Transcription response in the TGF-betapathwayFrancisco Manuel Sánchez de Oria

Transcription response in the TGF-beta pathway

Francisco Manuel Sánchez de Oria

Degree project in biology, Master of science (2 years), 2008 Examensarbete i biologi 30 hp till masterexamen, 2008

Biology Education Centre and Department of Genetics and Pathology, Rudbeck Laboratory, Uppsala

University

Table of Contents

List of abbreviations...2

Abstract...3

Introduction...3

The TGF­  superfamily β ...3

Role of TGF­   in tumor pathogenesis β ...4

TGF­  signal transduction and the Smad proteins β ...5

Studying transcription factors binding: Chromatin ImmunoPrecipitation (ChIP) assays...7

ChIP­seq: next generation ChIP assays...10

Results...13

In vivo mapping of binding sites for Smad4 transcription factor...13

Verification of known binding sites...13

Analysis of Smad4 target genes...17

Smad4 enriched regions contained an over representation of Smad binding sites...19

Discussion...20

Global mapping of Transcription Factor Binding Sites in the postgenomic era...20

Unraveling the secrets of the complex network of TFs in the TGF­  pathway β ...21

Materials and methods...23

Experimental procedures...23

Cell cultures...23

Antibodies...23

ChIP and DNA template preparation for sequence analysis...23

PCR confirmation...25

Data analysis...25

Acknowledgments...25

References...26

List of abbreviations

BMPs Bone MorphogeneticProteins CDK Cyclin­Dependent Kinases ChIP Chromatin Immunoprecipitation CLB Cell Lysis Buffer

FBS Fetal Bovine Serum

FoxG1 Forkhead Box G1B

I­Smads Inhibitory Smads

MAPK Mitogen Activated Protein Kinases PAI­1 Plasminogen Activator Inhibitor­1 R­Smads Receptor­Regulated Smads

RIPA RadioImmunoPrecipitation Assay SARA Smad Anchor for Receptor Activation

SBE Smad Binding Element

Smurf Smad ubiquitination regulatory factor TF Transcription Factor

TFBS Transcription Factor Binding Site

TGF­β Transforming Growth Factor beta

TSS Transcription Start Site

Summary

Transforming growth factor beta (TGF­ ) is a multifunctional cytokine involved in the regulation of β   numerous cellular responses including cell proliferation, differentiation and apoptosis. Escaping from  TGF­ ­induced apoptosis is one of the hallmarks that characterizes cancer cells.  β The aim of this project  was to identify genes bound and regulated by Smad2 and Smad4 transcription factors, which directly  mediate TGF­   β signaling. In this project I used ChIP­seq, a state­of­the­art method used to analyze  protein interactions with DNA. ChIP­seq combines Chromatin Immunoprecipitation, a powerful  method employed to selectively enrich for DNA sequences bound by a particular protein in vivo, with  massively parallel DNA sequencing of the ChIP­enriched DNA. Therefore the DNA bound to it is  identified and mapped to the human reference genome to locate visually the position of every DNA  fragment. Using HepG2 cells (human hepatocellular liver carcinoma cell line) as a model system, I  identified well known target genes of the Smad4 protein, such as PAI­1 and JUNB, as well as some  candidate genes that could potentially be targets for therapeutic intervention, like FoxG1 and HNF4 

genes.

Introduction

Transforming growth factor beta (TGF­ ) is a multifunctional cytokine involved in the regulation of β   numerous cellular responses, such as cell growth and proliferation, differentiation, cellular matrix  production, migration and apoptosis (Jennings & Pietenpol, 1998; Verrecchia & Mauviel, 2002). TGF­β  is a secreted homodimeric protein member of the TGF­  superfamily. β  Deregulation of TGF­β 

expression or signaling is involved in a variety of diseases, including cancer and fibrosis (Blobe et al.,  2000).

The TGF­  superfamily β

The TGF­   β superfamily includes more than 30 pleiotropic cytokines with similar structure, involved in  key roles in development and tissue homeostasis. The first member of the TGF­  superfamily,  β TGF­β1,  was discovered in the late 1970s. Its name stands for the ability to induce growth and morfological  transformation of rat kidney fibroblasts (DeLarco and Todaro, 1976). However, shortly after its 

discovery it was shown that TGF­β1 also acts as an inhibitor of cell proliferation (Tucker et al., 1984). 

This duality in cell growth regulation is cell­type dependent and imprinted during embryonic 

development (Sporn and Roberts, 1990). Other members of the TGF­  s β uperfamily are  TGF­β2 and  TGF­β3, bone morphogenetic proteins (BMPs), anti­müllerian hormone (AMH), activins and nodal  (Piek et al., 1999).

Role of TGF­ β in tumor pathogenesis

TGF­β plays important roles in tumor pathogenesis, contributing to cell growth, invasion and  metastasis, angiogenesis and also decreasing host tumor­specific immune responses (Jennings & 

Pietenpol, 1998). Although originally TGF­  acts as a tumor suppressor inhibiting cell growth in most β  

cell types via the Smads pathway, once the tumor has been established most cells become resistant to 

TGF­  and  β TGF­  turns pro­oncogenic (Elliott and Blobe, 2005) (Figure 1). Escaping from TGF­ β β 

growth inhibition is the identifying characteristic of many cancer cells (Massagué et al., 2000).

Figure 1. The dual role of TGF­  in tumor pathogenesis. β

TGF­  arrests the cell cycle progression at early G1 through controlling a number of important cell β   cycle regulators (Hanahan and Weinberg, 2000). Cyclin­dependent kinases (CDK) regulation is  essential for cell growth inhibition mediated by TGF­ . This regulation can be either direct β  

downregulation of CDK levels (Zhang et al., 2001) or by upregulation of CDK inhibitors (Alexandrow  and Moses, 1995)

Alterations of the TGF­  pathway can increase cancer risk. A common example is TGFBR1*6A , a β   variant of the TGFBR1 gene with a 9­bp in­frame deletion. This modification is present in 

approximately 14% of the general population and results in decreased TGF­ ­mediated growth β   inhibition. Population studies have shown that this allele is related to increased breast cancer risk by  31% for heterozygotes and 169% for homozygotes, respectively (Zhang et al., 2005). Nonetheless, the  most common cause of TGF­  signalling alteration is the mutational inactivation of the TGFBR2, β   present in about 20­30% of all colon cancers (Biswas et al., 2004).

TGF­   β signal transduction and the Smad proteins

The Smads proteins directly mediate the biological effects of TGF­ . The Smads proteins are homolog β   of both the Drosophila mothers against decapentaplegic (MAD) protein and the Caenorhabditis  elegans SMA protein, their name is a combination of the two.

TGF­β binds to and activates type I and type II serine/threonine kinase receptors present in the surface 

of the cell. The receptor­regulated Smads (R­Smads) directly mediate TGF­β signalling upon receptor 

activation, and those are Smad1, Smad2, Smad3, Smad5 and Smad8. The Smad anchor for receptor 

activation (SARA) or endofin mediates Smad activation delivering the R­Smads to the receptor, which  result in phosphorylation of the R­Smads (Tsukazaki et al., 1998; Shi et al., 2007). Once R­Smads are  activated they form heterodimeric complexes together with Smad4. These complexes are translocated to  the nucleus, where they recruit other transcription factors to regulate the expression of target genes  through the interaction with other transcription factors, coactivators and corepressors (Massagué et al.,  2005). Such genes mediate the biological effects of TGF­ . Some of the activated target genes stimulate β   tumorigenesis, while others suppress it. Although Smad4 is not required for translocation into the  nucleus, it seems to be needed for the Smad complex to act as a transcription factor (Liu et al.,1997).

Besides the TGF­  superfamily receptors there are other kinases such as cyclin dependent kinases β   (CDK) and mitogen activated protein kinases (MAPK) that can phosphorylate Smad proteins thus  regulating their capacity of controlling transcription of their target genes (Matsuura et al., 2004 ;  Kamaraju and Roberts, 2005) (Figure 2).

Figure 2. The TGF­ ­Smad pathway. TGF­  binds to and activates type I and type II serine/threonine kinase receptors β β   present in the surface of the cell . The receptor­regulated Smads (R­Smads) directly mediates TGF­  signalling upon β   receptor activation. SARA or endofin mediates Smad activation delivering the R­Smads to the receptor, which result in  phosphorilation. Once R­Smads are activated they form heterodimeric complexes together with Smad4 and are translocated  to the nucleus, where they control target genes. Smad7/Smurf1­2 represents the negative loop of the cycle, ending signaling. 

Modified with permission from ten Dijke and Hill, 2004.

Smad6 and Smad7, the I­Smads, constitute a subclass of inhibitory Smads that acts in direct opposition  to R­Smads signalling, forming a negative feedback loop. Originally this subclass was shown to 

compete with R­Smads for activated type I receptor binding (Moustakas et al., 2001). Later on they  were found to produce ubiquitination and degradation of the activated type I receptor by recruiting of  E3­ubiquitin ligases, also known as Smad ubiquitination regulatory factor 1 (Smurf1) and Smurf2, thus  ending signalling (Shi and Massagué, 2003). Shortly after this discovery it was demonstrated that I­

Smads associate with phosphatases, dephosphorylating and therefore inactivating type I receptors (Shi  et al., 2004). A possible role for I­Smads in transcriptional regulation has also been postulated as  Smad6 has been shown to repress BMP­induced transcription by recruiting co­repressor CtBP (C­

terminal binding protein) and Smad7 disrupts Smad2/Smad3 complexes in the nucleus (Lin et al.,  2003).

Although there are numerous members in the TGF­β superfamily that produce a vast diversity of  cellular responses there are only two different Smad pathways known, raising many questions about  how signaling specificity and diversity are produced (Attisano and Wrana, 2002; Miyazawa et al.,  2002).

Studying transcription factors binding: Chromatin ImmunoPrecipitation (ChIP) assays Transcription is controlled by the association of transcription factors (TFs) with their target DNA  sequences in gene regulatory regions and additional recruitment of activators of the transcription  machinery, hence it is of great importance to be able to study in vivo protein­DNA associations. Those  associations are fine tuned by epigenetic modifications including methylation of CpG dinucleotides  (Antequera, 2003), post­translational modifications of histones (Strahl and Allis, 2000 ; Jenuwein and  Allis, 2001) and incorporation of histone variants (Mito et al., 2007). Such modifications are used by  the transcription factors to modulate transcription and constitute the epigenetic code (Cosgrove and  Wolberger, 2005).

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) assays are the cutting­edge techniques to study large scale 

protein­DNA interactions in vivo. The ChIP technique involves reversible cross­linking of proteins with 

DNA, a procedure by which the protein­DNA interaction is covalently linked using formaldehyde. The 

purpose of the cross­linking is to ensure that the DNA­protein link is maintained during the ChIP 

procedure. The chromatin is fragmented into smaller pieces, usually in the range of 200 base pairs 

length, using either enzymatic digestion or sonication of the nuclei. The sheared chromatin is then 

immunoprecipitated with an antibody recognizing the protein of interest. In the last steps the cross­link 

is reversed, proteins are digested and the enriched ChIP­DNA is purified (Figure 3). For a recent review 

of the ChIP current state and applications see Collas and Dahl, 2008.

Figure 3. ChIP assay experimental outline. Modified with permission from Collas and Dahl, 2008

For several years a strong limitation of the ChIP technology was the restriction of analysis of the ChIP­

selected DNA material to a set of predetermined target sequences using PCR with chosen primers. This  method introduces a strong bias towards the sequence of interest. Array technology extended the power  of ChIP, enabling the discovery of novel target sites for TFs and build the map of post­translationally  modified histones across the genome. This approach is known as ChIP­on­chip or ChIP­chip, and was  first successfully applied on yeast in three papers published in 2000 and 2001 (Ren et al.,2000; Iyer et  al.,2001; Lieb et al.,2001). Recent advances in microarray technology have made it possible to study  TFs genome­wide in human cells (Rada­Iglesias et al., 2008). Microarray hybridization overcomes the  limitations of regular ChIP­PCR analysis and have permitted genome­wide scope analysis. Nonetheless,  the advent of next­generation sequencing technologies have lead ChIP assays to the next frontier.

ChIP­seq: next generation ChIP assays

The so called next­generation sequencing machines are machines capable of producing tens to hundreds  of millions of short sequence reads during a single instrument run (Shendure and Ji, 2008). This 

unprecedented sequencing capacity is being applied in many fields of biology enabling striking  scientific advances at dizzying speed.

ChIP­sequencing, also know as ChIP­seq, uses this novel technology to sequence ChIP­DNA fragments  in massively parallel manner. Some of the advantages of ChIP­seq over ChIP­chip assays are lower cost,  less input DNA or less amplification requirements, not limited by micro­array content and more 

accurate mapping (Barski et al., 2007; Johnson et al., 2007; Mikkelsen et al., 2007; Robertson et al., 

2007). ChIP­seq has been recently used to study epigenetic changes in the DNA and target sites for TFs 

and other related chromosome­associated proteins across the entire genome, enabling the possibility to  build a high resolution genome­wide map for gene expression and genome function (Barski et al., 2007; 

Johnson et al., 2007; Robertson et al., 2007; Wederell et al., 2008).

The Illumina sequencing technology (Figure 5), which relies on proprietary reversible terminator­based  sequencing chemistry. The first step prior to sequencing is the library preparation. Adaptor sequences  are ligated to the DNA fragments. The ligated fragments are then amplified and immobilized in a flow  cell surface, where they are directly amplified (solid phase amplification) to create up to 1000 clones of  each single molecule in very close proximity. Then the clusters of clones are sequenced using 

fluorescently­labeled modified nucleotides (sequencing­by­synthesis). One important property of those  nucleotides is reversible termination, allowing the presence of the 4 nucleotides (A, C, T, G) 

simultaneously during sequencing, which results in higher accuracy than methods where only one 

nucleotide is present at the time. For a cycle of sequencing, a laser excites the fluorescently­labeled 

nucleotides and the image is captured determining the identity of the base for each cluster. Each cycle is 

repeated to obtain the sequence of bases in a given fragment. In the last steps the Illumina Pipeline 

software maps the sequence reads to a reference genome in order to obtain the genomic coordinates of 

every ChIP­DNA fragment (aligned reads). The resulting file contains the sequence of every DNA 

fragment and its location in the genome, and it can be formatted and uploaded to the University of 

California Santa Cruz (UCSC) genome browser (http://genome.ucsc.edu/) genome browser to locate 

visually the position of every DNA fragment in the genome and compare the different samples. Those 

regions of the genome where several aligned ChIP­DNA overlaps form peaks. Each step in the peak 

represents the position of an aligned ChIP­DNA read in the human reference genome.

Figure 5. Scheme of the Illumina sequencing technology. Modified with permission from Illumina Inc., www.illumina.com  (2008)

Aim

The aim of this project was to identify genes bound and regulated by Smad2 and Smad4 transcription 

factors, which directly mediate TGF­  signaling, in HepG2 cells. For that purpose I used chromatin β  

immunoprecipitation and high throughput parallel sequencing (ChIP­seq), a method employed to 

determine the in vivo genomic localization of transcription factors and other chromatin related proteins.

Results

In vivo mapping of binding sites for Smad4 transcription factor

Chromatin immunoprecipitation coupled to high­thoughput sequencing technology (ChIP­seq) can be  used to profile whole­genome binding sites for a chosen transcription factor (Barski et al., 2007; 

Johnson et al., 2007; Robertson et al., 2007; Wederell et al., 2008). In this study I used chromatin  immunoprecipitation to isolate DNA bound by Smad4 in TGF­ ­treated and control HepG2 cell β s. All  ChIP samples were confirmed for the presence of known binding sites using semi­quantitative or  quantitative PCR. This step is required to evaluate the efficiency of the ChIP procedure before further  analysis using the Illumina genome analyzer. Samples in which the result of the PCR showed low or no  enrichment in known binding sites were discarded. Then the inmunoprecipitated Smad­bound DNA  samples were sequenced using Illumina 1G genome analyzer and mapped with respect to the human  genome using the Illumina Analysis Pipeline, thus identifying target genes of the TGF­  pathway.  The β   output text files were converted to browser extensible data (BED) format in order to visualize the data  in the University of California Santa Cruz (UCSC) genome browser (http://genome.ucsc.edu/). Table 1  summarizes the statistical information in the output files obtained:

Table 1. Sequencing statistics obtained for each sequenced ChIP­DNA sample.

Name Antibody TGF­beta treated #Aligned reads Peaks

Smad2 anti­Smad2 Yes 3176304 586

Smad4 anti­Smad4 Yes 2851319 667

Smad4C_Last anti­Smad4 No 4846500 17330

Smad4T_Last anti­Smad4 Yes 4707083 3117

a

Since Smad2 and Smad4 samples had less sequences, peaks above 6 overlapping reads are counted, while in  Smad4C_Last and Smad4T_Last only peaks above 8 overlapping reads are counted.

Verification of known binding sites

In order to validate my data in silico, I looked for peaks located in well known and characterized  promoters of the Smads target genes. I extracted 3 known target genes from the literature and analyzed  them in the UCSC Genome Browser (Mar. 2006 Assembly): plasminogen activator inhibitor­1 or PAI­1  (SERPINE1), JUNB proto­oncogene (JUNB) and SMAD family member 7 (Smad7).

For the PAI­1 gene, a Smad binding region has been located −586 to −551 upstream of the gene. This 

region contains 3 Smad Binding Elements (SBE) and an E­box, and the 3 bp spacer between the E­box  and an SBE has been shown to be essential to mediate TGF­ ­induced transcription (Hua  β et al.,1999). 

An E­box is a small DNA sequence located typically upstream of a gene promoter and contains a  palindromic canonical sequence CACGTG. Transcription factors containing the basic­helix­loop­helix  protein structural motif typically bind to E­boxes or related variant sequences and enhance transcription  of the downstream gene. TGF­  activates JUNB by binding of a nuclear factor to a promoter distal β   element, a 22 bp sequence located between nucleotides ­2813 and ­2792 relative to the Jun­B gene,  where a SBE for this gene has been characterized (Jonk et al., 1998). The Smad7 gene has been shown  to be regulated by the Smad3­Smad4 complex in the presence of TGF­  treatment. The Smad7 β  

promoter is located ­471 to ­275, and it contains a perfect 8 bp SBE (GTCTAGAC) (Nagarajan et al.,  1999 , Stopa et al., 2000).

The first ChIP carried out included Smad2 and Smad4 transcription factors in TGF­ ­treated HepG2 β   cells. The samples were sequenced and the sequencing data was analyzed in the UCSC genome 

browser. The number of peaks in those samples were similar and in many cases overlapping in the same  position. However, I did not find peaks at known binding sites.

The second set of samples were Smad4 control and TGF­ ­treated (Smad4C_Last and Smad4T_Last). β   Those samples confirmed known binding sites for PAI­1 (Figure 6A and 6B) and JUNB (Figure 7). 

Nevertheless, although my data did not support Smad4 binding at ­471 to ­275 for the Smad7 gene, 

there was a peak at around +750 bp (Figure 8). Further studies are necessary to determine whether the ­

471 to ­275 region of the Smad7 gene is in fact negative for Smad4 binding in vivo. 

A

B

Figure 6. (A) The PAI­1 promoter in the UCSC genome browser showing the genome localization of the sequences 

precipitated with anti­Smad4 antibody. The upper panel (Smad4T_Last) represents the sequence tags (black) from the 

TGF­ ­treated sample, while the lower panel (Smad4C_Last) represents the sequence tags (black) for the control sample. β  

The Y axis represents the peak height, whereas the X axis represent the localization in the genome. Peaks are scaled 

according to the tallest peak of each panel, so that different scaling is used in each panel. (B) A closer look at the PAI­1 

binding site. SBEs are shown in red, the E­box sequence in black and the the 3 bp spacer between the E­box and a SBE 

shadowed in green.

Figure 7. The JUNB distal element in the UCSC genome browser showing the genome localization of the sequences  precipitated with anti­Smad4 antibody. The upper panel (Smad4T_Last) represents the sequence tags (black) from the TGF­

­treated sample, while the lower panel (Smad4C_Last) represents the sequence tags (black) for the control sample. The Y

β  

axis represents the peak height, whereas the X axis represent the localization in the genome. Peaks are scaled according to  the tallest peak of each panel, so that different scaling is used in each panel.

Figure 8. The Smad7 promoter in the UCSC genome browser showing the genome localization of the sequences  precipitated with anti­Smad4 antibody. The upper panel (Smad4T_Last) represents the sequence tags (black) from the  TGF­ ­treated sample, while the lower panel (Smad4C_Last) represents the sequence tags (black) for the control sample. β   The Y axis represents the peak height, whereas the X axis represent the localization in the genome. Peaks are scaled  according to the tallest peak of each panel, so that different scaling is used in each panel

The overall success at identifying known targets genes suggests that my data have a good coverage of 

known Smads binding sites across the genome.

Analysis of Smad4 target genes

In an attempt to extract relevant biological information from the enormous amount of data, the treated  sample was filtered according the following criteria (see methods section): peaks below 8 hits and  peaks located at the same position as peaks above 5 hits in the control sample were removed. Regions  were extended +/­ 250 bp from center and only those that were within 10 kb of a transcription start site  (TSS) were saved. In this way, both weak peaks and peaks located in the same position in the control  and treated sample were filtered away, leaving only strong peaks in the proximity of a TSS, which could  potentially be gene promoters. Out of the 590 regions analyzed, table 2 shows the top 20 most enriched  regions, description of the closest gene and distance from the peak to the TSS.

Table 2. Top 20 enriched regions within 10 kb of a TSS. 

It is important to mention that amongst the most enriched regions appears the Forkhead Box G1B  (FoxG1) gene with peak height 9. FoxG1 has been shown to regulate p21 expression (Seoane et al.,  2004), a gene whose regulation determines TGF­ ­mediated growth inhibition. β

A histogram of distance from all 590 peaks to the TTS reveal that most were immediately downstream 

Gene id Description

17 NM_002985 CHEMOKINE (C-C MOTIF) LIGAND 5 9322

15 NM_032514 MICROTUBULE-ASSOCIATED PROTEIN 1 LIGHT CHAIN 3 ALPHA 7289

14 BX538238 HYPOTHETICAL PROTEIN DKFZP686B0790 30

14 AF346307 CHROMOSOME 19 F379 RETINA SPECIFIC PROTEIN -4555

14 NM_005484 POLY (ADP-RIBOSE) POLYMERASE FAMILY, MEMBER 2 -356

14 NM_080833 CHROMOSOME 20 OPEN READING FRAME 151 -6130

14 BC050331 HYPOTHETICAL PROTEIN DKFZP434K191 -50

14 AK123337 HYPOTHETICAL PROTEIN MGC12760 -95

14 AK125239 SIMILAR TO RIKEN CDNA 4632412N22 GENE -8043

13 X87871 HEPATOCYTE NUCLEAR FACTOR 4, ALPHA 3317

13 AK094414 ACYL-COA SYNTHETASE SHORT-CHAIN FAMILY MEMBER 1 8863

13 NM_148961 OTOSPIRALIN 7343

13 NM_152837 SORTING NEXIN 16 434

13 BX161415 TETRATRICOPEPTIDE REPEAT DOMAIN 6 5781

13 NM_198441 FLJ40296 PROTEIN -419

13 NM_198951 TRANSGLUTAMINASE 2 (C POLYPEPTIDE, PROTEIN-GLUTAMINE-GAMMA-GLUTAMYLTRA... 759

12 NM_203448 HYPOTHETICAL PROTEIN LOC286286 -653

12 NM_000088 COLLAGEN, TYPE I, ALPHA 1 -1895

12 AK131425 CDNA FLJ16545 FIS, CLONE OCBBF3004972 4979

12 NM_004455 EXOSTOSES (MULTIPLE)-LIKE 1 532

12 NM_001054 SULFOTRANSFERASE FAMILY, CYTOSOLIC, 1A, PHENOL-PREFERRING, MEMBER 2 2228 Peak

Height Distance

from TSS

of the TTS. More than 50 peaks were located in the 0 ­ +500 bp region of a TSS, suggesting that the  peaks were preferably situated close to TSSs and not randomly distributed (Figure 9).

Figure 9. Histogram of distance of peaks to TSSs.

Smad4 enriched regions contained an overrepresentation of Smad binding sites

To determine whether the regions occupied by the filtered peaks contained Smad binding motif 

sequences the data was analyzed using RegionMiner software (Genomatix, www.genomatix.de). The 

software engine searched for all known TF binding motifs potentially contained in the data submitted 

and the result was sorted by overrepresentation of those motifs compared to a set of background 

promoters (Table 3). The overrepresentation reflects the fold factor of match numbers in regions 

compared to an equally sized sample of the background (i. e. found versus expected). The Smad family 

of transcription factors were reported among the top, with an overrepresentation of 1.95, suggesting that 

the Smads binding motifs in my data occur almost twice as often as expected by chance.

Table 3. Overrepresentation of TF motifs contained in the sequenced samples

a

Z­scores measures the distance from the population mean in units of the population standard deviation. Z­scores bellow ­2  or above 2 are considered statistically significant, corresponding to a p­value of about 0.05

Expected

V$HAML 535 201.13 14.18 2.66 23.51

V$GABF 502 214.32 14.63 2.34 19.62

V$GZF1 254 109.85 10.48 2.31 13.71

V$HIFF 528 256.55 16.01 2.06 16.92

V$SMAD 416 212.82 14.58 1.95 13.9

V$BNCF 183 97.28 9.86 1.88 8.64

V$RBP2 167 89.09 9.44 1.87 8.2

V$MEF3 102 55.22 7.43 1.85 6.23

V$AHRR 625 339.47 18.41 1.84 15.48

V$MITF 190 104.09 10.2 1.83 8.37

V$OAZF 278 153.3 12.38 1.81 10.03

V$CHRE 194 109.15 10.45 1.78 8.08

V$MTF1 151 85.63 9.25 1.76 7.01

V$HESF 692 408.61 20.2 1.69 14

V$SREB 252 154.11 12.41 1.64 7.85

V$RREB 411 257.71 16.05 1.59 9.52

V$SP1F 1703 1075.08 32.73 1.58 19.17

V$P53F 604 390.16 19.74 1.55 10.81

V$EBOX 814 536.33 23.14 1.52 11.98

TF

Families Number of

Matches Std.

Dev. Over

representation Z-Score

Discussion

Global mapping of transcription factor binding sites in the postgenomic era

Global mapping of transcription factor binding sites (TFBSs) and histone modifications has become  widely available thanks to ultra­high­throughput sequencing technology. This innovative technology is  quickly being used to decipher the complex network of TFBSs that regulate the mammalian genome  (Barski et al., 2007; Johnson et al., 2007; Robertson et al., 2007; Wederell et al., 2008). 

However, not all TFBSs identified in a whole­genome study (using either ChIP­chip or ChIP­seq) are  functional TFBSs. Although ChIP­seq allow for a more accurate and unbiased mapping of TFBSs,  there is an increased need for tools that are able to differentiate true regulatory elements from those that  are the consequence of biological noise (Struhl, 2007) or simply indirect TF­DNA interaction 

crosslinked through protein­protein interaction during the ChIP process. Certain factors like the high  inter­dependency among transcriptional networks or functional redundancy make it difficult to 

recognize true binding sites. Moreover, it is important to note that binding sites that are located far from  TSS are difficult to attribute any transcriptional regulatory function (Carroll et al., 2005), thus a given  TF with a large number of binding sites located in such areas may act on enhancers, silencers or other  distal regulatory elements, hence leading to a high false discovery rate of target genes.

The data presented here show somewhat low peak height. This could be caused by technical factors  related to the efficiency of the antibody recognizing the Smad4 protein or the ChIP protocol itself, or  due to biological factors such as the way transcription factors form complexes with Smad proteins.

Nonetheless, this study attempted to overcome those limitations by restricting the analysis to proximal  regions of TSSs. Functional studies of the potential candidate genes are necessary in order to validate  their implication in the TGF­β pathway.

Unraveling the secrets of the complex network of TFs in the TGF­  pathway β

In this study I used HepG2 cells to identify targets of Smad4 in the TGF­  pathway. The number of β   genes detected may be underestimated due to the filter process. Along with known target genes my data  suggest interesting genes that potentially could be good candidates for follow up studies.

Interestingly, FoxG1 gene appears as a candidate gene with peak height 9. FoxG1 binds to FoxO­Smad 

complexes and blocks p21 expression (Seoane et al., 2004). p21 is thought to be one of the most 

important genes whose regulation determines TGF­ ­mediated growth inhibition. It has been shown β   previously that p21 is constitutively expressed in HepG2 cells through Smad4 and Sp1 and does not get  upregulated further by treating the cells with TGF­  (Moustakas and Kardassis, 1998). These findings β   are supported by the fact that in my data the control sample showed a peak for Smad4 at about +175 bp  of p21 and there was no signal in the treated sample, suggesting a basal state of p21 expression. 

Nonetheless, there was no binding for the FoxG1 gene in the control sample, but there was binding in  the treated sample. Taken together these results indicate that, in contrast to other cancer cell lines, p21  has no further upregulation during TGF­  treatment in HepG2 cells. β

Another interesting candidate gene is the hepatocyte nuclear factor 4   (HNF4 ). HNF4  belongs to      the nuclear hormone receptor family of transcription factors. This gene is recognized as a key regulator  of hepatocyte differentiation and function (Watt et al., 2003). Alterations of the HNF4  activity have    very serious consequences, such as maturity­onset diabetes of the young 1 (Fajans et al., 2001). It has  been shown recently that TGF­  represses HNF4  expression via ALK5/Smad3/HMGA2 signaling β    pathway in mouse epithelial cells (Ishikawa et al., 2008). Those findings are supported by my data  since there was a peak covering the TSS of the HNF4  gene, suggesting that the same mechanism may    act in human cells.

The detailed knowledge database of the molecular basis of cancer provides many unexploited targets for 

therapeutic intervention. This study expands that knowledge a little, allowing for future projects derived 

from these candidate genes presented. Emerging gene­based therapies, such as gene regulation by 

enhancing or suppressing expression or gene insertion (tumor suppressors, apoptosis­inducing genes, 

etc.) targeting cancer cells are in a growing number of clinical trials worldwide. Those innovative 

approaches combined with conventional therapies such as chemotherapy, radiotherapy and surgery can 

lead to a more effective and less invasive ways of cancer treatment. I sincerely hope that these findings 

will one day contribute to winning the race against cancer. 

Materials and methods

Cell cultures

HepG2 cells were grown at 37° C and 5% CO 2  in 175 cm ²  cell culture plates with 50 ml RPMI 1640  medium (Sigma­Aldrich, cat# R0883) supplemented with 10% heat­inactivated fetal bovine serum  (FBS) (Sigma­Aldrich, cat# F7524). Before each ChIP assay, cells were incubated overnight with  starvation medium (RPMI 1640, 1% FBS) at 37° C and 5% CO 2 .

Antibodies

The antibodies used for ChIP assays are presented in table 4.

Table 4. Antibodies used in the ChIP assay.

Antibody Type Company Catalog number

Anti­Smad2 Monoclonal Santa Cruz Biotech SC­6200

Anti­Smad3 Monoclonal Zymed 51­1500

Anti­Smad4 Monoclonal Santa Cruz Biotech SC­7154

Anti­Phosphorylated 

Smad2 Polyclonal Kindly provided by Aris 

Moustakas,  Ludvig  Institute, Uppsala,  Sweden

N/A

Anti­Immunoglobulin G Monoclonal Upstate 12­370

ChIP and DNA template preparation for sequence analysis

Around 10 ⁸  cells in starvation medium were used per ChIP experiment. TGF­ 1 (PeproTech, cat# 100­ β 21R) was added to a final concentration of 2.5 ng/ml during 1 hour. The nuclear proteins were cross­

linked to the DNA using 0.37% formaldehyde for 10 minutes on a rocking bed at room temperature. 

The cross­linking was stopped by adding glycine to a final concentration of 0.125 M and incubating  another 5 minutes on a rocking bed at room temperature. The cells were then resuspended in cell lysis  buffer (CLB) (0.01 M Tris­HCl pH 8, 0.01 M NaCl, 0.20% Nonidet P­40 [NP­40]) with protease 

inhibitors (PIs) added (10 µl/ml sodium butyrate, 1 µl/ml Leupeptin, 5 µl/ml 100x phenylmethylsulfonyl 

fluoride). The cell­CLB+PIs mix was incubated on ice for 10 minutes and centrifuged at 600 g at 4° C to  collect the nuclei. The supernatant was discarded and the nuclei pellet was resuspended in 

RadioImmunoPrecipitation Assay (RIPA) (1xPhosphate Buffered Saline [PBS] [Sigma­Aldrich, cat# 

231­834­5], 1% NP­40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate [SDS], 0.004% 

sodium azide) buffer containing PIs. The nuclei were incubated 10 minutes on ice and transferred to a  15 ml Falcon tube for sonication. Chromatin was fragmented using Bioruptor (Diagenode, cat# 

UCD200) to approximately 200 base pairs length. The sheared chromatin was precleared by adding 75  µl of protein G­agarose (Roche Diagnostics, cat# 11 243 233 001) and incubated for 1 hour at 4° C on a  rotating wheel. The agarose beads were centrifuged at 16000 g and the supernatant (contains precleared  chromatin) was used to set up the ImmunoPrecipitation (IP) reactions, aiming to use DNA from around  5x10 ⁶  cells per reaction. A small fraction of precleared chromatin was kept as input DNA. Every IP  reaction was incubated at 4° C overnight with 10 µg of antibody recognizing the protein of interest. The  following day 100 µl of protein G agarose were added to every IP and incubated for 2 hours at  4° C with  rotation to allow the antibody­protein­DNA complex to bind the agarose beads. Then the beads were  collected by centrifugation at 16000 g for 2 minutes at 4° C and washed 4 times with RIPA buffer, one  time with ImmunoPrecipitation Washing Buffer 2 (IPWB2) (0.01 M Tris HCl [pH 8],0.25 M  LiCl,  0.001 M EDTA, 1% NP­40, 1% Na deoxycholate) and one time with TE buffer (0.01 M Tris HCl [pH  8], 0.001 M EDTA). The immunocomplexes were diluted from the beads with 450 µl of freshly  prepared IP­Elution Buffer (IPEB) (0.1 M NaHCO 3 , 1% sodium dodecyl sulfate [SDS]) to every IP  reaction and incubated 30 minutes with gentle agitation at room temperature. Then the enriched DNA  was transferred to a new tube and incubated with 15 μg of RNase A (Amersham Biosciences, cat# 

E70194Y), and NaCl to a final concentration of 0.3 M at 65° C for 6 hours to reverse crosslinking. 

Proteins were degraded by adding 90 μg of proteinase K (Amersham Biosciences, cat# E76230Y) and  incubating at 45° C overnight. DNA was extracted by standard phenol/chloroform/isoamyl alcohol  extraction (Sambrook et al., 1989), ethanol precipitated (Sambrook et al., 1989) and resuspended in  water.

Polymerase chain reaction confirmation

Polymerase chain reaction (PCR) was performed on each sample to confirm the presence of known  binding sites in the immunoprecipitated material, as a quality control before sending the samples for  sequencing. 35 to 40 cycles of PCR were used to amplify the enriched DNA using primers for  promoters of known early target genes. The PCR mix was composed of 2 µl 10x PCR buffer 

(Invitrogen, cat# Y02028), 0.6 µl MgCl 2  (Invitrogen, cat# Y02016), 0.2 µl dNTP (10 mM) (Promega,  cat# C1141), 0.2 µl Taq Platinum DNA polymerase (5U/ml) (Invitrogen, cat# Y02016), 1 µl 

Reverse+Forward primer mix (Table 5) 10 µM, 0.5 µl DNA sample and 15.5 µl water, to a total volume 

of 10 µl per sample. The program used was as follows: 95°C 3  (95°C 30”, 59°C 30”, 72°C 45”)x35 or 

x40, 72°C 7'.

Table 5. Oligonucleotides used in the PCR reactions

Gene name  Forward primer Reverse primer

PAI­1 CAGAGGGCAGAAAGGTCAAG CTCTGGGAGTCCGTCTGAAC

JunB GTTAGCTTCCCAAGGTGCTG GGTCCCTGTGACCCCTAAAT

Smad7 TCGGACAGCTCAATTCGGAC GGTAACTGCTGCGGTTGTAA

Data analysis

A perl script made by Ola Wallerman was used to filter peaks in the treated sample that were present 

either both in control and treated samples or not located within 10 kb of a TSS. Briefly, the script 

compares the positions of the peaks to all TSSs downloaded from UCSC genome browser and reports 

the distance to the nearest one.

Acknowledgments

I would like to thank Claes Wadelius for giving me the chance to work in his group. Many thanks to  Olla Wallerman for teaching me the deep secrets of ChIP and for his support. I am really grateful to  Mehdi Motallebipour for his unconditional patience answering my questions, to Mahdu Bysani and  Kalicharan Patra for their generosity lending reagents, to Patricia Respuela for her "ChIP tips and  tricks", to Katerina Pardali for useful comments on the manuscript and TGF­beta wisdom and to Aris  Moustakas for providing home­made Smad2 antibody.

Lastly, this work is dedicated to the amazing friends I made along the way: Ammar, Gucci, Jelena, 

Jessica, Millaray and Sara. The moments we shared together made my experience at Rudbeck 

unforgettable.

References

Alexandrow, M. G. & Moses, H. L. (1995). Transforming growth factor beta and cell cycle regulation.  

Cancer Res 55(7), 1452­­1457.

Antequera, F. (2003). Structure, function and evolution of CpG island promoters. Cell Mol Life Sci  60(8), 1647­­1658.

Attisano, L. & Wrana, J. L. (2002). Signal transduction by the TGF­beta superfamily. Science  296(5573), 1646­­1647.

Barski, A.; Cuddapah, S.; Cui, K.; Roh, T.; Schones, D. E.; Wang, Z.; Wei, G.; Chepelev, I. & Zhao, K. 

(2007). High­resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell 129(4),  823­­837.

Biswas, S.; Chytil, A.; Washington, K.; Romero­Gallo, J.; Gorska, A. E.; Wirth, P. S.; Gautam, S.; 

Moses, H. L. & Grady, W. M. (2004). Transforming growth factor beta receptor type II  inactivation promotes the establishment and progression of colon cancer. Cancer Res 64(14),  4687­­4692.

Blobe, G. C.; Schiemann, W. P. & Lodish, H. F. (2000). Role of transforming growth factor beta in  human disease. N Engl J Med 342(18), 1350­­1358.

Carroll, J. S.; Liu, X. S.; Brodsky, A. S.; Li, W.; Meyer, C. A.; Szary, A. J.; Eeckhoute, J.; Shao, W.; 

Hestermann, E. V.; Geistlinger, T. R.; Fox, E. A.; Silver, P. A. & Brown, M. (2005). 

Chromosome­wide mapping of estrogen receptor binding reveals long­range regulation  requiring the forkhead protein FoxA1. Cell 122(1), 33­­43.

Collas, P. & Dahl, J. A. (2008). Chop it, ChIP it, check it: the current status of chromatin  immunoprecipitation. Front Biosci 13, 929­­943.

Cosgrove, M. S. & Wolberger, C. (2005), How does the histone code work?  Biochem Cell Biol 83(4),  468­­476.

DeLarco, J. & Todaro, G. J. (1976). Membrane receptors for murine leukemia viruses: characterization  using the purified viral envelope glycoprotein, gp71. Cell 8(3), 365­­371.

Elliott, R. L. & Blobe, G. C. (2005). Role of transforming growth factor Beta in human cancer. J Clin  Oncol 23(9), 2078­­2093.

Fajans, S. S.; Bell, G. I. & Polonsky, K. S. (2001). Molecular mechanisms and clinical pathophysiology  of maturity­onset diabetes of the young. N Engl J Med 345(13), 971­­980.

Hanahan, D. & Weinberg, R. A. (2000). The hallmarks of cancer. Cell 100(1), 57­­70.

Hua, X.; Miller, Z. A.; Wu, G.; Shi, Y. & Lodish, H. F. (1999). Specificity in transforming growth  factor beta­induced transcription of the plasminogen activator inhibitor­1 gene: interactions of  promoter DNA, transcription factor muE3, and Smad proteins. Proc Natl Acad Sci U S A  96(23), 13130­­13135.

Ishikawa, F.; Nose, K. & Shibanuma, M. (2008). Downregulation of hepatocyte nuclear factor­4alpha  and its role in regulation of gene expression by TGF­beta in mammary epithelial cells. Exp  Cell Res 314(10), 2131­­2140.

Iyer, V. R.; Horak, C. E.; Scafe, C. S.; Botstein, D.; Snyder, M. & Brown, P. O. (2001). Genomic 

binding sites of the yeast cell­cycle transcription factors SBF and MBF. Nature 409(6819),  533­­538.

Jennings, M. T. & Pietenpol, J. A. (1998). The role of transforming growth factor beta in glioma  progression. J Neurooncol 36(2), 123­­140.

Jenuwein, T. & Allis, C. D. (2001). Translating the histone code. Science 293(5532), 1074­­1080.

Johnson, D. S.; Mortazavi, A.; Myers, R. M. & Wold, B. (2007). Genome­wide mapping of in vivo  protein­DNA interactions. Science 316(5830), 1497­­1502.

Jonk, L. J.; Itoh, S.; Heldin, C. H.; ten Dijke, P. & Kruijer, W. (1998). Identification and functional  characterization of a Smad binding element (SBE) in the JunB promoter that acts as a 

transforming growth factor­beta, activin, and bone morphogenetic protein­inducible enhancer. J  Biol Chem 273(33), 21145­­21152.

Kamaraju, A. K. & Roberts, A. B. (2005). Role of Rho/ROCK and p38 MAP kinase pathways in  transforming growth factor­beta­mediated Smad­dependent growth inhibition of human breast  carcinoma cells in vivo. J Biol Chem 280(2), 1024­­1036.

Lieb, J. D.; Liu, X.; Botstein, D. & Brown, P. O. (2001). Promoter­specific binding of Rap1 revealed by  genome­wide maps of protein­DNA association. Nat Genet 28(4), 327­­334.

Lin, X.; Liang, Y.; Sun, B.; Liang, M.; Shi, Y.; Brunicardi, F. C.; Shi, Y. & Feng, X. (2003). Smad6  recruits transcription corepressor CtBP to repress bone morphogenetic protein­induced  transcription. Mol Cell Biol 23(24), 9081­­9093.

Liu, F.; Pouponnot, C. & Massagué, J. (1997). Dual role of the Smad4/DPC4 tumor suppressor in  TGFbeta­inducible transcriptional complexes. Genes Dev 11(23), 3157­­3167.

Massagué, J.; Blain, S. W. & Lo, R. S. (2000). TGF­beta signaling in growth control, cancer, and  heritable disorders. Cell 103(2), 295­­309.

Massagué, J.; Seoane, J. & Wotton, D. (2005). Smad transcription factors. Genes Dev 19(23),  2783­­

2810.

Matsuura, I.; Denissova, N. G.; Wang, G.; He, D.; Long, J. & Liu, F. (2004). Cyclin­dependent kinases  regulate the antiproliferative function of Smads. Nature 430(6996), 226­­231.

Mito, Y.; Henikoff, J. G. & Henikoff, S. (2007). Histone replacement marks the boundaries of cis­

regulatory domains. Science 315(5817), 1408­­1411.

Miyazawa, K.; Shinozaki, M.; Hara, T.; Furuya, T. & Miyazono, K. (2002). Two major Smad pathways  In TGF­beta superfamily signalling. Genes Cells 7(12), 1191­­1204.

Moustakas, A. & Kardassis, D. (1998). Regulation of the human p21/WAF1/Cip1 promoter in hepatic  cells by functional interactions between Sp1 and Smad family members. Proc Natl Acad Sci  USA 95(12), 6733­­6738.

Moustakas, A.; Souchelnytskyi, S. & Heldin, C. H. (2001). Smad regulation in TGF­beta signal  transduction. J Cell Sci 114(Pt 24), 4359­­4369.

Nagarajan, R. P.; Zhang, J.; Li, W. & Chen, Y. (1999). Regulation of Smad7 promoter by direct  association with Smad3 and Smad4. J Biol Chem 274(47), 33412­­33418.

Piek, E.; Heldin, C. H. & Dijke, P. T. (1999). Specificity, diversity, and regulation in TGF­beta  superfamily signaling. FASEB J 13(15), 2105­­2124.

Rada­Iglesias, A.; Ameur, A.; Kapranov, P.; Enroth, S.; Komorowski, J.; Gingeras, T. R. & Wadelius, C. 

(2008). Whole­genome maps of USF1 and USF2 binding and histone H3 acetylation reveal new  aspects of promoter structure and candidate genes for common human disorders. Genome Res  18(3), 380­­392.

Ren, B.; Robert, F.; Wyrick, J. J.; Aparicio, O.; Jennings, E. G.; Simon, I.; Zeitlinger, J.; Schreiber, J.; 

Hannett, N.; Kanin, E.; Volkert, T. L.; Wilson, C. J.; Bell, S. P. & Young, R. A. (2000). 

Genome­wide location and function of DNA binding proteins. Science 290(5500),  2306­­

2309.

Robertson, G.; Hirst, M.; Bainbridge, M.; Bilenky, M.; Zhao, Y.; Zeng, T.; Euskirchen, G.; Bernier, B.; 

Varhol, R.; Delaney, A.; Thiessen, N.; Griffith, O. L.; He, A.; Marra, M.; Snyder, M. & Jones,  S. (2007). Genome­wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin 

immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nat Methods 4(8), 651—657.

Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning ­ A laboratory manual. 2nd  edition. Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.

Seoane, J.; Le, H.; Shen, L.; Anderson, S. A. & Massagué, J. (2004). Integration of Smad and forkhead  pathways in the control of neuroepithelial and glioblastoma cell proliferation. Cell 117(2),  211­­223.

Shendure , J. & Ji, H. (2008). Next­generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26(10), 1135­­45.

Shi, W.; Chang, C.; Nie, S.; Xie, S.; Wan, M. & Cao, X. (2007). Endofin acts as a Smad anchor for  receptor activation in BMP signaling. J Cell Sci 120(Pt 7), 1216­­1224.

Shi, W.; Sun, C.; He, B.; Xiong, W.; Shi, X.; Yao, D. & Cao, X. (2004). GADD34­PP1c recruited by  Smad7 dephosphorylates TGFbeta type I receptor. J Cell Biol 164(2), 291­­300.

Shi, Y. & Massagué, J. (2003). Mechanisms of TGF­beta signaling from cell membrane to the  nucleus. Cell 113(6), 685­­700.

Sporn, M. B. & Roberts, A. B. (1990). TGF­beta: problems and prospects. Cell Regul 1(12), 875­­882.

Stopa, M.; Anhuf, D.; Terstegen, L.; Gatsios, P.; Gressner, A. M. & Dooley, S. (2000). Participation of  Smad2, Smad3, and Smad4 in transforming growth factor beta (TGF­beta)­induced activation of  Smad7. THE TGF­beta response element of the promoter requires functional Smad binding  element and E­box sequences for transcriptional regulation. J Biol Chem 275(38), 

29308­­29317.

Strahl, B. D. & Allis, C. D. (2000). The language of covalent histone modifications. Nature  403(6765), 41­­45.

Struhl, K. (2007). Transcriptional noise and the fidelity of initiation by RNA polymerase II. Nat Struct  Mol Biol 14(2), 103­­105.

ten Dijke, P. & Hill, C. S. (2004). New insights into TGF­beta­Smad signalling. Trends Biochem Sci  29(5), 265­­273.

Tsukazaki, T.; Chiang, T. A.; Davison, A. F.; Attisano, L. & Wrana, J. L. (1998). SARA, a FYVE  domain protein that recruits Smad2 to the TGFbeta receptor. Cell 95(6), 779­­791.

Tucker, R. F.; Shipley, G. D.; Moses, H. L. & Holley, R. W. (1984). Growth inhibitor from BSC­1 cells  closely related to platelet type beta transforming growth factor. Science 226(4675), 705­­707.

Verrecchia, F. & Mauviel, A. (2002). Transforming growth factor­beta signaling through the Smad 

pathway: role in extracellular matrix gene expression and regulation. J Invest Dermatol 118(2), 

211­­215.

Watt, A. J.; Garrison, W. D. & Duncan, S. A. (2003). HNF4: a central regulator of hepatocyte  differentiation and function. Hepatology 37(6), 1249­­1253.

Wederell, E. D.; Bilenky, M.; Cullum, R.; Thiessen, N.; Dagpinar, M.; Delaney, A.; Varhol, R.; Zhao,  Y.; Zeng, T.; Bernier, B.; Ingham, M.; Hirst, M.; Robertson, G.; Marra, M. A.; Jones, S. & 

Hoodless, P. A. (2008). Global analysis of in vivo Foxa2­binding sites in mouse adult liver  using massively parallel sequencing. Nucleic Acids Res 36(14), 4549­­4564.

Wong, C.; Rougier­Chapman, E. M.; Frederick, J. P.; Datto, M. B.; Liberati, N. T.; Li, J. M. & Wang,  X. F. (1999). Smad3­Smad4 and AP­1 complexes synergize in transcriptional activation of the  c­Jun promoter by transforming growth factor beta. Mol Cell Biol 19(3), 1821­­1830.

Zhang, H.; Zhao, J.; Zheng, S. & Chen, X. (2005). Is TGFBR1*6A really associated with increased  risk of cancer? J Clin Oncol 23(30), 7743­­4; author reply 7744­6.

Zhang, W.; Hoffman, B. & Liebermann, D. A. (2001). Ectopic expression of MyD118/Gadd45/CR6  (Gadd45beta/alpha/gamma) sensitizes neoplastic cells to genotoxic stress­induced apoptosis.  

Int J Oncol 18(4), 749­­757.