1
2
3
4
Prohlášení
Byl jsem seznámen s tím, ţe na mou diplomovou práci se plně vztahuje zákon č. 121/2000 Sb. o právu autorském, zejména § 60 – školní dílo. Beru na vědomí, ţe Technická univerzita v Liberci (TUL) nezasahuje do mých autorských práv uţitím mé diplomové práce pro vnitřní potřebu TUL. Uţiji-li diplomovou práci nebo poskytnu- li licenci k jejímu vyuţití, jsem si vědom povinnosti informovat o této skutečnosti TUL;
v tomto případě má TUL právo ode mne poţadovat úhradu nákladů, které vynaloţila na vytvoření díla, aţ do jejich skutečné výše. Diplomovou práci jsem vypracoval samostatně s pouţitím uvedené literatury a na základě konzultací s vedoucím diplomové práce a konzultantem. Současně čestně prohlašuji, ţe tištěná verze práce se shoduje s elektronickou verzí, vloţenou do IS STAG.
Datum:
Podpis:
5
Poděkování
Rád bych tímto poděkoval vedoucí mé diplomové práce Ing. Lucii Křiklavové za ochotu, věnovaný čas a odborné vedení při vypracovávání této práce. Dále děkuji pracovníkům Vysoké školy Chemicko-technologické v Praze za ochotu, trpělivost a poskytnuté rady v rámci laboratorního měření, které bylo zde provedeno. Nakonec bych rád poděkoval svému zaměstnavateli, který mi poskytl prostor pro finalizaci této práce.
6
Abstrakt
Účinné odbourání fenolu dnes hraje důleţitou roli při biologickém čištění průmyslových odpadních vod. Jednou z moţností je pouţití populace bakterie Rhodococcus erythropolis roustoucí v biofilmu. Biofilm je uskupení buněk uzavřených v extracelulárně produkovaném polymerním matrix a mezi jeho přední vlastnosti patří větší odolnost vůči toxickým vlivům. Tvorba biofilmu je podmíněna adhezí mikroorganismu na příslušný povrch. V první fázi adheze se uplatňují zejména fyzikálně-chemické interakce. Smyslem předkládané práce je popsat tyto interakce za pomocí fyzikálně-chemických modelů, přičemţ hlavním cílem je vytvoření počítačové aplikace v prostředí MATLAB, která bude univerzálním nástrojem pro studium adheze u volitelných objektů. Zároveň je ukázána její aplikovatelnost v rámci zkoumání několika moţných nosičů biofilmu, které by mohly být pouţity při zpracování odpadních vod.
Klíčová slova: biologické čištění, adheze, biofilm, interakce, mikroorganismus, nanovlákna, grafické uţivatelské rozhraní, MATLAB, signály
7
Abstract
Efficient degradation of phenol today plays an important role at biological treatment of industrial wastewater. One possibility is to use a population of bacteria Rhodococcus erythropolis growing in biofilm. Biofilm is a group of cells enclosed in extracellular-produced polymeric matrix and one of its most important property is higher resistance to the toxic effects. Adhesion is the first step in biofilm formation.
In the first phase of adhesion physical-chemical forces are exerted. The purpose of this thesis is to describe these interactions using physico-chemical models and the main aim is to create software program using MATLAB, which will be a universal tool for studying the adhesion of selectable objects. It is also shown its applicability in the context of a few possible biofilm media that could be used in wastewater treatment.
Keywords: biological treatment, adhesion, biofilm, interactions, microorganism, nanofibers, graphical user interface, MATLAB, signals
8
Obsah
1 ÚVOD ... 14
2 ZÁKLADNÍ POJMY ... 15
2.1 Fázové rozhraní ... 15
2.2 Koloidy ... 15
2.3 Mikrobiální adheze ... 15
2.4 Biofilm ... 16
2.5 Kohezní a adhezní síly ... 16
2.6 Povrchová energie ... 17
2.7 Nekovalentní interakce ... 18
3 INTERAKCE ... 19
3.1 Lifshits van der Waalsovy interakce ... 19
3.1.1 Elektronegativita ... 19
3.1.2 Dipólový moment ... 19
3.1.3 Londonovy disperzní síly ... 20
3.1.4 Keesomovy interakce ... 21
3.1.5 Debeyovy interakce ... 21
3.2 Elektrostatické interakce ... 22
3.2.1 Elektrická dvojvrsta ... 22
3.2.2 Zeta-potenciál ... 23
3.2.3 Faktor pH ... 23
3.3 Lewisovy acidobazické interakce ... 24
3.3.1 Hydrofobní efekt ... 25
3.3.2 Vodíkové vazby ... 25
4 FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ PŘÍSTUPY ... 26
4.1 Termodynamický přístup ... 26
4.2 Klasický DLVO přístup ... 30
9
4.3 Rozšířený DLVO přístup (xDLVO) ... 33
5 PRAKTICKÁ ČÁST ... 35
5.1 Laboratorní příprava ... 35
5.1.1 Bakterie Rhodococcus erythropolis ... 35
5.1.2 Komerční nosič AnoxKaldnes ... 36
5.1.3 Nosič PAQ_34 ... 37
5.1.4 Nanovlákenný nosič ... 38
5.1.5 Postup měření ... 39
5.1.6 Naměřené a nalezené hodnoty ... 40
5.2 ANALÝZA DAT ... 41
5.2.1 Analýza signálů v originální oblasti ... 41
5.2.2 Analýza signálů ve spektrální oblasti ... 46
5.3 REALIZACE V PROSTŘEDÍ MATLAB ... 48
5.3.1 Návrh řešení ... 48
5.3.2 Realizace aplikace ... 48
5.3.3 MATLAB ... 49
5.3.4 Rozvrţení programu ... 49
5.3.5 Systém Handle Graphics ... 50
5.3.6 Pouţité grafické objekty ... 51
5.3.7 Přenos dat ... 52
5.3.8 Řazení dat ... 53
8.5.7 Ukládání dat ... 53
8.5.8 Hlavní okno ... 54
8.5.9 Okno Termodynamický přístup ... 56
8.5.10 Okno pro porovnání křivek ... 57
8.5.11 Okno pro zobrazení historie výsledků ... 58
9 VÝSLEDKY A DISKUSE ... 60
10
9.1 Kolonizace komerčního nosiče AnoxKaldnes ... 60
9.2 Kolonizace nosiče v podobě nanovlákenné příze ... 65
10 ZÁVĚR ... 72
11 LITERATURA ... 74
11
Seznam symbolů a zkratek
A Hamakerova konstanta [J nebo kT]. Zastupuje konstanty odvozené pro výpočet vzájemných Lifshitz–van der Waalsovských interakcí mezi dvěma objekty.
a Poloměr částice (resp. buňky) [m]
AB Acidobazické (Lewisovy) polární interakce, tzv. hydrofobní/hydrofilní síly. Zahrnují veškeré elektron donor/akceptorové interakce (např.
vodíkové můstky).
BVB Systém buňka-voda-buňka, kde dochází k interakcím mezi buňkami.
BVN Systém buňka-voda-nosič, kde dochází k interakcím mezi buňkou a nosičem.
CAM Měření kontaktního úhlu θ (contact angle measurement), metoda pro měření volné povrchové energie (resp. hydrofobnosti) pevných látek a buněčných preparátů.
d Separační vzdálenost mezi dvěma povrchy [m] (mezi dvěma buňkami nebo mezi buňkou a pevným nosičem).
DFT Diskrétní Fourierova transformace – algoritmus pro získání spektra signálu, který je reprezentován výčtem vzorků. Slouţí pro převod signálů z časové oblasti do oblasti frekvenční.
DLVO Derjaguin, Landau, Verwey, Overbeek – fyzikální model popisu chování koloidních soustav, pojmenovaný zkratkou jmen zakladatelů.
EL Elektrostatické interakce, přitaţlivé nebo odpudivé nekovalentní síly mezi náboji nebo dipóly. Jejich energie závisí na velikosti nábojů a permitivitě prostředí, se vzdáleností exponenciálně klesá. Ve srovnání s ostatními nekovalentními interakcemi mají EL daleký dosah.
FBBR Biofilmový reaktor s fixovanými nosiči biomasy (Fixed Bed Biofilm Reactor).
FFT Fast Fourier Transform – rychlá varianta výpočtu Diskrétní Fourierovy transformace.
G Gibbsova energie [J], stavová termodynamická funkce, charakterizuje rovnováţný stav při konstantní teplotě a tlaku. Uţívá se k popisu přirozeného směru fyzikálních a chemických reakcí.
12 GUI Grafické uţivatelské rozhraní (Graphical User Interface) – soubor komponent (ikon, tlačítek, popisků, tabulek, oken, panelů …), které jsou vizuálně prezentovány uţivateli a slouţí k ovládání počítačového programu.
GUIDE Graphical User Interface Development Environment – interaktnivní průvodce při tvorbě programu v prostředí MATLAB.
HDPE Vysokodensitní polyetylen – polyetylen je termoplast, který vzniká polymerací ethenu.
I Iontová síla roztoku [mol·dm-3].
LW Lifshitz-van der Waalsovy síly (nepolární interakce), nekovalentní a neelektrostatické přitaţlivé nebo odpudivé síly mezi molekulami.
Vznikají z interakcí náhodně orientovaných dipólů molekul, indukovaných dipólů nebo dočasných dipólů v molekulách.
MATLAB Maticová laboratoř (matrix laboratory) – vývojové prostředí pro práci s čísly, vektory čísel a maticemi čísel, které zároveň poskytuje jejich snadnou vizualizaci.
MBBR Biofilmový reaktor s volně se pohybujícími nosiči biomasy (Moving Bed Biofilm Reactor).
MCR MATLAB Compiler Runtime - samostatný soubor sdílených knihoven, které umoţnují spouštění aplikací vytvořených v systému MATLAB bez nutnosti jeho instalace.
PAQ_34 Nosič vyrobený z vysokodensitního polyetylenu vyvíjený společností PRO-AQUA CZ a TUL.
PP Polypropylen - polymer, který je součástí nosiče v podobě nanovlákenné příze.
PU Polyuretan – polymer, který je součástí nosiče v podobě nanovlákenné příze.
xDLVO Extended Derjaguin Landau Verwey Overbeek – rozšířená verze fyzikálního modelu pro popis chování koloidních soustav.
ΔG Změna Gibbsovy interakční energie [J·m-2].
θ Řecké písmeno théta, značka pro kontaktní úhel (úhel smáčení).
γ Řecké písmeno gamma, značka pro povrchové (mezifázové) napětí.
ε Řecké písmeno epsilon, značka pro permitivitu prostředí [F·m-1].
13 ζ Řecké písmeno zeta, značka pro elektrokinetický potenciál (tzv. zeta
potenciál) [V].
κ Řecké písmeno kappa, jeho převrácená hodnota je Debyeova délka, tloušťka elektrické dvojvrstvy [m].
λ Recké písmeno lambda, značka pro korelační vzdálenost molekul v kapalném médiu.
14
1 ÚVOD
Ţivotní prostředí je vlivem působení člověka kontaminováno řadou toxických látek, které mají většinou průmyslový původ. Pouţití populace bakterie Rhodococcus erythropolis rostoucí v biofilmu umoţňuje efektivní odbourávání těchto látek při zpracovávání průmyslových odpadních vod. Tento mikroorganismus disponuje relativně dobrými vlastnostmi k formování biofilmu. Biofilm je uskupení buněk uzavřených v extracelulárně produkovaném polymerním matrix a lze si ho představit v podobě tenké vrstvy na povrchu určitého objektu (kámen, plast). Jednou z hlavních vlastností biofilmu je vysoká ochrana uskupených buněk, které dokáţí obstojně odolávat vnějším vlivům, například přítomnosti polutantů. Tyto procesy jsou velmi rozšířeny v environmentální biotechnologii. Biofilmové reaktory dovolují dosaţení vysoké koncentrace biomasy umoţňující účinné čištění velkých objemů průmyslových odpadních vod. Jedním z klíčových kroků vzniku biofilmu je adheze první buňky k pevnému povrchu. Poznání a pochopení souvislostí mezi vlastnostmi povrchu buněk, schopností adheze a tvorbou biofilmu můţe otevřít cestu ke konstrukci účinnějších biotechnologických procesů určených pro dekontaminaci odpadních vod [1] [23].
Cílem této práce je prozkoumat moţnosti modelování mikrobiální adheze a na základě těchto poznatků vytvořit počítačovou aplikaci, která by usnadnila další vývoj této dosud nepříliš probádané oblasti. Dílčím krokem bude laboratorní testování několika povrchů, jehoţ účelem je získat vstupní veličiny pro následné modelování.
Konkrétně se jedná o komerční nosič AnoxKaldnes, nekomerční nosič Aqua PK a nanovlákenný nosič vyvíjený na Technické univerzitě v Liberci. V rámci tohoto úkolu bude vyuţita analýza signálů k identifikaci naměřených dat a nalezení specifických informací potřebných pro srovnání jednotlivých testovacích vzorků.
Samotné modelování by mělo stanovit verdikt, který z těchto nosičů disponuje největší adherenční schopností a tudíţ nejlepšími předpoklady pro úspěšnou aplikaci na čistírnách odpadnívch vod, jelikoţ právě první nárůsty biofilmu v čistírenských procesech jsou stěţejním předpokladem k vytvoření úspěšného systému.
15
2 ZÁKLADNÍ POJMY 2.1 Fázové rozhraní
Fázové rozhraní je tenká oblast mezi dvěma objemovými fázemi. V této tenké oblasti se mění vlastnosti první objemové fáze na vlastnosti druhé objemové fáze.
Vlastnosti se však nemění skokem, nýbrţ pozvolně. Jako příklad můţeme uvést vodní hladinu, kde se jedná o fázové rozhraní kapalina-plyn (voda na rozhraní se vzduchem) [4].
2.2 Koloidy
Koloidy jsou obecně tzv. disperzní soustavy tvořené částicemi o rozměrech 1nm-1µm, které jsou rozptýlené v kapalině, plynu a někdy i v pevné látce.[4].
Disperzní soustava se skládá z disperzního podílu a z disperzního prostředí.
Disperzní podíl jsou jednotlivé částice. Disperzní prostředí je prostředí, ve kterém jsou tyto částice rozptýlené [4].
Thomas Graham zavedl v roce 1861 slovo koloid jako označení pro suspenzi jedné látky ve druhé, které se ani po dlouhém stání neoddělily. Koloidy se tedy skládají z dispergované fáze a z disperzního prostředí. Přitom o koloidním stavu látky se obecně mluví tehdy, kdyţ je látka dispergována na částice menší neţ asi 0,2 µm. Jelikoţ rozlišovací schopnost mikroskopu při pouţití obyčejného světla je přibliţně 0,2 µm, je k přímému pozorování koloidních částic obvykle nutný elektronový mikroskop [8].
2.3 Mikrobiální adheze
Doslovný překlad adheze je přilnavost. Je to schopnost materiálu (především dvou rozdílných materiálů) spolu přilnout. Mikrobiální je od slova mikroorganismus a je to jednobuněčný, jen mikroskopicky pozorovatelný organismus. Často tvoří různé kolonie, shluky s jinými organismy. Tato práce se konkrétně zabývá koloidními soustavami, tedy mikroorganismy o velikosti od aţ rozptýlenými v kapalném prostředí [4].
16
2.4 Biofilm
Biofilm představuje uskupení buněk, které jsou uzavřeny v extracelulárně produkovaném polymerním matrix, tedy v jakési mimobuněčné hmotě. Jeho hlavním znakem je odolnost vůči vnějším vlivům [1].
Většina mikroorganismů se v ţivotním prostředí vyskytuje v přisedlé formě, tj. uchytí se na určitý biotický či abiotický povrch. V takovémto přirozeném uskupení jsou navíc obklopené mimobuněčnou hmotou a chovají se jako komplexní a spolupracující celek [37].
Vytvoření zralého biofilmu na povrchu objektu se obecně skládá ze čtyř sekvenčních kroků: transport mikroorganismu, počáteční mikrobiální adheze, tvorba mimobuněčné hmoty, kolonizace růstem pevně přiloţených organismů. Adheze mikroorganismu na pevný povrch je tedy klíčovým krokem pro následný vznik biofilmu [38].
2.5 Kohezní a adhezní síly
Kohezní síly si můţeme představit jako síly v rámci kaţdé látky. Mezi molekulami uvnitř látky působí přitaţlivé síly a tyto síly „drţí“ látku při sobě. U pevné látky jsou největší, u plynu nejmenší.
Při rozestírání kapaliny po povrchu pevné látky nebo po povrchu jiné kapaliny si konkurují přitaţlivé síly mezi molekulami rozestírané kapaliny (síly kohezní) a mezimolekulární síly mezi oběma fázemi, jejichţ rozhraní při rozestírání zvětšuje svou plochu (síly adhezní). Kohezní síly v rozestírané kapalině jsou charakterizovány tzv. kohezní prací, definovanou jako práce potřebná k roztrţení sloupce kapaliny o jednotkovém průřezu, tj. pro vytvoření dvou nových rovnováţných rozhraní s plynnou fází. Podobně je definována adhezní práce jako práce potřebná k odtrţení sloupce kapaliny o jednotkovém průřezu od druhé fáze [4] [37].
17
2.6 Povrchová energie
Soustava zobrazená na obr. 1 představuje kapalinu, která je ve styku se svou párou. Chceme-li zvětšit plochu mezifázového rozhraní, musíme převést odpovídající počet molekul z vnitřku kapaliny na její povrch, coţ znamená, ţe musíme vykonat určitou práci proti kohezním silám působícím v kapalině [4] [20].
Obr.1 Fázové rozhraní kapalina – pára
Zdroj: BARTOVSKÁ, Lidmila.Fyzikální chemie povrchů a koloidních soustav
Z toho plyne, ţe kapalina na fázovém rozhraní má vyšší volnou povrchovou energii neţ stejná kapalina ve fázi objemové. V roce 1805 ukázal Thomas Young, ţe mechanické vlastnosti povrchu kapaliny je moţno přirovnat k vlastnostem jakési hypotetické blány napnuté přes povrch kapaliny. O této bláně se mělo za to, ţe je ve stavu napětí. Tento jev charakterizuje veličina povrchové napětí γ. Povrchové napětí působí v rovině povrchu a vţdy takovým směrem, ţe klade odpor všem snahám zvětšit plochu povrchu. Jednotkou povrchového napětí v SI je newton na metr (N.m-1) [4] [20].
18
2.7 Nekovalentní interakce
Předkládaná práce se týká pouze a jen nekovalentních interakcí. K rozpoznávání molekul obecně dochází pomocí specifických interakcí mezi nimi. V tomto případě nesmí dojít k trvalému spojení rozpoznávaných molekul. Proto tyto interakce nevedou ke vzniku pevných (kovalentních) vazeb, ale pouze ke vzniku slabých spojení, které se nazývají nekovalentní interakce, nevazebné interakce nebo slabé interakce [12].
V našem případě poté následují jiné neţ chemické děje k pevnému upoutání buňky a nosiče, popřípadě dvou stejných buněk.
19
3 INTERAKCE
3.1 Lifshits van der Waalsovy interakce
Van der Waalsovy síly jsou slabé interakce, které působí přímo mezi jednotlivými částicemi, tedy mezi molekulami, či atomy. Jsou přímo úměrné vzdálenosti mezi těmito částicemi [5] [7].
K pochopení Van der Waalsových interakcí je nejprve nutné pochopit několik pojmů, jako například pojem dipól, dipólový moment, elektronegativita, polární a nepolární typ molekuly.
3.1.1 Elektronegativita
Přesná definice elektronegativity závisí na úhlu pohledu. Například Linus Carl Pauling definoval elektronegativitu jako schopnost atomu v molekule přitahovat k sobě elektrony [8]. My se této definice budeme drţet, protoţe v rámci naší problematiky je postačující a asi nejvýstiţnější.
3.1.2 Dipólový moment
Představme si molekulu, která je sloţená z různých atomů, například kyselinu chlorovodíkovou – HCl. Chlor má vyšší elektronegativitu neţ vodík a proto si chlor přitáhne k sobě elektronový pár blíţ. Z toho plyne, ţe v okolí chloru vznikne částečný (parciální), záporný náboj ( ). Záporný z toho důvodu, protoţe elektron je záporně nabitá částice. V okolí vodíku zase vznikne částečný, kladný náboj ( ). Jsou to tedy v podstatě dva stejně veliké, od sebe oddělené náboje, ale opačné polarity. Velikost tohoto dipólu lze určit za pomoci dipólového momentu. Dipólový moment se vypočítá jako součin délky vazby ( ) a náboje ( ). Dipólový moment je vektor, tudíţ záleţí na směru úsečky. Orientace je od záporného pólu ke kladnému (viz. obr. 2) [5] [8].
20 V případě, ţe víceatomová molekula obsahuje více neţ jednu vazbu mající dipólový charakter, výsledný dipólový moment molekuly se vypočítá jako vektorový součet jednotlivých dipólových momentů. Výsledek udává typ molekuly [8].
Obr.2: Dipólový moment dvouatomové molekuly Zdroj: www.doitpoms.ac.uk
První moţností je, ţe výsledný dipólový moment molekuly je nenulový. V tomto případě hovoříme o molekule polární. Naopak nepolární molekula vznikne v případě, kdy celkový dipólový moment je roven nule.
Můţe nastat případ, kdy rozloţení elektronů v atomu či molekule se neustále mění. Příčinou tohoto jevu můţe být samovolné působení nebo působení jiné polární molekuly. Takový dipól, který vznikne působením jiné částice, se nazývá indukovaný.
Po skončení působení jiné nabité částice tento dipól zaniká - jedná se tedy o dočasný dipól [5].
Van der Waalsovy síly se z hlediska zastoupení dělí na tři základní skupiny.
Pomocí Lifshitze bylo dokázáno, ţe v makroskopických systémech by měly být všechny tři typy zohledněny stejným způsobem [20].
3.1.3 Londonovy disperzní síly
Tyto síly jsou ze všech nejslabší. Působí většinou mezi nepolárními molekulami.
Jsou to vzájemné interakce dočasných dipólů. Jinými slovy musí platit, ţe ţádná z reagujících komponent není permanentním dipólem [20].
21 3.1.4 Keesomovy interakce
Tyto síly jsou naopak nejsilnější. Jedná se o vzájemné působení permanentních dipólů. Můţeme je nalézt hlavně u polárních molekul, například u molekuly vody [20].
3.1.5 Debeyovy interakce
Tyto interakce vznikají v případě, ţe se nepolární molekula dostane do blízkosti polární molekuly. Díky tomu ovlivní elektrické pole polární molekuly rozloţení elektronů v nepolární molekule a vzniká indukovaný dipól, který pak můţe interagovat s dalšími molekulami [20].
22
3.2 Elektrostatické interakce
Druhou velkou skupinou interakcí, které se vysokou mírou podílejí na průběhu mikrobiální adheze, jsou interakce elektrostatické. Opět je nutné si nejprve objasnit pár základních pojmů.
3.2.1 Elektrická dvojvrsta
Představme si nějakou částici (atom, molekulu) umístěnou do kapaliny (např. vody). Kaţdá částice disponuje určitým nábojem (v praxi většinou záporným), tedy distribuuje ionty do svého okolí. Díky této skutečnosti se zvyšuje koncentrace opačných iontů těsně u povrchu částice a vzniká tak útvar sloţený ze dvou opačně nabitých vrstev, který se nazývá elektrická dvojvrstva. Tato elektrická dvojvrstva vzniká kolem kaţdé částice v kapalině [4] [5].
Obr.3 Elektrická dvojvrstva Zdroj: www.intechopen.com
Šternova vrstva
Difůzní vrstva
Vzdálenost od povrchu částice Potenciál
Povrchový potenciál Šternův potenciál Zeta potenciál
23 Okolí částice lze následně rozdělit do dvou oblastí (obr. 3). První je oblast vnitřní, tzv. Šternova vrstva. Zde jsou ionty silně vázané. Druhá (vnější oblast) se nazývá difúzní a zde jsou ionty vázány slaběji. V difúzní oblasti existuje hranice, kde jsou ionty a částice v rovnováze [5].
3.2.2 Zeta-potenciál
Kaţdá částice se můţe například vlivem gravitace pohybovat. V tu chvíli však ne všechny ionty putují s ní. Část iontů ulpívá na povrchu pevné látky, ale zbytek se nepohybuje s pevnou látkou, ale s kapalinou. Vzniká jakýsi potenciál na tzv. pohybovém rozhraní - na rozhraní mezi přilínající vrstvou a ostatní kapalinou.
Potenciál, který se vyskytuje na této hranici, se nazývá elektrokinetický nebo také Zeta-potenciál (ζ-potenciál) [4] [5].
Tento potenciál nám mimo jiné naznačuje stabilitu koloidního systému. Má-li částice v suspenzi hodně vysoký či hodně nízký ζ-potenciál, částice se navzájem odpuzují. V případě, ţe mají částice ζ-potenciál nepatrný (+30 mV,-30 mV), shlukují se [5].
ζ-potenciál je funkcí uspořádání fázového rozhraní. Znaménko ζ-potenciálu je opačné neţ znaménko iontů vnější vrstvy a hodnota nebývá vyšší jak 0,1V. Jeho hodnota je značně ovlivněna přídavkem elektrolytů a to i v malých koncentracích [4].
3.2.3 Faktor pH
Samotná hodnota ζ-potenciálu je v podstatě nic neříkající. K uvedené hodnotě ζ-potenciálu je zároveň nutné charakterizovat prostředí (kapalinu), ve kterém se částice
vyskytuje. Stěţejní parametr, který ovlivňuje ζ-potenciál a charakterizuje danou kapalinu je tzv. faktor pH. Tento parametr by se měl uvádět ke kaţdé jeho hodnotě.
Hodnota pH, při které je velikost ζ-potenciálu nulová, se nazývá izoelektrický bod a v tomto bodě je koloidní systém nejméně stabilní [5].
24 Obr.4: Závislost Zeta potenciálu na faktoru pH
Zdroj: http://www.silver-colloids.com/Tutorials/Intro/pcs18.html
3.3 Lewisovy acidobazické interakce
Poslední velkou skupinou zúčastněných sil jsou tzv. Lewisovy acidobasické interakce. Síla těchto interakcí je aţ o dva řády větší neţ interakce LW či EL a projevují se mezi polárními komponentami molekul, čili v polárních prostředích jako například ve vodě. Vliv AB interakcí je nesmírně významný v porovnání s EL a LW interakcemi.
Nicméně, AB interakce mají relativně krátký dosah a tudíţ je vyţadován blízký kontakt obou povrchů (méně neţ 5 nm), aby tyto síly měly vliv [13] [19].
Do Lewisových acidobasických interakcí jsou zahrnuty i tzv. vodíkové můstky (vazby) a hydrofobní interakce [19].
AB interakce jsou zaloţeny na elektron-donorových a elektron-akceptorových interakcích mezi polárními polovinami ve vodných roztocích, jejichţ výsledkem jsou specifické jevy, jako účinky strukturované vody na rozhraních, hydrofobní přitaţlivost a hydrofilní odpudivost [13]
Například nepolární molekuly se v polárních rozpouštědlech rozpouštějí jen nepatrně. Mezi molekulami rozpouštědla látky totiţ nepůsobí tak velké přitaţlivé síly, jaké působí mezi molekulami rozpouštědla navzájem [7].
Zeta potenciál (mV)
pH
Stabilní
Stabilní Izoelektrický bod
25 3.3.1 Hydrofobní efekt
Hydrofobní přitaţlivost je nejsilnější nekovalentní, neelektrostatická vazebná síla vyskytující se mezi částicemi, molekulami polymerů, ponořených ve vodě.
Přitaţlivost mezi dvěma nepolárními povrchy nebo mezi jedním polárním a druhým nepolárním ve vodě se nazývá hydrofobní efekt. Název hydrofobní je ale nesprávné označení. Hydrofobní povrchy, tj. nepolární povrchy se nebojí vody, ale naopak, hydrofobní povrchy přitahují vodu. Například velmi hydrofobní materiály, jako je teflon, nebo alkany, kdyţ jsou ponořeny do vody, přitahují molekuly vody pomocí volné povrchové energie o velikosti zhruba 40-50 mJ/m2, coţ není zanedbatelné [19].
3.3.2 Vodíkové vazby
Vodíková vazba, která rovněţ nese alternativní název vodíkový můstek, je specifickým typem přitaţlivé interakce zprostředkované atomem vodíku podle schématu A-H…B, kde A a B jsou prvky s velkou elektronegativitou a B je prvek, který má volný elektronový pár. Skupina A-H je donorem vodíku a atom B je jeho akceptorem. Prvek B je nejčastěji kyslík (voda), dusík, flor, či chlor. Elektrostaticky můţeme vysvětlit tvorbu vodíkové vazby jako interakci kladného parciálního náboje H a záporného parciálního náboje na B [7].
Obr. 5: Hydrofobní interakce ve vodě Zdroj: VODRÁŽKA, Zdeněk. Biochemie.
Hydrofobní interakce se obecně uplatňují ve vodných roztocích. Způsobují je nepolární části molekul, které mají tendenci vzájemně se seskupovat a minimalizovat svůj kontakt s molekulami vody (odtud hydrofobní, neboli „bojící se“ vody). Názorný popis ukazuje obr. 5. Energie těchto interakcí vznikne z porušení uspořádané struktury molekul vody, které obklopují shlukující se nepolární zbytky [12].
26
4 FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ PŘÍSTUPY 4.1 Termodynamický přístup
Termodynamický přístup (k adhezivním interakcím) porovnává volné povrchové energie jednotlivých zúčastněných látek, tedy buňky (mikroorganismus), pevného povrchu (substrát) a kapaliny (obr. 6). Tento rozdíl energií je vyjádřen tzv. volnou energií adheze (celková Gibbsova energie), která je vyjádřena jako rozdíl mezi mezifázovou energií pevný povrch-buňka a součtem mezifázových energií pevný povrch-kapalina a kapalina-buňka [13].
Obr.6: Adheze mikroorganismu (M) na substrát (S) v kapalině (L) Zdroj: Rolf Bos, Henny C. van der Mei, Henk J. Bussche r - Physico- chemistry of initial microbial adhesive interactions its mechanisms and
methods for study, 1999).
27 Jak jiţ bylo řečeno, kaţdé z těchto rozhraní je charakterizováno mezifázovou energií (mezifázovým napětím). Změnu Gibbsovy energie pro adhezní děj je moţno vyjádřit bilancí:
(1)
kde je adhezní Gibbsova energie v systému buňka – vodné prostředí – nosič (BVN), vztaţená na jednotku plochy fázového rozhraní ) a jsou příslušná mezifázová napětí ) [6].
V případě záměny substrátu za jinou buňku, lze tento model pouţít i pro agregaci. Znaménko výsledné adhezní energie předpovídá z fyzikálně-chemického hlediska, zda k adhezi dojde či nikoliv. Jako všechny systémy v přírodě, se bude zobrazený systém interagujících povrchů, snaţit dosáhnout stavu nejniţší volné energie.
Mikrobiální adheze je upřednostňována z pohledu volné energie takto:
pro < 0 upřednostňována, pro > 0 nikoliv [13].
Mezifázová napětí vystupující v rovnici (1) však nejsou přímo experimentálně přístupná. Tento problém je moţno řešit např. rozdělením celkové Gibbsovy adhezní energie i mezifázových napětí v systému BVN na dvě sloţky: nepolární, Lifshitz-van der Waalsovu (LW) a polární, acidobazickou (AB).
(2)
(3)
28 Pro nepolární část platí:
(√ √ ) (√ √ ) (4)
Polární sloţka se dále dá rozdělit na sloţku elektron-akceptorovou (index +) a elektron-donorovou (index -):
√ (5)
[ √ (√ √ √ )
√ (√ √ √ ) √ √ ] (6)
Podle vztahu (2) je celková adhezní energie dána součtem rovnic (4) a (6).
Celkovou Gibbsovu energii při agregaci, tedy v případě interakce dvou stejných buněk ( ), lze popsat vztahem [6]:
(√ √ )
(√ √ √ √ ) (7)
Bohuţel je experimentálně nemoţné získat i hodnoty volných mezifázových energií , , , , , , které vystupují v rovnicích (5) a (6), resp. (7).
Běţným vstupem pro modelování těchto energií jsou data o kontaktních úhlech.
Kontaktní úhly různých kapalin (index ℓ) jsou měřeny umístěním kapky velikosti 1 mikrolitr na povrch, kterým můţe být jak pevný substrát, tak mikrobiální kolonie
29 (index s = N pro pevné substráty, s = B pro mikrobiální vrstvy). Rovnováţný stav kontaktních úhlu souvisí s volnými povrchovými energiemi ve vztahu podle Youngovy rovnice (8), ve které dolní indexy vyjadřují příslušné volné povrchové energie. Mezi kontaktním úhlem θ, povrchovým napětím kapaliny ( ) a pevného povrchu ( ) a mezifázovým napětím pevná látka-kapalina ( ) platí v rovnováze [13]:
(8)
Vztah pro Gibbsovu adhezní energii kapaliny ℓ na pevném povrchu nosiče nebo mikrobiální vrstvy ve spojení s Youngovou rovnicí (2) má pro tento případ tvar:
) (9)
Mezi povrchovým napětím kapaliny a kontaktním úhlem na jedné straně a polárními a nepolárními sloţkami povrchových napětí kapaliny a pevného povrchu na druhé straně pak platí Youngova-Dupréova rovnice:
) (√ √ √ ) (10)
Dále si určíme tři různé kapaliny, pro něţ známe hodnoty celkového povrchového napětí ( ), hodnoty elektron-donorové ( ), elektron-akceptorové ( ) a nepolární ( ) sloţky povrchového napětí (například vodu, formamid a 1-bromnaftalen). Dosadíme-li jejich obecně známé hodnoty kontaktních úhlů (θ), získáme tak soustavu tří rovnic o třech neznámých ( √ , , √ √ ), kterou můţeme relativně jednoduše vyřešit. Nalezneme tak hodnoty sloţek povrchových energií, které potřebujeme pro výpočet adhezní Gibbsovy energie [6].
30
4.2 Klasický DLVO přístup
Termodynamický přístup nebere mimo jiné v potaz separační vzdálenost mezi jednotlivými zúčastněnými objekty ani elektrostatickou sloţku vzájemných interakcí.
Adheze je zde vyjádřena jako celková Gibbsova energie při kontaktu obou povrchů [23].
V klasickém DLVO (Derjaguin, Landau, Verwey, Overbeek) přístupu je naopak mikrobiální adheze popsána jako bilance mezi přitaţlivou Lifshitz-van der Walsovou (LW) silou a odpudivou či přitaţlivou silou elektrostatickou (EL) v závislosti na separační vzdálenosti obou povrchů. Zapojení EL interakcí zde však vyţaduje, aby byly k jiţ naměřeným kontaktním úhlům naměřeny i hodnoty Zeta potenciálů interagujících povrchů. V souladu s tímto faktem, interagující energie mezi dvěma interagujícími povrchy můţe být rozdělena následovně:
) ) ) (11)
Slábnutí / úbytek těchto energií závisí na separační vzdálenosti (d) mezi dvěma interagujícími povrchy [13].
Lifshitz-van der Walsovy přitaţlivé síly nejsou závislé na iontové síle, ale jak dosah, tak velikost elektrostatických interakcí se zvyšující se iontovou silou slábne díky překrývání nábojů jednotlivých povrchů. Elektrostatické síly při vysoké iontové síle prakticky ztrácí vliv [13].
Ve většině případů je odpudivý nebo přitaţlivý charakter elektrostatických sil ( ) dán skutečností, ţe všechna mezifázová rozhraní nesou za daných podmínek určitý náboj. Jelikoţ převáţná část povrchů v přírodě mívá za běţných podmínek celkový náboj záporný, elektrostatické interakce jsou zpravidla odpudivé [6].
Van der Waalsovy síly ( ) jsou pro systém BVN (nebo BVB) nejčastěji přitaţlivé a jsou přímo úměrné Hamakerově konstantě (A), jak vyplývá ze vztahů (13) a (15). Hamakerova konstanta je sloţena z více konstant a popisuje vlastnost prostředí, charakterizuje intenzitu interakce obou povrchů v kapalině a závisí na dielektrických vlastnostech prostředí a interagujících materiálů [4] [6].
31 Ačkoliv přesné hodnoty Hamakerovy konstanty pro mikrobiální buňky ve vodném prostředí nejsou dány, existují způsoby jejich alespoň přibliţného získání.
Způsobů existuje více (například dosazení univerzální hodnoty), ale my se budeme drţet jednoho konkrétního, který je kombinací termodynamického a klasického DLVO přístupu. Hamakerova konstanta je vyjádřena pomocí Lifshitz-van der Waalsovy sloţky Gibbsovy interakční energie podle rovnice (12) [6] [13] [21] :
(12)
Jak elektrostatické tak Van der Waalsovy interakce jsou závislé na zakřivení jednotlivých částic vyjádřeném poloměrem (a). Zároveň je i důleţité, zdali se jedná o interakci buňky s pevným povrchem (tedy kulová částice s rovinným povrchem) anebo o agregaci (tedy interakci dvou stejných, kulových povrchů). V prvním případě (systém BVN) je výpočet sloţek celkové interakční energie ( a ) v závislosti na vzdálenosti mezi povrchy (d) dán rovnicemi (13) (14) [6] [13]:
) * ( )+ (13)
)
) * ( ) )) { )}+ (14)
32 Ve druhém případě (systém BVB) platí pro sloţky celkové interakční energie ( a ) rovnice:
) ) (15)
) ) )
* ( ) )) { )}+ (16)
√ ∑ (17)
V rovnicích (14) aţ (16) vystupuje tzv. Debeyova délka ( ), která představuje tloušťku elektrické difuzní dvojvrstvy a lze ji vypočítat pomocí vztahu (17).
Obr.7: Potenciálová bariéra Zdroj: Procházková el al., 2011
33 V závislosti na iontové síle existuje tzv. sekundární minimum (několik kT), ve kterém se mikroorganismy mohou uchytit reversibilně (jelikoţ primární minimum vyţaduje větší přiblíţení). V mnoha případech lze přechodné ukotvení v sekundárním minimu povaţovat za dostatečné pro úspěšnou adhezi, jelikoţ v této vzdálenosti (několik nm) se jiţ mohou projevit specifické biochemické interakce vedoucí k pevné nevratné adhezi [6] [13].
Pro interagující energie jsou preferovány jednotky kT (1 kT = 4,04 . J při 293 K). 1kT představuje tepelnou energii nebo energii Brownova pohybu organismu, coţ poskytuje referenční hodnotu pro adhezi [6] [13].
4.3 Rozšířený DLVO přístup (xDLVO)
Tento přístup byl navrţen van Ossem a v poslední době vznikl v souvislosti s původem hydrofobních interakcí v mikrobiální adhezi. Zvaţuje 4 fundamentální, nekovalentní interakce: Lifshits van der Waalsovy, Elektrostatické, Lewisovy acidobazické a síly Brownova pohybu [13].
Oproti klasické DLVO teorii se tedy liší v přidání sloţky AB, coţ jsou v podstatě hydrofobní interakce. Jak jiţ bylo řečeno, vliv AB interakcí je nesmírně významný v porovnání s EL a LW interakcemi (10-100krát vyšší), ale kvůli krátkému dosahu je nutný blízký kontakt obou povrchů (méně neţ 5 nm) [13].
Celková interakční energie adheze ( ) v závislosti na separační vzdálenosti (d) se v rozšířené DVLO (xDLVO) teorii pak vyjadřuje jako:
) ) ) ) (18)
Rozšířenou DLVO teorii lze povaţovat za kombinaci termodynamického přístupu a klasické DLVO teorie, jelikoţ se do vztahu (19) dosazuje polární sloţka mezifázové interakční energie ( ) získaná termodynamickým přístupem.
Pro výpočet ) a ) u xDLVO teorie platí vztahy (13) aţ (16) [6].
34 Výpočet ) pro systém BVN v závislosti na vzdálenosti mezi povrchy (d) je dán vztahem (19). Vztah (20) popisuje podobný výpočet pro systém adheze dvou buněk o poloměru (a) v závislosti na vzdálenosti mezi povrchy (d):
) [ ) ] (19)
) [ ) ] (20)
Ve vztazích (17) a (18) se objevuje tzv. rovnováţná vzdálenost (nejbliţší moţný kontakt povrchů) = 0,158±0,009 nm a korelační délka molekul v kapalném médiu ( ), která se pohybuje v závislosti na převaţující acidobazické interakci (hydrofilní odpuzování nebo hydrofobní přitaţlivost) v rozmezí 0,6 aţ 13 nm [6].
35
5 PRAKTICKÁ ČÁST
Cílem této části předkládané diplomové práce bylo laboratorně otestovat několik povrchů různých materiálů a na základě naměřených dat určit přibliţný průběh adheze mezi jednotlivými účastníky a vybrat tak nejvhodnější materiál pro poţadované účely.
V rámci laboratorní přípravy bylo nutné naměřit hodnoty kontaktních úhlů a zeta potenciálů zkoumaných vzorků materiálů. Takto získaná data dále slouţila jako vstupní hodnoty pro vytvořený model procesu adheze jednobuněčných mikroorganismů k abiotickému povrchu. Tento model byl naprogramován v prostředí MATLAB podle předepsaných kritérií probíraných v teoretické části této práce. Konkrétně byl aplikován termodynamický přístup a následně klasická i rozšířená teorie DLVO. Na základě výsledků obou přístupů byla provedena analýza dat pomocí teorie signálů a byly stanoveny obecné charakteristiky jednotlivých průběhů adheze. Na závěr byla provedena komparace průběhů zkoumaných materiálů a selekce nejvhodnějšího materiálu pro účely biologického čištění odpadních vod.
5.1 Laboratorní příprava
Nejprve bylo nutné naměřit hodnoty kontaktních úhlů a zeta potenciálů jednotlivých účastníků adheze, pro které se bude studovat (ne)úspěšnost tohoto děje.
Měření probíhalo v laboratořích ve Vysoké škole chemicko-technologické na Ústavu biotechnologie.
5.1.1 Bakterie Rhodococcus erythropolis
První z účastníků byl kmen bakterie Rhodococcus erythropolis, který splňuje všechny poţadované atributy pro pouţití v rámci zkoumané problematiky této práce.
Jedná se o aerobní, nepohyblivý mikroorganismus vyskytující se v půdě. Co se týče tvaru a uspořádání buněk, dá se přirovnat ke krátkým i delším tyčkám s náznaky větvení. Jeho velikost je . Jeho optimální kultivační teplota je 30 °C. Vyznačuje se mimo jiné vysokou schopností tvorby biofilmu [1].
36 Obr. 8: Rhodococcus Erythropolis
Zdroj: demystifybiodesulphurisationoil.wordpress.com
5.1.2 Komerční nosič AnoxKaldnes
První ze zkoumaných materiálů byl Anoxkaldnes typu K3, který má cylindrický tvar a rozměry 12,5 mm v průměru, 12 mm na výšku. Z vnější strany vystupují malé výběţky. Uvnitř je nosič rozdělen ţebrováním. Biofilm se ideálně vyvíjí uvnitř nosiče, jelikoţ je mu zde poskytnuta ochrana před vnějšími vlivy. Nosič je vyroben z vysoko- densitního polyetylenu (HDPE). Tyto polyethylenové nosiče mohou tvořit aţ 70 % objemu nádrţe reaktoru a jsou navrhovány tak, aby suspendovány ve vodě poskytovaly co největší chráněný povrch pro nárůst biofilmu a optimální podmínky pro rozvoj bakteriálních kultur [22].
Následující laboratorní měření bylo soustředěno na dva konkrétní vzorky tohoto materiálu – zcela nový a pouţitý, jiţ jednou kolonizovaný vzorek.
0.5 µm
37 Obr. 9: Nosič Anoxkaldnes typ K3 (nový a kolonizovaný)
Zdroj: www.veoliawaterst.com/mbbr/cz/carriers.htm
5.1.3 Nosič PAQ_34
Druhým zkoumaným nosičem byl nosič PAQ_34, který byl vyvinut společností PRO-AQUA CZ, s.r.o., která se zaměřuje na realizace projektů v oblasti vodního hospodářství (čištění odpadních vod, úprava vod pitných apod.). Vyvinutý nosič PAQ_34 je navrţen pro univerzální vyuţití pro pomalu i rychle rostoucí mikroorganismy, tedy typy biodegradérů s nízkým i vysokým koeficientem produkce biomasy. Proto vykazuje relativně značný povrch při vysoké průchodnosti kapaliny nosičem, coţ zabraňuje problémům s ucpáváním otvorů nosiče biofilmem a sniţováním celkového uţitného specifického povrchu. Na druhou stranu je specifický povrch nosiče dostatečný pro uchycení pomalu rostoucích mikroorganismů s niţší hodnotou koeficientu produkce biomasy (např. nitrifikační baktérie) [23].
Obr. 10: Nosič PAQ_34 Zdroj:[23]
25 mm
3 mm
38 5.1.4 Nanovlákenný nosič
Posledním zkoumaným nosičem byla nanovlákenná příze. Technologie nanovlákenných nosičů je jiţ řadu let vyvíjena na Technické univerzitě v Liberci.
Velkou výhodou této technologie je moţnost kombinovat různé polymery a podle charakteru odpadních vod nastavovat hustotu nosiče (900 kg/m3 aţ 1200 kg/m3).
Výchozími, dosud ověřenými materiály pro nanovlákenné nosiče, jsou polyetylen, polypropylen a polyuretan. Zkoumané vlákno je tvořeno následovně. Základní vlákno je z polypropylenu. Povlak je tvořen polyuretanovými vlákny. Vše je navíc dvojitě obtočeno ochranným polyetylenovým vláknem, které má za úkol chránit objekt vůči tření při zpracování a vůči dezintegraci nanovláken při následných aplikacích [24].
Ob. 11: Nosič v podobě nanovlákenné příz e Zdroj: [24]
Smyslem měření bylo mimo jiné určit pokud moţno optimální poměr výše uvedených částí materiálů pro dosaţení maximální schopnosti adheze.
0.5 mm
39 5.1.5 Postup měření
Kontaktní úhly byly stanoveny metodou CAM (Contact Angle Measurement) pomocí přístroje CAM 200, KSV Instruments LTD, Finsko a softwaru CAM 2008, KSV. Určení hodnot kontaktních úhlů spočívalo ve snímání tvaru kapky kapaliny v kontaktu s povrchy jednotlivých zkoumaných materiálů. Aplikované kapaliny byly voda, formamid a 1-bromnaftalen. Pro kaţdý povrch bylo v rámci jedné kapaliny provedeno 5 měření.
Kaţdý vzorek materiálu byl nejprve omyt ethanolem, aby byl zbaven od nečistot a poté nalepen pomocí oboustranné lepicí pásky na podloţní sklíčko, které bylo následně umístěno na snímané místo. Celý proces byl realizován v ochranných rukavicích, protoţe i drobná kontaminace vzorku, např. potem z dlaně ruky, by mohla ovlivnit přesnost měření.
Kapalina byla aplikována pipetou. Výška jehly nad vzorkem byla nastavena tak, aby kapka dopadala na vzorek z co nejmenší výšky, aby nedocházelo k její deformaci.
Pomalým otočením šroubu jehly byla vytlačena kapka o minimální velikosti.
V okamţiku dopadu kapky kamera automaticky zhotovila 20 snímků. Jednotlivé snímky byly snímány vţdy po jedné sekundě. Po nasnímání se v softwaru ručně určily hraniční body mezi kapkou a povrchem měřeného vzorku a program automaticky vyhodnotil levý, pravý a průměrný kontaktní úhel u všech dvaceti snímků.
Hodnoty potenciálu Zeta byly naměřeny pomocí přístroje Zetasizer Nano-ZS (Malvern, UK). Měření se nejčastěji provádějí ve vodném prostředí a při nepříliš velké koncentraci elektrolytu [5]. Měřeno bylo za standardních podmínek (10 mM, pH 2-12).
Samotný proces spočíval pouze ve vloţení preparátu do kyvety přístroje. Přístroj vyhotovil grafický výstup, z něhoţ byl vysledován výsledek.
40 5.1.6 Naměřené a nalezené hodnoty
Tabulka1: Naměřené a nalezené hodnoty kontaktních úhlů Kontaktní úhel tří kapalin
Materiál Voda (°) Formamid (°) 1-Bromnaftalen (°)
AnoxKaldnes typ K3 nový 78,20 61,56 29,14
AnoxKaldnes typ K3 pouţitý
75,95 61,55 35,19
Aqua PAQ_34 93,57 77,67 34,43
Rhodococcus erythropolis 88 ± 1 66 ± 1 40 ± 1 Polypropylen 107 ± 3 [31] 91,8 ± 2,4 [31] 53,2 ± 2,3 [31]
Polyuretan 78,43 [29] 62,98 ± 0,72 [32]
37,96 [29]
Polyetylen 102 ± 2,4
[31]
78 ± 2,8 [31] 35,8 ± 1,8 [31]
Nanovlákenná příze * 95,8 77,6 42,3
Nanovlákenná příze ** 99,9 76,7 36,2
Tabulka2: Naměřené a nalezené hodnoty zeta potenciálu Zeta potenciál při neutrálním pH
Materiál Hodnota (mV)
Rhodococcus erythropolis -28
Vysokodensitní polyetylen -54 [35]
Polypropylen -80 [34]
Polyuretan -42 [30]
Polyetylen -18 [39]
Nanovlákenná příze * -46
Nanovlákenná příze ** -19.5
* hodnota je určena aritmetickým průměrem tří dílčích materiálů (polypropylen, polyuretan, polyetylen)
** hodnota je určena následujícím rozložením: 1% polypropylen, 9% polyuretan, 90%
polyetylen
41
5.2 ANALÝZA DAT
Výsledky (rozšířeného) DLVO přístupu jsou z důvodu postupného přibliţování dvou povrchů v podobě řady čísel. Řada čísel definuje obecný diskrétní signál [3].
S výsledky lze proto pracovat jako s diskrétními signály a vzniká tak nová oblast studie daných křivek. Číslicový signál je v tomto případě vektorem (maticí) čísel v paměti počítače [14].
Cílem analýzy signálů je daný signál charakterizovat, neboli určit jeho parametry [14]. Jednotlivé parametry zde vyplývají z povahy řešené úlohy.
V následující kapitole byla popsána vţdy daná problematika, teoretický princip řešení a zároveň jeho konkrétní aplikace.
K popisu nebo zobrazení signálu existují teoreticky dvě moţnosti. První z moţností je popis signálu v originální oblasti. To je oblast, kde byl signál pořízen.
Tato oblast je nám bliţší, většinou to bývá čas nebo vzdálenost. Druhou moţností je popis signálu ve spektrální oblasti, kde je popsán tzv. spektrem. Někdy je vhodné oba způsoby kombinovat. Oba přístupy popisují signál beze zbytku [14] [17].
5.2.1 Analýza signálů v originální oblasti
Jednodušším způsobem analýzy číslicových signálů je jejich zkoumání v oblasti, kde byla data pořízena. Obvykle je originální oblastní čas, čili jednotlivé vzorky jsou naměřeny v časových intervalech. Vodorovná osa zobrazení má pak význam času [14].
V našem případě to není čas, ale vzdálenost – konkrétně separační vzdálenost mezi buňkou a pevným povrchem, respektive mezi dvěma buňkami.
5.2.1.1 Průsečíky křivky
Nalezení průsečíků křivky s vodorovnou, popřípadě vertikální osou patří mezi základní charakteristiky analyzovaných signálů v rovině [14]. Průsečíky obecně definují určitý přechod mezi dvěma prostředími. V tomto případě se jedná o interakční energie
mezi dvěma objekty, kdy pod vodorovnou osou (separační vzdálenost) je celková adhezní energie záporná a nad vodorovnou osou kladná. Připomeňme si ještě základní fakt, ţe adheze je upřednostňována pro < 0.
42 V předkládané práci jsou brány v úvahu celkem tři obecné varianty průběhů adhezní funkce. Tyto případy jsou následující: křivka protne vodorovnou osu celkem dvakrát a vzniknou dva průsečíky (obr. 12a), křivka protne vodorovnou osu pouze jednou a vznikne jeden jediný průsečík (obr. 12b) a křivka vodorovnou osu neprotne (obr. 12c). Nás zajímá případ první, protoţe k adhezi dochází za určitých okolností a tyto okolnosti budou předmětem zkoumání. V tomto případě totiţ existují body primárního energetického maxima, primárního energetického minima a sekundárního energetického minima, které nám budou poskytovat referenční hodnoty pro další analýzy. Zároveň existuje oblast tzv. energetické potenciální bariéry, která rovněţ hraje významnou roli. Zbylé dvě varianty jsou z teoretického hlediska moţné, ale pro další zkoumání bezúčelné.
Obr. 12: Průsečíky křivky s vodorovno osou
G G
G
d d
d
a) b)
c)
43 Adhezní děj popíšeme od jeho počátku, tedy budeme postupovat směrem doleva z konce vodorovné osy (mezi dvěma objekty je nejdelší vzdálenost, která se postupným přibliţováním objektů zkracuje). Dva objekty (dvě buňky, popřípadě buňka a nosič) jsou od sebe vzdáleny určitou vzdáleností a postupně se k sobě přibliţují. Trajektorie křivky se nachází pod osou d, protoţe se oba objekty vyskytují v dostatečné vzdálenosti na to, aby na sebe nemohly působit odpudivými silami. Při dostatečném přiblíţení se buňka dostane do tzv. sekundárního minima (obr. 13), kdy následuje relativně prudký nárůst energie směrem nahoru, neboť musí překonat tzv. energetickou (potenciálovou) bariéru. Po překonání této bariéry se dostane do tzv. primárního maxima. Odtud pak následuje pokles energie směrem dolů pod vodorovnou osu, kdy vzniká přilnutí obou objektů k sobě navzájem a koncovou hodnotu adhezní energie stanovuje primární minimum. Celková adhezní energie je záporná, protoţe se objekty přitahují.
Při hledání průsečíků bylo nutné brát v potaz diskrétní povahu signálu. Signál je reprezentován výčtem vzorků, a proto bylo nutné dva sousední vzorky, pro které platí, ţe jeden ze vzorků se nachází pod vodorovnou osou a druhý nad vodorovnou osou, proloţit přímkou. Přímka je obecně tvořena dvěma body. Souřadnice obou bodů jsou známé, a proto lze sestrojit obecnou rovnici přímky. Dosazením jedné ze souřadnic (d=0) hledaného průsečíku do obecné rovnice přímky získáme jeho přibliţnou polohu a tedy separační vzdálenost, při které se celková adhezní energie mění ze záporné hodnoty v kladnou a naopak.
5.2.1.2 Extrémy křivky
Maximální, minimální hodnota a jejich souřadnice nám slouţí pro první identifikaci křivky [14]. Nás zajímá primární maximum, které specifikuje výši energetické bariéry a sekundární minimum, které specifikuje nejzápornější bod v předbariérové části křivky (tedy bod, ze kterého buňka začne energetickou bariéru překonávat). Primární minimum představuje konečnou interakční energii při maximálním přiblíţení obou objektů.
44 Obr. 13: Průběh adhezní funkce
5.2.1.3 Numerická derivace
K výpočtu derivace se obvykle pouţívají algebraické výrazy, které byly odvozeny na základě platných matematických pravidel. Tento princip lze pouţít v případě algebraického vyjádření funkce. V našem případě máme k dispozici pouze řadu číselných hodnot, tudíţ je nezbytné pouţít jiný princip a to numerické metody derivace [24].
Tyto metody na rozdíl od analytických, které určují spojité řešení na určité předem definované oblasti, poskytují číselné řešení v předem zvolených diskrétních bodech v rámci této oblasti. Toto řešení většinou nebývá přesné, ale představuje pouze jeho aproximaci, která je zatíţena určitou chybou [24].
V předkládané práci je však kladen důraz na porovnání parametrů různých průběhů signálů a na základě tohoto porovnání vyvodit určité závěry. Z tohoto důvodu jsou tyto metody v tomto případě zcela dostačující.
PRIMÁRNÍ MAXIMUM
PRIMÁRNÍ MINIMUM
SEKUNDÁRNÍ MINIMUM G
d
45 Numerická podoba derivace se nazývá diference. Jedná se o rozdíl mezi hodnotami dvou sousedních vzorků číslicového signálu [14]. Diference vyjadřuje změnu signálu v určité oblasti [3]. Za určitých podmínek adhezního děje mezi buňkou a pevným povrchem ve vodném prostředí existuje specifická oblast v podobě energetické potenciální bariéry, kterou buňka musí překonat. Smyslem výše uvedeného postupu bylo získat míru změny signálu v oblasti potenciální bariéry.
5.2.1.4 Numerická integrace
Výpočet spojitého určitého integrálu stanoví obsah plochy pod křivkou.
Principem numerické integrace je rozdělení vzdálenosti mezi prvním a koncovým bodem integrované oblasti na jakési svislé prouţky a následné posčítání všech takto vzniklých podoblastí [26]. Numerické metody výpočtu integrálu jsou velmi vhodné pro pouţití ve výpočetní technice, neboť jsou algoritmicky snadno realizovatelné [24].
Je důleţité evidovat rozdíl mezi pojmy integrace a kvadratura. Zatímco integrace je pouţívána ve smyslu metod pro řešení diferenciálních rovnic, kvadraturou je rozuměno vyčíslení určitého integrálu funkce, tedy nalezení plochy funkcí vymezenou. V našem případě se jedná o druhý případ [14].
Během adhezního děje je definována svislá osa jako celková interakční energie mezi dvěma přibliţujícími se povrchy. V případě, ţe je celková energie záporná, adhezní děj je přípustný. Čím větší tato hodnota je, tím větší předpoklady pro úspěšnou adhezi vznikají. Dalším kritériem by mohl být obsah plochy, kterou vymezuje řada hodnot vzhledem k vodorovné ose ve chvíli, kdy platí < 0. Pro odhad této hodnoty byl pouţit výpočet kvadratury.
K přibliţnému výpočtu plochy, kterou definují vybrané vzorky dat, bylo vyuţito tzv. lichoběţníkového pravidla. V systému MATLAB lze realizovat pomocí příkazu trapz. Výpočet plochy pod křivkou je zde nahrazen výpočtem plochy pod lichoběţníkem [24].
46 5.2.1.5 Korelace
Korelace je matematický nástroj pouţívaný v rámci zpracování signálů pro analýzu řady hodnot. Vyjadřuje vzájemný vztah mezi dvěma nebo více signály [17].
Jednotlivé změny vstupních hodnot mají vliv na tvar výsledné křivky. Rozdíly mezi tvary jednotlivých křivek byly studovány pomocí korelace. Míra korelace byla vyjádřena pomocí korelačního koeficientu, který charakterizuje sílu lineárního vztahu mezi oběma veličinami a v případě, ţe se jeho hodnota rovná , stanovuje lineární závislost.
5.2.2 Analýza signálů ve spektrální oblasti
Spektrální analýza nám přináší další poznatky o signálu. Můţeme říci, ţe spektrální analýza doplňuje analýzu v originální oblasti. Oba pohledy jsou ale kvalitativně naprosto rovnocenné, kaţdý však poskytuje jiné informace [14] [17].
Spektrální analýzu lze na signál aplikovat pouze v případě, je-li zadán jeho průběh v originální oblasti. K provedení této analýzy a k získání tzv. spektra signálu je nutné podrobit originální průběh některé z uţívaných lineárních transformací. Tyto transformace mají podobu příslušného algoritmu, po jehoţ aplikaci získáme sloţky spektra signálu [14] [17]. V předkládané práci byla vyuţita diskrétní Fourierova transformace, neboť pro spektrální analýzu jednorozměrných číslicových signálů nalezla největšího vyuţití [14].
5.2.2.1 Spektrum signálu
Spektrum signálu se dělí na dvě dílčí spektra a to na amplitudové a fázové.
Amplitudové spektrum vyjadřuje závislost amplitud signálu na jeho frekvenci a fázové spektrum vyjadřuje závislost jednotlivých fází signálu na jeho frekvenci [14].
Jinými slovy lze kromě originálního průběhu zakreslit signál ve formě frekvenčního spektra, kde na vodorovné ose je frekvence a na svislé ose je amplituda respektive počáteční fáze [14].
47 5.2.2.2 Diskrétní Fourierova transformace
Uţívané transformace mají za úkol rozloţit originální průběh na jednotlivé sloţky spektra. Diskrétní Fourierova transformace k tomu pouţívá harmonické funkce sinus a kosinus [14] [17].
DFT je nejpouţívanějším algoritmem pro spektrální analýzu číslicových signálů [14] a je definována pomocí rovnice (21), kde je originální průběh signálu, je celkový počet vzorků signálu, je komplexní proměnná, je pořadové číslo vzorku signálu:
{ } ∑
(21)
5.2.2.3 FFT
Pro výpočet jednoho vzorku spektrální odezvy pomocí algoritmu DFT je nutné provést celkem násobení a ) součtů. Dohromady je tedy nutné provést obecně komplexním operací. S mírnou nadsázkou lze konstatovat, ţe počet operací roste s kvadrátem počtu vzorků. Kvadratická závislost je omezujícím faktorem při velkém mnoţství vzorků [14].
V roce 1965 vznikla tzv. rychlá Fourierova transformace, jejíţ poslání bylo zefektivnění algoritmu DFT. Principem je rozdělení původního počtu vzorků (N) na dvě skupiny a to se sudým a lichým pořadovým indexem. V případě, ţe bude původní počet , kde , pak bude moţné v naznačeném dělení pokračovat do doby, kdy zůstanou jen dvojice vzorků. Výsledkem je razantní redukce potřebných operací (pro N = 8 je úspora okolo 78%) a sníţení výpočetní náročnosti z kvadratické na lineární [14] [17].
Systém MATLAB pouţívá k realizaci diskrétní Fourierovy transformace oba typy algoritmu. V případě, ţe je počet vzorků roven mocnině čísla 2, aplikuje algoritmus FFT. V opačném případě provede DFT. Zkoumání signálu v předkládané práci pomocí spektrální analýzy bylo zahrnuto z důvodu identifikace náhlých změn v pohybu buňky, která se přibliţuje k pevnému povrchu.
48
5.3 REALIZACE V PROSTŘEDÍ MATLAB
V následující kapitole je rozebráno uţivatelské rozhraní aplikace, načítání vstupních dat, jejich zpracování a následné výpočty pouţívané u všech metod modelování mikrobiální adheze.
5.3.1 Návrh řešení
Před samotným vytvářením programové aplikace v prostředí MATLAB byly stanoveny základní poţadavky na vzhled, souslednost výpočtů a funkčnost, které byly během vývoje doplňovány, aţ se ustálily na tomto výčtu:
1) jednoduchý vzhled a rozmístění ovládacích prvků,
2) načítání vstupních hodnot zadaných ručně uţivatelem, nebo z listu MS Excel 3) definování a ukládání nových objektů v podobě buněk a nosičů
4) výpočet aplikováním termodynamického přístupu 5) výpočet aplikováním klasické a rozšířené teorie DLVO 6) grafický výstup v podobě barevného grafu
7) analýza a výpočet základních parametrů křivky (průsečíky, extrémy, derivace, integrace, korelace)
8) analýza a výpočet dodatečných parametrů křivky (spektrální analýza) 9) moţnost porovnání dvou křivek na základě jednotlivých parametrů 10) uloţení jednotlivých výsledků do souboru nebo listu MS Excel
5.3.2 Realizace aplikace
Pro realizaci uţivatelské aplikace bylo zvoleno programové prostředí MATLAB, jakoţto vědeckotechnický nástroj pro zpracování dat. Aplikace byla realizována ve verzi R2009a pomocí kombinace grafického rozhraní GUIDE (Graphical User Interface Development Environment) a metody přímého naprogramování. Výhoda první varianty spočívá v tom, ţe všechny přidané prvky a provedené změny se zaznamenávají do zdrojového kódu v automaticky generovaném m-souboru (m-file). Programátor má tak značně ulehčenou práci. Výhoda druhé varianty spočívá ve větší volnosti a v lepším vyuţití paměti počítače. Z důvodu efektivnosti byly základní části programu vytvořeny formou GUIDE. Spuštění aplikace se provádí souborem Hlavni.exe, který je v kořenovém adresáři MBAdheze.
