betydande teknisk kunskap hos användaren.
Senare tids utveckling inom framtagning av monoklonala antikroppar har resulterat i antikroppar som är högspecifika för HSV-1 och HSV-2.
Effektiviteten hos dessa antikroppar för diagnostisering av HSV-infektioner har bevisats i kliniska prövningar (11, 12). Pathfinder® direkt antigendetektionssystem för herpes simplex-virus använder fyra monoklonala antikroppar som konjugerats med fluorescein för identifiering
och typning av HSV i direkt kliniska prov och isolat från cellkultur. Detta test kombinerar specificitet och reproducerbarhet hos monoklonala antikroppar med snabbhet och enkelhet hos ett direkt fluorescenstest. En sannolik identifiering och typning av HSV kan utföras inom en timme efter att ett kliniskt prov erhållits. Direkt kliniska prov som är negativa eller med otillräcklig cellkvalitet, kräver uppföljningstestning genom virusisolering.
Det är därför nödvändigt att ta prov för virusisolering och direktpåvisning samtidigt. Testet är ett enkelt och tillförlitligt alternativ till endonukleasrestriktionsanalys för typning av virusisolat från cellkultur.
TESTPRINCIP
Detta test använder fyra monoklonala antikroppar som konjugerats med fluorescein (2 HSV-1, 2 HSV-2) för identifiering och typning av herpes simplex-virus. Antikropparna mot HSV-1 reagerar med polypeptider som har en ungefärlig molekylvikt på 150 000 respektive 85 000 dalton. En antikropp mot HSV-2 reagerar med polypeptider som har ungefärliga molekylvikter på mellan 43 000 och 50 000 dalton. Den andra antikroppen mot HSV-2 reagerar med en polypeptid som har en ungefärlig molekylvikt på 79 000 dalton. De monoklonala antikropparna mot HSV-1 och HSV-2 tillsätts till separata brunnar på ett objektglas som innehåller provet, och reagerar med virusantigen i infekterade celler. Obunden antikropp avlägsnas i ett tvättsteg.
Celler som är infekterade med HSV visar i fluorescensmikroskop en specifik äppelgrön fluorescens mot en röd (kontrastfärgad) bakgrund.
TESTREAGENS För in vitro-diagnostik.
Endast för professionellt bruk Förvara antikroppar och kontrollobjektglas vid 2–8 °C.
Förvara fosfatbuffrad koksaltlösning vid 2–26 °C.
När förpackningarna har öppnats är samtliga reagenser stabila fram till utgångsdatumet på etiketten, så länge de förvaras vid angiven temperatur och saknar synliga tecken på kontaminering. Om det finns anledning att misstänka olämplig förvaring eller hantering av kittet under transport skall testet utföras med enbart positiva och negativa kontroller. Observera med tanke på oväntade resultat.
1. Monoklonal antikropp mot HSV typ 1, 2,5 mL 2. Monoklonal antikropp mot HSV typ 2, 2,5 mL
Varje flaska innehåller 2,5 mL fluoresceinkonjugerad musantikropp mot HSV-1 eller HSV-2 med Evans Blue kontrastfärg, bovint serumalbumin, en hämmare av icke-specifik färgning och 0,1 % natriumazid. Den flytande antikroppen är arbetslösningen. Spädning av antikroppen minskar testets känslighet. Tecken på eventuell försämring:
• Grumlighet eller bottensats i flaskan.
• Förändring av förväntad reaktivitet med positiva och negativa kontroller.
3. Fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,3 ± 0,10, 11,34 gm, 2 flaskor, katalognr 31098
Varje flaska innehåller 11,34 g fosfatbuffrad saltlösning som beretts med dibasiskt natriumfosfat, monobasiskt natriumfosfat och natriumklorid.
Lös upp innehållet i 1 flaska med destillerat vatten till en slutlig volym på 1 liter. Pulveriserat PBS har obegränsad hållbarhet vid förvaring i 2-26 °C. I lösning är det stabilt i 3 månader vid förvaring i 2–26 °C.
Tecken på eventuell försämring:
• Förändrat pH.
• Grumlighet,vilket kan tyda på mikrobiell kontaminering.
OBS! Byt inte ut reagens mot reagens från andra tillverkare och använd ej reagens efter sista förbrukningsdatum.
Nödvändigt extra material, tillgängligt hos Bio-Rad
1. Pathfinder® kontrollobjektglas, 5 objektglas, katalognr 12000150 Varje objektglas har 1 brunn vardera med Vero-celler som infekterats med HSV-1 (American Tissue Culture Collection (ATCC) stam F(1)) och HSV-2 (ATCC stam MS) och 2 brunnar med oinfekterade Vero-celler.
Det fixeringsförfarande som används vid framställning av dessa objektglas har visat sig inaktivera HSV. Ta ut ett objektglas från kylskåpet före varje test. Låt objektglaset anta rumstemperatur i foliepåsen. En förändring av den förväntade reaktiviteten med HSV- antikropparna kan vara ett tecken på försämring.
VARNING! Håll objektglasen i kanten vid hantering. Tryck inte på foliepåsen.
2. Pathfinder® monteringsmedium, 2,75 ml, katalognr 30693
Varje flaska innehåller 2,75 ml Tris-buffrad glycerollösning med en fotoblekningsfördröjare och konserveringsmedel. Tecken på eventuell försämring visas genom en ändring av förväntad reaktivitet med positiva och negativa kontroller eller en ökad grön bakgrund på kontrollobjektglasen.
Pathfinder® Mounting Medium har utvecklats särskilt för att komplettera fluorescerande antikroppar i Pathfinder®-serien. För optimala resultat måste detta monteringsmedium användas vid utvärdering av direkta prover och cellodlingsisolat med hjälp av Pathfinder®-kitet.
Valfritt material, tillgängligt hos Bio-Rad
1. Pathfinder® HSV DFA Collection Slides (90 glas), katalognr 30494 2. Monoklonal antikropp mot HSV typ 1, 5 mL, katalognr 30490 3. Monoklonal antikropp mot HSV typ 2, 5 mL, katalognr 30491
VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER Reagens innehållande natriumazid
VARNING—Antikropparna innehåller 0,1 % natriumazid (NaN3).
Natriumazid kan reagera med bly- och kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Spola med stora mängder vatten så att aziduppbyggnad förhindras när vätska hälls ut. Ytterligare information finns i den handbok (Safety Management No. CDC-22) som ges ut av Centers for Disease Control (13). Bortskaffa produkt- och förpackningsavfall i enlighet med alla tilllämpliga lokala, regionala och nationella bestämmelser.
Säkerhetsdatablad finns på bio-rad.com och på begäran.
Kontrollobjektglas
Den fixeringsprocess som används i framställningen av Pathfinder® Control Slides har visat sig inaktivera HSV. Hantera och omhänderta likväl glasen som potentiellt smittsamt material.
Patientprov
Följ vedertagna säkerhetsrutiner för biologiskt riskmaterial vid insamling och bearbetning av Chlamydia-prov. Men dessa produkter bör handhavas som potentiellt smittsamma enligt normala försiktighetsåtgärder och god laboratoriepraxis, oavsett ursprung, behandling eller tidigare certifiering.
Tillämpa Standard og Universella försiktighetsåtgärder. Hantera dessa reagenser, allt humanblod och alla humanprov som om de kan överföra infektionssjukdom, i ett laboratorium med biologisk säkerhetsnivå 2, enligt riktlinjerna från gällande CDC/NIH Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories17 (biologisk säkerhet i mikrobiologiska och biomedicinska laboratorier), WHO Laboratory Biosafety Manual18 (Laboratoriet biosäkerhet Manual) eller motsvarande. Förvara och kasta material och använda behållare i enlighet med lokala föreskrifter och riktlinjer.
Virusisolering
Endast laboratorier med erfarenhet av vävnadsodling för virusisolering ska utföra isolering av HSV.
PROVTAGNING OCH FÖRBEREDELSER
Provtagningen har mycket stor betydelse för identifiering och typning av herpes simplex-virus. Personal som tar HSV-prov ska vara välutbildad för att minimera risken för prover av dålig kvalitet . Följande tillvägagångssätt rekommenderas vid provtagning från orala, genitala, hud- eller cervikala lesioner. Ytterligare information om provtagning kan erhållas från en referens om virologiteknik (9).
H303: Kan vara farligt vid förtäring.
H313: Kan vara farligt vid hudkontakt.
P312: Vid obehag, kontakta GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller läkare.
VARNING! Följ institutionens säkerhetsrutiner för biologiskt riskmaterial vid insamling och bearbetning av HSV-prov. Behandla prov och allt material som kommit i kontakt med prov som potentiellt smittsamt och omhänderta det på lämpligt sätt. Använd lämpligt desinfektionsmedel för sanering. Munpipettera ej. Undvik aerosolbildning. Mer information om hur laboratorieinfektioner förhindras finns i referens 14.
Provtagning (orala, genitala, hud-, eller cervikala lesioner) för direktpåvisning och virusisolering
Material som behövs men ej medföljer:
1. Steril 27G nål (för öppning av en oral, genital eller hudvesikel eller för att ta bort skorpa från en torkad lesion).
2. Steril tork (för borttagning av var från en sårig lesion).
3. Provtagningsmaterial
• Sterila torkar
Använd torkar som ej hämmar tillväxt av HSV eller cellkultur. Använd ej kalciumalginattorkar eftersom de kan hämma tillväxt av HSV (15).
• Transportmedium, 0,5–1 mL
Använd transportmedium som ej hämmar tillväxt av HSV eller cellkultur.
• Mikroskopobjektglas av glas
Använd objektglas som stämmer överens med följande specifikationer:
• brunndiameter – 7–10 mm,
• minimiavstånd mellan brunnar – 5 mm,
• antal prov per objektglas – ett.
Markera 2 brunnar på släta objektglas med en vax- eller etsningspenna.
• Aceton av HPLC-kvalitet Förvaras i glasbehållare.
• Behållare för transport av prov till laboratoriet
• Mikroskopobjektglasbox av standardtyp för förvaring av objektglas Tillvägagångssätt för provtagning
Obs! Var noga med att ej kontaminera provtagningsstället när provet tas.
1. Använd penna och märk objektglaset med patientens namn eller ID- nummer. Placera objektglaset på en vågrät yta.
2. Följ respektive anvisningar nedan och frilägg lesionens bas. Stör inte lesionens bas. Kassera torken eller nålen i behållare för biologiskt riskavfall.
OBS! Prov från vesikulära lesioner föredras framför såriga eller torkade lesioner, eftersom viraltiter minskar efter hand som lesionen bildar sår, skorpa och läker.
• Vesikulär lesion – Öppna en cervikal lesion med en steril tork. Öppna orala, genitala och hudlesioner med en steril 27G nål.
• Sårig lesion – Avlägsna eventuellt var från lesionen med en steril tork.
• Torkad lesion – Lyft bort skorpan från lesionen med en steril nål.
3. Tag prov för respektive virusisolering och direktpåvisning från infektionsstället.
OBS! Undvik att få med blod när lesionens bas skrapas med torken.
Antikroppar som förekommer i serum kan blockera virala antikroppsbindningsställen eller hämma virusreplikation i cellkultur.
Provtagning för virusisolering
Skrapa lesionens bas med en steril tork och placera torken omedelbart i ett transportmedium för cellodling.
Provtagning för direktpåvisning
a. Skrapa lesionens bas kraftigt med en andra, steril tork. Det direkta kliniska provet ska innehålla infekterade celler från lesionens bas.
b. Rulla torken ordentligt på objektglasets 2 brunnar så att båda brunnarna täcks men överskrid inte brunnens omkrets. Stryk inte ut torken på brunnen eftersom det kan orsaka ökad celldistortion.
c. Undersök objektglaset makroskopiskt med avseende på korrekt celltäckning. Upprepa steg 3b om brunnarna inte verkar ogenomskinliga. Kassera torken i en behållare för biologiskt riskavfall.
d. Låt provet lufttorka helt i 5–10 minuter. Om provet inte är torrt, kan celler tvättas bort från objektglaset vid fixeringen.
e. Flöda objektglaset med 0,5 mL aceton och låt det avdunsta helt.
4. Skicka proverna till laboratoriet för omedelbar bearbetning. Undvik exponering för extrema temperaturer vid transport av prover. Om proven inte kan bearbetas inom 4 timmar ska nedanstående förvaringsanvisningar följas:
a. Placera objektglaset med det direkta provet i en förvaringsbox för objektglas. Förvara både objektglas för direktpåvisning och virusisoleringsprovet vid 2–8 °C i högst 24 timmar.
b. Vid längre förvaring:
• Frys cellodlingsprovet i –70 °C. Undvik upprepad frysning och tining. Cellodlingsprovet får inte förvaras i –20 °C.
• Förvara objektglaset med det direkta provet i en förvaringsbox för objektglas i –20 °C i högst 72 timmar.
Bearbetning av prov för virusisolering Material som behövs men ej medföljer 1. Cellodlingslinje
• Använd en cellodlingslinje som är mottaglig för HSV-infektioner, t.ex.
humana diploidfibroblaster, primär kaninnjure, human embryonjure eller apnjure (Vero).
OBS! Valet av cellodlingslinje kan inverka på känsligheten för HSV-isolering genom cellodling.
2. Cellodlingskontroller
• Negativ kontroll – cellodling som inokulerats med transportmedium.
• Positiva kontroller – cellodlingar som inokulerats med kända stammar av HSV-1 och HSV-2. Stammar av HSV-1 och HSV-2 för beredning av kontroller kan erhållas från ATCC, ATCC.org.
Mer information om cellodlingskontroller finns i avsnittet Kvalitetskontroll i bipacksedeln.
3. Andra leverantörer av och utrustning för cellodling – odlingsmedia, odlingsrör etc.
4. Pasteur-pipetter
5. Centrifug med kapacitet för 500 X G 6. Mikroskopobjektglas av glas
Se föregående avsnitt beträffande specifikationer.
7. Färgningsskål eller Coplin-behållare för fixering av objektglas 8. Kall aceton (2–8 °C)
9. Mikroskopobjektglasbox av standardtyp för förvaring av objektglas Tillvägagångssätt för preparering av objektglas från virusisolering.
OBS! Bearbeta patientprover och cellodlingskontroller på samma sätt.
1. Följ en fastställd metod för isolering av HSV i cellkultur (9).
2. När infektionen når 2-3+ cytopatogen effekt (CPE), dekanteras mediet från odlingsröret och ersätts med 1,0 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
3. Skrapa celler från röret med en Pasteur-pipett av glas.
4. Centrifugera cellsuspensionen vid 500 X G i 5 minuter.
5. Aspirera eller dekantera supernatanten eller resuspendera cellpelleten i 50 μL PBS.
6. Märk patient-/kontrollobjektglaset. Överför lika volymer till 2 brunnar på objektglaset och låt lufttorka ordentligt i 10–20 minuter. (Faktisk torkningstid beror på rumstemperatur och luftfuktighet.) Om provet inte är torrt, kan celler tvättas bort från objektglaset vid fixeringen.
7. Undersök objektglaset makroskopiskt med avseende på korrekt celltäckning. Brunnarna ska se grumliga ut.
8. Fixera objektglaset i 10 minuter i en färgningsskål fylld med kall aceton (2–8 °C). Låt objektglaset lufttorka ordentligt.
9. Testa objektglaset med avseende på HSV så snart som möjligt. Om nödvändigt kan objektglaset förvaras i högst 24 timmar vid 2–8 °C eller i 72 timmar vid –20 °C.
TESTFÖRFARANDE Tillhandahållet material
1. Monoklonal antikropp mot HSV typ 1 2. Monoklonal antikropp mot HSV typ 2 3. Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) Material som behövs men ej medföljer
1. Pathfinder® HSV kontrollobjektglas – Bio-Rad Laboratories katalognr 12000150.
2. Pathfinder® monteringsmedium – Bio-Rad Laboratories katalognr 30693.
3. Destillerat eller avjoniserat vatten.
4. Cellodlingskontroller – behövs endast vid testning av isolat från cellkultur. Prepareras enligt anvisningarna i avsnittet Provtagning och förberedelse.
5. Fuktkammare.
6. Tvättflaska av plast.
7. Coplin-behållare eller färgningsskål för tvättning av objektglas.
8. Magnetomrörare (option).
9. Täckglas, 24 mm x 60 mm – Bio-Rad Laboratories katalognr 102610.
10.Fluorescensmikroskop – Granska prov som färgats med fluorescein- isotiocyanat med hjälp av ett filtersystem som ger en excitationsvåglängd på 480–490 nm och en emissionsvåglängd på 510 nm eller högre.
Mikroskopfiltrens och ljuskällans typ och tillstånd kan påverka fluorescensreaktionens intensitet.
Tillvägagångssätt för fluorescensanalys 1. Bered PBS enligt beskrivningen på sidan 144.
2. Ta ut patient- och kontrollobjektglasen från kylskåp eller frys. Låt patient- och cellodlingskontrollobjektglasen anta rumstemperatur i förvaringsbehållarna (5–10 minuter). Låt Pathfinder® kontrollobjektglas anta rumstemperatur i foliepåsen (5–10 minuter).
OBS! I bipacksedelns avsnitt Kvalitetskontroll rekommenderas lämpliga kontroller för testning av direkta kliniska prov och isolat av cellkulturer. Se sidan 150.
3. Ta ut patient- och cellodlingskontrollobjektglasen ur förvaringsbehållarna och märk den första brunnen på varje objektglas med HSV-1 och den andra brunnen med HSV-2. Ta ur Pathfinder® kontrollobjektglas ur foliepåsen. Placera samtliga objektglas i fuktkammaren.
4. Tillsätt en droppe (cirka 30 μL) monoklonal antikropp mot HSV-1 i den första brunnen och en droppe monoklonal antikropp mot HSV-2 i den andra brunnen på varje patient- och cellodlingskontrollobjektglas.
Tillsätt en droppe av lämplig monoklonal antikropp till varje brunn på Pathfinder® kontrollobjektglas. Täck varje brunn helt med antikropp.
OBS! Om HSV-1- och HSV-2-antikroppar kombineras vid undersökning av HSV, minskas testets känslighet.
5. Täck fuktkammaren och inkubera objektglasen i rumstemperatur i 30 minuter. Antikropparna får inte torka på objektglasen.
6. Skölj varje objektglas försiktigt med en stråle PBS. Håll strålen ovanför brunnarna så att PBS sköljer över varje brunn. Rikta ej strålen direkt på brunnarna.
7. Tvätta objektglasen i 10–15 minuter i en Coplin-behållare eller färgningsskål fylld med PBS. Byt buffert en gång under denna tid. Skaka färgningsskålen försiktigt flera gånger eller använd en magnetomrörare under tvätten.
8. Tag upp alla objektglasen från PBS-badet och låt dem torka en kort stund på en pappershandduk. Tillsätt 3–4 droppar monteringsmedium per objektglas. Lägg försiktigt över täckglaset och ta bort eventuella luftbubblor.
OBS! Använd alltid Pathfinder® monteringsmedium – Bio-Rad Laboratories katalognr 30693.
9. Undersök objektglasen under ett fluorescensmikroskop med en total förstoring på 100–400X. Om nödvändigt kan objektglasen förvaras mörkt vid 2–8 °C och avläsas inom 24 timmar.
KVALITETSKONTROLL Testning av direkt kliniska prov
Verifiera fluorescensmetoden och mikroskopets prestanda genom att inkludera ett Pathfinder® kontrollobjektglas för varje analysomgång av prover för direktpåvisning.
Testning av isolat av cellkulturer
När isolat av cellkulturer testas med avseende på HSV, ska ett Pathfinder® kontrollobjektglas och ett objektglas för negativ odlingskontroll analyseras i
varje omgång. Pathfinder® kontrollobjektglas verifierar prestandan för fluorescenstekniken och mikroskopet. Den negativa odlingskontrollen testar kontaminering av cellkulturen och underlättar tolkning av patientresultat.
Med varje nytt parti celler eller HSV-antikroppar ska två objektglas med positiva odlingskontroller utvärderas, ett innehållande HSV-1-infekterade celler och ett innehållande HSV-2-infekterade celler. Dessa objektglas verifierar prestandan hos cellodlingssystemet och tillhandahåller följande kontroller som underlättar tolkning av patientresultat:
• Positiva HSV-1- och HSV-2-kontroller.
• Utför intertypning av specificitetskontroller för de monoklonala antikropparna (HSV-1-infekterade celler som färgats med HSV-2- antikropp och vice versa bör vara negativa).
OBS! Cellodlingskontroller underlättar tolkning av patientresultat eftersom:
• De visar positiva och negativa reaktioner på den cellinje som används för patientprov.
• Prepareringen av objektglas från kontroll- och patientkulturer är identisk.
Beskrivningar av kontrollreaktioner finns i avsnittet Resultat i denna bipacksedel. Upprepa testet om kontrollerna inte uppvisar korrekt reaktivitet.
UTVÄRDERING AV RESULTAT
Avläs kontrollobjektglasen först. Om kontrollerna uppvisar korrekt reaktivitet, kan patientobjektglasen tolkas. Upprepa testet om kontrollerna inte reagerar korrekt. Nedan följer beskrivningar för positiva och negativa resultat.
OBS! Evans Blue kontrastfärg färgar oinfekterade celler och bakgrunden till infekterade celler röd. Mörkgrön färgning av hela celler är icke-specifik. Ignorera färgning av extracellulära fragment.
Positiva resultat
Ett positivt prov uppvisar specifik äppelgrön fluorescens. Celler som är infekterade med HSV-1 uppvisar i allmänhet cytoplasmatisk färgning.
Celler som är infekterade med HSV-2 kan färga cytoplasman, cellkärnan eller båda, beroende på infektionscykelns stadium. När infekterade celler (oberoende av HSV-typ) är rundade, kan cellkärnan tyckas färgad på grund av att den täcks av cytoplasma. Enbart färgningsmönstret är inte någon indikator på HSV-typning. Tolkning av positivt prov och typ måste fastställas genom utseendet på en specifik fluorescensreaktion med en av de monoklonala antikropparna. Icke-specifik färgning kan visa sig som icke-cellulär fluorescens eller som en gul eller vit färg i stället för den förväntade äppelgröna.
Positivt kontrollprov
Det sätt på vilket kontrollobjektglas bearbetas kan orsaka morfologiska skillnader i cellerna. Celler som har växt på ett täckglas eller en objektglasbrunn (som till exempel Pathfinder® kontrollobjektglas) ser i allmänhet utdragna ut. Celler som skrapats från odlingar och placerats på objektglas (som till exempel odlingskontrollobjektglas) ser rundade ut. Ett acceptabelt positivt kontrollprov ska innehålla minst 10 celler som uppvisar specifik fluorescens per lågeffektfält.
Positivt patientprov
Ett patientprov som innehåller en eller flera celler (icke-ytliga epitelial- eller odlingsceller) som uppvisar äppelgrön fluorescens i HSV-1- och/eller HSV- 2-brunnen anses positivt. Blandinfektioner med celler som är infekterade med såväl HSV-1 som HSV-2 kan förekomma. Placera cellodlingsisolaten på 2 separata objektglas före testning med respektive antikropp,för att utesluta korskontaminering.
Negativa resultat
Negativa prover uppvisar ingen specifik fluorescens. Cellerna färgas röda till följd av kontrastfärgningen. Prov som saknar tillräckligt antal icke-ytliga epitelceller eller kulturceller ska anses bristfälliga och ej tolkningsbara.
Resultat från negativ kontroll
Ett acceptabelt negativt kontrollprov måste innehålla minst 50 celler per brunn och får inte uppvisa någon specifik fluorescens. Objektglas som innehåller färre än 50 celler är otillräckliga för bestämning av ett negativt HSV-resultat. Den icke-specifika färgningen av objektglaset ska vara minimal.
Negativa patientprover
Ett acceptabelt direkt prov måste innehålla minst 10 icke-ytliga epitelceller.
Ett acceptabelt kulturprov måste innehålla minst 50 celler per brunn. Dessa prov anses negativa för HSV om både HSV-1- och HSV-2-brunnen innehåller tillräckliga celler för tolkning och ingen av brunnarna uppvisar specifik fluorescens. Viss icke-specifik färgning av celler och fragment kan förekomma.
OBS! Prov för direktpåvisning som är negativa eller med otillräcklig cellkvalitet, kräver uppföljningstestning med cellodling.
BEGRÄNSNINGAR
1. Om antikropparna torkar på objektglaset under inkubering, kan mönstertolkningen bli svår och resultaten kan bli ogiltiga.
2. Utvärdering av prov med ett av antikroppsreagensen utesluter inte möjligheten av en infektion med den andra HSV-typen. Därför ska prover utvärderas med båda antikroppsreagensen.
3. Icke-specifik bakgrundsfärgning av patientprov kan bero på en film på objektglaset eller på att acetonfixativet absorberat vatten.
4. Möjliga lösningar kan vara att:
• Skölja objektglas i aceton (5–10 minuter) och låta dem torka ordentligt före användning eller att använda de objektglas som medföljer i Pathfinder® provtagningssats.
• Prova med en ny flaska aceton och hålla den väl försluten.
5. Prestanda för detta test på patientprov som tagits under eller efter antiviral behandling är inte känd.
6. Ett objektglas som preparerats från ett direkt kliniskt prov kan ha otillräcklig cellkvalitet för identifiering av HSV. I sådana fall är det nödvändigt med en parallell virusisolering, med efterföljande identifiering och typning genom fluorescenstestning. Nedanstående steg vid provtagning och förberedelse är mycket viktiga för att erhålla fullgoda prover:
• Ta prov från tidiga vesikulära lesioner.
• Skrapa lesionens bas tillräckligt kraftigt för att icke-ytliga epitelceller ska erhållas.
• Rulla torken för det direkta provet kraftigt på objektglaset för att erhålla tillräcklig celltäckning.
7. Om HSV-isolering via cellodling ska lyckas, måste provtagning, transport och förberedelse utföras korrekt. Endast laboratorier med erfarenhet av cellodling för virusisolering ska utföra isolering av HSV. Ett negativt odlingsresultat utesluter inte möjligheten för en HSV-infektion hos patienten. Testet ska tolkas i kombination med en klinisk bedömning av patienten och övriga labresultat.
8. Mer information om testets känslighet i olika provtagningssituationer finns i avsnittet Särskilda egenskaper i denna bipacksedel. Det finns inte tillräckliga uppgifter för att stödja användning av detta test i andra situationer.
9. De kliniska aspekterna för att använda detta test med prover från asymtomatiska patienter är inte kända.
10.Detta test kan påvisa icke livsdugligt (odlingsnegativt) HSV eller HSV- antigen från direkt kliniska prov.
11.Resultat från direkta prov ska inte användas som enda medel för diagnostisering av HSV när ett kejsarsnitt övervägs. Tidigare odlingsresultat (om sådana är tillgängliga) och bästa kliniska bedömning måste råda.
FÖRVÄNTADE VÄRDEN
Information finns under punkt 1a, 1b och 2a i avsnittet Särskilda egenskaper. Förväntade värden kan variera beroende på den patientpopulation som testas.
SÄRSKILDA EGENSKAPER 1. HSV-identifiering
Jämförelse mellan Pathfinder® HSV-reagens och cellodlingsmetoder a. Direktpåvisning i kliniska prov
Företagsinterna studier som genomfördes av två oberoende bedömare användes för att utvärdera förmågan hos Pathfinder®- reagens att identifiera HSV i direkt kliniska prover. De oberoende studieställena var en delstatshälsoklinik i västra USA och en storstadsklinik för STD i Mellanvästern, USA. Prov för den företagsinterna studien erhölls från ett barnsjukhus i östra USA.
Proverna togs från vuxna och barn som sökte vård för lesioner som kunde tyda på HSV-infektion.
Man samlade prover från varje patient och sände dem till laboratoriet för virusisolering och preparering av direkta prov på objektglas. De oberoende bedömarna bearbetade och utvärderade direkta provobjektglas samt gjorde virusisolering på prover som samlats på deras institution. Direkta prover från barnsjukhuset i östra USA bearbetades och utvärderades på institutionen. Barnsjukhuset utförde även virusisolering på dessa prover.
Alla deltagare använde humana fibroblaster för cellodling. Positiva cellodlingsresultat bekräftades genom att objektglas preparerades från positiva kulturer (2-3+ CPE) och testades med avseende på HSV med hjälp av fluorescensreagens. De oberoeende bedömarna tolkade cellkulturerna som negativa för HSV om de inte uppvisade karakteristisk CPE inom 7 dagar efter inokulation. Barnsjukhuset iakttog odlingar i minst 14 dagar innan ett negativt resultat rapporterades.
I tabell 1 sammanfattas resultaten per bedömare. Av de 165 direkta prov som insamlats för studien var 145 tillfredsställande för tolkning.
Återstående 20 prover var bristfälliga på grund av otillräckligt antal celler. (Av dessa 20 prover var 17 odlingspositiva och 3 odlingsnegativa.) Procentandelen bristfälliga prover varierade med bedömare (6 % – 16 %) vilket betonar vikten av rätt provtagning och objektglaspreparering. För fullgoda prover uppvisade Pathfinder® en total känslighet på 80 % och specificitet på 98 % jämfört med cellodlingsmetoder.
Table 1 - Direktpåvisning av HSV i kliniska prov Resultat per bedömare
I tabell 2 redovisas resultaten uppdelade på kön och lesionsställe. Dessa uppgifter tyder inte på några signifikanta skillnader i känslighet eller specificitet för genitala lesioner hos män och kvinnor.
Table 2 - Direktpåvisning av HSV i kliniska prov resultat uppdelade på kön och lesionsställe
Obs! Beräkningarna i tabell 1 och 2 baseras på jämförelser med cellodling som referensmetod.
b. Isolat från cellkultur
• Bedömare A och B utvärderade förmågan hos Pathfinder® reagens att identifiera HSV i isolat från cellkultur. Beskrivning av studieställen, patientpopulationer och cellodlingstekniker finns under punkt 1a i avsnittet Särskilda egenskaper. Isolat från cellkulturer härstammade primärt från genitala och anala lesioner.
• Bedömarna preparerade objektglas från HSV-positiva och HSV- negativa kulturer och testade därefter objektglasen med avseende på HSV med hjälp av Pathfinder® reagens. Cellkulturerna bedömdes positiva för HSV om de uppvisade karakteristisk CPE inom 7 dagar efter inokulation med ett misstänkt HSV-prov. De
SP FP FN SN
Otillräckligt Antal (%) Totalt
Pathfinder® reagens + + - -
Cellodlingsmetod + - + -
Bedömare A 34 0 6 18 11 (16%) 69
Bedömare B 21 1 6 18 3 (6%) 49
Företagsinternt 26 0 8 7 6 (13%) 47
Totalt 81 1 20 43 20 165
Känslighet= SP
= 80% Specificitet = SN
= 98%
SP + FN SN + FP
OBS! SP = sant positiv, FP = falskt positiv, FN = falskt negativ, SN = sant negativ.
Lesionsställe Män Kvinnor
Prediktionsvärde Känslighet Specificitet Positiva Negativa
SP SN SP SN
SP + FN SN + FP SP + FP SN + FN
Genitalt 69 79% 95% 97% 67%
38/48 20/21 38/39 20/30
Genitalt 43 81% 100% 100% 67%
25/31 12/12 25/25 12/18
Analt 8 3 71% 100% 100% 67%
5/7 4/4 5/5 4/6
Övrigt 10 11 86% 100% 100% 78%
12/14 7/7 12/12 7/9
Okänt 1
Totalt 88 57
ansågs negativa om CPE ej noterades efter 7 dagar. Resultaten i tabell 3 visar att Pathfinder® reagens uppvisade en känslighet och specificitet på 100 % i jämförelse med cellodlingstekniker.
Table 3 - Identifiering av HSV i isolat från cellkultur
2. HSV-typning
a. Jämförelse mellan typningsresultat för direkt kliniska prov och isolat från cellkultur
De oberoende bedömare som beskrivs under punkt 1a i detta avsnitt typade direkt kliniska prover och positiva cellkulturer (2-3+ CPE) med hjälp av Pathfinder® reagens. I tabell 4 redovisas typningsresultaten för patienter med positiva direkta prov och positiva cellkulturer.
Typningsresultaten som erhölls för direkt kliniska prov överensstämde till 98 % med dem som erhölls för isolat från cellkulturer. Av 49 HSV-2-isolat härstammade 45 från genitala lesioner och 4 från anala lesioner. De 6 HSV-1-isolaten härstammade från följande lesioner: genitala (5) och anala (1).
Table 4 - HSV-typning i direkta kliniska prov och isolat från cellkulturer
*Tekniska fel vid preparering av objektglaset för det direkta kliniska provet eller objektglaset för isolat kan inte uteslutas.
b. Jämförelse mellan Pathfinder® HSV reagens och endonuklueasrestriktionsanalys
I en separat studie typades totalt 69 HSV-isolat av Bio-Rad och en oberoende bedömare med endonukleasrestriktionsanalys och med direkt fluorescens med hjälp av Pathfinder® HSV reagens. De prov som användes i denna studie var kliniska isolat som odlats i Vero- celler (apnjure) eller WI-38-celler (human fibroblast) tills cellerna uppvisade 3+ CPE. De företagsinterna bedömarna använde en anpassning av Lonsdale-metoden (10), medan det oberoende
Cellodlingsmetod Positiva Negativa
Pathfinder® reagens
Positiva 70 0
Negativa 0 41
Cellodlingsmetod
HSV-1 HSV-2
Direkt kliniskt prov
HSV-1 5 0
HSV-2 1* 49
laboratoriet använde en metod för endonukleasrestriktionsanalys som beskrivs av Arens och Swierkosz (16).
Resultaten av denna studie redovisas i tabell 5. Överensstämmelsen mellan endonukleasrestriktionsanalysen och Pathfinder® HSV- reagens för typning av HSV-1- och HSV-2-isolat var 100 %.
Table 5 - Typning av HSV med Pathfinder® reagens och endonukleasrestriktionsanalys
3. Korsreaktivitet
Pathfinder® HSV monoklonala antikroppar uppvisade ingen korsreaktivitet med de cellinjer som användes för HSV-isolering. Med undantag för Staphylococcus aureus (Cowan-stam) reagerade antikropparna inte med de organismer som testades med avseende på korsreaktivitet. De cellinjer som utvärderades var Vero (apnjure), HEp-2 (human epitel) och WI-38 (humana fibrolaster). I tabell 6 redovisas de organismer som testats med avseende på korsreaktivitet.
Endonukleasrestriktionsanalys
HSV-1 HSV-2
Pathfinder® reagens
HSV-1 40 0
HSV-2 0 29
Table 6 - Organismer som testats med avseende på korsreaktivitet
1Provet var en EBV-transformerad cellinje - P3HR-1.
2Det antas att korsreaktiviteten mellan Cowan-stammen av Staphylococcus och de monoklonala antikropparna mot HSV inte interfererar med tolkningen av testresultat av följande skäl:
• Eftersom var avlägsnas från lesionerna före provtagning bör det förekomma få eller inga Staphylococcus aureus i proven.
• Även om Staphylococcus aureus, en bakteriell cell, förekommer, bör den vara klart urskiljbar från en HSV-infekterad mammaliecell.
Monoklonal antikropp mot HSV-1
Monoklonal antikropp mot HSV-2 Organism Antal isolat Reaktivitet Antal isolat Reaktivitet Herpesvirus
Cytomegalovirus 10 Negativa 6 Negativa
Varicella zoster-virus 3 Negativa 10 Negativa
Epstein Barr-virus (EBV)1 1 Negativa 1 Negativa
Vanlig cellodling Smittämnen
Mycoplasma orale 1 Negativa 1 Negativa
Mycoplasma salivarium 1 Negativa 1 Negativa
Mycoplasma arginini 1 Negativa 1 Negativa
Mycoplasma hyorheinis 1 Negativa 1 Negativa
Acoleplasma laidlarvii 1 Negativa 1 Negativa
Övriga organismer
Candida albicans 1 Negativa 1 Negativa
Candida parapsilosis 1 Negativa 1 Negativa
Mycoplasma hominis 1 Negativa 1 Negativa
Chlamydia trachomatis 1 Negativa 1 Negativa
Staphylococcus aureus2 1 Positiva 1 Positiva
(Cowan-stam)
REFERENCES / BIBLIOGRAPHIE / REFERENCIAS / LITERATUR / BIBLIOGRAFIA / REFERÊNCIAS / REFERENCER / REFERENSER 1. Whitley RJ, Alford CA. Antiviral agents: Clinical status report. Hospital
Practice V16, 109-121, (1981).
2. Whitley RJ, et al. Infections caused by herpes simplex virus in the immunocompromised host: Natural history and atopical acyclovir therapy. Journal of Infectious Diseases V150, No. 3, 323-329, (1984).
3. Straus SE, Seidlin M, Takiff H. Management of mucocutaneous herpes simplex virus infections. Drugs V27, 364-372, (1984).
4. Nahmias AJ, Keyserling HL, Kerrick GM. Herpes simplex, in Remington JS, Klein JO (eds). Infectious Diseases of the Fetus and Newborn Infant Second Edition, 636-678, WB Saunders Co, Philadelphia, (1983).
5. Reeves WC, Corey L, Adams HG, Vontver LA, Holmes KK. Risk of recurrence after first episodes of genital herpes. Relation to HSV type and antibody response. New England Journal of Medicine V305, No.
5, 315-319, (1981).
6. DeClercq E, et al. Comparative efficacy of antiherpes drugs against different strains of herpes simplex virus. Journal of Infectious Diseases V141, No. 5, 563-574, (1980).
7. Nahmias AJ, Norrild B. Oncogenic potential of herpes simplex viruses and their association with cervical neoplasia, in Rapp F (ed). Oncogenic Herpesviruses Volume 2, 24-45, CRC Press Inc, Boca Raton, Florida, (1980).
8. Vonka V, et al. Prospective study on the relationship between cervical neoplasia and herpes simplex type-2 virus. II. Herpes simplex type-2 antibody presence in sera taken at enrollment. International Journal of Cancer V33, 61-66, (1984).
9. Rawls WE. Herpes Simplex Virus Types 1 and 2 and Herpesvirus Simiae, in Lennette EH, Schmidt NJ (eds). Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections Fifth Edition, 309-373. American Public Health Association, Washington, DC, (1979).
10.Lonsdale DM. A rapid technique for distinguishing herpes-simplex virus type 1 from type 2 by restriction-enzyme technology. Lancet 849-852.
(April 21, 1979).
11.Nowinski RC, et al. Monoclonal antibodies for diagnosis of infectious diseases in humans. Science V219, 637-644. (1983).
12.Goldstein LC, Corey L, McDougall JK, Tolentino E, Nowinski RC.
Monoclonal antibodies to herpes simplex viruses: Use in antigenic typing and rapid diagnosis. Journal of Infectious Diseases V147, No.
5, 829-837, (1983).
13.Manual Guide – Safety Management No. CDC-22, Decontamination of Laboratory Sink Drains to Remove Azide Salts. Center for Disease Control, Atlanta GA, (April 30, 1976).
14.Pike RM, Richardson JH. Prevention of laboratory infections, in Lennette EH, Schmidt NJ (eds). Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections Fifth Edition, 49-63, American Public Health Association, Washington, DC, (1979).
15.Crane LR, Gutterman PA, Chapel T, Lerner AM. Incubation of swab materials with HSV. Journal of Infectious Diseases V141, 531, (1980).
16.Arens MQ, Swierkosz EM. Simplified method for typing herpes simplex virus by restriction endonuclease analysis. Journal of Clinical Microbiology V17, No. 3, 548-551, (1983).
17.US Department of Health and Human Services. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 5th ed. Washington, DC: US Government Printing Office, HHS Publication No. (CDC) 21- 1112. December 2009.
18.World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual. 3rd ed.
Geneva: World Health Organization, 2004.
Bio-Rad Laboratories
For Customer Orders and Technical Service Call:
1-800-2-BIO-RAD
Website: www.bio-rad.com Bio-Rad Laboratories Main Office:
4000 Alfred Nobel Drive, Hercules, California 94547 Ph. (510) 724-7000, Fx. (510) 741-5824
Also in:
AUSTRALIA - Regents Park, Ph. 61-2-9914-2800, Fx. 61-2-9914-2888
AUSTRIA - Vienna, Ph. 43-1-877-8901, Fx. 43-1-876-5629 BELGIUM - Nazareth, Ph. 32-9-385-5511, Fx. 32-9-385-6554 BRAZIL - Rio de Janeiro, Ph. 5521-3461-5202, Fx. 5521-2224-6524 CANADA - Montreal, Ph.1-514-334-4372,Fx. 1-514-334-4415 CZECH REPUBLIC - Prague, Ph. 420-2-41430532, Fx. 420-2-41431642 CHINA - Shanghai, Ph. 86-21-63052255, Fx. 86-21-53964775 DENMARK - Herlev, Ph. 45-4452-1000, Fx. 45-4452-1001 FINLAND - Espoo, Ph. 358-9-804-22-00, Fx. 358-9-804-11-10 FRANCE - Marnes-la-Coquette , Ph. 33-1-4795-6000,Fx. 33-1-4741-9133 GERMANY - Munich, Ph. 49-89-318840, Fx. 49-89-318-84100 HONG KONG - Quarry Bay, Ph. 852-2789-3300, Fx. 852-2789-1257 INDIA - Gurgaon, Ph. 91-124-6398112, Fx. 91-124-6398115 ISRAEL - Rishon Le Zion, Ph. 972-3-9514127, Fx. 972-3-9514129 ITALY - Milan, Ph. 39-02-216091, Fx. 39-02-21609-398 JAPAN - Tokyo, Ph.81-3-5811-6290, Fx. 81-3-5811-6282 KOREA - Seoul, Ph. 82-2-3473-4460, Fx. 82-2-3472-7003 LATIN AMERICA - Miami Lakes, Florida, Ph. 305-894-5950, Fx. 305-894-5960
MEXICO - Mexico D.F., Ph. 5255-5534-2552, Fx. 5255-5524-5555 THE NETHERLANDS - Veenendaal, Ph. 31-318-540666, Fx. 31-318-542216
NEW ZEALAND - Auckland, Ph. 64-9-415-2280, Fx. 64-9-415-2284 NORWAY - Oslo, Ph. 47-23-38-41-30, Fx. 47-23-38-41-39 POLAND - Warsaw, Ph. 48-22-331-99-99, Fx. 48-22-331-99-98 PORTUGAL - Amadora, Ph. 351-21-472-7700, Fx. 351-21-472-7777 RUSSIA - Moscow, Ph. 7-095-721-14-00, Fx. 7-095-721-14-12 SINGAPORE, Ph. 65-6415-3188, Fx. 65-6415-3189 SOUTH AFRICA - Johannesburg, Ph. 27-11-442-85-08, Fx. 27-11-442-85-25
SPAIN - Madrid, Ph. 34-91-590-5200, Fx. 34-91-590-5211 SWEDEN - Sundbyberg, Ph. 46-8-555-127-00, Fx. 46-8-555-127-80 SWITZERLAND - Reinach, Ph. 41-61-717-95-55, Fx. 41-61-717-95-50 THAILAND - Bangkok, Ph. 662-651-8311, Fx. 662-651-8312 UNITED KINGDOM - Hemel Hempstead, Ph. 44-208-328-2000, Fx. 44-208-328-2550
Revised October 2013 506654
