1
Examensarbete
Jämförelse och utvärdering av tre
kromogena medier för detektion av
Extended-spectrum β-lactamase hos
Enterobacteriaceae
Jämförelse och utvärdering av tre kromogena medier för detektion av
Extended-spectrum β-lactamase hos Enterobacteriaceae
Ida Svensson
Examensarbete, Biomedicinsk laboratorievetenskap 15 hp Filosofie Kandidatexamen
Handledare: Medicinsk chef, Annika Wistedt, Klinisk mikrobiologi och vårdhygien, Hus 17 Länssjukhuset 391 85 Kalmar
Forskarassistent, Karin Holmfeldt, Institutionen för Biologi och Miljö, Linnéuniversitetet 392 31 Kalmar
Examinator: Universitetslektor, Britt-Inger Marklund, Institutionen för Kemi och Biomedicin, Linnéuniversitetet 391 82 Kalmar
Examensarbetet ingår i Biomedicinska analytikerprogrammet 180 hp
Sammanfattning
Kliniska användandet av antibiotika är under ett allt större hot då bakterier har utvecklat resistens mot många klasser av antibiotika som används i sjukvården.
Resistensgener hos bakterier finns kromosomalt eller burna av plasmider som kan förvärvas från andra bakterier. Spridning av resistens mot β-laktamantibiotika är oroande hos Enterobacteriaceae där inte många antibiotikaalternativ finns. Några plasmidburna β-laktamaser med ett utökat spektrum (ESBL) har blivit vanligare. Syftet med studien var jämförelse och utvärdering av tre kommersiella kromogena medier (CHROMagar™ C3GR, Chromatic™ ESBL+AmpC och CHROMagar™
mSuperCARBA™) selektiva för ESBL-producenter och jämföra dessa mot nuvarande metod (selektivt medium för gramnegativa bakterier och antibiotikadiskar). Kända stammar (11 st) med ESBLA / ESBLM tillväxte på C3GR och ESBL+AmpC men
tendens till starkare tillväxt fanns på ESBL+AmpC. mSuperCARBA™ detekterade samtliga (14 st) karbapenemresistenta stammar. Vid jämförelse av 85 kliniska prov som analyserades med nuvarande metod för detektion av ESBL-producerande bakterier, och kromogena medier detekterades alla nio positiva för ESBLA på C3GR och
ESBL+AmpC. Två ESBLM-producenter detekterades med säkerhet på ESBL+AmpC
men ej på C3GR. Bland de negativa proverna gav 11växt på C3GR och sju på
ESBLCARBA-producenter bättre än nuvarande metod som missade vissa. Slutsats från
studien blev att ESBL+AmpC gav bättre tillväxt och selekterade bort fler arter och isolat som bar på minskad känslighet mot cefalosporiner men ej klassificerades som ESBL-producerande. Användning av medierna ESBL+AmpC och mSuperCARBA i kombination som ersättning för nuvarande metod innebär ökad känslighet och förenklad avläsning.
Abstract
The clinical use of antibiotics is becoming less successful as bacteria have developed resistance to many antibiotics used in health care. Resistance genes in bacteria are chromosomal or carried by plasmids that can be acquired from other bacteria. The resistance to β-lactam antibiotics is particularly worrying in Enterobacteriaceae where there are few options available for treatment. Some plasmid-encoded β-lactamases with extended spectrum (ESBLs) have become common. The aim of the study was to compare and evaluate three commercial chromogenic media (CHROMagar™ C3GR,
Chromatic™ ESBL+AmpC and CHROMagar™ mSuperCARBA™) selective for ESBL-producing bacteria and comparing them to the current method using selective medium for gram negative bacteria and antibiotic disks. All known ESBL-producing strains tested (11) with ESBLA or ESBLM grew on C3GR and ESBL+AmpC but there
was a tendency towards stronger growth on ESBL+AmpC. mSuperCARBA™ detected all tested (14) carbapenem-resistant strains. In an analysis of 85 clinical samples, the chromogenic media detected all positive ESBLA producers, both C3GR and
ESBL+AmpC. Two positive ESBLM producerswere detected by ESBL+AmpC with
certainty but not on C3GR. Among the negative samples 11 gave growth on C3GR and
seven on ESBL+AmpC. These bacteria had a slightly decreased cephalosporin sensitivity but were not classified as ESBL producers. mSuperCARBA™ detected ESBLCARBA producers better than the current method. The conclusion was that
ESBL+AmpC gave better growth and was more selective against species and isolates carrying reduced susceptibility to cephalosporines, without being ESBL producing. ESBL+AmpC and mSuperCARBA™ could be used together for detecting the ESBL producing bacteria to increase sensibility.
Nyckelord
Förkortningar
AmpC= Class C cephalosporinases CAZ= Ceftazidim
CMY= Cephamycinase
CPE= Carbapenem-producing Enterobacteriaceae CTX= Cefotaxim
CTX-M= Cefotaximase-München DDT= Double disk diffusion test ESBL= Extended-spectrum β-lactamase IMP= Imipenemase
KPC= Klebsiella pneumoniae carbapenemase MER= Meropenem
NDM= New Delhi Metallo-β-lactamase OXA= Oxacillin
SHV= Sulfhydril variabel TEM= Temoniera
Innehållsförteckning
-- 1 --
Introduktion
Det kliniska användandet av antibiotika, för effektiv behandling av infektioner orsakade av bakterier, är under ett allt större hot då bakterier har utvecklat resistens mot många klasser av antibiotika som används dagligen i sjukvården (1). Det är bakterier som tidigare har varit mottagliga för antibiotika men som har förvärvat gener från andra bakterier genom horisontell överföring av plasmider, där genen finns lokaliserad, eller genom spontana mutationer av gener som finns kromosomalt (1, 2). De gener som finns kromosomalt hos bakterien kan överföras till andra bakterier inom samma art genom vertikal överföring när bakterien replikerar sig medan de plasmidmedierade generna kan överföras mellan bakterier inom samma art eller mellan olika arter (1, 2). Plasmider kan samtidigt bära på resistensgener mot många olika antibiotikaklasser som β-laktam-antibiotika, aminoglykosider, makrolider, tetracyklin och kinoloner och leder då till multiresistens (2).
Gramnegativa bakterier har en naturlig resistens mot många antibiotika som är effektiva mot grampositiva bakterier då yttermembranet är impermeabelt mot flera antibiotika (3). Infektioner orsakade av gramnegativa bakterier är svåra att behandla på grund av att det inte finns så många antibotikaalternativ (1, 2). Särskilt spridningen av resistens mot β-laktamantibiotika hos Enterobacteriacae är oroväckande då det kan innebära att till exempel urinvägsinfektioner, postoperativa infektioner och infektioner i samband med immunosuppression kan bli svåra att behandla (4).
Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae är en stor grupp av gramnegativa bakterier och dessa är fakultativt
anaeroba stavar med hög tillväxthastighet och omfattar > 150 bakteriearter som ingår i den normala tarmfloran hos människor (3). Cirka 25 av dessa bakteriearter är
medicinskt betydelsefulla som bland annat Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae och
Enterobacter cloacae. Dessa är också de vanligaste bakterierna som orsakar
urinvägsinfektion, intra-abdominala infektioner, vårdrelaterade infektioner och infektioner i blodet (3, 5, 6).
β-laktamantibiotika
- 2 -
gynsamma biverkningsprofil och inkluderar penicilliner, cefalosporiner, monobaktamer och karbapenemer (7). Penicillin (bensylpenicillin) upptäcktes 1928 och utvanns från mögelsvampen Penicillium notatum och var effektiv mot grampositiva bakterier men inte gramnegativa bakterier på grund av deras yttermembran (3). Dock var denna
penicillin olämplig att tas oralt då den snabbt bröts ned av magsyran och kan därför bara ges intravenöst. En modifikation gjordes för att få fram ett medel som kunde tas oralt och detta resulterade i den syrastabila formen fenoximetylpenicillin. Ampicillin är en vidareutvecklad syrastabil penicillin som är aktiv mot många gramnegativa bakterier. Piperacillin är en vidareutveckling av ampicillin med en ökad effekt och används ofta i kombination med β-laktamashämmaren tazobaktam (3). Cefalosporiner är antibiotika med ett bredare antibakteriellt spektrum och fungerar mot gramnegativa bakterier och kan klassificeras i olika generationer där cefadroxil (CDR) är en första generationens cefalosporin medan cefotaxim (CTX) och ceftazidim (CAZ) ingår i tredje generationens cefalosporiner och kallas även för oxyiminocefalosporiner (8). Karbapenemer används ofta mot multiresistenta gramnegativa bakterier och har ett bredare spektrum än penicilliner och cefalosporiner (3). Meropenem (MER) är en karbapenem som är mycket resistent mot β-laktamaser och cefalosporinaser (9).
Resistens mot β-laktamantibiotika
Hos gramnegativa bakterier är produktion av laktam-nedbrytande enzymer, β-laktamas, den största bidragande orsaken till resistens mot β-laktamantibiotika och inaktiverar den typen av antibiotika genom hydrolys (10). Infektioner med
multiresistenta Enterobacteriaceae är inte behandlingsbara med de antibiotika som rutinmässigt används. Det är därför viktigt att se hur resistensmönster ser ut för de bakterier som orsakar infektioner, speciellt för de som bär på multiresistensgener samt att förebygga spridningen på sjukhus för dessa bakterier (11).
Klassificering av β-laktamaser
β-laktamaser klassificeras enligt två traditionella system; Ambler molecular
- 3 -
metallo-β-laktamaser som behöver divalenta zinkjoner för hydrolys (8, 12, 13). Klassificering av β-laktamaser enligt Bush-Jacoby-Medeiros delar in enzymerna med avseende på funktionella likheter och det finns fyra huvudgrupper (1 till 4) och flera subgrupper i detta system (Tabell I) (12). Systemet är mer användbart för
mikrobiologiska laboratorier då det beaktar de inhibitorer och substrat för β-laktamas som är kliniskt relevanta (12).
Tabell I. Översikt och jämförelse mellan olika sätt att klassificera β-laktamaser samt deras aktivitet och exempel på specifika resistensgener inom varje klass.
Svensk klassificering
Bush-Jacoby-Medeiros Ambler Inhiberas av klavulansyra
Gener Aktiv mot ESBLM (endast
plasmidburen)
Grupp 1:
Cefalosporinaser
Klass C Nej AmpC, CMY
Cefalosporiner, cefamyciner
Grupp 2a: Penicillinaser Klass A Ja PC1 Benzylpenicillin+ derivat av penicilliner
Grupp 2b: Bred-spektrum β-laktamaser
Klass A Ja TEM, SHV Penicilliner och tidiga generationer cefalosporiner
ESBLA Grupp 2be:
Extended-spectrum β-lactamase Klass A Ja TEM, SHV, CTX Penicilliner och cefalosporiner
Grupp 2br: Inhibitor-resistenta enzymer
Klass A Nej TEM, SHV Klavulansyra, tazobaktam, sulbaktam.
Grupp 2c: Karbenicillinaser
Klass A Ja PSE, CARB Carbenicillin
ESBLM eller ESBLCARBA Grupp 2d: Cloxacillinaser/oxacillinas er Klass A
och D Varierad OXA Cloxacillin/ oxacillin
Grupp 2e:
Cefalosporinaser Klass A Ja CepA Extended-spektrum cefalosporiner
ESBLCARBA Grupp 2f:
Karbapenemaser (serin-baserad)
Klass A Varierad KPC, IMI Karbapenemer
ESBLCARBA Grupp 3:
Metallo-β-laktamaser (zink-baserad)
Klass B Nej IMP, VIM, NDM Karbapenemer Grupp 4: Penicillinaser (inhiberas inte av klavulansyra) Ingen klassifikat ion Penicilliner
De bakterier som bär på multiresistens mot laktamantibiotika bär oftast på β-laktamaser som klassificeras som/i grupp 2 och 3 (A, B och D).
- 4 -
Subgrupp 2a innehåller penicillinaser som utgör en liten grupp inom β-laktamaserna med ett smalt spektrum av hydrolysaktivitet och finns främst hos grampositiva kocker och enterokocker. Dessa enzymer hydrolyserar benzylpenicillin och andra derivat av penicilliner medan de har sämre hydrolysaktivitet mot cefalosporiner, karbapenemer och monobaktamer. β-laktamaserna i denna subgrupp är huvudsakligen kromosomala och inhiberas av klavulansyra och tazobaktam (8, 13).
Subgrupp 2b innehåller β-laktamaser som hydrolyserar penicilliner och tidiga
generationer av cefalosporiner och inhiberas starkt av klavulansyra och tazobaktam. De flesta av dessa enzymer hör till den plasmidmedierade enzymfamiljen Temoniera
(TEM) och sulfhydril variabel (SHV) speciellt TEM-1 och TEM-2 samt SHV-1 (8, 13). TEM-1 är det mest vanligt förekommande β-laktamaset för ampicillinresistens hos gramnegativa bakterier, exempelvis E. coli. SHV-1 produceras till största delen av K.
pneumoniae (12).
Subgruppen 2be innehåller enzymer med hydrolysaktivitet liknande den hos enzymerna i subgrupp 2b men med utökad hydrolys av tredje generationens cefalosporiner som CTX, CAZ och aztreonam. De flesta enzymerna inom subgrupp 2be härstammar från TEM-1, TEM-2 och SHV-1 men aminosyrasubstitutioner har gjort att dessa enzymer ökat sitt substratspektrum mot flertalet β-laktamantibiotika (13). Förekomst av en annan familj av ESBL, CTX-M, som är släkt med kromosomala β-laktamaser som finns hos
Kluyvera, har ökat snabbt runt om i världen (8, 12, 13). Namnet härstammar från
enzymets resistens mot CTX samt att det upptäcktes i München, varav bokstaven M (14). Denna familj av ESBL är den snabbast växande runt om i världen och nu den vanligaste som upptäcks i kliniska isolat (10, 12, 14).
- 5 -
Subgrupp 2f innehåller karbapenemaser som har förmåga att hydrolysera karbapenemer med serin i aktivt site. Den plasmidmedierade familjen K. pneumoniae- carbapenemase (KPC)-enzymer har blivit associerad med stora utbrott av multiresistenta gramnegativa infektioner på sjukhus runt om i världen (9, 12, 13).
Grupp 3 innehåller metallo-β-laktamaser (Ambler klass B) med zinkjoner som kofaktor som hydrolyserar karbapenemer. Dessa enzymer produceras ofta i kombination med ett andra eller tredje β-laktamas hos kliniska isolat. Till skillnad från serin-baserade
karbapenemaser har dessa enzymer sämre hydrolytisk kapacitet för monobaktamer och inhiberas inte av klavulansyra eller tazobaktam. En stor familj av plasmidmedierade metallo-β-laktamaser är imipenemase- (IMP) och verona imipenemase (VIM)- enzymer som förekommer runt om i världen vanligast hos icke-fermenterade bakterier men även hos Enterobacteriacae (13).
Extended-spectrum β-lactamase (ESBL)
ESBL-enzymerna har förmågan att hydrolysera de flesta β-laktamantibiotika som används i sjukvården idag och orsakar stora kliniska problem runt om i världen. Den ursprungliga definitionen för ESBL är enzym som ger hydrolys av 3:e generationens cefalosporiner (8), har ett serinbaserat aktivt site och inihiberas generellt av
β-laktamasinhibitorer som klavulansyra, sulbaktam eller tazobaktam (8). ESBL kodas till största delen av stora plasmider som har storleken 100 kb eller större och som kan överföras mellan olika bakteriestammar och även mellan olika bakteriearter.
Enzymernas ursprung är TEM-, SHV- eller OXA- penicillinaser som genom evolution genomgått aminosyraförändringar som lett till strukturella förändringar i det aktiva sitet av enzymet. Dessa mutationer förändrade aktiviteten hos β-laktamaserna så att dessa blev effektiva mot tredje generationens cefalosporiner (8). ESBL-producerande
bakterier upptäcktes för första gången 1983 och sedan dess har dessa snabbt spridit sig runt om i världen och varit orsaken till flertal infektionsutbrott. De senaste 10 åren har frekvensen av ESBL-producerande isolat ökat och är nu ett stort problem vid sjukvård, till exempel vid intensivvårdsavdelningar i stora delar av världen (8).
Klassificering av ESBL i Sverige
- 6 -
ESBLCARBA (15). I den första gruppen, ESBLA, finns de ”klassiska” enzymerna som
bryter ned 3:e generationens cefalosporiner och inhiberas av klavulansyra och tazobaktam (6, 11). Den andra gruppen, ESBLM, innehåller de enzymer som inte
inhiberas av klavulansyra och tazobaktam men kan ofta inhiberas av kloxacillin istället. Här ingår de β-laktamaser som hör till AmpC-gruppen. I den sista gruppen, ESBLCARBA,
finns de enzymer som ger resistens mot karbapenemer, de finns hos carbapenemas-producing Enterobacteriaceae (CPE) och ger även resistens mot 3:e generationens cefalosporiner (6, 11, 15). Vid vissa fall kan bakterier som producerar ESBLA eller
ESBLM vara resistenta mot karbapenemer utan att producera karbapenemaser. Detta kan
bero på att bakterien har förvärvat andra resistensgener, till exempel impermeabilitet mot karbapenemer och dessa klassificeras inte som ESBLCARBA-producenter. De
bakterier som producerar ESBLCARBA, OXA-48 enzymer, kan i vissa fall varken
uttrycka intermediär känslighet eller resistens mot meropenem eller imipenem in vitro och enzymet har därmed inte lika stark karbapenem-hydrolys-aktivitet som andra karbapenemaser (11).
Resistensläget i Sverige av ESBL-produce rande bakterier
Under 2014 anmäldes enligt Folkhälsomyndigheten 8 902 fall av Enterobacteriaceae med ESBL vilket var en ökning med 9% från året innan. Det var E. coli som var den dominerande bakteriearten (89%) och därefter kom K. pneumoniae (7%). De flesta fynden gjordes i urinprover. Under 2014 anmäldes även 46 fall med infektioner av ESBLCARBA-producerande bakterier med OXA-48 och NDM som de vanligaste
enzymerna. Under 2014 var 5% av alla E. coli från kliniska prov ESBL-producerande (16).
Detektion av ESBL-stammar och konfirmation av resistensmekanismer
För att upptäcka ESBL-producerande bakterier används ofta en screeningmetod för att detektera nedsatt känslighet mot 3:e generationens cefalosporiner samt ett fenotypiskt konfirmationstest för att se en synergieffekt mellan en cefalosporin och en
- 7 -
inhibitionszon < 25 mm för CAZ, <29 mm för CTX och/eller <33mm för MER eller inväxt av enstaka kolonier i zon så undersöks isolaten närmare. För misstänkta isolat utförs resistensbestämning med diskdiffusion enligt EUCAST och dessutom double disk diffusion test (DDT). Detta är ett fenotypiskt konfirmationstest med
amoxicillin-klavulansyra som β-laktamasinhibitor och appliceras i mitten på en Mueller-Hinton platta och cefalosporiner som CTX, CAZ, cefepim och cefoxitin appliceras runt amoxicillin-klavulansyran med 25 mm mellanrum för att kontrollera synergi mellan dessa (8, 18). Finns en synergi är detta en indikation på att bakterien producerar ESBLA
(8, 18). Observeras ingen synergi utförs ett nytt DDT med kloxacillin som
β-laktamasinhibitor. Observeras nu en synergi indikerar detta på att bakterien producerar ESBLM eller kromosomal AmpC (18). Denna screeningmetod som för närvarande
används på laboratoriet har svårt att upptäcka ESBLCARBA-produktion med lågt uttryckt
OXA-48 och även låga koncentrationer av bakterier som producerar ESBL kan vara svåra att upptäcka då zonerna runt antibiotikadiskarna kan bli större än de gränsvärden varje antibiotikadisk har. Materialkostnaden för screening av ESBL är 9 kr/prov.
De kromogena medierna kombinerar upptäckt av ESBL-producerande bakterier med identifiering av organismen. Dessa medier innehåller kromogena substrat som färgar bakteriekolonierna då de hydrolyseras av specifika enzymer hos bakterierna. Mediet innehåller även selektiva kombinationer av antibiotika för växt av ESBL-producerande bakterier (4). CHROMagar™ (Paris, Frankrike) är två kromogena medier (C3GR och
mSuperCARBA™). C3GR detekterar gramnegativa bakterier som producerar
β-laktamas och AmpC medan mSuperCARBA™ detekterar bakterier som producerar karbapenemaser (19, 20). Liofilchem (Roseto degli Abruzzi, Italien) har utvecklat ett kromogent medium (Chromatic™ ESBL+AmpC) för detektion av ESBL-producerande
Enterobacteriacae och AmpC-producerande bakterier (21). Dessa tre kromogena medier valdes för detektion med hög känslighet av ESBLA, ESBLM och ESBLCARBA
(framförallt OXA-enzymer). Medierna kan produceras på laboratoriet. Materialkostnaden för plattorna är cirka 15 kr/platta.
Syfte
- 8 -
Material och metod
Allt laborativt arbete utfördes med sterilteknik.
Kontrollstammar och kliniska stammar
Som känsliga kontrollstammar användes E. coli CCUG 17620, Enterococcus faecalis CCUG 9997 och P. aeruginosa CCUG 17619. De positiva (resistenta)
kontrollstammarna var K. pneumoniae CCUG 45421 som producerar ESBLA, E. coli
(Isolat 13 från CPE-studie) som producerar ESBLM och K. pneumoniae CCUG 64452
som producerar ESBLCARBA. Dessa kontrollstammar odlades på blodagarplattor och
förvarades i kyl. Kliniska stammar förvarades frysta (-70°C). Dessa var E. coli, K.
pneumoniae, Proteus mirabilis, Citrobacter freundii och E. cloacae (Tabell II).
Både de negativa och positiva kontrollstammarna och de utvalda kliniska stammarna som producerar ESBLA, ESBLM och ESBLCARBA (Tabell II) samt isolat från en
CPE-studie, som är en pågående nordisk metodstudie för diagnostik av ESBLCARBA-isolat
med genetiskt väldefinierade stammar som hade utförts på det kliniska laboratoriet tidigare under året, spreds på blodagarplattor med steril 1 µL platinös.
- 9 - Tabell II. De kontrollstammar och utvalda kliniska stammar som använts i studien. Under provtyp finns information om var ifrån bakterien isolerades och mekanism innebär vilken typ av enzym bakterien producerar. Vid de tre högra kolumnerna markerar X vilka kromogena medier som bakterien odlats ut på, CHROMagar™ C3GR (C3GR), Chromatic™ ESBL+Amp C (ESBL+) och CHROMagar™
mSuperCARBA™ (sC).
Kontrollstam Art (isolat) Provtyp Resistens-mekanism
C3G
R ESBL+ sC
Neg. ESBL E. coli (CCUG 17620) X X X
Neg. ESBL E. faecalis (CCUG 9997) X X X
Neg. ESBL P. aeruginosa (CCUG 17619)
X X X
ESBLA K. pneumoniae (CCUG
45421)
X X X
ESBLM E. coli (Isolat 13 CPE-studie)
CMY X X X
ESBLCARBA K. pneumoniae (CCUG 64452) X X X ESBLA 880 E. coli Blod X X X 8040 E. coli Urin X X 816 K. pneumoniae Urin X X 976 P. mirabilis Urin X X 716 E. coli Urin X X ESBLM
397 E. coli Blod AmpC-plasmid X X X
442 C. freundii Blod Kromosomal
AmpC
X X X
2073 E. coli Blod AmpC-plasmid X X X
ESBLCARBA 957 E. cloacae Urin X 831 E. coli Rectum-faeces OXA-48 X 660 E. coli Rectum-faeces OXA-48 X X X 539 E. coli Rectum-faeces OXA-48 X 540 E. coli Rectum-faeces OXA-48 X 651 E. coli Rectum-faeces OXA-48 X 466 E. coli Rectum-faeces OXA-48 X 196 E. cloacae Buksekr et X X X 673 K. pneumoniae Urin NDM X X X CPE-studien
Isolat 3 E. cloacae IMI-9 X
Isolat 4 K. pneumoniae KPC-2 X
Isolat 11 Citrobacter NDM-1 X
Isolat 23 E. coli OXA-181 X
Isolat 24 E. coli IMP-26 X
- 10 -
Kontrollstammar och de utvalda kliniska stammarna odlades ut på CHROMagar™ C3GR, Chromatic™ ESBL+AmpC och CHROMagar™ mSuperCARBA™ enligt Tabell
II och inkuberades i en termostat (aerob miljö 35-37°C) i 18-24 timmar (19-21).
Isolat från fyra kliniska prov från allmän avdelning (Tabell III) som hade
resistensbestämts och visade känslighet mot cefalosporiner valdes ut som negativa kontroller och odlades ut på CHROMagar™ mSuperCARBA™, CHROMagar™ C3GR
och Chromatic™ ESBL+AmpC. Plattorna inkuberades i en termostat (aerob miljö 35-37°C) i 18-24 timmar.
Tabell III. Utvalda kliniska isolat från daglig produktion från allmän avdelning som var negativa för ESBL efter resistensbestämning.
Negativa
ESBL Art Provtyp C3G
R ESBL+ sC
6621 E. coli Sårsekret X X X
7264 E. coli Rectum-faeces X X X
7270 E. coli Urin X X X
7272 E. coli Rectum-faeces X X X
Kontroll av känslighet hos de kromogena medierna Spädning av bakteriestammar
För varje bakteriestam från Tabell II gjordes en spädningsserie (1:101, 1:102, 1:103,
1:104 och 1:105). Detta utfördes genom att från blodagarplattor ta bakteriekolonier med
sterila bomullspinnar och suspendera i plaströr innehållande 1000 µL 0,9% NaCl-lösning så att bakteriesuspensionen fick en grumlighet på McFarland 0,5 ± 0,1 som kontrollerades med en kalibrerad DensiCHEK™ plus (Biomérieux, Marcy l'Etoile, Frankrike). Från bakteriesuspensionerna överfördes 100 µL till nya plaströr
innehållande 900 µL NaCl-lösning så varje bakteriestam späddes 1:10 och fick spädningen 1:101. Detta upprepades så att en spädningsserie för varje bakteriestam
erhölls. Från bakteriesuspensioner med spädningen 1:104 och 1:105 togs 10 µL upp med
en automatpipett och applicerades på blodagarplattor och spreds ut med 1 µL platinös för beräkning av colony forming units/mL (CFU/mL) och kontroll av spädningarna.
Tillsats och detektion av kända ESBL-stammar i faecesprov (spikade prover)
- 11 -
applicerades på blodagarplattor och Juhlin32-plattor och spreds ut på hela plattan med 1µL platinös för kontroll av faecesprovet. På Juhlin32-plattorna applicerades
antibiotikadiskarna CTX (5 µg), CAZ (10 µg) och MER (10 µg) (Biomérieux, Marcy l'Etoile, Frankrike). Från faeceslösningen togs 90 µL upp med automatpipett och tillsattes till två nya plaströr per bakteriestam. Till dessa 90 µL faeceslösning tillsattes 10 µL av bakteriesuspensionerna med spädning 1:103 och 1:104 så de spikade proverna
fick en slutgiltig spädning av stam på 1:104 och 1:105. Från varje spädning togs 10 µL
upp med automatpipett och applicerades på en blodagarplatta, Juhlin32-platta, CHROMagar™ C3GR, Chromatic™ ESBL+AmpC och CHROMagar™
mSuperCARBA™ och spreds ut med 1 µL platinös över hela plattan. Till Juhlin32-plattan applicerades antibiotikadiskarna CTX, CAZ och MER. Alla plattorna inkuberades i en termostat (aerob miljö 35-37°C) i 18-24 timmar (19-21).
Parallell utodling av kliniska prover
Kliniska prover, 85 stycken faeces-rectumprover, som kom in till laboratoriet under veckorna 16-19 med begäran om screening för ESBL-producerande bakterier odlades ut på Juhlin32-plattor enligt nuvarande screeningmetod med antibiotikadiskarna CTX, CAZ och MER. Alla dessa prover odlades även ut på CHROMagar™ C3GR,
Chromatic™ ESBL+AmpC och CHROMagar™ mSuperCARBA™ där proverna ströks ut tätt och en spridning gjordes från det täta stryket. Alla plattorna inkuberades i en termostat (aerob miljö 35-37°C) i 18-24 timmar (19-21). Avläsning skedde tillsammans med tjänstgörande biomedicinsk analytiker på laboratoriet och svar rapporterades enligt ordinarie rutiner.
Resultat
Kontrollstammar och kliniska stammar
Från de positiva kontrollstammarna (ESBLA, ESBLM och ESBLCARBA) som odlades ut
på CHROMagar™ C3GR (Figur 1A) och Chromatic™ ESBL+AmpC (Figur 1B)
observerades växt av mörkblåa/grönblåa kolonier av K. pneumoniae som producerade ESBLA och rosa/ljusrosa kolonier av E. coli som producerade ESBLM medan K. pneumoniae som producerade ESBLCARBA växte svagt med mörkblåa/grönblåa kolonier
och med ett rosa färgomslag på CHROMagar™ C3GR (Figur 1A). På Chromatic™
ESBL+AmpC växte alla tre även K. pneumoniae som producerade ESBLCARBA rikligt
- 12 -
2B) av E. coli och E. faecalis men det förekom färgomslag på de kromogena medierna (Figur 2). P. aeruginosa växte sparsamt på CHROMagar™ C3GR (Figur 2A) och rikligt
på Chromatic™ ESBL+AmpC (Figur 2B) med ett gult färgomslag på de kromogena medierna.
Figur 1. Utodling av de positiva kontrollstammarna (ESBLA, ESBLM och ESBLCARBA) på (A)
CHROMagar™ C3GR och (B) Chromatic™ ESBL+Amp C.
Figur 2. Utodlade negativa kontrollstammar på (A) CHROMagar™ C3GR och (B) Chromatic™
- 13 -
De positiva kontrollstammarna för ESBL som odlades ut på CHROMagar™
mSuperCARBA™ gav växt av rosa kolonier av E. coli som producerade ESBLM och
mörkblåa kolonier av K. pneumoniae som producerade ESBLCARBA. Ingen växt av K. pneumoniae som producerade ESBLA observerades men ett färgomslag i mediet
förekom (Figur 3A). Av de negativa kontrollerna observerades ingen växt på CHROMagar™ mSuperCARBA™ av E. coli och E. faecalis men det förekom färgomslag i mediet. P. aeruginosa växte sparsamt på CHROMagar™
mSuperCARBA™ med ett färgomslag i mediet (Figur 3B).
Figur 3. Positiva kontrollstammar (ESBLA, ESBLM och ESBLCarba) utodlade på CHROMagar™
mSuperCARBA™ (A) samt negativa kontroller för ESBL utodlade på CHROMagar™ mSuperCARBA™ (B).
Vid utodling på CHROMagar™ C3GR och Chromatic™ ESBL+AmpC observerades
växt av samtliga kliniska stammar som producerade ESBLA, ESBLM och de två
stammarna som producerade ESBLCARBA och karbapenemas (Tabell IV) (se exempel i
Figur 4A och B). Vid utodling på CHROMagar™ mSuperCARBA™ observerades växt av samtliga stammar som producerade ESBLCARBA och isolat från CPE-studie (Figur
4C). Ingen växt av stammar som producerade ESBLA och stammar som producerade
- 14 - Figur 4. Utvalda stammar bärande på karbapenemresistens utodlade på CHROMagar™ C3GR (A),
Chromatic™ ESBL+AmpC (B) och CHROMagar™ mSuperCARBA™ (C).
Av de utvalda kliniska isolaten som visade känslighet mot cefalosporiner (Tabell III) och odlades ut på CHROMagar™ C3GR, Chromatic™ ESBL+AmpC och
CHROMagar™ mSuperCARBA™ observerades ingen växt på någon av plattorna, bara färgomslag av det kromogena mediet (Figur 5).
Figur 5. Kliniska isolat negativa för ESBL som är utodlade på (A) CHROMagar™ C3GR, (B)
Chromatic™ ESBL+AmpC och CHROMagar™ mSuperCARBA™ (C).
Tabell IV. Sammanställning av resultaten från utodling på de kromogena medierna av kontrollstammar och kliniska stammar som producerar ESBLA, ESBLM och karbapenemresistens samt isolat från
- 15 -
CHROMag ar™ C3GR Chromatic™
ESBL+AmpC
CHROMag ar™ mSuperCARBA™
Kontrollstammar
Neg. ESBL Växt av P. aeruginosa Växt av P. aeruginosa Växt av P. aeruginosa
ESBLA Växt Växt Ingen växt ESBLM Växt Växt Växt ESBLCARBA Växt Växt Växt Kliniska stammar ESBLA Växt av samtliga 5 stammar Växt av samtliga 5 stammar Ingen växt ESBLM Växt av samtliga 3 stammar Växt av samtliga 3 stammar Ingen växt
ESBLCARBA Växt av stam 660 och 196 som utodlades.
Växt av stam 660 och 196 som utodlades
Växt av samtliga 9 stammar
CPE-studien Inga data Inga data Växt av samtliga 6 stammar
Kliniska isolat neg. ESBL
Ingen växt Ingen växt Ingen växt
Kontroll av känslighet hos de kromogena medierna
Vid kontroll av spädningarna 1:104 och 1:105 av bakteriesuspensionerna där 10 µL
ströks ut på hela blodagarplattor observerades växt mellan 75-170 kolonier (7,5x107 –
1,7x108 CFU/mL) av alla bakteriestammar vid spädningen 1:104 och 5-20 kolonier
(5x107 – 2x108 CFU/mL) vid spädningen 1:105 (Bilaga II, Tabell VII och VIII).
Vid kontroll av faecesproverna som odlades ut på blodagarplatta och Juhlin32-platta med antibiotikadiskar observerades riklig växt på blodagarplattan och Juhlin32-plattan med stora zoner runt antibiotikadiskarna.
De spikade proverna som innehöll faeces som grundmaterial och kliniska stammar (ESBLA, ESBLM och ESBLCARBA) som var spädda 1:104 och 1:105 odlades ut på
Juhlin32-plattor, CHROMagar™ C3GR, Chromatic™ ESBL+AmpC och
CHROMagar™ mSuperCARBA™. För stammar som producerade ESBLA och ESBLM
observerades generellt en bättre tillväxt på Chromatic™ ESBL+AmpC än på
CHROMagar™ C3GR (Figur 6) och ingen växt på CHROMagar™ mSuperCARBA™
förutom för den positiva kontrollstammen för ESBLM (Isolat 13) som växte på
mSuperCARBA beräknad halt 3,7x107 CFU/mL från spädningen 1:104 och 1,1x108
CFU/mL från spädningen 1:105 (Bilaga II, Tabell VII och VIII). CHROMagar™ C3GR
detekterade inte två kliniska stammar som producerade ESBLA (880 och 8040) vid
- 16 - Figur 6. Stapeldiagram som visar CFU/mL, beräknat från spädning 1:104, hos samtliga stammar som
producerade ESBLA och ESBLM som var utodlade på blodagar, CHROMagar™ C3GR, Chromatic™
ESBL+Amp C och CHROMagar™ mSuperCARBA™.
För stammar som producerade ESBLCARBA samt isolaten från CPE-studien observerades
oftast en bättre tillväxt på Chromatic™ ESBL+AmpC för de stammar som växte på alla tre kromogena medier (Figur 7). För stammar som producerade ESBLCARBA
observerades växt av samtliga stammar på CHROMagar™ mSuperCARBA™ medan det bland isolat från CPE-studien inte observerades tillväxt på mSuperCARBA av isolat 3 och isolat 24 (Figur 7).
Figur 7. Stapeldiagram som visar CFU/mL, beräknat från spädning 1:104, av samtliga stammar bärare på
karbapenemresistens och isolat från CPE-studie som var utodlade på blodagar, CHROMagar™ C3GR,
Chromatic™ ESBL+AmpC och CHROMagar™ mSuperCARBA™.
0,00E+00 2,00E+07 4,00E+07 6,00E+07 8,00E+07 1,00E+08 1,20E+08 1,40E+08 1,60E+08 1,80E+08
ESBL-A och ESBL-M
- 17 -
Vid utodling på Juhlin32 med antibiotikadiskar observerades ofta en riklig växt av både bakgrundsbakterier från faeceslösningen och de tillsatta kliniska stammarna som
producerade ESBLA, ESBLM och ESBLCARBA. Hos stammar som producerade på
ESBLA och ESBLM observerades växt intill antibiotikadiskarna CTX och/eller CAZ av
samtliga stammar vid spädningen 1:104. För stammar som producerade ESBLCARBA och
isolat från CPE-studien observerades växt mot CTX och/eller CAZ vid spädningen 1:104 av samtliga förutom isolat 3 och kontrollstammen för ESBLCARBA (Bilaga II,
Tabell VI) då dessa bedömdes som känsliga från zondiametern. Generellt var zondiametern kring MER på gränsvärdet eller större hos samtliga stammar som
producerade ESBLCARBA. För fyra av åtta stammar låg zondiametern kring MER på
28-30 mm vid spädningen 1:104, resterande fyra hade en zondiameter över 33 mm. Vid
spädningen 1:105 var det bara en av åtta stammar som hade en zondiameter < 33 mm
kring MER. Av isolat från CPE-studien var det tre av sex isolat som hade en zondiameter <33 mm vid spädningen 1:104. Vid 1:105 var det ingen som hade en
zondiameter <33 mm (Bilaga II, Tabell VI).
Parallell utodling av kliniska prover
Av de 85 kliniska prover som kom in under vecka 16-19 var 74 prov negativa för ESBL-producerande bakterier. Av dessa 74 negativa prover observerades växt på CHROMagar™ C3GR från 11 prover och sju växte på Chromatic™ ESBL+AmpC
(Tabell V). Ingen av de negativa proverna gav växt på CHROMagar™
mSuperCARBA™. Bakteriearterna som växte från de 11 proverna var icke-ESBL-bärande E. coli, C. freundii, P. aeruginosa, E. cloacae, Serratia fonticola, Klebsiella
oxytoca och Morganella morganii (Bilaga II, Tabell IX). Flera av dessa stammar
uppvisade lätt sänkt cefalosporin-känslighet som ej var ESBL-relaterad. Av de 85 kliniska proverna var 11 positiva för ESBL-producerande bakterier varav nio var ESBLA- och två ESBLM-producerande. CHROMagar™ C3GR och Chromatic™
ESBL+AmpC detekterade alla 11 positiva proverna. I ett prov med både ESBLA- och
ESBLM-producenter (E. coli) kunde inte ESBLM säkert detekteras från CHROMagar™
C3GR. På Chromatic™ ESBL+AmpC hade dessa stammar tydligt olika koloniutseende.
CHROMagar™ mSuperCARBA™ detekterade ingen av de ESBLA/ESBLM-positiva
- 18 - Tabell V. Sammanställning av resultat från den parallella utodlingen av kliniska prover på
CHROMagar™ C3GR, Chromatic™ ESBL+AmpC och CHROMagar™ mSuperCARBA™.
Antal C3GR ESBL+ sC
Negativa ESBL 74 prover 11 prover 7 prover 0 prover
Positiva ESBL 11 prover (9 ESBLA, 2
ESBLM) 10 prover ( 9 ESBLA, 1 ESBLM) 11 prover (9 ESBLA, 2 ESBLM) 0 prover
Diskussion
Syftet med studien var att jämföra och utvärdera tre kromogena medier, CHROMagar™ C3GR, Chromatic™ ESBL+AmpC och CHROMagar™ mSuperCARBA™, för
detektion av ESBL- och karbapenemas-producerande bakterier med högre känslighet jämfört med nuvarande metod. Den nuvarande metoden använder sig av ett
odlingsmedium, Juhlin 32, som är selektivt för gramnegativa bakterier och förhindrar växt av grampositiva bakterier och applicering av antibiotikadiskarna CTX och CAZ, som är oxyiminocefalosporiner, samt MER som är en karbapenem screenar för ESBL-producerande bakterier. De tre kromogena medierna i denna studie innehöll alla kromogena ämnen för differentiering av olika bakteriearter samt selektiva ämnen för växt av bakterier som producerar ESBL och AmpC eller karbapenemaser (19-21).
CHROMagar™ C3GR och Chromatic™ ESBL+AmpC detekterade alla tre positiva
kontrollstammar (ESBLA, ESBLM och ESBLCARBA) vilket var som förväntat då alla tre
bär på β-laktamaser mot cefalosporiner. CHROMagar™ mSuperCARBA™ detekterade bara den positiva kontrollen för ESBLCARBA vilket var som förväntat då denna bar på
resistens mot karbapenemer vilket de andra två positiva kontrollerna ej gjorde. Ingen av de två känsliga kontrollstammarna CCUG 17620 (E. coli) och CCUG 9997 (E. faecalis) tillväxte på dessa tre medier vilket var som förväntat då de ska vara känsliga mot β-laktamantibiotika. Dock tillväxte den känsliga kontrollstammen CCUG 17619 (P.
aeruginosa) vilket beror på att P. aeruginosa har kromosomal AmpC
- 19 -
CHROMagar™ C3GR och Chromatic™ ESBL+AmpC detekterade samtliga kliniska
stammar som producerade ESBLA (5 st), ESBLM (3 st) och ESBLCARBA (2 st) som
odlades ut på dessa två medier. Ingen tillväxt av känsliga kliniska isolat detekterades vilket var som förväntat. CHROMagar™ mSuperCARBA™ detekterade samtliga kliniska stammar som producerade ESBLCARBA (9 st) samt de kliniska isolaten från
CPE-studien (6 st). Inga kliniska stammar som producerade ESBLA (1st) eller ESBLM
(3 st) samt de känsliga kliniska isolaten (4 st) detekterades av mediet vilket var förväntat då ingen av dessa bär på resistens mot karbapenemer.
Hos alla bakteriestammar som odlades ut på de tre kromogena medierna observerades färgomslag på medierna oavsett om de tillväxte eller ej. Detta kan bero på att enzymer hos bakterier reagerar med det kromogena mediet så att ett färgomslag bildas.
Färgomslaget på det kromogena mediet stämde överens med bakterieartens kolonifärg som uppkom vid tillväxt, vid utodling av till exempel E. coli bildades ett rosa
färgomslag, E. faecalis gav ett grönblått färgomslag och vid utodling av P. aeruginosa sågs ett gult färgomslag.
Vid kontroll av känsligheten hos de kromogena medierna kunde det observeras att tillväxten var generellt högre vid utodling på Chromatic™ ESBL+AmpC än på
CHROMagar™ C3GR för de stammar som producerade ESBLA och ESBLM, både från
spädningen 1:104 och 1:105. På CHROMagar™ C3GR var det lite svårare att detektera
de stammar som producerade ESBLA från spädningen 1:105 då två av sju stammar inte
växte alls vid denna spädning även om de växte vid 1:104. Dock behövs detta test
utföras flera gånger med samma kliniska stammar för att detta resultat ska vara tillförlitligt. För de stammar som bar på ESBLCARBA var tillväxten högre på
Chromatic™ ESBL+AmpC än på både CHROMagar™ C3GR och CHROMagar™
mSuperCARBA™ dock detekterade mSuperCARBA™ alla de kliniska stammar som producerade karbapenemresistens samt den positiva kontrollstammen vid både spädningen 1:104 och 1:105. Isolat från CPE-studien växte generellt bättre på
CHROMagar™ mSuperCARBA™ jämfört med de kliniska stammarna som
producerade ESBLCARBA vilket är rimligt då de flesta av de kliniska stammarna som
- 20 -
fast de växte vid utodling av ren bakteriekultur. Isolat 3 växte inte heller på CHROMagar™ C3GR eller Chromatic™ ESBL+AmpC vilket kan bero på att det
enzym som bakterien producerade inte är aktivt mot oxyiminocefalosporiner. Enzymet som isolat 24 producerade var istället aktivt mot dessa cefalosporiner och bakterien växte också på de båda kromogena medierna (24). Vid utodling på Juhlin32
detekterades bara hälften av de kliniska stammarna som producerade ESBLCARBA och
isolaten från CPE-studien utifrån zondiametern kring MER vilket betyder att den nuvarande metoden inte är tillräckligt känslig för att detektera karbapenemaser vid låga bakteriehalter.
Från den parallella utodlingen av 85 kliniska prover som kom in till laboratoriet under tre veckor så observerades att med den nuvarande metoden så detekterades ESBL-producerande bakterier i 11 av dessa 85 prover varav nio var ESBLA och två ESBLM.
CHROMagar™ C3GR och Chromatic™ ESBL+AmpC kunde detektera alla 11 positiva
prover. I ett av proverna fanns både ESBLA och ESBLM-producerande bakterier. Där
kunde bakterien som producerade ESBLM inte säkert detekteras av CHROMagar™
C3GR medan den kunde med säkerhet detekteras med Chromatic™ ESBL+AmpC då
dessa två ESBL-producerande E. coli hade tydligt olika koloniutseende. CHROMagar™ mSuperCARBA™ detekterade ingen av de 11 proverna vilket var förväntat då dessa bakterier inte bar på någon karbapenemresistens. Av de 74 prover som var negativa för ESBL-producerande bakterier gav 11 växt på CHROMagar™ C3GR och sju på
Chromatic™ ESBL+AmpC medan inget växte på CHROMagar™ mSuperCARBA™. Bakterierna som visade på någon typ av resistens mot cefalosporiner var av arterna E.
coli, C. freundii, P. aeruginosa, E. cloacae, Serratia fonticola, Klebsiella oxytoca och Morganella morganii. Detta observerades även vid utodling på Juhlin32 med
antibiotikadiskar och dessa bakterier bar därmed på β-laktamaser men dessa klassificerades inte som ESBL.
Slutsats
Slutsatsen från denna studie blev att Chromatic™ ESBL+AmpC gav bättre tillväxt och selekterade bort fler bakteriearter/isolat, med en lätt minskad känslighet mot
cefalosporiner men som inte klassificerades som ESBL-producerande, än
- 21 -
bar på karbapenemresistens, även OXA-48 som inte har lika stark karbapenem-hydrolys-aktivitet. Detta är något som den nuvarande metoden hade svårare för. Tidsåtgång och arbetsinsats var lika stora för både den nuvarande metoden och de kromogena medierna. Kostnaden för medierna skiljde sig åt med 9 kr/prov för
nuvarande metod med Juhlin32 och antibiotikadiskar och 15 kr/platta för de kromogena medierna. Chromatic™ ESBL+AmpC och CHROMagar™ mSuperCARBA™ kan med fördel användas tillsammans för att detektera de ESBL-producerande bakterierna och kostnaden för varje prov skulle då bli 30 kr. Om istället en delad platta skulle användas där båda medierna kunde gjutas med en vägg mellan medierna skulle kostnaden minska till 15 kr/prov. Detta skulle innebära att färre odlingsplattor behövde läsas av vid laboratoriet.
Tack
Ett stort tack till all personal på Klinisk mikrobiologi och vårdhygien på Länssjukhuset i Kalmar för all hjälp under tiden på laboratoriet. Jag vill även tacka mina handledare på laboratoriet, Annika Wistedt och Jorge Hernandez och min handledare på
- 22 -
Referenser
1. Cox G, Wright GD. Intrinsic antibiotic resistance: mechanisms, origins,
challenges and solutions. Int J Med Microbiol. 2013 Aug;303(6-7):287-92.
2. Carattoli A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 2013 Aug;303(6-7):298-304.
3. Brauner A. Medicinsk mikrobiologi & immunologi. 1. uppl. ed. Lund: Studentlitteratur; 2015. 824 s. p.
4. Gazin M, Paasch F, Goossens H, Malhotra-Kumar S, Teams MWaSWS. Current
trends in culture-based and molecular detection of extended-spectrum-β-lactamase-harboring and carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. J Clin
Microbiol. 2012 Apr;50(4):1140-6.
5. Martirosov DM, Lodise TP. Emerging trends in epidemiology and management
of infections caused by carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. Diagn
Microbiol Infect Dis. 2015 Oct: 265-275. 6. Folkhälsomyndigheten. ESBL-producerande
tarmbakterier. Kunskapsunderlag med förslag till handläggning för
att begränsa spridningen av Enterobacteriaceae med ESBL. 2 ed. Stockholm:
Folkhälsomyndigheten; 2014.
7. Holten KB, Onusko EM. Appropriate prescribing of oral beta-lactam
antibiotics. Am Fam Physician. 2000 Aug;62(3):611-20.
8. Stürenburg E, Mack D. Extended-spectrum beta-lactamases: implications for
the clinical microbiology laboratory, therapy, and infection control. J Infect.
2003 Nov;47(4):273-95.
9. Nordmann P, Cuzon G, Naas T. The real threat of Klebsiella pneumoniae
carbapenemase-producing bacteria. Lancet Infect Dis. 2009 Apr;9(4):228-36.
10. Pitout JD, Laupland KB. Extended-spectrum beta-lactamase-producing
Enterobacteriaceae: an emerging public-health concern. Lancet Infect Dis.
2008 Mar;8(3):159-66.
11. Giske C, Tängdén T. ESBL-producerande tarmbakterier - en kunskapsöversikt [Internet]. Läkartidningen; 2008. 28: Hämtad från:
http://www.lakartidningen.se/Functions/OldArticleView.aspx?articleId=9809. [2015-05-03]
12. Paterson DL, Bonomo RA. Extended-spectrum beta-lactamases: a clinical
update. Clin Microbiol Rev. 2005 Oct;18(4):657-86.
- 23 -
14. D'Andrea MM, Arena F, Pallecchi L, Rossolini GM. CTX-M-type β-lactamases:
a successful story of antibiotic resistance. Int J Med Microbiol. 2013
Aug;303(6-7):305-17.
15. Giske CG, Sundsfjord AS, Kahlmeter G, Woodford N, Nordmann P, Paterson DL, et al. Redefining extended-spectrum beta-lactamases: balancing science
and clinical need. J Antimicrob Chemother. 2009 Jan;63(1):1-4.
16. Folkhälsomyndigheten. Consumption of antibiotics and occurrence of antibiotic
resistence in Sweden. Solna: Public Health Agency of Sweden and National
Veterinary Institute; 2015.
17. Melhus Å. Juhlin's medium, a selective and differential medium for
gram-negative rods [Internet]. MEDICAL MICROBIOLOGY LETTERS; 1996.
Hämtad från:
https://www.researchgate.net/publication/283838509_Juhlin's_medium_a_select ive_and_differential_medium_for_gram-negative_rods. [2015-05-10]
18. Eucast. Antimicrobial susceptibility testing
EUCAST disk diffusion method [Internet]. Eucast; 2015. Hämtad från:
http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Disk_test_doc uments/Manual_v_5.0_EUCAST_Disk_Test.pdf. [2015-05-10]
19. CHROMagar. CHROMagar C3GR. For overnight detection of Gram-negative
bacteria producing Beta-lactamase. Frankrike: CHROMagar; 2014.
20. CHROMagar. CHROMagar mSuperCARBA. For detection of gram-negative
bacteria with areduced susceptibility to most of the carbapenem agents.
Frankrike: CHROMagar; 2016.
21. Liofilchem. Chromatic ESBL+AmpC. Chromogenic media for detection of
ESBLs and AmpC in Enterobacteriacae directly from clinical specimens. Italien:
Liofilchem; 2014.
22. Hancock RE, Speert DP. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa:
mechanisms and impact on treatment. Drug Resist Updat. 2000
Aug;3(4):247-55.
23. Poirel L, Potron A, Nordmann P. OXA-48-like carbapenemases: the phantom
menace. J Antimicrob Chemother. 2012 Jul;67(7):1597-606.
Bilagor
Bilaga I Material
Innehåll i de medier som använts i studien samt innehållet i NaCl-lösningen som produceras på laboratoriet.
CHROMagar™ C3GR
Powder Base Total 33 g/L
(CHROMagar Orientation)
Agar 15 g/L
Peptone and yeast extract
17,0 g/L
Chromogenic mix 1,0 g/L
CHROMagar C3GR
Supplement Selective mix 0,37 g/L
Chromatic™ ESBL+AmpC Typical Formula Peptone mix 43,2 g/L Chromogenic mix 1,0 g/L Agar 15,0 g/L Selective mix 0,5 g/L CHROMagar™ mSuperCARBA™
Powder Base Total 42,5 g/L
Agar 15,0 g/L Peptones 20,0 g/L Salt 5,0 g/L Chromogenic and selective mix 1,7 g/L
Juhlin32
NaCl-lösning (0,9%)
Ingredienser Normalsats
Natriumklorid 18,0 g
Bilaga II Rådata
Tabell VI. Rådata från kontroll av känslighet hos de kromagena mediumen vid spädningarna 1:104 och
1:105.
ProvID Mekanism Juhlin32 ( antal kolonier)
Sp.10^4 Sp.10^5 Sp.10^4 Sp.10^5 Sp.10^4 Sp.10^5 Sp.10^4 Sp.10^5 Sp.10^4 Sp.10^5 CCUG 45421 ESBL-A 130 10 50 50 61 7 43 12 0 0 CAZ(10mm) 880 ESBL-A 150 15 100 11 8 0 80 10 0 0 CTX(10mm), CAZ(8mm) 8040 ESBL-A 120 13 >200 150 40 0 44 2 0 0 CTX(14mm) CAZ(18mm) 816 ESBL-A 75 10 >200 150 39 7 46 4 0 0 CTX(6mm), CAZ(18mm) CAZ(20mm) 976 ESBL-A 80 5 150 100 65 11 70 10 0 0 CTX(6mm) CTX(6mm) 716 ESBL-A 150 15 >200 100 24 3 80 9 0 0 CTX(12mm), CAZ(12mm) 673 ESBL-A 160 14 >200 100 64 11 120 9 0 0 CTX(6mm),CAZ(6mm) CTX(14mm) Isolat 13 ESBL-M 130 15 110 100 29 6 68 11 37 11 CTX(12mm),CAZ(8mm) CTX(14mm) 397 ESBL-M 82 16 >200 100 26 4 61 6 0 0 CTX(10mm), CAZ(14mm) 442 ESBL-M 150 12 >200 140 40 4 60 12 0 0 CTX(12mm),CAZ(16mm) CTX(14mm),CAZ(14mm) 2073 ESBL-M 170 16 >200 150 26 5 70 14 0 0 CTX(14mm),CAZ(12mm) CAZ(20mm) CCUG 64452 ESBL-CARBA 120 11 70 50 0 0 0 0 53 10 957 ESBL-CARBA 160 17 150 100 68 9 136 24 33 9 CTX(22mm),CAZ(10mm),MER(30mm) CTX(10mm) 831 ESBL-CARBA 150 10 140 120 52 5 80 12 22 5 CTX(16mm), CAZ(22mm),MER(30mm) CAZ(24mm),MER(24mm) 660 ESBL-CARBA 124 14 >200 100 20 8 70 9 6 3 CTX(14mm) 539 ESBL-CARBA 170 20 160 130 38 1 70 8 8 1 CTX(16mm),CAZ(14mm) CTX(10mm),CAZ(24mm) 540 ESBL-CARBA 150 17 80 80 48 1 63 7 5 3 CTX(12mm),CAZ(6mm) 651 ESBL-CARBA 140 15 70 70 60 7 47 13 30 5 CTX(8mm),CAZ(16mm),MER(30mm) CTX(16mm) 466 ESBL-CARBA 120 10 130 100 0 0 2 0 20 4 CTX(22mm),MER(30mm) CTX(24mm) Isolat 3 IMI-9 110 11 80 80 30 0 0 0 0 0 Isolat 4 KPC-2 125 12 90 90 73 7 105 13 100 6 CTX(12mm),CAZ(16mm),MER(28mm) CAZ(20mm) Isolat 11 NDM-1 105 16 120 80 36 7 47 8 65 10 CTX(6mm),CAZ(6mm) CTX(10mm) Isolat 23 OXA-181 107 14 85 30 54 4 83 4 56 10 CTX(10mm),CAZ(22mm) Isolat 24 IMP-26 112 13 90 50 67 3 73 12 0 0 CTX(6mm),CAZ(8mm),MER(31mm) CAZ(12mm) Isolat 27 VIM-1 130 12 140 100 46 4 78 13 54 9 CTX(19mm),CAZ(10mm),MER(32mm) CAZ(14mm)
Tabell VII. Beräkning av CFU/mL från antalet kolonier vid spädningen 1:104 med formeln (antal
kolonier*100*spädningsfaktor)
Tabell VIII. Beräkning av CFU/mL från antalet kolonier vid spädningen 1:105 med formeln (antal
kolonier*100*spädningsfaktor)
Prov ID Art Mekanism Blodagar (Antal kolonier) CFU/mL C3GR (Antal kolonier) CFU/mL ESBL+ (Antal kolonier) CFU/mL sC (Antal kolonier) CFU/mL
CCUG 45421 K.pneum ESBL-A 130 1,30E+08 61 6,10E+07 43 4,30E+07 0 0,00E+00
880 E.coli ESBL-A 150 1,50E+08 8 8,00E+06 80 8,00E+07 0 0,00E+00
8040 E.coli ESBL-A 120 1,20E+08 40 4,00E+07 44 4,40E+07 0 0,00E+00
816 K.pneum ESBL-A 75 7,50E+07 39 3,90E+07 46 4,60E+07 0 0,00E+00
976 P.mirabilis ESBL-A 80 8,00E+07 65 6,50E+07 70 7,00E+07 0 0,00E+00
716 E.coli ESBL-A 150 1,50E+08 24 2,40E+07 80 8,00E+07 0 0,00E+00
442 C.freundii ESBL-M 150 1,50E+08 40 4,00E+07 60 6,00E+07 0 0,00E+00
2073 E.coli ESBL-M 170 1,70E+08 26 2,60E+07 70 7,00E+07 0 0,00E+00
Isolat 13 E.coli ESBL-M 130 1,30E+08 29 2,90E+07 68 6,80E+07 37 3,70E+07
397 E.coli ESBL-M 82 8,20E+07 26 2,60E+07 61 6,10E+07 0 0,00E+00
CCUG 64452 K.pneum ESBL-CARBA 120 1,20E+08 0 0,00E+00 0 0,00E+00 53 5,30E+07
957 E.cloacae Karbapenemas 160 1,60E+08 68 6,80E+07 136 1,36E+08 33 3,30E+07
660 E.coli ESBL-CARBA 124 1,24E+08 20 2,00E+07 70 7,00E+07 6 6,00E+06
831 E.coli ESBL-CARBA 150 1,50E+08 52 5,20E+07 80 8,00E+07 22 2,20E+07
539 E.coli ESBL-CARBA 170 1,70E+08 38 3,80E+07 70 7,00E+07 8 8,00E+06
466 E.coli ESBL-CARBA 120 1,20E+08 0 0,00E+00 0 0,00E+00 20 2,00E+07
651 E.coli ESBL-CARBA 140 1,40E+08 60 6,00E+07 47 4,70E+07 30 3,00E+07
540 E.coli ESBL-CARBA 150 1,50E+08 48 4,80E+07 63 6,30E+07 5 5,00E+06
673 K.pneum ESBL-CARBA 160 1,60E+08 64 6,40E+07 120 1,20E+08 0 0,00E+00
Isolat 3 E.cloacae IMI-9 110 1,10E+08 30 3,00E+07 0 0,00E+00 0 0,00E+00
Isolat 4 K.pneum KPC-2 125 1,25E+08 73 7,30E+07 105 1,05E+08 100 1,00E+08
Isolat 11 Citrobacter 105 1,05E+08 36 3,60E+07 47 4,70E+07 65 6,50E+07
Isolat 23 E.coli OXA-181 107 1,07E+08 54 5,40E+07 83 8,30E+07 56 5,60E+07
Isolat 24 E.coli IMP-26 112 1,12E+08 67 6,70E+07 73 7,30E+07 0 0,00E+00
Isolat 27 K.pneum VIM-1 130 1,30E+08 46 4,60E+07 78 7,80E+07 54 5,40E+07
Prov ID Art Mekanism Blodagar (antal kolonier CFU/mL C3GR (antal kolonier) CFU/mL ESBL+ (antal kolonier) CFU/mL sC (antal kolonier) CFU/mL
CCUG 45421 K.pneum ESBL-A 10 1,00E+08 7 7,00E+07 12 1,20E+08 0 0,00E+00
880 E.coli ESBL-A 15 1,50E+08 0 0,00E+00 10 1,00E+08 0 0,00E+00
8040 E.coli ESBL-A 13 1,30E+08 0 0,00E+00 2 2,00E+07 0 0,00E+00
816 K.pneum ESBL-A 10 1,00E+08 7 7,00E+07 4 4,00E+07 0 0,00E+00
976 P.mirabilisESBL-A 5 5,00E+07 11 1,10E+08 10 1,00E+08 0 0,00E+00
716 E.coli ESBL-A 15 1,50E+08 3 3,00E+07 9 9,00E+07 0 0,00E+00
442 C.freundii ESBL-M 12 1,20E+08 4 4,00E+07 12 1,20E+08 0 0,00E+00
2073 E.coli ESBL-M 16 1,60E+08 5 5,00E+07 14 1,40E+08 0 0,00E+00
Isolat 13 E.coli ESBL-M 15 1,50E+08 6 6,00E+07 11 1,10E+08 11 1,10E+08
397 E.coli ESBL-M 16 1,60E+08 4 4,00E+07 6 6,00E+07 0 0,00E+00
CCUG 64452 K.pneum ESBL-CARBA 11 1,10E+08 0 0,00E+00 0 0,00E+00 10 1,00E+08
957 E.cloacae Karbapenemas 17 1,70E+08 9 9,00E+07 24 2,40E+08 9 9,00E+07
660 E.coli ESBL-CARBA 14 1,40E+08 8 8,00E+07 9 9,00E+07 3 3,00E+07
831 E.coli ESBL-CARBA 10 1,00E+08 5 5,00E+07 12 1,20E+08 5 5,00E+07
539 E.coli ESBL-CARBA 20 2,00E+08 1 1,00E+07 8 8,00E+07 1 1,00E+07
466 E.coli ESBL-CARBA 10 1,00E+08 0 0,00E+00 0 0,00E+00 4 4,00E+07
651 E.coli ESBL-CARBA 15 1,50E+08 7 7,00E+07 13 1,30E+08 5 5,00E+07
540 E.coli ESBL-CARBA 17 1,70E+08 1 1,00E+07 7 7,00E+07 3 3,00E+07
673 K.pneum ESBL-A 14 1,40E+08 11 1,10E+08 9 9,00E+07 0 0,00E+00
Isolat 3 E.cloacae IMI-9 11 1,10E+08 0 0,00E+00 0 0,00E+00 0 0,00E+00
Isolat 4 K.pneum KPC-2 12 1,20E+08 7 7,00E+07 13 1,30E+08 6 6,00E+07
Isolat 11 Citrobacter 16 1,60E+08 7 7,00E+07 8 8,00E+07 10 1,00E+08
Isolat 23 E.coli OXA-181 14 1,40E+08 4 4,00E+07 4 4,00E+07 10 1,00E+08
Isolat 24 E.coli IMP-26 13 1,30E+08 3 3,00E+07 12 1,20E+08 0 0,00E+00
Tabell IX. Rådata från den parallella utodlingen på Juhlin32, CHROMagar™ C3GR, Chromatic™
ESBL+Amp C och CHROMagar™ mSuperCARBA™. Sp står för sparsam växt, M för måttlig växt och Ri för riklig växt medan R står för resistent och S för känslig. Gulmarkerade prover är de prover som var positiva för ESBL-producerande bakterier.
Linnéuniversitetet
Kalmar Växjö Lnu.se
Resultat Prov-ID Mängd Utseende Mängd Utseende Mängd Utseende Mängd CTX-zon CAZ-zon MER-zon
475 Sp - - 0 - Ri S S S Ej ESBL 476 0 - - - 0 - 0 - - - Ej ESBL 477 0 - - - 0 - 0 - - - Ej ESBL 478 0 - - - 0 - Sp S S S Ej ESBL 479 M - - 0 - Ri S Gräns S Ej ESBL 480 0 - - - 0 - Ri S S S Ej ESBL 493 Ri Ri 0 - Ri R R S ESBL-A (E.coli) Ri S S S Ej ESBL (E.cloacae CDR=R) 494 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL 495 0 - 0 - 0 - Ri S S S Ej ESBL 498 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL 499 Sp 0 - 0 - Ri Ej ESBL 507 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL 508 0 - 0 - 0 - Ri S S S Ej ESBL 509 0 - 0 - 0 - M S S S Ej ESBL 510 0 - 0 - 0 - Ri S S S Ej ESBL 511 Ri Ri 0 - Ri R R S ESBL-A (E.coli) 512 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL 513 Ri Ri 0 - Ri R S S ESBL-A (E.coli)
515 Ri M 0 - Ri R R S Ej ESBL (P.aeruginosa och M.morganii)
516 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL 517 0 - 0 - 0 - Ri S S S Ej ESBL 518 0 - 0 - 0 - M S S S Ej ESBL 522 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL 530 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL 531 M M 0 - Ri Gräns S S Ej ESBL (Enterobacter)
533 Ri Ri 0 - Ri R R S Ej ESBL (C.freundii och E.cloacae)
536 Sp Sp 0 - Ri Gräns Gräns S Ej ESBL (E.coli) 537 0 - 0 - 0 - Ri S S S Ej ESBL 538 0 - 0 - 0 - Sp - - - Ej ESBL 539 M 0 - 0 - Ri R R S Ej ESBL 541 0 - 0 - 0 - Ri S S S Ej ESBL 542 0 - 0 - 0 - Ri Gräns Gräns S Ej ESBL 543 0 - 0 - 0 - Ri Gräns Gräns S Ej ESBL 544 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL
574 Ri Ri 0 - Ri S Gräns S Ej ESBL (Serratia fonticola CDR=R, CTX=I) (Klebsiella oxytoca PTZ=I)
584 0 - Sp 0 - Ri Ej ESBL (E.coli)
586 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL
592 0 - Ri Färglös 0 - Ri R R S Ej ESBL (P.aeroginosa och E.coli)
593 0 - 0 - 0 - Ri R R R Ej ESBL (Jästsvamp) 594 0 - 0 - 0 - Ri R S S Ej ESBL (P.aeruginosa) 595 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL 597 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL 598 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL 600 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL 601 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL
602 Ri 0 - 0 - Ri R R S Ej ESBL (E.cloacae och C.freundii)
604 0 - 0 - 0 - Ri S S S Ej ESBL 611 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL 613 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL 614 0 - 0 - 0 - Ri R R R Ej ESBL (Jästsvamp) 615 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL 618 0 - 0 - 0 - Ri S S S Ej ESBL 620 Ri Ri 0 - Ri R R S ESBL-M (E.coli) 635 Ri Ri 0 - Ri R R S ESBL-A (E.coli) Ri Ri Ej ESBL (M.morganii CDR=R, CTX=R, CFZ=R) 641 0 - 0 - 0 - Ri S S S Ej ESBL 642 Ri Ri 0 - Ri R R S ESBL-A (E.coli) 645 0 - 0 - 0 - Ri S S S Ej ESBL 647 0 - 0 - 0 - Ri S S S Ej ESBL 648 0 - 0 - 0 - Ri S S S Ej ESBL 673 Sp Sp 0 - Ri ESBL-A (E.coli) 702 0 - 0 - 0 - Ri S S S Ej ESBL 703 0 - 0 - 0 - Ri S S Gräns Ej ESBL 707 0 - 0 - 0 - Sp - - - Ej ESBL
715 Sp M 0 - Ri R S S Ej ESBL (P.aeruginosa (gul) och E.cloacae (Blå))
716 0 - 0 - 0 - Ri S S S Ej ESBL 717 0 - 0 - 0 - M S S S Ej ESBL 730 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL 731 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL 739 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL 740 M M 0 - Ri R R S ESBL-A (E.coli) 741 0 - 0 - 0 - Sp S S S Ej ESBL 742 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL 743 0 - 0 - 0 - Ri S S S Ej ESBL 744 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL 746 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL 774 0 - 0 - 0 - Ri S S Gräns Ej ESBL 780 0 - Sp Sp Ri R R S ESBL-A (E.coli) ESBL-M (E.coli) 781 0 - 0 - 0 - 0 - - - Ej ESBL 796 0 - Ri Ri Ri R R S ESBL-A (E.coli) 807 0 - 0 - 0 - Ri S S S Ej ESBL 810 0 - 0 - 0 - Ri S S S Ej ESBL 815 0 - 0 - 0 - Ri S S S Ej ESBL