Antisekretorisk Faktor –
från grundvetenskaplig upptäckt till klinisk behandling av inflammatoriska sjukdomar i tarmen och nervsystemet
Genusperspektiv
Diarrésjukdomar är en dominerande sjukdoms- och dödsorsak bland barn i fattiga länder.
Våra resultat från studier av spädbarnsdiarré i Pakistan visar att AF-terapi kan påskynda tillfrisknandet samt minska dödligheten i diarrésjukdom. Slutresultatet blir en bättre hälsa och överlevnad hos barnen, vilket avspeglas i färre graviditeter och därmed en bättre kvinnohälsa.
Klinisk mastit, mjölkstockning, är ett mycket smärtsamt tillstånd som saknar effektiv terapi.
Mastit drabbar c:a var tredje ammande kvinna i västvärlden. Våra studier visar, att behandling som höjer AF-nivån i bröstmjölk minskar risken för mastit, vilket är av stor vikt för hälsa och livskvalitet.
Olika typer av inflammatoriska ledsjukdomar drabbar ofta kvinnor. I flera av våra studier har vi noterat att patienter med olika typer av smärtsamma ledaffektioner spontant meddelat en förbättring efter AF-inducerande behandling. Dessa resultat ligger till grund för att en dubbel- blind studie med fokus på reumatisk sjukdom skall startas våren 2011.
Projektsammanfattning
Vår forskning är fokuserad på struktur och funktion hos det endogena proteinet Antisekretorisk Faktor (AF) vilket vi klonades 1995. AF motverkar inflammation och
normaliserar vätskesekretion. Den endogena AF-aktiviteten i plasma ökar vid diarré och efter intag av en balanserad diet av socker och aminosyror i födan. Endogen AF-aktivitet utgör en del i det naturliga försvaret mot inflammatoriska reaktioner och diarrésjukdomar.
Vår forskning har resulterat i två produkter som uppfyller EU-reglerna för Livsmedel för särskilda medicinska ändamål: 1. SpecialProcessade Cerealier (SPC-flakes®), som inducerar
en ökad AF-aktivitet, samt 2. spraytorkat äggpulver (Salovum®) som innehåller hög halt preformerat AF och ökar koncentrationen av aktivt AF i blodbanan.
AF-terapi minskar sjukdomssymptomen och förkortar sjukdomsförloppet vid tillstånd där inflammation och/eller sekretionsrubbningar dominerar sjukdomsbilden.
Målsättningen är:
1. Att klarlägga verkningsmekanismerna för AF.
2. Att klarlägga vilken del av AF som skall ligga till grund för vidare läkemedelsutveckling.
3. Att identifiera ytterligare sjukdomsgrupper där patienterna förbättras av AF-terapi.
I de grundvetenskapliga försöken kombineras in vitro-metoder, försök på cellkulturer och djurförsök. Ett viktigt fynd är att en kort AF-peptid (AF-16) normaliserar det förhöjda
intrakraniella trycket och förbättrar överlevnaden vid experimentell herpesencephalit på råtta.
Den trycksänkande effekten skall nu testas på patienter som insjuknat i Japansk
meningoencephalit. Studien skall utföras i Nordvietnam och Kina. AF-16 sänker även trycket i experimentella bröstcancertumörer. Dessa resultat ligger till grund för att kliniskt undersöka om Salovum® kan potentiera den cellulära penetrationen av cytostatika i levermetastaser.
Studien startas hösten 2010.
Out research focus on the endogenous protein Antisecretory Factor (AF), cloned by us 1995.
AF has potent anti-inflammatory and antisecretory effects. Endogenous AF-activity increases after exposure to diarrhoeal diseases irrespective of the inducing agent, but increases also after intake of carefully adjustetd components od sugars and amino acids in food. Increased AF-activity is a part of the endogenous defence system to various inflammatory and infectious diseases, and contributes substantially to a resistance against e.g. diarrhoeal diseases. Our research has resulted in two products which fulfil the EU-rules for "Food for special medical purposes", namely:
1.Specially Processed Cereals (SPC-flakes®).
2.Spray-dried egg yolk (Salovum®) with a high concentration of active AF.
Clinical studies with double-blind design have proven that AF-therapy contributes to a positive clinical outcome in diseases characterized by various forms of inflammation and/or secretory disturbances. Our future work aims to:
1. Clarify the detailed mechanism of action in vivo for AF at the molecular level, and to
2. Adding additional patient groups responding to AF therapy.
Projektplan
1. Bakgrund
Karakterisering av AF: Antisekretorisk faktor (AF) är ett endogent protein som reglerar transporten av vatten och joner över cellmembraner. AF isolerades ursprungligen från grishypofys och grisplasma, klonades och sekvenserades 1995 (1). Vi registrerade proteinet i Gene Bank under beteckningen antisekretorisk faktor (AF, 1996). Amerikanska
proteasomforskare karakteriserade därefter en sekvens identisk med AF vilket var en subenhet inom proteasomkomplexet. Denna betecknades S5a eller Rpn10 (2). AF/S5a/Rpn10 är ett 41 kD stort protein och förekommer såväl associerat till proteasomen som fritt intra-och
extracellulärt. Praxis har blivit att forskargrupper som studerar proteinets effekt på sekretion och inflammation kallar det för AF (3-6), medan proteasomforskare kallar det för S5a/Rpn10.
AF uppvisar ett flertal antisekretoriska och anti-inflammatoriska effekter (1, 7-9). Vi har identifierat en 8 aminosyror lång sekvens i proteinets N-terminala del, som utövar dessa effekter (10). I experimentella system och som utgångsmaterial för läkemedelsutveckling använder vi en något längre peptid bestående av 16 aminosyror, AF-16, som innefattar den aktiva sekvensen och är kemiskt mer stabil. Proteinet AF förekommer fritt intracellulärt i de flesta av kroppens celler och fritt i plasma (5,11-12), men det kan även vara associerad till proteasomkomplexet. Den C-terminala delen av AF, i vilken bindningsställen för ubiquitin är belägna, saknar antisekretorisk effekt (10,13).
Den endogena AF-aktiviteten i plasma ökar vid diarré eller efter födointag av en noga avvägd blandning av socker och aminosyror. AF utgör en viktig del i det naturliga försvaret mot olika typer av inflammatoriska sjukdomar samt infektiösa tarminfektioner och bidrar till att bygga upp skydd mot det/de infekterande agens (14).
Medicinska tillämpningar: Vår grundforskning om AF ligger till grund för utvecklingen av två marknadsprodukter, nämligen SpecialProcessade Cerealier (SPC-flakes®) och spraytorkat AF-rikt äggpulver (Salovum®), vilka bägge uppfyller EU-reglerna gällande för "Livsmedel för särskilda medicinska ändamål" (Food for special medical purposes). Vi är den enda grupp som i kontrollerade dubbel-blind studier har kunnat påvisa signifikanta, kliniska effekter förmedlade av Medicated Food. Både SPC-flakes® och Salovum® säljs via apoteken, och bägge produceras av AS-Faktor AB, ett dotterbolag till Svenska Lantmännen. AF-terapi kan ges på två sätt:
1. Intag av SPC-flakes® (1 gram per kg kroppsvikt och dygn) leder till en ökad, kroppsegen syntes av aktivt AF.
2. Intag av Salovum® i form av en äggdryck ger ett direkt tillskott av aktiv AF.
AF-terapi har visat sig vara gynnsam vid inflammatorisk tarmsjukdom (15), diarré orskad av carcinoidtumörer (16), Ménières sjukdom (17), akut och kronisk diarré hos barn i u-land (18) och mastit (mjölkstockning) (19).
Verkningsmekanism: Vi har identifierat flotillin-1 som ett intracellulärt bindarprotein för AF (20), medan de klassiska, ytbundna, receptorerna återstår att definiera. Flotillin-1 är en delkomponent av "lipid rafts", en membranstruktur kopplad till cellens receptorer. Olika signaler i cellens omgivning kan via lipid rafts utlösa centrala och regulativa cellulära reaktioner. Flottilin-1 är således en regulator av cellens morfologiska struktur och av signaltransduktions-systemet via G-proteiner, jonkanaler och aquaporiner. En av
huvuduppgifterna för vår forskargrupp är att klarlägga hur AF styr vätske- och jontransporter över cellmembraner. Vi har visat hur AF modulerar transport av joner över isolerade
nervcellsmembran från Deiter´s celler (21, 22). Vårt nuvarande arbete går ut på att kartlägga den detajerade, reglerande effekten av AF i intakta celler.
2. Syfte
2.1 Grundvetenskapliga studier]
Att klarlägga den detaljerade verkningsmekanismen på cellulär nivå för AF och AF-16. En preciserad mekanism kan ligga till grund för läkemedelsutveckling.
2.2 Kliniska studier
1. Att utveckla ELISA och RIA för att mäta AF-aktivitet i plasma och i andra kroppsvätskor.
2. Att värdera effekten av olika former av AF-terapi hos patienter med sjukdomstillstånd relaterade till vätskebalansrubbningar och/eller inflammation.
3. Metod och Material
3.1 Grundvetenskapliga studier 3.1.1. In vitro
Följande metoder används:
1. Micro-arrayer används för studier av förändringar i genuttryck före och efter olika former av AF-terapi.
2. Realtids-PCR (TaqMan-metodik) för kvantifiering av AF-mRNA har utvecklats i samarbete med prof. Tomas Bergström, Virologiska laboratoriet, SU.
3. ELISA används för att analysera AF-aktivitet i plasma, basalt och efter AF-terapi.
4. Proteomics (samarbete med ”core facility”, SA) för att undersöka proteinexpression vid intag av AF-aktiverande kost (SPC-flakes®).
5. Primärkulturer av microgliaceller och astrocyter från råtta används för att undersöka hur AF-16 reglerar syntes och sekretion av cytokiner vid LPS-inducerad inflammation.
Studierna utföres i samarbete med prof. Elisabeth Hansson och Lars Rönnbäck, Inst.f.
Anatomi och Cellbiologi, SA.
6. Inbindningsstudier. Avsikten är att identifiera strukturer som kan fungera som ligander för AF/AF-16. Omsättning och inbindning av 14C-AF undersöks i djurförsök genom scintillationsräkning och autoradiografi på vävnadssnitt. Inbindning till glykolipider undersöks med tunnskiktskromatografi, inbindning till membranproteiner med Western ligand-blotting. Inbindning av omärkt peptid på vävnadssnitt undersöks med avbildande masspektrometri (TOF-SIMS). Studierna utföres i samarbete med prof.
Håkan Nygren och doc. Per Malmberg, Inst.f. Anatomi och Cellbiologi, SA.
3.1.2. Djurförsök.
Effekten av AF-16 eller AF-inducerande behandling (SPC-flakes®) undersöks i modeller där inflammation/ödemutveckling/patologisk sekretion kan förväntas. Djurförsöken, som samtliga är godkända av Göteborgs djuretiska kommitté, utförs på råttor och möss.
Tryckmätning.
Registrering av vävnadstryck i olika djurmodeller görs över tid med hjälp av en tryckgivare kopplad till en kontrollenhet(23). Vi utvecklar en radiostyrd tryckmätningsmetodik som tillåter kontinuerlig tryckmätning upp till 11 dygn.
Aktuella djurmodeller:
1. Herpes simplex-encefalit på råttor och möss induceras via intranasal inokulering av herpes simplexvirus typ 1 (HSV-1). Effekten av AF och placebo undersöks med avseende på skadebild i CNS och förhöjt intrakraniellt tryck (23). Virusreplikation och AF- genens transkriptionsnivåer undersöks medels kvantitativ PCR (TaqMan-metodik), virusantigen, pro-inflammatoriska molekyler och AF studeras med immunhistokemi (23).
2. Skallskador på råttor induceras med en kyld metallstav som under 20 sekunder placeras mot den fripreparerade, intakta duran med underliggande skallben. Frysskadan ger en underliggande, lokal vävnadsskada på hjärnvävnaden, vilket åtföljs av ett ökat intrakraniellt tryck. Den trycksänkande effekten av AF och AF-16 undersöks, dessutom görs PCR-analyser och immunhistokemi på valda delar av hjärnan (24).
3. Två typer av bröstkörteltumörer induceras på honråttor, DMBA tumörer och MAT BIII tumörer. Båda tumörtyperna utvecklar ett förhöjt vävnadstryck (25), den
trycksänkande effekten av AF-16 på tumörena undersöks. Studierna utföres i samarbete med prof. Ragnar Hultborn, Onkologiska kliniken, SU.
3.1.3. Histologi
Histologiska undersökningsmetoder används frekvent i både i de kliniska och i de
experimentella delarna av projektet. Vi har tillgång till instrument och kompetens för ett brett spektrum av framför allt ljusmikroskopiska metoder (vanlig ljusmikroskopi,
konfokalmikroskopi), men även elektronmikroskopiska metoder, vilket inkluderar
immunelektronmikroskopi. Alla morfologiska studier i projektet leds av doc. Eva Jennische, Inst. f. Anatomi och Cellbiologi, SA.
3.2. Kliniska studier
3.2.1. Analys av DNA i patientmaterial.
Vi vill undersöka den genetiska bakgrunden hos patientgrupper med nedsatt endogen AF aktivitet som har störningar i inflammation- och sekretionsprocesser. Detta görs i samarbete med avdelningen för Klinisk Genetik (SU/Sahlgrenska) som utför SNP array-analyser. Alla molekylärbiologiska analyser i detta projekt leds av dr. Ewa Johansson, SU.
3.2.2. Kliniska studier avseende effekter av AF-terapi
Våra patientstudier av AF-terapi är i de flesta fall placebokontrollerade med dubbel-blind- design. I vissa fall ingår även en cross-over period. SPC-flakes® intas i en daglig dos av 0,5-
1,0 g/kg kroppsvikt för vuxna och 1,5 -2,0 g/kg kroppsvikt för barn fördelat på 2-3 tillfällen per 24 timmar för bästa effekt. Salovum® ges i form av en äggdryck i en dos av 4,0 gram äggula 3-6 ggr dagligen.
Patienterna följs med klinisk bedömning, rutinkemiska analyser, AF-analyser och AF- relaterade markörer (cytokiner, komplementfaktorer) och i vissa fall tarmbiopsier för histologi, bakteriologisk odling eller molekylärbiologiska analyser (micro-array och kvantitativ PCR för analys av förändringar i inflammationsmarkörer och
membrantranportörer). Aktuella kliniska studier omfattar följande patientgrupper:
1. Patienter med inflammatorisk tarmsjukdom/ patologiskt höga flödestillstånd i tarmen (Doc.
Anders Eriksson, ÖS, prof. Ingvar Bosaeus, SU)
2. Barn med akut och kronisk diarré (Doc. Sven-Arne Silverdal, Umeå, Prof. Shakila Zaman, Lahore, Pakistan, dr. Yigael Finkel, Astrid Lindgren, KI)
3. Patienter med Mb. Meniérè, (Doc. Per Hanner, SU, prof. Helge-Rask Andersen, UAS).
4. Patienter med högt intrakraniellt tryck (Dr. Kliment Gatzinsky, prof. Hans Silander, dr.
Mohamed Al-Olama, SU)
5. Patienter med högt intraokulärt tryck (samarbete med ögonkliniken på NÄL)
6. Patienter med olika typer av inflammatoriska ledbesvär, i första hand Mb Bechterew (dr.
Boel Mörck, prof. Hans Carlsten, SU).
7. Patienter med mastit (Doc. Sven-Arne Silverdal, Umeå, barnmorska Anna Gustavsson, KI)
4. Arbetsplan och preliminära resultat
AF hämmar diarré, minskar inflammation, minskar endolymfaproduktion samt sänker
patologiskt ökat intraokulärt och intracerebralt tryck. Alla dessa effekter förmedlas direkt eller indirekt via reglering av vätsketransport. Denna sker sannolikt via fritt AF utan associering till proteasomen.
Arbetshypotes. AF verkar genom att primärt eller sekundärt återställa/normalisera den optimala öppningsgraden av vatten- och jonkanaler i cellmembranet. Därigenom påverkas såväl sekretoriska som inflammatoriska processer. Kanalen kan antingen öppnas eller stängas beroende på i vilken riktning den ursprungliga störningen skett.
4.1. Arbetsplan och preliminära resultat. Grundvetenskap 4.1.1. In vitro
Vi har framställt ett flertal både monoklonala och polyklonal antisera, samt ett flertal syntetiska peptider med relation till AF-sekvensen. Vi har dessutom en 14C-märkt AF-16 peptid. Samtliga molekyler tjänar som diagnostiska verktyg när det gäller utvecklingen av i första handen in vitro-metoder.
Arraytekniker
Colonbiopsier från 5 patienter med ulcerös colit (UC) och 5 friska kontrollpatienter analyserades med "whole genome" microarrayer (47 000 transkript). Fem transkript, som visade en 10-faldig skillnad mellan UC och friska, analyserades vidare med kvantitativ PCR och immunhistokemi i ytterligare 7 UC-patienter och 7 kontroller (26, 27). Av de
uppreglerade transkripten (elafin, SLC6A14, aldolase B, numb-interacting homolog) var proteasinhibitorn elafin av speciellt intresse, då den även på proteinnivå var kraftigt
uppreglerad vid UC. Den kan därför vara användbar som en biomarkör. Fynden har verifierats i en utvidgad studie (28). En ny array-studie på patienter med ospecificerad typ av
inflammatorisk reaktion i tunntarmen och i colon håller på att genomföras och kommer att utvärderas våren 2011.
ELISA och RIA
Vi utvecklar kontinuerligt ELISA och RIA för bestämning av SPC-flakes®-inducerad AF- aktivitet i plasma. Metoderna ersätter bioassay på råtta. Vi har framställt och karakteriserat monoklonala antikroppar mot det nativa AF-protein som är frampreparerat från human placenta. Vi har nu 9 AF-antikroppsproducerande kloner där vi kan använda en mAb i ELISA, vilken selektivt detekterar en SPC-flakes®-inducerad ökning av AF-aktiviteten i plasma (29). Vi utvecklar metoden för att kunna mäta AF-aktivitet i bröstmjölk, urin, saliv och faeces, sannolikt går detta medelst en sandwich-modell bestående av en fångande och en detekterande antikropp. Vår ELISA fungerar optimalt enligt gällande kvalitetsnormer,
Metoden har validerats och vidimerats av prof. Olof Beck på avd. för klinisk farmakologi, KI.
Proteomics.
Försöken (2D DIGE och LC-MS/MS) görs i samarbete med SA:s core facility för proteomics, i avsikt att söka klarlägga verkningsmekanismen för kostinducerad AF-aktivering. Intag av SPC-flakes® hos råttor uppreglerade enzymet GST-1 mu i levern (30), samtidigt som ett antal G-kopplade receptorer i tunntarmens slemhinna förändrades. Med proteomics skall vi även
kartlägga hur den toxin-inducerade ökningen av AF återspeglas, samt beskriva verkningsmekanismen för Salovum®.
Cellstudier på primärkulturer
Både AF och aminoterminal AF-peptider reglerar såväl GABA som Cl- och Ca2+- transport över isolerade membran från Deiter´s celler (21, 22). AF-16 modulerar cytokinproduktionen i LPS-påverkade mikrogliaceller och astrocyter från råtta i primärkulturer. Denna cellmodell visar på effekter som AF-16 utövar på syntes- och transportprocesser i inflammatoriskt påverkade celler, och fungerar som ett mycket effektivt instrument för att beskriva verkningsmekanismen för AF-16.
Identifiering av AF-inbindning
Autoradiografi på vävnadsssnitt visar, att intravenöst tillfört AF-16 binder med högst affinitet till exokrina pancreas, därefter till slemhinnor i magtarmkanalen, plexus choroideus och adenohypofysen. Inbindningsmönstret vid intranasal och konjunctival applikation skall studeras för att specifikt identifiera de primära målstrukturerna, som är aktuella vid frågeställningen ”tryckreduktion”.
Tunnskiktskromatorgrafi. I samarbete med prof. Michael Breimer (Avd. för Kirurgi, SU) och medarbetare undersöker vi om AF-16 binder till glykolipider. Vi kommer även att undersöka inbindningen av märkt AF-16 till fraktionerade membranproteiner från tunntarmens
slemhinna.
TOFSIMS (Time of Fligth Secondary Ion Mass Spectometry). Med denna metod undersöker vi om tillförd omärkt AF-16 kan identifieras i vänadsnitt. Preliminära resultat talar för att intakt peptid kan återfinnas både i CNS och i tunntarm, vilket talar för att peptiden är relativt stabil.
4.2. Experimentella och Kliniska studier. Arbetsplan och preliminära resultat.
4.2.1. Djurförsök
HSV-1-encefalit . En modell för HSV-1-encefalit på mus och råtta har utvecklats (23). I denna modell ger behandling med AF-16 intranasalt eller intravenöst en total inhibition av såväl morbiditet som mortalitet. AF-16 administreras terapeutiskt, och behandlingen påbörjas 4 dagar efter den intransala HSV-1 inokulationen. Denna inokulation sker medelst
droppinfektion i en volym av 25 µl, vilket innebär att alla intransala och intracerebrala
slemhinnor och epiteliala skyddshinnor är mekaniskt opåverkade. Intrakraniell tryckmätning visar, att AF-16 inom 90 minuter sänker det förhöjda intrakraniella trycket orsakat av HSV-1 infektionen, sannolikt beroende på att peptiden ger en trycksänkning av ett patologiskt förhöjt liqvortryck/intracerebralt tryck. Skillnaden i överlevnad mellan försöksgruppen och
kontrollgruppen har lett till att effekten av AF-16 skall testas kliniskt på japansk
meningoencephalit, en CNS-lokaliserad, myggburen sjukdom, vars terapeutiska arsenal är begränsad till kranioektomi.
Traumatisk skallskada. Experimentella skallskador på råttor ger en underliggande, lokal vävnadsskada på hjärnvävnaden, vilket åtföljs av ett ökat intrakraniellt tryck. Detta förhöjda tryck sänker vi signifikant inom 90 min efter intranasal behandling med AF-16. Resultaten har varit så entydiga, att vi har startat upp ett samarbete med neurokirurgiska kliniken, SU (dr.
Kliment Gatzinsky och prof. Hans Silander), med syfte att så snart som möjligt testa AF-16 kliniskt på postoperativa/post-traumatiska hjärnödem. I de fortsatta försöken kommer vävnadstrycket att mätas kontinuerligt med en unik, radiostyrd tryckmätningsmetod som vi utvecklar. Metoden ger fortlöpande information om det intrakraniella trycket, vilket ger oss möjligheten att fortlöpande registrera information beträffande dos-responseförhållanden och varaktigheten av solitärt eller kontinuerligt tillförda droger och/eller behandlingar. Denna form av tryckregistrering kommer primärt att utvecklas av dr. Mohamed Al-Olama, som även är doktorand i projektet.
Tumörer. Både DMBA- och MAT BIII- tumörer kännetecknas av förhöjt vävnadstryck, vilket försämrar penetrationen av farmaka och minskar effekten av den medicinska behandlingen, inklusive strålning. Våra resultat visar, att AF-16 effektivt sänker vävnadstrycket i bägge tumörer och i samband därmed förbättrar penetrationen av ett cytostatikum (doxorubicin).
AF-16 skulle därmed kunna användas som ett adjuvans vid cancerterapi (25), och vi avser nu att starta en studie på patienter med levermetastaser, för att undersöka om intag av Salovum®
i samband med cytostatikabehandling/strålbehandling potentierar behandlingseffekten, viken följs med diffusions-MR. Dessa försök göres i samarbete med prof. Ragnar Hultborn, SU.
4.2.2. Analys av patient DNA.
En microarray-analys genomförs med GeneChip® Human Mapping 250K Nsp I array
(Affymetrix) i samarbete med avdelningen för Klinisk Genetik SU. Här ingår analys av Single Nucleotide Polymorphism-markörer (SNP’s) för att detektera eventuella deletioner eller
dublikationer i patient DNA. Avsikten är att i detalj undersöka DNA hos medlemmarna i en familj som uppvisar en kombination av oklara tarmfunktionsstörningar och Meniérès sjukdom. Från dessa familjemedlemmar har vi även tarmbiopsier för histokemisk undersökning. Studierna har under 2010 utökats till att även gälla kliniska tillstånd med rubbad vätskebalans med eller utan inflammation.
4.2.3. Kliniska studier avseende effekter av AF-terapi.
4.2.3.1 Inflammatorisk tarmsjukdom
En multicenterstudie (dubbel-blind, cross-over, samarbete med Docent Anders Eriksson, ÖS), där effekten av SPC-flakes® på höga tarmflöden hos patienter med inflammatorisk
tarmsjukdom studerades (31). Förutom rutinnalyser undersöks AF-aktivitet, IGF-1 och leptin i plasma samt immunhistokemiska studier av tarmslemhinnan. Studiematerialet analyseras vidare för ytterligare en publicering.
4.2.3.2. Ménières sjukdom
Både SPC-flakes® och Salovum®, B221® har visats ge symtomlindring hos patienter med Mb Ménière (17). AF uttrycks av specifika cellpopulationer i anslutning till
endolymfarummet (17). En dubbel-blindstudie har publicerats i samrbete med Docent Per Hanner, SU, och Prof. Helge Rask-Andersen, UAS. Vi redovisar där 51 patienter som behandlats med SPC-flakes® eller kontrollcerealier under 12 veckor (32). Resultaten bekräftar tidigare studier och visar, att patienter som behandlats med SPC-flakes® hade en signifikant minskning av yrselbesvären jämfört med placebobehandlade. Denna studie har inspirerat öronläkare på såväl Rikshospitalet i Köpenhamn som i Liverpool att kliniskt undersöka effekten av SPC-flakes® på olika grupper av Meniérè-patienter.
Det finns dock en liten andel av Meniérè-patienterna, som inte reagerar tillfredsställande på SPC-flakes®. Vid behandling med Salovum® har även dessa patienter uppvisat goda kliniska resultat, speciellt när det gäller reduktion av yrselsymptom. Hittills 23 patienter inkluderats i denna studie.
4.2.3.4. Spädbarnsdiarré
En dubbel-blind placebokontrollerad diarréstudie har gjorts vid Fatima Jinnah Medical College/Sir Ganga Ram Hospital, Lahore, Pakistan (18). 240 barn, 6-24 mån, med akut diarré (< 1 vecka) eller långdragen diarré (> 1vecka) randomiserades till behandling antingen med Salovum® eller kontrollägg, 2 g x 5 under tre dagar, som tillägg till sedvanlig terapi.
Behandling med Salovum® av barn med akut diarré ledde till signifikant färre diarréer jämfört med placebo, 82 % bedömdes vara kurerade jämfört med 54 % i placebogruppen (p<0.001). I gruppen barn med prolongerad diarré bedömdes 91 % Salovum®-behandlade som kurerade jämfört med 63 % i placebogruppen (p<0.001). Resultaten är mycket
uppmuntrande, då långvarig barndiarré är svårbehandlad och behäftad med en hög mortalitet.
Vi har därför fortsatt med ytterligare en studie som inkluderar 120 mödrar med barn i varje grupp. Studien har mätdata från tiden 3 månader före förlossningen till 3 månader efter.
Plasma- och mjölkprover från mödrar och barn skall analyseras i Göteborg. Studien avslutades i juni 2010.
4.2.3.5 Japansk meningoencephalit
Japansk meningoencephalit är en myggburen sjukdom som företrädesvis uppträder i Japan, Nordvietnam och Sydvästra Kina. Hos patienter med symtomgivande sjukdom är mortaliteten c:a 20 % och överlevande uppvisar en mycket hög frekvens av allvarliga neurologiska
restsymptom. Den enda verksamma terapi som beskrivits för patienter med kliniska symptom är kranioektomi, vilket dock ej genomförbart på mer än ett fåtal patienter. Således är det av stort intresse att pröva AF-16 som en trycksänkande drog. Skulle man erhålla en
trycksänkande effekt av AF-16 vid denna form av intraktabel tryckhöjning skulle det kunna ge betydande såväl medicinska som sociala och ekonomiska vinster, vilket är vad ansvariga (Tom Solomon, Shareen Galbrigth) inom WHO menar. En test av AF-16 på patienter med kliniska symptom på japansk meningoencephalit planeras därför till hösten 2010 i
Nordvietnam och Sydövästra Kina. Ett positivt utfall av en sådan test skulle ha stor betydelse för aktuell sjukvård på SU, då vi därmed skulle kunna starta behandling av hjärnödem med vitt skild bakomliggande patofysiologi. Hjärnödem uppträder postoperativt, efter olika former av stroke, efter trauma, i samband med infektioner. Således skulle ett stort antal patienter kunna bli föremål för trycksänkande behandling med Salovum®.
4.2.3.6. Ökat intraokulärt tryck
De flesta former av glaukom kännetecknas av ökat intraokulärt tryck som obehandlat kan leda till blindhet. Vi har visat att topikal applikation av AF-16 sänker det intraokulära trycket hos kaniner på ett dosberoende sätt, samt att AF-16 givet intravenöst normaliserar experimentellt förhöjt intraokulärt tryck hos råttor. Hos patienter som inte reagerade med en tillfredsställande trycksänkning på konventionell behandling med Timolol® eller Xalatan® har vi i en klinisk studie utförd på NÄL visat, att Salovum®, B221® givet i en dosering av 4 gram x 3 sänker
det intraokulära trycket hos medicinrefraktära glaukompatienter. Baserat på dessa resultat har vi fått Läkemedelsverkets tillstånd att göra en fas-I studie, vilket skall göras på avd. för kliniska prövningar, KI. På NÄL har användandet av Salovum®, B221® i trycksänkande syfte fortsatt oförändrat efter studiens avslut.
4.2.3.7. Mastit.
Mastitfrekvensen hos förstföderskor är så hög som 30 % i vissa mödravårdsdistrikt i Sverige.
Vår studie samt uppföljande statistik visar att SPC-flakes® har en kurativ effekt på c:a 80 % av dessa mastiter. Bröstmjölken från en SPC-flakes® behandlad kvinna kan oförändrad ges till barnet, i motsats till mjölk från kvinnor som behandlats med antibiotika. Denna mjölk måste ofta kasseras. En minskad antibiotikabehandling minskar risken för antibiotikaresistens i fr.a. tarmfloran hos både mor och barn. AF-behandlingen av mastit är föremål för en utökad studie som vi gör i samarbete med doc. Sven-Arne Silverdahl, Universitetssjukhuset i Umeå, samt doktoranden, leg barnmorska Anna Gustavsson, obstetriksektionen, KI, Huddinge.
5. Betydelse
AF är en originalupptäckt från Göteborg. Kliniska och experimentella data visars, att AF är av grundläggande betydelse för att normalisera en rubbad vatten- och jonbalans över
cellmembranet och även dämpa inflammatoriska reaktioner. Den kliniska effekten av AF på sjukdomssymptom kan komma inom minuter och effekten av en ökad endogen syntes
uppträder inom några dygn. En kombination av behandling med Salovum® och SPC-flakes®
kan således ha en maximalt gynnsam kurativ effekt på sjukdomarna. Patientgrupperna med sjukdomar som AF kan påverka är mycket stora. Detta betyder att AF-behandling kommer att ge en avsevärd samhällsvinst liksom en förbättrad livskvalitet hos den enskilda patienten.
Genom ökad kunskap om AF, dess reglering och verkningsmekanism, kan nya förbättrade terapiformer för en rad vanliga sjukdomstillstånd utvecklas.
Referenser
1. Johansson E et al. Molecular cloning and expression of a pituitary gland protein modulating intestinal fluid secretion. J. Biol. Chem. 270:20615-20620, 1995.
2. Ferrell K et al. Molecular cloning and expression of a multiubiquitin chain binding subunit of the human 26S protease FEBS Lett. 381: 143-148, 1996.
3. Tateishi K et. al. Molecular cloning and expression of rat antisecretory factor and its intracellular localization. Biochem Cell Biol 77:223-8, 1999;
4. Gröndahl ML et al. Neuronal involvement in the effect of an antisecretory factor-derived peptide on induced secretion in the porcine small intestine. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 188:589-94, 2002.
5. Davidson TS, Hickey WF. Distribution and immunoregulatory properties of antisecretory factor. Lab Invest 84:307-19, 2004.
6. Davidson TS, Hickey WF. Antisecretory factor is regulated by inflammatory mediators and influences the severity of experimental autoimmune encephamyelitis. J Leukoc Biol.
74:835-44, 2004.
7. Lönnroth I, Lange S, Skadhauge E. The antisecretory factors: Inducible proteins which modulate secretion in the small intestine. Comp Biochem Physiol.90: 611-617, 1988.
8. Torres J, Jennische E, Lange S, Lönnroth I. Cl. difficile toxin A induces a specific
antisecretory factor which protects against mucosal damage. Gut 32: 791-795, 1991.
9. Johansson E, Jennische E, Lange S, Lönnroth I. Antisecretory factor supresses intestinal inflammation and hypersecretion. Gut 41:642 - 645, 1997.
10. Johansson E, Lange S, Lönnroth I. Identification of an active site in the antisecretory factor protein. Biochim Biophys Acta, 1362:177- 182, 1997.
11. Lange S, Jennische E, Johansson E, Lönnroth I. The antisecretory factor - synthesis and intracellular localisation in porcine tissues. Cell Tissue Res, 296:607-617, 1999.
12. Lange S, Lönnroth I. The Antisecretory Factor: Synthesis, Anatomical and Cellular Distribution and Biological Action in Experimental and Clinical Studies. Int Rev Cytol 210: 39-75, 2001.
13. Fujiwara K et al. Structure of the ubiquitin-interacting motif of S5a bound to the ubiquitin-like domain of HR23B. J Biol Chem, 279: 4760-4767, 2004.
14. Torres J et al. Antisecretory activity in a lectin fraction of plasma from patients with acute diarrhea. Arch Med Res 24:7-11, 1993
15. Björck S et al. Food-induced stimulation of the antisecretory factor improve recurrence from human colonic inflammatory disease. A study of a concept. GUT 46:824-829, 2000
16. Laurenius A et al Antisecretory factor counteracts secretory diarrhoea of endocrine origin.
Clin Nutr, 22: 549-552, 2003.
17. Hanner P et al. Increased antisecretory factor reduces vertigo in patients with Menière's Disease: a pilot study. Hear Res 190:31-36, 2004.
18. Zaman S et al. Efficacy of B 221, a medical food containing antisecretory factors in reducing diarrhoeal illnesses in children 6-24 months of age -a placebo controlled trial Acta Paediatr 96:1655-1659, 2007.
19. Svensson K et al. Induction of anti-secretory factor in human milk may prevent mastitis.
Acta Paediatr 93:1228-1231, 2004
20. Johansson E, Jonson I, Bosaeus I, Jennische E. Identification of Flotillin-1 as an interacting protein for Antisecretory Factor. Regul Pept 146:303–309,2008
21. Lange S et al An inhibitory protein of intestinal fluid secretion reverses neuronal GABA transport. Biochem Biophys Res Comm, 130: 1032-1036, 1985.
22. Rappalino MV, Lange S, Lönnroth I, Cupello A. Antisecretory Factor peptide derivatives specificly inhibits (3H)-GABA/36Cl- out àin transport across the isolated rabbit Deiters´neuronal membrane. Acta Physiol Scand 179: 367-371, 2003.
23. Jennische E et al. The peptide AF-16 abolishes sickness and death at experimental encephalitis by reducing increase of intracranial pressure. Brain Res 1227:189-97, 2008
24. Al-Olama M, Lange S, Hansson HA, Jennische E. The peptide AF-16 lowers the raised intracranial pressure after a freezing experimental brain injury. Submitted
25. Al-Olama M et al. The Peptide AF-16 Decreases the High Interstitial Fluid Pressure and Facilitates Drug Distribution in Solid Tumors. Under revision.
26. Eriksson A et al. Real-time PCR quantification analysis of five mucosal transcripts in patients with Crohn´s disaese. Eur J Gastroenterol Hepatol., 20: 290-296, 2008.
27. Flach C-F et al. Detection of elafin as a candidate biomarker for ulcerative colitis by wholegenome microarray screening. Inflamm Bowel Dis 12:837-42, 2006.
28. Eriksson A et al. Five mucosal transcripts of interest in ulcerative colitis identified by quantitative real-time PCR: a prospective study. BMC Gastroenterol. 8:34, 2008.
29. Johansson E, Lönnroth I, Jonson I, Lange S, Jennisch E. Developement of monoclonal antibodies for detection Antisecretory Factor activity in human plasma. J Immunol Methods 342:64-70, 2009
30. Johansson E, Lange S, Jennische E. Specially Processed Cereals diet increases plasma levels of active Anti-secretory Factor and up-regulate rat hepatic Glutathione S- transferase Mu. Nutrition, accepted for publication 2010.
31. Pagoldh M et al. Effects of a supplementary diet with specially processed cereals in patients with short bowel syndrome. Eur J Gastroenterol Hepatol. 20:1085-93, 2008.
32. Hanner P. Rask-Andersen H. Lange S. Jennische E. Antisecretory Factor inducing therapy improves the clinical outcome in patients with Menière's disease. Acta Otolaryng.
130:223-227, 2010.
Klinisk relevans
AF-terapi med SPC-flakes® eller Salovum® har kliniskt en symptomlindrande effekt vid ett flertal vanliga sjukdomstillstånd. I våra dubbel-blind - upplagda studier påvisas dessutom förkortad vårdtid vid inflammatorisk tarmsjukdom, Ménières sjukdom, akut och kronisk spädbarnsdiarré, mastit och glaukom.
I Sverige lider c:a 50.000 personer av inflammatorisk tarmsjukdom, insjuknadet hos vuxna beräknas till 500 personer per år. Antalet barn med denna diagnos har ökar hastigt i hela västvärlden.
Mastitfrekvensen kan vara så hög som 30 % bland förstföderskor i Sverige, symptomlindring uppnås på c:a 80% med SPC-flakes® behandling.
Vår studie i Pakistan på akut och kronisk spädbarnsdiarré visade att bägge sjukdomstillstånd är behandlingsbara med AF-terapi. Dessa barna får en signifikant bättre överlevnadsprognos.
En nyligen avslutad studie på NÄL visar, att Salovum® sänker det intraokulära trycket hos patienter där sedvanlig trycksänkande behandling varit resultatlös. En uppföljande studie planeras.
AF – 16 sänker experimentellt förhöjt intracerebralt tryck (hjärnödem) orsakat av såväl infektion som trauma, vårat mål är att få till stånd en behandlingsstrategi med AF-16 på postoperativa, neurokirurgiska patienter. Den trycksänkande effekten av AF - 16 skall testas på japansk meningoencephalit, studien skall genomföras i Nordvietnam och sydvästra delen av Kina.
Användningen av såväl SPC-flakes® som Salovum® är till gagn för såväl den drabbade patienten som sjukvårdshuvudmannen. Patientens lidande minskar, risken för biverkningar saknas. Ett flertal patienter som står på AF-behandling har dessutom oväntat meddelat en minskad förbrukning av antibiotika, vilket reducerar risken för bakteriell resistensutveckling.
En korrekt analys av sjukvårdskostnader i relation till AF-behandling skall utföras 2011.
Utvecklingen av peptiden AF-16 till ett läkemedel har påbörjats.
Beviljade anslag:
1. 1. Huvudman: Stefan Lange, ”Antisekretorisk Faktor vid inflammatoriska sjukdomar i tarmen och nervsystemet. Från funktionell karakterisering till praktisk terapi” Tilldelat anslag från Medi-SAM, kr. 362.000, beslutat november 2007, utbetalning till SU, AF konto 71570.
1. Huvudman: Stefan Lange, ”Barn och Antisekretorisk Faktor – terapi vid diarrésjukdom och inflammatorisk tarmsjukdom ” Tilldelat anslag från Frimurare
Barnhusdirektionen, kr. 100.000, beslutat 2010-05-25, utbetalning till GU.
2. Huvudman: Stefan Lange, ”Antisekretorisk Faktor och dess analysmetoder”Tilldelat anslag från Programprojekt, Laboratoriemedicin, kr. 191.000, beslutat 2010-05-31, utbetalning till SU, AF konto 94920.
3. Huvudman: Stefan Lange, ”A new approach to elucidate and treat raised intracranial pressure”Tilldelat anslag från UAE (Unitet Arab Emirate) kr. 300.000, pengarna tilldelade för att fullfölja Dr.Mohamed Al-Olamas utbildning och fortbildning i neurokirurgi. Beslutat 2009-04-06, pengarna utbetalade till SU, AF konto 830300.
4. Huvudman: Ewa Johansson, "Bestämning av Antisekretorisk Faktor (AF) i samband med klinisk sjukdom och vid normalisering av inflammation och vätskebalans" Tilldelat anslag från Magnus Bergvalls stiftelse, kr. 60 000:-, beslutat 2010-01-15, utbetalning till SU, AF kontot 83030, datum 2010-03-17.
5. Huvudman:Eva Jennische, ”Antisekretorisk Faktor vid inflammatorisk tarmsjukdom och barndiarré – Vilka är verkningsmekanismerna för den gynnsamma effekten?” Tilldelat anslag från Magnus Bergvalls stiftelse
6. Huvudman: Sareen Elisabeth Galbraith, (University of Liverpool, England),
“Virusinflammation” European Research Council starting grant Anslag, sökta ännu ej beviljade.
1. Huvudman: Stefan Lange, organisation, SIDA (SWE -2010-227) ”The Antisecretory Factor may decrease the problems in developing countries with inflammatory conditions during late pregnancy and early life” har sökt kr. 4.045.000 under en period av 5 år.
2. Huvudman: Sven-Arne Silverdal, organisation, FORMAS ” “Studies on Anti-secretory factor – a potential factor in promotion of growth and immune regulation, prevention of prematurity, intrauterine growth retardation, mastitis and neonatal infectious diseases and treatment against conditions due to secretory and immune dysfunctions”. Project organisation. The project includes different aspects with separate studies to be
performed in Sweden (Stockholm and Umeå) and Pakistan (Lahore). A PhD student in Stockholm, Anna M Gustafsson, will be involved supported by the research team consisting of Prof Lars Å Hanson, Prof Stefan Lange, Ass Prof Eva Jenniche Götebrog University, Prof Shakila Zaman, Lahore, Pakistan, Prof Mikael Norrman, Karolinska Institut, Stockholm, and Dr Sven Arne Silfverdal, Umeå University. Prof Hanson has
been collaborating with the research group in Pakistan for more than 30 years. Sökt belopp: SEK 50.000 som planeringsbidrag.
3. Huvudman: Sven-Arne Silverdal, organisation, Bill and Melinda Gates Foundation, “
“Anti-secretory factor – a potential factor in promotion of growth and immune regulation, prevention of prematurity, intrauterine growth retardation, mastitis and neonatal infections”. Sökt belopp: USD 100.000 som planerings- och start upbidrag.
4. Huvudman: Sven-Arne Silverdal, organisation, Ekhagastiftelsen, ”Analys av Antisekretorisk Faktor i dagligt, praktiskt kliniskt arbete”. Sökt belopp: kr 72.000 för laboratorieanalyser.
Vetenskaplig rapport.
1. Eriksson A, Jennische E, Flach C-F, Jorge A, Lange S. Real-time PCR quantification analysis of five mucosal transcripts in patients with Crohn´s disaese. Eur J Gastroenterol Hepatol., 20: 290-296, 2008.
2. Jennische E, BergströmT, Johansson M, Nyström K, Tarkowski A, Hansson H-A, Lange S.
The peptide AF-16 abolishes sickness and death at experimental encephalitis by reducing increase of intracranial pressure. Brain Res;1227:189-97, 2008.
3. Eriksson A, Flach C-F, Lindgren A, Kvifors E, Lange S. Five mucosal transcripts of interest in ulcerative colitis identified by quantitative real-time PCR: a prospective study. BMC Gastroenterol.;8:34, 2008.
4. Johansson E, Jonson I, Bosaeus M, Jennische E. Identification of flotillin-1 as an
interacting protein for antisecretory factor. Regul pept. Feb 7;146(1-3):303-9, 2008.
5. Johansson E, Lönnroth I, Jonson I, Lange S, Jennisch E. Developement of monoclonal antibodies for detection of Antisecretory Factor activity in human plasma. J Immunol Meth. 342:64-70, 2009.
6. Pagoldh M, Eriksson A, Heimtun E, Kvifors E, Sternby B, Blomquist L, Lapidus A, Suhr O, Lange S, Karlbom U, Nordström D, Rettrup B. Effects of a supplementary diet with specially processed cereals in patients with short bowel syndrome. Eur. J.
Gastroenterol. Hepatol 20:1085-93, 2008.
7. Ping GuoJ, VerdrenghM, TarkowskiA, LangeS, JennischeE, LorentzenJC, HarrisRA.
The rat antigen presenting lectin-like receptor complex influences innate immunity and development of infectious diseases. Genes Immun, 10:227-36, 2009.
8. Hanner P. Rask-Andersen H. Lange S. Jennische E. Antisecretory Factor inducing therapy improves the clinical outcome in patients with Menière's disease. Acta Otolaryng.
130:223-227, 2010.
9. Lång P, Lange S, Delbro D, Andersson G. Induction and cellular expression of tartrate resistant acid phosphatase during dextran sodium sulphate induced colitis in rats.
Histochem Cell Biol. 132:599-612, 2009.
10. Klak M, Anäkkälä N, LangeS, JonssonI-M, Tarkowski A, JinT Tranexamic acid, an inhibitor of plasminogen activation, aggravates staphylococcal septic arthritis and sepsis. Scand J Infect Dis 42:351-8, 2010.
11. Gillett A, Marta M, Jin T, Tuncel J, Leclerc P, Nohra R, Lange S, Holmdahl R, Olsson T, Harris RA, Jagodic M TNF Production in Macrophages Is Genetically Determined and Regulates Inflammatory Disease in Rats. J Immunol. 185: 442-50, 2010.
12. Säljö A, Bolouri H, Mayorga M, Svensson B, Hamberger A. Low-level blast raises intracranial pressure and impairs cognitive function in rats: prophylaxis with processed cereal feed. J Neurotrauma Feb;27(2):383-9, 2010.
13. Johansson E, Lange S, Jennische E. Specially Processed Cereals diet increases plasma levels of active Anti-secretory Factor and up-regulate rat hepatic Glutathione S- transferase Mu. Nutrition, accepted for publication 2010.
14. Mannerås-Holm L, Leonhardt H, Kullberg K, Jennische E, Odén A, Holm G, Hellström M, Lönn L, Olivecrona G, Stener-Victorin E and Lönn M. Enlarged adipocytes, low serum adiponectin, and normal body fat distribution characterize women with PCOS
— the adipose tissue abnormalities, but not circulating sex steroids, are strongly associated with insulin resistance. J Clin Endocrinol Metab. 2010, accepted for publication
15. Malmberg P, Jennische E, Nilsson D and Håkan Nygren. High resolution, imaging TOF- SIMS in medical research. Anal Bioanal Chem, 2010, accepted for publication.
Artiklar publicerade i dagspress samt examensarbeten
1. Emma Sohl. Characterization of galectin-1. A possible binding protein to the fluid
regulating protein antisecretory factor. Examensarbete, våren 2008. Handledare Ewa Johansson.
2. Noor Jamal. Induction of Antisecretory Factor in rat can be measured by ELISA.
Examensarbete 30 hp, våren 2009. Handledare: Ewa Johansson.
3. Stefan Lange. SPC-Flakes kan ge lindring vid inflammatorisk tarmsjukdom.
Medlemstidning i Riksförbundet för mag- och tarmsjuka, Nr.1/2009.
4. Per Hanner, Stefan Lange, Eva Jennische. Dietinducerad ökning av antisekretorisk faktor (AF) minskar symptomen vid Ménières sjukdom. Vi hörs, Svenska hörselförbundet rf, 3/2009.
5. Jessica Lundqvist . The influence of SPC on AF-induction and results in slaughterchicken production., Examensarbete 30 hp D-nivå, Swedish University of Agricultural Sciences, department of Animal Nutrition and management, Uppsala 2010, handledare: Klas Elwinger.
6. Johanna Westberg. Different protein expression in rat jejunum after induction of Antisecretory Factor. Examensarbete 30 hp våren 2010. Handledare: Ewa Johansson.
Översiktsartiklar
1.Hanson LÅ, Zaman S, Werner B, Håversen L, Motas C, Moisei M, Mattsby-Baltzer I, Lange S, Banasaz M, Midtvedt T, Norin E, Silferdal SA. Growth and Nutrition: the first six month. Nestle Nutr Workshop Ser Pediatr Program. 61:123-34, 2008.
2. Jennische E, Hanson LÅ, Hansson H-A, Johansson E, Lönnroth I, Lange S. Antisecretory Factor and its biological activities. Old Herborn University Seminar Monograph 22, ISBN3-923022-26-3, June 26-29, 2009
3. Ulgheri C, Paganini B, Rossi F. Antisecretory factor as a potential health-promoting molecule in man and animals. Nutrition Research Reviews, 1-14, 2010.
Opublicerade manuskript
1.Al-OlamaM, WallgrenAC, AnderssonB, GatzinskyK, HultbornR, , Karlsson-ParraA, LangeS, HanssonHA JennischeE. The Peptide AF-16 Decreases the High
Interstitial Fluid Pressure and Facilitates Drug Distribution in Solid Tumors. Cancer Res, under revision.
2.Krave U, Al-Olama M, Davidsson J, HöjerS, Hansson HA. Importance of impulse direction for brain pressure response during rotational head trauma. J Neurotrauma, under revision
3. Krave U, Al-Olama M, Hansson HA. Rotational acceleration closed head flexion trauma generates more extensive diffuse brain injury than extension. J Neurotrauma, under revision
4. Ewa Johansson, Stefan Lange, Eva Jennische.Induction of Antisecretory Factor activity can be detected in plasma from pig, cattle, rat and chicken using ELISA. Manuscript in preparation
5. Ewa Johansson, Stefan Lange, Eva Jennische. Increased level of C3c in affinity-purified human plasma after stimulation of Antisecretory Factor using SPC® Manuscript in preparation
6. Al-OlamaM, HanssonHA, LangeS. Acute lowering of raised intracranial pressure after a brain injury at no side effects by the peptide AF-16. Manuscript in preparation
