EXAMENSARBETE
KEMITEKNIK
HÖGSKOLEINGENJÖRSUTBILDNINGEN
Metaboliter från svampar associerade till
granbarkborren (Ips typographus) och
deras effekter på andra svampars tillväxt.
Alexandra Wallerman
KTH
Stockholm
2 KTH KEMITEKNIK
HÖGSKOLEINGENJÖRSUTBILDNINGEN
EXAMENSARBETE
TITEL:
Metaboliter från svampar associerade till granbarkborren (Ips
typographus) och deras effekter på andra svampars tillväxt.
ENGELSK TITEL: Metabolites produced by fungi associated with bark
beetle (Ips typographus) and their effects on other
fungi growth.
SÖKORD:
Granbarkborre, Ips typographus, Ophiostoma picea,
Grosmannia penicillata, Ceratocystis polonica.
ARBETSPLATS:
Skolan för kemivetenskap, avdelningen för organisk
kemi, gruppen för ekologisk kemi, KTH.
HANDLEDARE:
Tao Zhao taozhao@kth.se
HANDLEDARE:
Karolin Axelsson karaxe@kth.se
STUDENT:
Alexandra Wallerman
DATUM:
020000 (datum för godkännande)
GODKÄND:
(examinators underskrift)
3
Sammanfattning
4
Summary
5
Innehållsförteckning
Sammanfattning ... 3 Summary ... 4 1. Inledning ... 7 1.1 Bakgrund ... 7 1.2 Problembild ... 7 1.3 Syfte ... 7 1.4 Mål ... 7 1.5 Metod ... 7 1.6 Avgränsningar ... 8 2. Granbarkborren i Sverige ... 9 2.1 Granbarkborren ... 9 2.2 Blånadssvampar ... 92.3 Kemisk ekologi mellan granbarkborrar och granar ... 10
2.4 Trädets försvarsmekanismer ... 12
2.5 Ekonomiska förluster i skogsindustrin ... 13
2.6 Dagens bekämpningsmetoder ... 15
2.6.1 Förebyggande åtgärder ... 15
2.6.2 Bekämpningsåtgärder ... 16
3 Material och metoder ... 18
3.1 2DGCMS ... 18
3.2 SPME ... 18
3.3 Odling av svampar ... 18
3.4 Agarplattor ... 20
3.5 Halvtidsanalys med SPME... 22
3.6 Filtrering och extraktion... 22
3.6.1 Svampodlingar i vätskemedium ... 22
3.6.2 Agarplattor ... 22
3.2 Odla gran i svampvätskan ... 23
3.3 Analys med 2DGCMS ... 23
3.4 SPME agarplattor ... 23
4 Resultat ... 24
4.1 Svampodling i vätskemedium ... 24
6 4.2.1 Barkmedium ... 24 4.2.2 Maltmedium ... 26 4.3 Agarplattor ... 27 4.3.1 Första odlingen ... 27 4.3.2 Andra odlingen ... 28 4.4 Granodling ... 32
4.5 SPME och GCMS agarplattor Barkmedium ... 33
4.6 SPME och GCMS agarplattor Maltmedium ... 37
5 Slutsats och diskussion ... 43
5.1 Odling av svampar ... 43 5.2 Agarplattor ... 43 5.3 Halvtidsanalys ... 44 5.4 Odling av grankvistar ... 44 5.5 2DGCMS ... 44 5.5.1 Svampodling i vätskemedium... 44 5.5.2 Agarplattor ... 45 5.6 SPME agarplattor ... 45 5.6.1 C. Polonica Bark ... 45 5.6.2 C. Polonica Malt ... 47 5.6.3 G. penicillata Bark ... 48 5.6.4 G. penicillata Malt ... 49 5.6.5 O. picea Bark ... 52 5.6.6 O. picea Malt ... 54 6 Felkällor ... 56 Källförteckning ... 57 Bilagor ... 58
Bilaga 1: Tillväxt av svampar andra omgången ... 58
Bilaga 2: Resultat av GCMS, ämnen producerade av bark och respektive svamp. ... 62
Bilaga 3: Ämnen producerade av malt och respektive svamp. ... 64
7
1. Inledning
1.1 Bakgrund
Granbarkborren är en svår skadeinsekt i de svenska skogarna och dödar stora mängder träd. Forskning visar på att insekten inte kan döda trädet själv, utan är beroende av de blånadssvampar de för med sig in när de attackerar trädet. Svamparna letar sig in i splintveden och orsakar där en lokal uttorkning. Detta stoppar vattenflödet och trädet dör av uttorkning. Vid ett kraftigt angrepp med många angreppspunkter kan trädet dö inom bara några veckor efter att svampen etablerat sig. Forskning visar även på att olika arter av blånadssvamp sänder ut tillväxthämmande ämnen för att konkurrera ut andra svamparter.
1.2 Problembild
Under ett normalt år dödas uppskattningsvis 50 000 m3 skog av granbarkborren i Sverige. För skogsägarna motsvarar detta en förlust på minst 10 miljoner kronor årligen (Södra, 2011). Man har upprättat lagar som syftar till att förebygga insektsskador så väl som bekämpningsåtgärder för att rädda redan angripen skog, men ingen metod ger idag ett fullständigt skydd utan att använda miljöfarliga insekticider. Granskogen är särskilt sårbar vid torra miljöförhållanden och efter stormar. Efter stormarna Gudrun och Per har granbarkborren under åren 2006-2009 dödat 3 miljoner m3 skog (Witzell, 2009). En uppskattning gjord år 2009 visar att kostnaderna för skadorna av granbarkborren efter stormen Gudrun uppgått till ca 1,2 miljarder kronor. (SLU, 2014)
1.3 Syfte
Detta examensarbete syftar till att undersöka de tillväxthämmande effekterna svamparterna Ophiostoma picea, Grosmannia penicillata och Ceratocystis polonica utövar på varandra. De kemiska ämnena ska extraheras och analyseras. En litteraturstudie ska utföras för att kartlägga problemet med granbarkborren i Sverige, hur ekologin mellan insekten och dess värdträd ser ut samt vilka metoder man använder idag för att bekämpa skadeinsekten.
1.4 Mål
Målen med arbetet är att ta reda på vilka ämnen svamparna sänder ut samt spekulera i vilka ämnen från vilken svampart som har störst tillväxthämmande effekt. Dessutom skall en beskrivning av problembilden innehållande typiska problemsituationer och effektproblematik tas fram. Möjligheterna att resultatet av analysen kan appliceras i skogsindustrin skall spekuleras .
1.5 Metod
8
1.6 Avgränsningar
9
2. Granbarkborren i Sverige
2.1 Granbarkborren
Granbarkborren är den mest destruktiva skadeinsekten för barrskog. Olika arter av barkborren attackerar olika typer av barrträd, men i Sverige förekommer främst den så kallade åttatandade granbarkborren, Ips typographus, som attackerar granskog. Granbarkborrens livscykel börjar med att unga insekter flyttar ut från de döda träd där de vuxit upp från larver. De börjar sprida sig och söka efter träd de själva kan yngla i. Med hjälp av visuella, känsel- och luktsignaler hittar de ett lämpligt träd varpå de sänder ut feromoner till andra granbarkborrar för att inleda en massattack. Granbarkborrarna gnager sig genom barken in till kambiumskiktet där de parar sig och gräver utrymmen för äggen. I dessa utrymmen sker larvutvecklingen och förpuppningen, dessa gångar kan ses i figur 1. De vuxna granbarkborrarna gnager sedan utgångar och sprider sig till nya träd (Phillips & Croteau, 1999).
Figur 1: Gnaggångar [B1] Granbarkborren är utspridd i hela Sveriges skogar, men nämndvärd träddöd orsakad av
denna insekt förekommer endast i Götaland, delar av Svealand samt en bit upp längs Norrlandskusten. (Witzell, 2009) Granbarkborren behöver ett dött träd för att kunna yngla. Därför angriper den gärna redan döda eller försvagade träd med nedsatt kondition som kan bero av torkstress. Särskilt utsatta är träden under torrperioder kombinerat med varma somrar eller efter stormfällningar. (Paine, et al., 1997) Granbarkborren kan även angripa ett friskt träd men behöver då lägga ner stor energi på att döda det. När granbarkborren börjat gnaga in sig i ett träd sänder de ut aggregationsferomoner till andra granbarkborrar för att locka dem till samma träd. Med detta samarbete kan trädet snabbare dödas vilket gynnar alla inblandade granbarkborrar. (SLU, 2014)
2.2 Blånadssvampar
10 döda trädet själv, utan är beroende av de blånadssvampar som den för med sig in i trädet. Blånadssvamparna sitter på huvudet av granbarkborren och när denna attackerar trädet förs svampen med in. När svampen trängt in i trädet letar den sig uppåt längs med veden för att hitta ett lämpligt ställe att attackera splintveden. När svampen nått in till splintveden, som är det yttersta levande veden, orsakar den där en lokal uttorkning. Trädets vattentransport sker främst i den yttersta veden vilken stoppas av denna uttorkning (Krokene, et al., 2000). Detta resulterar i att trädet torkar ut och dör. Vid många angreppspunkter tar det endast några veckor innan trädet dött (Långström & Solheim, 2001). Granbarkborren och dess larver kan äta av de kolhydrater blånadssvampen producerar, vilket även gör svampen till en födokälla för granbarkborren (Phillips & Croteau, 1999).
Figur 2: Granvirke angripen av blånadssvamp [B2]
2.3 Kemisk ekologi mellan granbarkborrar och granar
11 Verbenolerna kan oxideras vidare till motsvarande ketoner, (+)- och (-)-verbenon, vilka fungerar som antiaggregationsferomon. Detta feromon sänds ut då trädet framgångsrikt har koloniserats av massattacken. Granbarkborrarna signalerar då till andra artfränder att trädet är fullt och att de istället ska attackera ett annat träd. Vissa predatorer och parasiter har associerat flera av alla dessa ämnen med sitt byte respektive värddjur, vilket gör att granbarkborren riskerar att även tillkalla icke önskade organismer när de kommunicerar med varandra. I detta komplexa ekologiska sammanhang kan trädet ändra sin kemi i kådan. Detta omfattar överväganden om attraktion eller repulsion, toxicitet, feromonsignalering och plats i näringskedjan. (Phillips & Croteau, 1999)
Kemiska komponenter i kådan Aggregationsferomon Antiaggregationsferomon
(−)-α-pinen (+)-cis-verbenol (-)-verbenon
(+)-α-pinen (+)-trans-verbenol (+)-verbenon
12
2.4 Trädets försvarsmekanismer
När ett träd skadats behöver det transportera högmolekylviktiga terpenhartssyror till det skadade området. I kådan finns terpentin som fungerar som lösningsmedel för dessa ämnen. När hartssyrorna nått fram till skadan avdunstar terpentinet ut i atmosfären och hartssyrorna polymeriseras oxidativt och bildar en semikristallin massa. Detta skapar en härdad barriär vilken tätar skadan samtidigt som den angripande insekten och dess patogena mikroorganismer fastnar och fångas in (Phillips & Croteau, 1999). Kådan sipprar ut i skador i barken för att spola bort skadliga ämnen och genom att kristalliseras förseglar vävnaden vilket ger en fysisk såväl som kemisk barriär. Kådan kan även stoppa granbarkborren. Vid ett granbarkborreangrepp har man sett att både cellulära och biokemiska egenskaper förändras i trädet, vilken då kan isolera och förgifta attackerande granbarkborrar (Paine, et al., 1997). Man har påvisat att oleoresinets monoterpener är giftiga för granbarkboren samtidigt som det har en tillväxthämmande effekt på deras tillhörande svampar. I en studie har man utsatt granbarkborrar för monoterpener från gran under fyra timmar, vilket resulterade i att granbarkborrarna dog (Gijzen, et al., 1993). Samma studie visar även att monoterpenerna gav en tillväxthämmande effekt på de symbiotiska svamparna. Genom att testa ämnena separat fann man att det endast finns små skillnader i toxicitet bland de olika oleofin (?) isomererna. (virulent) svampen Ceratocystis visades vara känslig mot monoterpenerna i kådan, både genom utsättning i gasform samt inokulering i växtmedium (Gijzen, et al., 1993).
Hur starkt detta skydd visar sig vara för det enskilda trädet är beroende av trädets styrka, miljöförhållandena där det växer och hur stor granbarkborrepopulationen är i detta område. Genom studier med granbarkborre och svampinokulering har man tydligt visat på att trädets motståndskraft har ett tröskelvärde för antalet attacker per enhet barkyta trädet klarar av att försvara sig mot. Detta tröskelvärde är direkt kopplat till trädets kondition. (Paine, et al., 1997) Denna upptäckt har varit avgörande i att förstå hur trädets försvarsförmåga är starkt kopplat till miljöfaktorer och biotisk stress. Om ett granbarkborreangrepps omfattning ligger under detta tröskelvärde är trädets försvarsförmåga fortfarande starkt nog för att stå emot angreppet. Insekterna kommer därför att fortsätta producera aggregationsferomon för att locka flera granbarkborrar till det angripna trädet. Denna kommunikation fortsätter till dess att försvaret inte längre räcker till för så pass många granbarkborrar på en gång och granbarkborrarna kan utan svårigheter döda trädet. Mängden aggregationsferomon hos granbarkborrarna har visats variera hos olika individer. Parade granbarkborrehannar har oftast lägre mänger av dessa aggregationsferomoner än icke parade hannar. Man har även sett att mängden av vissa feromonämnen som utsöndras har påverkats av mängden kåda som finns i det attackerade trädet (Birgersson, et al., 1987).
13 toxiner, såsom limonen och 3-karen, som samverkar för att avskräcka skadeinsekter. Granbarkborrarna hittar till ett lämpligt träd genom att följa ett luktspår av samma substanser som är giftiga för dem. Efter flera generationer av evolutionär selektion är nu granbarkborrarna anpassade till just barrträdet gran och granen kan uppbåda flera olika kemiska försvar mot just granbarkborren (Gijzen, et al., 1993).
2.5 Ekonomiska förluster i skogsindustrin
Då angripna träd måste fällas innan de dör kommer inte trädet hinna växa till slutavverkningsålder vilket ger en förlorad produktion för skogsföretagen (SLU, 2014). Blånadssvamparna ger inte bara en minskning av träd som uppnår avverkningsåldern utan sänker även timmerkvalitén. Den drabbade veden klassas då ner och får en ekonomisk värdeminskning (Witzell, 2009). Under ett normalt år dödas uppskattningsvis 50 000 m3 svensk skog av granbarkborren. För skogsägarna motsvarar detta en förlust på minst 10 miljoner kronor årligen (Södra, 2011). Att sätta in förebyggande eller bekämpningsåtgärder medför en merkostnad för skogsproduktionsföretagen.
Av Sveriges 41 miljoner hektar landareal består ca 67 % av skogsmark. Inom skogsbruket och skogsindustrin är ca 75 000 personer sysselsatta. Ungefär hälften, 51 %, av den svenska skogen ägs av enskilda skogsägare. Privata aktiebolag äger 24 %, det statligt ägda företaget Sveaskog AB äger 15 %, staten tillsammans med övriga allmänna ägare äger 4 % och återstående 6 % av Sveriges skog ägs av övriga privata ägare. År 2006 fanns i Sverige 354 000 skogsägare och 239 000 skogsföretag. Skogsföretagen var samma år till 64 % närboägda, där samtliga personer bor i samma kommun som fastigheten, medan 28 % var utboägda och 8 % var delvis utboägda, där samtliga personer bor i annan kommun. (Lindgren, 2009)
14 Figur 4: Volym stående granar dödade av granbarkborre (SLU, 2014)
15
2.6 Dagens bekämpningsmetoder
Idag finns två huvudsakliga metoder för att bekämpa granbarkborren, med förebyggande åtgärder och bekämpningsåtgärder (SLU, 2014). Med förebyggande åtgärder vill man minska risken för att trädet blir utsatt för angrepp av granbarkborren. Vid bekämpningsåtgärder vill man minska skadorna som uppstår då ett träd redan angripits. Gränsen mellan dessa åtgärder är dock ofta otydlig och vissa metoder kan användas både förebyggande och som bekämpning mot ett redan pågående angrepp.
2.6.1 Förebyggande åtgärder
Främsta förebyggande åtgärder man tar till är att begränsa tillgången på yngelmaterial. För att kunna föröka sig är granbarkborrarna nämligen mycket beroende av lämpligt yngelmaterial, i form av nyligen vindfällda träd eller annat färskt dött barrvirke. Under våren och sommaren förökar sig granbarkborrarna och det är då man ser till att det finns brist på dessa material i skogarna. Enligt den svenska skogsvårdslagen §29 får obarkade träd inte lagras i skog eller vid bilväg efter den 1 juli i södra Sverige resp. den 15 juli i norra Sverige. (SLU, 2014) Lagen säger även att man inte får lämna mer skadad skog än 5 m3 skog per hektar.
16
2.6.2 Bekämpningsåtgärder
En metod för att bekämpa granbarkborren är den så kallade sök och plock-metoden. Här identifierar man de träd som befinner sig i ett tidigt angreppsstadium och fäller dem. Fördelen med detta är att granbarkborrarna inte hinner föröka sig i trädet och nästa generation uteblir. Blånadssvamparna som granbarkborren fört in i trädet har inte hunnit växa så pass mycket innan avverkningen, vilket gör att den erhållna veden har en bättre kvalité än hos ett träd där angreppet pågått en längre tid. Svårigheterna med denna åtgärd är att det idag inte finns några effektiva metoder att identifiera angripna träd (SLU, 2014). Man måste leta efter ingångshål där granbarkborren tagit sig in. Detta ser man genom att det finns gnagmjöl och kåda nära ingångshålet. Att syna varje träd och hitta de inte alltid lättupptäckta hålen är mycket tids- och resurskrävande.
Feromoner kan användas på flera sätt för att minska mängden skadeingrepp. Fermonfällor används ofta för massfångst av granbarkborrar då insekterna lockas ner i fällor behandlade med de feromoner hangranbarkborrar släpper ifrån sig när de gnager in sig i trädet. Feromonet syftar till att locka till sig flera granbarkborrar, såväl honor som hannar, då trädet dör snabbare vid flera angrepp samtidigt. Detta gynnar både den enskilda granbarkborren som får hjälp att döda trädet och en mängd andra granbarkborrar som får chansen att lägga egna ägg i samma träd. Att använda fermonfällor är, ur ett forskningsperspektiv, ett effektivt sätt att åskådliggöra mängden granbarkborrar i ett område, men det är osäkert hur mycket metoden hjälper till att reducera artbeståndet. (SLU, 2014)
18
3 Material och metoder
3.1 2DGCMS
En tvådimensionell gaskromatograf med masspektrometri bygger på att två, via en modulator, seriekopplade kolonner ger två olika spektra på samma prov. De olika kolonnerna är laddade med två olika bärmaterial och kan ställas in med två olika temperaturprogram. Detta gör att en yta kan skapas med de två analyserna på vardera axeln. Resultaten kan sättas ihop till en bild med områden som representerar substanserna i provet. Med denna metod kan man få en bättre separation av två substanser med samma retentionstid, då samma prov går igenom två olika körningar. Retentionstiden ändras nämligen när betingelserna ändras i den andra kolonnen. Denna metod har tio gånger högre upplösning än en vanlig GCMS (1D). Vanligast är att man separerar komponenter med avseende på flyktighet, men med detta instrument kan man även separera ett ämne med avseende på kiralitet. Analysinstrumentet är utrustad med två injektorer och kan analysera ämnen i olika faser, t.ex. fas-, gas- eller vätskefas. Den är även utrustad med en SPME-funktion och autoinjektor vilket möjliggör att köra flera prover automatiskt över en längre tid enligt ett förinställt schema. Varje maskin kan köras individuellt och styrs av varsin dator.
(bild 2D-GCMS)
3.2 SPME
SPME (Solid Phase Micro Extraction) är en analysmetod för separation av kemiska komponenter där man använder ett gaskromatogram. SPME-nålen är belagd med fiber som extraherar analyten där de samlas på nålen. Nålen trycks förs ut genom att trycka ner fästskruven och injiceras in i ett prov, se figur 6. Under en viss tidslängs sätter sig komponenterna på nålens fiber. Efter provinsamling injiceras sprutan i en GC-apparat där det desporberas.
3.3 Odling av svampar
Svamparna ska låtas växa i två medium: ett naturligt medium med bitar av granbark och ett artificiellt med malt. Maltlösningen blir homogen medan barken blir mer heterogen med bitar av barken kvar. Båda medierna tillsattes glukos för ytterligare näring till svamparna. Svamparna ska få växa under fyra veckor innan de genomgår filtrering och extraktion som följs av analys med GCMS. En halvtidsanalys med SPME kommer att ske efter två veckor.
Barklösning förberedes genom att riva ut bark från grangrenar. Lösningen fick 2 vikt% bark, 0,5 % glukos och späddes med destillerat vatten till en volym av 600 ml. Eftersom
19 barken vuxit ute i naturen kan den vara infekterad av andra svampar och mikroorganismer. För att döda dessa autoklaverades lösningen två gånger, en gång i stora flaskan med hela lösningen och en gång i de mindre flaskorna. Autoklaveringen varade under 15 min med en temperatur på 125 °C varje omgång. 24 kärl á 250 ml autoklaverades efter tillsats av redan autoklaverad barklösning. Efter autolavering steriliserades arbetsplatsen. Maltlösningen förberedes på liknande sätt med 2 vikt% malt och 0,5 % glukos. Lösningen autoklaverades en omgång och tillsattes i redan autoklaverade flaskor. Flaskorna utgjordes av E-kolvar och rundkolvar där alla kärl var lika stora á 250 ml. Tolv kärl tillsattes 50 ml barklösning medan ytterligare tolv kärl tillsattes 50 ml maltlösning.
Svamparna trycktes ut ur plattan och tillsattes en steril provtub. Svamparna mosades och skakades för att så mycket som möjligt skulle lösas ut i 12 ml autoklaverat destvatten. 2 ml svamplösning tillsattes i vardera sex kärl. Sex flaskor utgjorde kontroll, tre med barklösning och tre med maltlösning. I kontrollerna tillsattes rent destvatten i samma volymer och med samma instrument som vid tillsatts av svamplösning.
Flaska nr Lösning 50 ml Svamp 2 ml
1 Malt O. picea 2 Malt O. picea 3 Malt O. picea B1 Bark O. picea B2 Bark O. picea B3 Bark O. picea 4 Malt C. polonica 5 Malt C. polonica 6 Malt C. polonica B4 Bark C. polonica B5 Bark C. polonica B6 Bark C. polonica 7 Malt G. penicillata 8 Malt G. penicillata 9 Malt G. penicillata B7 Bark G. penicillata B8 Bark G. penicillata B9 Bark G. penicillata 10 Malt - 11 Malt - 12 Malt - B10 Bark - B11 Bark - B12 Bark -
20
3.4 Agarplattor
Agarlösningen förberedes med antingen malt eller bark. 2 vikt% bark med 1,5 % agar samt 0,5 % glukos. Dessa späddes till 225 ml. Maltlösningen autoklaverades en gång medan barklösningen autoklaverades två gånger för att få bort oönskade svampar och mikroorganismer. Plattorna förberedes och läts torka under natten innan inokulering av svamparna. 6 plattor tillsattes alla tre svampar med olika medium och skall användas för att kontrollera de tillväxthämmande effekterna de utövar på varandra. I kontrollplattorna doppades det tomma instrumentet efter destillering. Agarplattorna förvarades staplade på varandra. Locken förslöts ej med plast de första dagarna så att luft kunde sippra in.
Platta nr Lösningsmedium Svamp
1 Malt O. picea, C. polonica, G. penicillata
2 Malt O. picea, C. polonica, G. penicillata
3 Malt O. picea, C. polonica, G. penicillata
4 Bark O. picea, C. polonica, G. penicillata
5 Bark O. picea, C. polonica, G. penicillata
6 Bark O. picea, C. polonica, G. penicillata
7 Malt O. picea 8 Malt O. picea 9 Malt O. picea 10 Bark O. picea 11 Bark O. picea 12 Bark O. picea 13 Malt C. polonica 14 Malt C. polonica 15 Malt C. polonica 16 Bark C. polonica 17 Bark C. polonica 18 Bark C. polonica 19 Malt G. penicillata 20 Malt G. penicillata 21 Malt G. penicillata 22 Bark G. penicillata 23 Bark G. penicillata 24 Bark G. penicillata 25 Malt - 26 Malt - 27 Malt - 28 Bark - 29 Bark -
21 Svamparna odlades en andra gång på agarplattor, den här gången med mer medium eftersom plattorna i det första försöket snabbt torkade ut. Denna gång frystes barken ner i flytande kväve under 3 timmar och autoklaverades därefter i en halvtimme. Detta gjordes för att få bort så många oönskade mikroorganismer som möjligt.
Platta nr Lösningsmedium Svamp
1 Malt O. picea 2 Malt O. picea 3 Malt O. picea 4 Bark O. picea 5 Bark O. picea 6 Bark O. picea 7 Malt G. penicillata 8 Malt G. penicillata 9 Malt G. penicillata 10 Bark G. penicillata 11 Bark G. penicillata 12 Bark G. penicillata 13 Malt C. polonica 14 Malt C. polonica 15 Malt C. polonica 16 Bark C. polonica 17 Bark C. polonica 18 Bark C. polonica 19 Malt - 20 Malt - 21 Malt - 22 Bark - 23 Bark - 24 Bark -
22
3.5 Halvtidsanalys med SPME
Provinsamling med SPME-nål under 35 min.
Programmet i GCMS: MS2, dbwax column, 40 °C (1 min), 5 °C/min, 225 °C (7 min), SPME Pink, Collect 35 min, 16 dpi.
GCMS
3.6 Filtrering och extraktion 3.6.1 Svampodlingar i vätskemedium
Svampodlingarna i maltmediet extraherades först eftersom en klar tillväxt skett här efter fyra veckor (se bild i resultat). Vätskan och svampen separerades genom sugfiltrering. Ur vätskefasen pippeterades 750 µl över till ett eppendorfrör. En liten bit av svampen tillsattes i ett annan eppendorfrör. Till dessa tillsattes 750 µl hexan. Rören skakades och läts stå för extrahering i 30 minuter. Därefter centrifugerades proven i en och en halv minut och hexanfasen överfördes till glasvialer (storlek?), figur 7. Glasvialerna förslöts och förvarades i frys. Svampodlingarna i barkmediet filtrerades och extraherades två veckor senare. Även här tillsattes 750 µl hexan till filtraten och rören skakades. Rören läts stå för extrahering under tre timmar. Proven centrifugerades därefter och hexanfasen överfördes till glasvialer, vilka förslöts och förvarades i frys.
Figur 7: Extraktet i glasvialer
3.6.2 Agarplattor
23
3.2 Odla gran i svampvätskan
En del av den separerade svampvätskan överfördes till provrör där grankvistar läts gro under UV-lampa i två veckor.
3.3 Analys med 2DGCMS
Ett program optimerades för proverna. Analysprogrammet testas först med hexan för att identifiera bakgrundsspektra i de extraherade proverna. Proverna injiceras automatiskt enligt ett förprogrammerat schema. Endast extrakten från svampmediet i filtratet valdes att analyseras då dessa vid optimeringen noterades ge bättre resultat än extrakten från vätskemediet. Proverna laddades i maskinen hälften i taget då rumstemperaturen kan förstöra proverna om de står framme för länge. Resterande prov förvarades i frys.
3.4 SPME agarplattor
24
4 Resultat
4.1 Svampodling i vätskemedium
Svamptillväxten var tydligast i maltmediet efter kortast tid. I barkmediet syntes senare tillväxt då flaskorna med svampar hade mycket mörkare färg än kontrollen. Det syntes som att en del av barken lösts upp av svampen och att hela vätskan var en geléaktig klump av svamptillväxten med en liten vätskefas undertill. Svamp- och vätskefasen var mycket tydligare i flaskorna där svamparna fått växa i maltmedium.
GP Malt CP Malt OP Malt
GP Bark CP Bark OP Bark
Tabell 4: Resultat odling i vätskemedium
4.2 Halvtidsanalys med SPME och GCMS
Vid analys av kromatogrammen från GCMS:en kan man se att vissa ämnen är närvarande i kontrollen men inte vid närvaro av svamp. Vissa ämnen är dessutom unika för olika svampar.
4.2.1 Barkmedium
I tabell 5 nedan presenteras de ämnen som fanns närvarande i de flaskor där svamparna växte i barkmedium. Dessa jämförs även med kontrollflaskan där endast bark fanns närvarande. Ämne GP CP OP Kontroll 1 R-α-Pinene ‡‡ ‡‡ ‡‡ ‡‡ 1,3,8-p-Menthatriene ‡ ‡‡ 1,4-Methanoazulene, decahydro-4,8,8-trimethyl-9-methylene-, [1S-(1α,3aα,4α,8aα)]- ‡‡ ‡‡‡ ‡‡ ‡‡
1. 6-Octadien-3-ol, 3.7-dimethyl-, formate ‡‡ ‡
1-Butanol, 3-methyl- ‡‡‡ ‡‡ ‡‡ ‡‡‡
1-Butanol, 3-methyl-, acetate ‡‡ ‡‡‡
1H-Cyclopropa[a]naphthalene,
25 tetramethyl- 1-Nonen-3-ol ‡‡ ‡‡ 1-Propanol, 2-methyl- ‡‡ ‡‡ 1R-α-Pinene ‡‡ 2(10)-Pinen-3-one ‡‡ 2,4-Pentanedione, 3-methyl- ‡ 2,6-Octadiene, 2,6-dimethyl- ‡‡ 2-Decanenal, (E )- ‡‡ 2H-2,4a-Ethanonaphthalene, 1,3,4,5,6,7-hexahydro-2,5,5-trimethyl- ‡‡‡ ‡‡‡ 2-Heptenal, (Z)- ‡‡ 2-Octenal,(E)- ‡‡ 3-Carene ‡‡‡ ‡‡ ‡‡‡ 3-Cyclohexen-1-ol, 4-methyl-1-(1-methylethyl)-, (R)- ‡‡ 3-Cyclohexene-1-methanol, α,α,4-trimethyl-, (S)- ‡‡ ‡‡ ‡‡ ‡‡ 3-Octanone ‡‡ ‡‡ 4-Nonenal, (E)- ‡‡ 5-Hepten-2-one, 6-methyl- ‡‡ Acetic acid ‡‡
Acetic acid, 2-methylpropyl ester ‡‡‡ ‡‡‡
Acetic acid, hydrazide ‡
α-Longipinene ‡‡ α-Thujenal ‡‡ Benzene, 1-methyl-2-(1-methylethyl)- ‡‡ ‡‡ Benzene, 2-methoxy-4-methyl-1-(1-methylethyl)- ‡‡ ‡ ‡ Beta-Pinene ‡‡‡ Bicyclo[2.2.1]heptan-2-one, 1,7,7-trimethyl-, (1S)- ‡ ‡‡‡ ‡ Bicyclo[3.1.1]hept-2-ene-2-methanol, 6,6-dimethyl- ‡‡ Bornyl acetate ‡‡
Butanoic acid, ethyl ester ‡‡
Cyclohexane, 4-methylene-1-(1-methylethyl)- ‡‡ ‡‡ Cycloisosativene ‡ ‡‡ ‡ D-Limonene ‡ ‡‡‡ ‡‡ ‡‡‡ Ethanol ‡‡‡ ‡‡‡ ‡‡‡ Ethanone, 1-(3.3-dimethyloxiranyl)- ‡‡ Ethyl Acetate ‡‡‡ ‡‡‡ Globulol ‡‡ ‡‡ Hexanal ‡‡ Isocaryophillene ‡‡ o-Mentha-1(7),8-dien-3-ol ‡ Oxirane, (1-methylbutyl)- ‡ Oxirane, 2-(1,1-dimethylethyl)-3-methyl- ‡‡ Patchouli alcohol ‡‡
26
Phenylethyl Alcohol ‡‡
p-Menthane-1,3-diol ‡‡
Propanoic acid, pentyl ester ‡‡
Squalene ‡
Thunbergol ‡
Tricyclo[5.4.0.0(2,8)]undec-9-ene,
2,6,6,9-tetramethyl- ‡ ‡‡ ‡‡
Tabell 5: I tabellen betyder ‡‡‡ >0,008, ‡‡ 0,008-0,0008 och ‡ < 0,0008.
4.2.2 Maltmedium
I tabell 6 nedan presenteras de ämnen som fanns närvarande i de flaskor där svamparna växte i maltmedium. Dessa jämförs även med kontrollflaskan där endast malt fanns närvarande.
Ämne GP CP OP Kontroll Malt
1-Butanol, 3-methyl- ‡‡‡ ‡‡‡ ‡‡‡
1-Butanol, 3-methyl-, acetate ‡‡‡ ‡‡‡
1-Heptene, 5-methyl- ‡‡ 1-Octen-3-ol ‡‡ ‡‡ 1-Octen-3-one ‡‡ 1-Propanol, 2-methyl- ‡‡‡ ‡‡ ‡‡ 2H-2,4a-Ethanonaphthalene, 1,3,4,5,6,7-hexahydro-2,5,5-trimethyl- ‡‡‡ ‡‡‡ ‡‡‡ 2-Heptenal, (Z)- ‡‡‡ 2-Octenal, (E)- ‡‡‡ 3-carene ‡‡‡ ‡‡‡ 3-Octanol ‡‡ 3-Octanone ‡‡ 3-Octen-2-one ‡‡ 5-Hepten-2-on, 6-methyl- ‡‡ ‡ Acetic acid ‡‡ ‡‡ Benzaldehyde ‡‡‡ Benzene, 1-methyl-2-(1-methylethyl)- ‡‡‡ ‡‡
Butanoic acid, 3-methyl-, methyl ester ‡‡
Ethanol ‡‡‡ ‡‡‡ ‡‡‡ Ethyl Acetate ‡‡‡ ‡‡‡ Furfural ‡‡ Hexanal ‡‡ Limonene ‡‡‡ ‡‡‡ Nonanal ‡‡ n-Propyl acetate ‡‡ Patchouli alcohol ‡‡ ‡‡ ‡‡ Phenylethyl Alcohol ‡‡ ‡‡ ‡‡‡ α-longipinene ‡‡ ‡‡ α-pinene ‡‡‡ ‡‡‡ β-Phelandrene ‡‡‡ ‡‡‡ β-Pinene ‡‡ ‡‡‡
27
4.3 Agarplattor 4.3.1 Första odlingen
I den första odlingen av svampar i bark- och maltmediet noterades en stark tillväxt av G. penicillata i de båda medierna. I barken syntes redan efter en vecka att svampen vuxit över hela plattan, vid jämförelse med kontrollen som bara innehöll barkmediet. I bilden i tabell 7 ser man att färgen är mycket mörkare än kontrollen vilket tyder på att svampen, som själv är mörk (jämför G. penicillata i malt tabell 8), har vuxit över hela plattan. G. penicillata har vuxit snabbare i bark än i malt vilket motsätter hypotesen att ämnen i barken ska vara tillväxthämmande. Detta styrker därför att svampen har kunnat dra nytta av barken för att växa.
C. polonica i barkmediet har vuxit över hela plattan i en svagt gul färg. I barken har den inte alls samma färg som i maltmediet, där den är mycket mörk (tabell 7 och 8). C. polonica i maltmedium har så gott som vuxit över hela plattan. I barkmediumplattan där O. picea växte fanns på en platta en kontaminering från granen som inte dog i autoklaveringen. Denna lilla svamp har försvarat sig själv, se bilder i tabell 7, med att O. picea inte vuxit i en ring runt denna svamp. (bild på denna svamp finns..). Precis som med G. penicillata finns hos O. picea en stor skillnad i färg och utseende mellan svampen i bark- resp. maltmediet. I maltmediet har svampen vuxit obehindrat och spritt sig över hela plattan. I barken däremot har tillväxten hämmats och efter tillväxttiden syns bara en mörkare fläck med lite ludd på ovansidan (se figur i tabell 7).
GP Bark CP Bark OP Bark
Alla svampar Bark Kontroll Bark
28
GP Malt CP Malt OP Malt
Alla svampar Malt Kontroll Malt
Tabell 8: Resultat Maltmedium
4.3.2 Andra odlingen
Till skillnad från det första försöket mättes tillväxten hos svamparna kontinuerligt under två veckor för att ta fram deras tillväxthastighet. Vid förberedandet av agarplattorna läts barken frysas ner i flytande kväve under tre timmar och sedan autoklaveras i trettio minuter, till skillnad från det första försöket där det autoklaverades två gånger utan att frysas. När barkmediet hälldes upp på plattorna fick de olika mycket mängd bark på vardera platta. Detta utnyttjades senare vid ockuleringen då varje svamp fick växa på tre olika plattor; en med mycket bark, en med medelmängd och en med lite bark. Detta för att se om tillväxthastigheten ändras vid närvaro av mycket eller lite barkmedium.
GP Malt CP Malt OP Malt
Alla Malt Kontroll Malt
29
GP Bark CP Bark OP Bark
Alla Bark Kontroll
Tabell 10: Resultat Bark andra odlingen
I tillväxtkurvorna kan man se att barkmediet hade en tillväxthämmande effekt mot svamparna då de växer långsammare här. Man kan tydligt se att G. penicillata har en snabbare tillväxt än de andra svamparna, såväl i malt som i bark (graf). Dock sjönk dess hastighet när alla svampar växte tillsammans, men G. penicillata var fortfarande den största svampen i dessa plattor. I plattorna med maltmedium där alla svampar växte tillsammans växer (graf...) alla svampar i ungefär samma hastighet och lägger sig sedan på en stabil hastighet när hela plattan är bevuxen.
30 .
Figur 8: Tillväxt av G. penicillata i bark- resp. maltmedium.
31 Figur 10: Tillväxt av O. picea i bark- resp. maltmedium.
32 Figur 12: Tillväxt av C. polonica, G. penicillata och O. picea i maltmedium när de växte på samma platta.
4.4 Granodling
Femte maj (11 dagar senare) syns lite svamptillväxt på grenen som är i kontakt med svampvätskan. (bilder) På vissa av grangrenarna har det vuxit ut nya ljusgröna barr. Resultatet syns i (tabell 11). C. polonica är den svamp som haft störst inverkan på granen då dessa grenar var så pass uttorkade att barren föll av vid minsta beröring. Alla granar som vuxit i vätska med svampar hade fått döda gulbruna barr där den var i kontakt med vätskan. I de flesta kunde man även notera en viss tillväxt av svampen vilket bevisar dess närvaro i vätskan.
Vätska med svamp
Barren på grenen Barren under
vattenytan
Svamptillväxt
O. picea Sitter fast ganska bra, tillväxt av nya ljusgröna barr på en av grenarna.
Döda gulbruna barr.
Fluffig tillväxt av svamp på ytan av det bruna vattnet.
G. penicillata Sitter fast någorlunda bra. Några bruna barr.
Döda gulbruna barr.
Lite svamptillväxt på ytan av det bruna vattnet och barren.
C. polonica Sitter knappt fast alls och ramlar av när man rör vid dem.
Många bruna barr. Mer svamptillväxt än de andra proven på ytan av det bruna vattnet.
Kontroll Barren sitter fast ordentligt med
tillväxt av nya ljusa barr på toppen av grenarna.
Gröna friska barr. Ingen svamp.
33
Kontroll OP GP CP
Tabell 12: Resultat granodling
4.5 SPME och GCMS agarplattor Barkmedium
I tabell 13 presenteras de ämnen som hittades i plattorna då svamparna växte i barkmedium under två veckor. Mängderna av de olika ämnena jämförs med avseende på deras toppareor. I kromatogrammen förekom koldioxid tidigt, vilket tyder på ett läckage i kolonnen. Styrene-toppen var lika stor hos kontrollen som plattorna där svamparna växte. Styrene har alltså inte konsumerats av svamparna.
Ämne GP CP OP Kontroll Bark
34 2-Heptanol, 3-methyl- ‡ 2-Pentanol, 2-methyl- ‡ 2-Pinen-4-one ‡‡ ‡‡ 3-Carene ‡‡‡ ‡‡‡ ‡‡‡ ‡‡‡ 3-Cyclohexen-1-ol, 4-methyl-1-(1-methylethyl)- ‡‡‡ ‡‡‡ 3-Cyclohexen-1-ol, 5-methylene-6-(1-methylethenyl)-, acetate ‡‡ ‡‡ ‡‡ 3-Cyclohexene-1-methanol, α,α4-trimethyl- ‡‡‡ ‡‡‡ ‡‡‡ 3-Heptanol ‡ 3-Hexanol ‡‡
3-Hydroxymandelic acid, ethyl ester, di-TMS ‡‡
3-Octanone ‡‡
3-Pentanol, 3-methyl- ‡‡
3-Pinanone ‡‡ ‡‡ ‡‡
4-Acetylpyridine, oxime ‡
4-Hydroxymandelic acid, ethyl ester, di-TMS ‡‡ ‡‡ ‡
35 Bicyclo[4.1.0]heptan-3-ol, 4,7,7-trimethyl-, (1α,3α,4β,6α)- ‡‡ ‡ Borneol ‡‡ Camphene ‡‡ ‡‡‡ ‡‡ ‡‡‡ Camphor ‡‡ Camphor, (1R,4R)-(+)- ‡‡ ‡ ‡ Caryophyllene ‡‡ ‡‡ ‡‡ Cembrene ‡‡ ‡‡‡ ‡‡‡ ‡ Chrysanthenone ‡ cis-Linalool Oxide ‡‡ ‡‡ cis-Verbenol ‡ Copaene ‡‡ ‡‡ Cumene ‡‡ Cyclohexane ‡‡ Cycloisosativene ‡ ‡ Cyclopentane, methyl- ‡‡‡ Cyclopentanol, 1-methyl- ‡‡ D-Limonene ‡‡‡ ‡‡‡ DL-Leucine, N-glycyl- ‡‡ D-Verbenone ‡ Epiglobulol ‡‡ Ethylbenzene ‡ ‡‡ ‡‡ ‡‡ Heptadecane ‡‡ ‡‡ ‡‡ Irone α b ‡ ‡ Isoledene ‡‡‡ ‡‡‡ ‡‡‡ ‡‡‡ Isolongifolol, acetate ‡‡ Isopinocarveol ‡ ‡‡ ‡ L-Alanine-4-nitroanilide ‡ ‡ Ledene ‡‡ Ledol ‡‡‡ ‡‡ Limonene ‡ Longicyclene ‡‡ Longifolene ‡‡‡ ‡‡‡ ‡‡‡ ‡‡‡ Longifolene-(V4) ‡‡ ‡‡‡ L-pinocarveol ‡ L-trans-Pinocarveol ‡‡ Manoyl oxide ‡ ‡ m-Cymene ‡‡ Methanimidamide, N,N-dimethyl-N'-phenyl- ‡ ‡
Methyl thymyl ether ‡ ‡‡ ‡
36 N-(3-Methylbutyl)acetamide ‡ Naphthalene, 1,2,3,4,4a,7-hexahydro-1,6-dimethyl-4-(1-methylethyl)- ‡‡ ‡ Neocembren A ‡ Nonadecane ‡ ‡‡ Octane ‡ ‡‡ ‡ o-Cymene ‡‡ ‡‡‡ p-Cymen-8-ol ‡‡ ‡‡ ‡‡‡ Pentadecane ‡‡ Pentane, 2-methyl- ‡‡ Pentane, 3-methyl- ‡‡ Phenylethanolamine ‡‡ ‡
Propanedioic acid, (hydroxyimino)-, diethyl
37 β-Guaiene ‡‡‡ β-Pinene ‡‡ ‡‡‡ ‡‡‡ ‡‡ γ-Cadinene ‡ γ-Muurolene ‡ ‡ γ-Patchoulene ‡ γ-Terpinene ‡ δ-Cadinene ‡‡ ‡‡‡ ‡‡ ‡‡‡ δ-Cadinene ‡‡‡ δ-Cadinol ‡
Tabell 13: I tabellen indikerar ‡‡‡ en topparea på > 8x106 Ab*s, ‡‡ 8x106– 8x105 Ab*s och ‡ 8x105 – 28x103 Ab*s.
4.6 SPME och GCMS agarplattor Maltmedium
I tabell 14 presenteras de ämnen som hittades i plattorna då svamparna växte i maltmedium under två veckor. Mängderna av de olika ämnena jämförs med avseende på deras toppareor.
Ämne GP CP OP Kontroll Malt
8,9,9,10,10,11-Hexafluoro-4,4-dimethyl-3,5-dioxatetracyclo[5.4.1.0(2,6).0(8,11)]dodecane ‡ Z,Z-2,5-Pentadecadien-1-ol ‡ (1R)-Norinone ‡ (2-Aziridinylethyl)amine ‡ (3-Methoxyphenyl)pentylamine, pentafluoropropionyl- ‡ (6-Hydroxymethyl-2,3-dimethylphenyl)methanol ‡‡ (R)-(Z)-14-Methyl-8-hexadecen-1-ol ‡ 1,1'-(4-Methyl-1,3-phenylene)bis{3-[5-(p-tolyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]urea} ‡‡ 1,1,4a-Trimethyl-5,6-dimethylenedecahydronaphthalene ‡‡ ‡‡ 1,11-Tridecadiene ‡‡‡ 1,1-Dodecanediol, diacetate ‡ 1,2,3-Propatriol, 1-indol-4-yl(ether) ‡
1,2,4-Benzenetricarboxylic acid, 1,2-dimethyl ester ‡
1,3-Dioxane, 4-phenyl- ‡ 1-[4-(tert-Butyl)phenyl]-2-(4-toluidino)-1-ethanone ‡ 11,12-Dihydroxyseychellane ‡ ‡ ‡ 11-Methylene-2,4-dimethyl-3-azatricyclo[5.3.1.0(4,9)]undec-2-ene ‡ 1-Benzylbenzimidazole 3-oxide ‡ ‡ 1-benzylindole ‡ 1-Butanol, 2-methyl- ‡‡ ‡‡
38 1-Ethyl-3-(propen-1-yl)adamantane ‡ 1H-Azepin-1-amine, hexahydro-N-(1-methyl-2-propenyl)- ‡‡ 1H-Indole, 5-methyl-2-phenyl- ‡ 1H-Naphthalen-2-one, 3,4,5,6,7,8-hexahydro-4a,8a-dimethyl- ‡‡‡ 1-Pentanol, 4-amino- ‡ ‡ 1-Phenyl-5-methylheptane ‡ 1R-α-Pinene ‡ ‡ ‡ ‡‡ 1S,2S,5R-1,4,4-Trimethyltricyclo[6.3.1.0(2,5)]dodec-8(9)-ene ‡‡ 1-Terpinen-4-ol ‡ ‡‡‡ ‡‡‡ ‡‡‡ 2(4H)-Benzofuranone, 5,6,7,7a-tetrahydro-4,4,7a-trimethyl- ‡‡ 2,10,10-Trimethyl-6-methylene-1-oxaspiro[4.5]decan-7-one ‡ 2,2-Dimethyl-5-isopropyl-1,3-oxathiane ‡ 2,4,4-Trimethyl-3-hydroxymethyl-5a-(3-methyl-but-2-enyl)-cyclohexene ‡‡ ‡ ‡ 2,4-Cyclohexadien-1-one, 3,5-bis(1,1-dimethylethyl)-4-hydroxy- ‡ 2,4-Di-tert-butylphenyl benzoate ‡ 2,6,6-Trimethyl-bicyclo[3.1.1]hept-3-ylamine ‡ 2-Benzimidazolinone, 5-methyl- ‡ 2-Cyclopropylcarbonyloxydodecane ‡‡ 2-Furanol, tetrahydro-2-methyl- ‡ 2H-1-Benzopyran, 2,2-diphenyl- ‡ 2H-2,4a-Ethanonaphthalene, 1,3,4,5,6,7-hexahydro-2,5,5-trimethyl- ‡‡ ‡‡ ‡‡‡ ‡ 2H-Benzimidazol-2-one, 1,3-dihydro-5-methyl- ‡ 2-Heptanol, 6-amino-2-methyl- ‡ 2-Methyl-2-bornene ‡ 2-Methyldocosane ‡ 3-(3-Hydroxyphenyl)-3-trifluoromethyl-3H-diazirine ‡ 3,3,7,11-Tetramethyltricyclo[5.4.0.0(4,11)]undecan-1-ol ‡ 3,5-Diphenyl-1-pentene ‡ 3,6-Dimethyl-4H-furo[3,2-c]pyran-4-one ‡ 3-Carene ‡ ‡‡‡ ‡‡ 3-Cyanomethyl-2,3-dehydroquinuclidine ‡‡ ‡ 3-Phenyltetrahydrofuran ‡ 3-Pinanone ‡‡ ‡‡ ‡‡ ‡‡
3-Pyridinecarboxaldehyde, O-acetyloxime, (E)- ‡ ‡
39
4-Cyanocyclohexene ‡
4-Dehydroxy-N-(4,5-methylenedioxy-2-nitrobenzylidene)tyramine ‡
4-Heptanone ‡ ‡
4-Hydroxymandelic acid, ethyl ester, di-TMS ‡‡ ‡‡ ‡‡
4-Methyl-6-phenyltetrahydro-1,3-oxazine-2-thione ‡ ‡ 5-Nonadecen-1-ol ‡ 7-Hexadecenal, (Z)- ‡‡ 9,12-Octadecadien-1-ol, (Z,Z)- ‡ Acetamide, 2-(2,4-dimethoxybenzylidenehydrazino)-N-ethyl-2-oxo- ‡ ‡‡ ‡ Acetone ‡‡ Acetophenone ‡‡‡ ‡‡‡ Aciphyllene ‡ Acoradien ‡ Adamantane, 1-acetoxy-3-(1-acetoxy-1-methylethyl)- ‡ Alloaromadendrene ‡ ‡‡
Allyl o-tolyl ether ‡
Aristolene ‡‡ Aromadendrene ‡ Aromadendrene, dehydro- ‡ Benzaldehyde ‡‡‡ Benzene, (1-methoxy-1-methylethyl)- ‡‡ ‡‡ ‡‡ ‡‡ Benzene, (1-nitropropyl)- ‡ Benzene, [(methoxymethoxy)methyl]- ‡ Benzene, 1-ethyl-2-methyl- ‡ Benzene, 2,4-diisocyanato-1-methyl- ‡‡ ‡‡ ‡ Benzene, propyl- ‡‡ Benzeneacetaldehyde ‡‡ Benzenemethanol, α,α-dimethyl- ‡‡ ‡‡ Benzylcyclobutane ‡ Bicyclo[2.2.1]heptan-2-one, 1,3,3-trimethyl- ‡ Bicyclo[3.1.1]hept-2-ene, 2,6-dimethyl-6-(4-methyl-3-pentenyl)- ‡‡ Bicyclo[3.1.1]hept-2-ene, 6,6-dimethyl-2-[2-(phenylmethoxy)ethyl]-, (1S)- ‡ Bicyclo[3.1.1]heptan-2-one, 3,6,6-trimethyl- ‡ ‡‡ Bicyclo[4.1.0]heptane, 7-butyl- ‡
Butanoic acid, 2,3-dimethyl-, methyl ester ‡‡
Camphene hydrate ‡
Camphenol, 6- ‡
Camphor ‡‡ ‡‡ ‡‡ ‡‡
Carbamothioic acid, dipropyl-, S-propyl ester ‡‡
40 Caryophyllene-(I1) ‡‡ Cathinone ‡ Cedran-diol, 8S,14- ‡‡ Chrysanthenone ‡ cis-2,4a,5,6,9a-Hexahydro-3,5,5,9-tetramethyl(1H)benzocycloheptene ‡ Cubenol ‡‡ ‡‡ ‡ Cumene ‡ ‡ Cyclodecanol ‡ Cyclohexane-1,3-dione, 2-allylaminomethylene-5,5-dimethyl- ‡
Cyclohexanol, 2-methyl-3-(1-methylethenyl)-, acetate,
41 Isolongifolol, acetate ‡‡ Isopulegol ‡ Ledene ‡‡ Ledol ‡‡‡ Limonen-6-ol, pivalate ‡ Limonene ‡ Longiborneol ‡‡ Longifolenaldehyde ‡‡ Longifolene ‡‡ Longifolene-(V4) ‡‡ ‡‡ L-Phenylalanine, N-acetyl- ‡ l-Verbenone ‡‡ ‡‡ ‡‡ Mayuron ‡ ‡ ‡ m-Cymene ‡‡ N-(2-Benzyloxy-ethyl)-benzenesulfonamide ‡ ‡ N-Acetyl-3-methoxyamphetamine ‡ N-Acetyl-N-desmethylmethoxyphenamine ‡ N-Aminomorpholine ‡ N-Benzyloxy-2-isopropoxycarbonylazetidine ‡ ‡ Neodihydrocarveol ‡ Nerolidyl acetate ‡ N-Methyl-1-adamantaneacetamide ‡ ‡ Nonadecane ‡‡ ‡‡ ‡‡‡ Nonanal ‡‡
Octadecanoic acid, dimethyl(isopropyl)silyl ester ‡
Octahydroazocine, 3-bromo-2-oxo- ‡
o-Methylisourea hydrogen sulfate ‡ ‡
Palustrol ‡‡‡ Pentanamide, 4-hydroxy-4-methyl-N-phenyl- ‡ Pinocamphone ‡‡ Piperitone ‡ p-Mentha-1(7),8(10)-dien-9-ol ‡ Propanenitrile, 3-(5-diethylamino-1-methyl-3-pentynyloxy)- ‡ Propiophenone, 3-phenyl-3-piperidino- ‡ Pterin-6-carboxylic acid ‡ Pyrido[2,3-d]pyrimidine, 4-phenyl- ‡
Quinaldic acid, 1,2,3,4-tetrahydro-8-hydroxy-4-oxo-,
42 Tetradecane, 2,6,10-trimethyl- ‡ Thiazolidine, 2-amino-N-aminoformyl- ‡ Thujopsene-(I2) ‡‡ Trans-Pinocarveol ‡‡ trans-Chrysanthenyl Acetate ‡‡ Tricyclo[3.2.2.0]nonane-2-carboxylic acid ‡‡ Tricyclo[4.2.1.1(2,5)]deca-3,7-diene-9,10-diol, stereoisomer ‡‡ Tricyclo[5.4.0.0(2,8)]undec-9-ene, 2,6,6,9-tetramethyl- ‡ Undecanal ‡ Ursane-3,16-diol, (3β,16α,18α,19α,20β)- ‡ Valencene ‡‡ Verbenone ‡‡ ‡‡ Verbenone,(l) ‡‡ Vinyl butyrate ‡ Z,Z,Z-1,4,6,9-Nonadecatetraene ‡ Z,Z-2,5-Pentadecadien-1-ol ‡ α-Amorphene ‡‡ α-Bergamotene ‡ α-Bulnesene ‡ α-Caryophyllene ‡ α-Cycloserine ‡ α-Fenchene ‡ α-Guaiene ‡‡‡ α-Himachalene ‡‡ α-Muurolene ‡ α-Patchoulene ‡ ‡ α-Terpineol ‡‡‡ ‡‡ ‡‡ ‡‡‡ β-Aminobutyric acid ‡ β-Caryophyllen ‡‡‡ ‡‡ β-Eudesmol ‡ ‡‡ β-Neoclovene ‡‡ β-Patchoulene ‡‡ β-Pinene ‡‡ ‡‡ ‡‡ β-Pinone ‡ ‡‡ β-Terpinen ‡ ‡‡ ‡‡ β-Thujene ‡ γ-Chlorobutyrophenone ‡ ‡‡ γ-Gurjunene ‡‡ γ-Neoclovene ‡‡ γ-Patchoulene ‡ ‡ δ 3-carene ‡‡ ‡‡
43
5 Slutsats och diskussion
5.1 Odling av svampar
Svamptillväxten var mycket tydlig i maltmediet med en tjock hinna av svamp på ytan av vätskan. I barkmediet syntes inte detta lika tydligt, men genom att rulla på flaskan och lysa med en lampa underifrån kunde man se att hela vätskemediet bestod av geléaktig svampmassa och delvis upplöst bark. Detta tyder på att svampen använt barken som föda istället för att växa på ytan av vätskan. Vid filtreringen var denna geléaktiga konsistens svår att filtrera utan att få baksug i sugfiltreringen och då få in vatten i vätskan. Hexan användes för extraktionen eftersom de komponenter vi vill analysera troligen är hydrofoba. Med denna extraktion kanske vi missar några viktiga hydrofila komponenter, men efter erfarenhet som säger att de flesta intressanta ämnen är fettlösliga valde vi hexan som lösningsmedel.
5.2 Agarplattor
De två odlingarna av svampar på agarplattor skiljde sig åt på några faktorer. Den andra odlingen fanns plattor med olika mängder bark eftersom det är svårt att få ut exakt lika mycket bark på varje platta. De tre plattor med samma medium och svamp har varierats med olika mängder bark för att se hur svamparna växer i mer bark jämfört med lite mindre. Resultatet blev att G. penicillata växte snabbare i ett medium med mer bark än i närvaro av mindre bark. Detta förekom både där G. penicillata växte ensam i bark och där den växte tillsammans med de andra svamparna. Detta går att se i bilaga 2. Med O. picea och C. polonica ser det däremot ut som att svamparna har vuxit bättre i ett medium med mindre mängder bark. Detta gäller både där de vuxit ensamma och där de vuxit tillsammans.
Där svamparna växte tillsammans i barkmedium kunde man se en tydlig kant mellan O. picea och G. penicillata. Däremot var det svårare att hitta en kant mellan de andra svamparna. G. penicillata och C. polonica var mycket lika till utseendet med samma färger. Att C. polonica hade lite luddigare yta var det enda som gick att skilja dem åt. Kanten mellan O. picea och C. polonica var också svår att hitta då området mellan dessa svampar lika gärna kunde vara G. penicillata eftersom den vuxit mycket snabbare än de andra svamparna. För att reda ut om det är G. penicillata eller C. polonica mellan O. picea och C. polonica måste resultaten från SPME och GCMS analyseras.
44 Under den andra odlingen noterades tidigt flera kontamineringar i både barken och malten. Det fanns färre kontamineringar i det första försöket vilket tyder på att alla mikroorganismer i barken inte dött av att frysas och sedan autoklaveras. Det borde därför vara bättre att autoklavera flera gånger. I en av plattorna med maltmedium där alla tre svampar fick växa har en okänd kontaminering kraftigt hämmat tillväxten på alla tre svampar.
Figur 13: Okänd kontaminering hämmade tillväxten av alla tre svampar växande i barkmedium.
5.3 Halvtidsanalys
Alla svampar växande i båda medierna kunde analyseras, dock kunde inte alla prover analyseras innan maskinen fick problem.
5.4 Odling av grankvistar
Försöket gjordes för att se om svamparna i vätskan skulle ha någon effekt på grankvistarna, t.ex. att de dör. Man kunde se att grenens vattenupptagningsförmåga hämmats av vissa svampar då den är så pass torr att barren lossnar så lätt. Detta försök kan, med mer planering, utvecklar och studeras vidare.
5.5 2DGCMS
5.5.1 Svampodling i vätskemedium
Då programmet för analysen togs fram observerades att fler komponenter blev synliga i den vid filtreringen extraherade svampdelen analyserades jämfört med den tillhörande vätskedelen. Därför kördes endas de prover innehållande den extraherade svampdelen från både malt och bark. Då maltmediets kontrollflaska inte fick någon svamptillväxt togs vätskan ur dessa prov som kontroll. Barkkontrollerna hade ett övre lager av bark så dessa kunde användas som kontroll.
45
5.5.2 Agarplattor
Extrahering av agarplattor. Resultaten i GCMS blev inte så bra, därför togs dessa resultat bort ur rapporten.
5.6 SPME agarplattor
Rören räckte inte till alla prov så några återanvändes, tillsammans med deras skruvkork. De diskades innan inokulering och ett diskat kontrollrör med lock utan svamp användes för att se om det finns några ämnen kvar från den tidigare körningen.
I figurerna nedan syns de kemiska komponenter som producerats av bark och svampar. Eftersom aceton användes vid inokulering av svamp i SPME-röret kan denna indikation vara felvisande. Däremot har C. polonica inte visat någon förekomst av aceton, vilket tyder på att svamparna och barken kan producera aceton. Alternativt att C. polonica konsumerat acetonen.
5.6.1 C. Polonica Bark
I kromatogrammet över C. polonica med jämförelse mot barkkontrollen fanns sylvestern endast i närvaro av svamp. I kromatogrammet nedan syns denna topp vid nummer 3. Vid samma retentionstid fanns i kontrollen en betydande mängd D-Limonen, mycket mer än mängden sylvestren som fanns i de andra proven innehållande svamp. Mängden acetophon var intressant eftersom mängden av denna substans minskade i kontrollen alternativt ökade i närvaro av svamp. Kanske har svampen producerat mer av detta ämne eller så har barken triggats till att producera mer i närvaro av svampen. En sak som kan tilläggas är att detta ämne inte finns närvarande hos de andra svamparna, däremot finns den närvarande hos C. polonica i malt samtidigt som malten själv producerar acetophenon. Kanske har just C. polonica en tendens att producera detta ämne medan de andra svamparna inte har det. camphor, verbenone och terpineol är ämnen som finns närvarande i barken men inte i svampen. Detta pekar mot att svamparna konsumerat dessa ämnen.
46
Camphor 1-Terpinen-4-ol Verbenone
Figur 14: Några av de ämnen funna i C. polonica växande i bark.
Figur 15: Kromatogram över C. polonica i jämförelse med barkkontrollen.
47
5.6.2 C. Polonica Malt
I maltkontrollen så väl som plattan med svampen närvarande fanns styrene i lika stora mängder. Även acetophenone och benzene, (1-methoxy-1-methylethyl) fanns tydligt närvarande i båda typerna av plattor. Dessa ämnen har alltså inte konsumerats av svampen. 2H-2,4a-Ethanonaphthalene 1,3,4,5,6,7-hexahydro-2,5,5-trimethyl-, β-Aminobutyric acid och (2-Aziridinylethyl)amine är några ämnen som inte fanns närvarande i maltkontrollen, men däremot i plattan där svampen fanns närvarande. Detta tyder på att det är svampen själv som har producerat dessa ämnen.
2H-2,4a-Ethanonaphthalene, 1,3,4,5,6,7-hexahydro-2,5,5-trimethyl-
(2-Aziridinylethyl)amine β-Aminobutyric acid
Styrene Acetophenone Benzene,
(1-methoxy-1-methylethyl) Figur 16: Några av de ämnen funna i C. polonica växande i malt.
48 Nummer Ämne
1 (2-Aziridinylethyl)amine 2 β-Aminobutyric acid
3 1-Butanol, 3-methyl-, acetate 4 3,5-Diphenyl-1-pentene 5 Deltacyclene 6 Benzene, 1-ethyl-2-methyl- 7 Tricyclo[4.2.1.1(2,5)]deca-3,7-diene-9,10-diol, stereoisomer 8 m-Cymene 9 α-Bergamotene 10 Bergamotol, Z-α-trans-
11 Octadecanoic acid, dimethyl(isopropyl)silyl ester 12 l-Verbenone
13 α-Patchoulene
14 2H-2,4a-Ethanonaphthalene, 1,3,4,5,6,7-hexahydro-2,5,5-trimethyl- 15 Camphenol, 6-
5.6.3 G. penicillata Bark
I G. penicillata fanns bland annat monoterpenerna fenchon och terpinolen närvarande utan att finnas i barkkontrollen. Isopinocarveol fanns även som unikt ämne i svampen och vid jämförelse av alla resultat fanns detta ämne närvarande i alla svampar när de växte i bark. Även seskviterpenerna longifolene-(V4), β-Bisabolene och sativen var unika ämnen i svampen, vilket tyder på att svampen producerat dessa ämnen. Fenchone var även, förutom G. penicillata i barkmediet, även närvarande i plattan där O. picea växte i barkmedium. Sativen gick att finna både hos G. penicillata och C. polonica växande i bark.
Fenchon Terpinolen Isopinocarveol
Longifolene-(V4) β-Bisabolene Sativen
49 Figur 19: Kromatogram över G. penicillata i jämförelse med barkkontrollen.
Nummer Ämne 1 Benzene, 1-ethyl-2,3-dimethyl- 2 Benzene, 1-methyl-3-(1-methylethyl)- 3 Benzene, 1-methyl-2-(1-methylethyl)- 4 Fenchone 5 Terpinolen 6 Toluene, p-allyl- 7 cis-Verbenol 8 L-trans-Pinocarveol 9 Isopinocarveol 10 1H-Naphthalen-2-one, 3,4,5,6,7,8-hexahydro-4a,8a-dimethyl- 11 p-Cymen-8-ol 12 Myrtenol 13 Longicyclene 14 Copaene 15 Sativen 16 Cycloisolongifolene 17 Longifolene-(V4) 18 α-Bulnesene 19 β-Bisabolene 20 Epiglobulol 5.6.4 G. penicillata Malt
50
3-Carene Limonene Sylvestrene
Acetophenone α-Terpineol Aciphyllene
Figur 20: Några av de ämnen funna i G. penicillata växande i malt.
51 Nummer Ämne 1 4-Heptanone 2 N-Benzyloxy-2-isopropoxycarbonylazetidine 3 β-Terpinen 4 Z,Z,Z-1,4,6,9-Nonadecatetraene 5 3-Carene 6 Limonene 7 Sylvestrene 8 Bicyclo[2.2.1]heptan-2-one, 1,3,3-trimethyl- 9 Benzenemethanol, α,α-dimethyl- 10 (1R)-Norinone 11 Pentanamide, 4-hydroxy-4-methyl-N-phenyl- 12 Isoindole-1,3-dione, perhydro-2-butyl-spiro-5,2'-1',3'-dioxolane- 13 Terpin Hydrate 14 Octahydroazocine, 3-bromo-2-oxo-
52
5.6.5 O. picea Bark
Terpenen 1-Terpinen-4-ol finns i stora mängder i kontrollen, men i mycket mindre mängder i närvaro av svampen. Isopinocarveol, terpenerna Borneol och D-Verbenone, 2H-2,4a-Ethanonaphthalene, 1,3,4,5,6,7-hexahydro-2,5,5-trimethyl- samt seskviterpenen Longifolene-(V4) är exempel på ämnen som inte finns närvarande i kontrollen, men gick att finna i närvaro av svampen. 2H-2,4a-Ethanonaphthalene, 1,3,4,5,6,7-hexahydro-2,5,5-trimethyl- fanns närvarande hos O. picea i både maltmediet och barken. Den var däremot endsat närvarande i malten hos C. polonica och inte alls närvarande hos G. penicillata.
1-Terpinen-4-ol Isopinocarveol Borneol
D-Verbenone 2H-2,4a-Ethanonaphthalene,
1,3,4,5,6,7-hexahydro-2,5,5-trimethyl-
Longifolene-(V4)
Figur 22: Några av de ämnen funna i O. picea växande i bark.
53 Nummer Ämne 1 Benzeneethanamine, N-[(4-hydroxy)hydrocinnamoyl]- 2 Cumene 3 Toluene, o-ethyl- 4 1-Octen-3-ol 5 3-Octanone 6 m-Cymene 7 Limonene 8 Irone α b
54
5.6.6 O. picea Malt
Monoterpenen β-Thujene och seskviterpenen α-Guaiene gick endast att hitta i svampen. Acetophenone, 2H-2,4a-Ethanonaphthalene, 1,3,4,5,6,7-hexahydro-2,5,5-trimethyl-, Globulol och Ledol fanns tydligt närvarande i kontrollen, men inte i närvaro av svampen. Detta tyder på att svampen har konsumerat dessa ämnen. Alloaromadendrene, benzenemethanol α,α-dimethyl-, caryophyllene, N-Benzyloxy-2-isopropoxycarbonyl-azetidine och β-Caryophyllen fanns närvarande i både O. picea och G. penicillata när dessa svampar växte i maltmedium. Longifolene-(V4) fanns hos O. picea och G. penicillata i både malt och bark.
β-Thujene α-Guaiene Acetophenone
2H-2,4a-Ethanonaphthalene,
1,3,4,5,6,7-hexahydro-2,5,5-trimethyl-
Globulol Ledol
Figur 24: Några av de ämnen funna i O. picea växande i malt.
55 Nummer Ämne
1 Butanoic acid, 2,3-dimethyl-, methyl ester
2 4-Methyl-6-phenyltetrahydro-1,3-oxazine-2-thione 3 α-Fenchene 4 N-Benzyloxy-2-isopropoxycarbonylazetidine 5 Ethyl (1-adamantylamino)carbothioylcarbamate 6 β-Thujene 7 Furan, 2-pentyl- 8 1,2,3-Propatriol, 1-indol-4-yl(ether) 9 2-Cyclopropylcarbonyloxydodecane 10 Fenchone 11 Benzenemethanol, α,α-dimethyl- 12 Nerolidyl acetate 13 β-Pinone 14 Camphene hydrate 15 Pinocamphone
56
6 Felkällor
Ojämn tillväxt av svampar där det togs. Olika koncentrationer och styrkor hos svampen som tillsattes.
Kontamineringar.
57
Källförteckning
Birgersson, G., Schlyter, F., Bergström, G. & Löfqvist, J., 1987. Individual Variation in aggregation pheromone content of the bark beetle, Ips typographus., u.o.: Journal of Chemical Ecology, Vol. 14, No. 9, 1998..
Fossen, M., 2006. Environmental Fate of Imidacloprid., u.o.: Department of Pesticide Regulation, Sacramento, CA..
Gijzen, M., Lewinsohn, E., Savage, T. J. & Croteau, R. B., 1993. Conifer Monoterpenes, Biochemistry and Bark Beetle Chemical Ecology., u.o.: Bioactive Volatile Compounds from Plants, pp. 8–22, American Chemical Society..
Krokene, P., Solheim, H. & Långström, B., 2000. Fungal infection and mechanical wounding induce disease resistance in Scots pine., u.o.: European Journal of Plant Pathology 106: 537–541, 2000..
Långström, B. & Solheim, H., 2001. Vem dödar tallen – märgborren eller dess blånadssvampar?, u.o.: SLU.
Lindgren, N., 2009. Vi hade i alla fall tur med vädret - En processutvärdering av arbetet med barkborre och storm 2007., u.o.: Internationella Handelshögskolan, Högskolan i Jönköping..
Paine, T., Raffa, K. & Harrington, T., 1997. Interactions among scolytid bark beetles, their associated fungi, and live host conifers., u.o.: Annual Reviews Entomology..
Phillips, . M. A. & Croteau, R. B., 1999. Resin-based defenses in conifers., u.o.: Trends in plant science, Vol. 4, No. 5, Elsevier Science..
SLU, I. f. e., 2014. Granbarkborren - biologi, skador och forskning.. [Online] Available at: http://www2.ekol.slu.se/granbarkborre/skador_traddod.php [Använd 01 04 2014].
Södra, 2011. Insektsskador. [Online] Available at:
http://skog.sodra.com/sv/BrukaSkog/Skogsskador/Skadeinsekter/Granbarkborre/Kostnad er-for-skador-av-granbarkborre/
[Använd 13 05 2014].
58 Bilder
B1: http://www.skogsstyrelsen.se/Myndigheten/Skog-och-miljo/Skadeovervakning/ [hämtat
elektroniskt 12 maj 2014]
B2: http://www2.ekol.slu.se/granbarkborre/skador_blanad.php [hämtat elektroniskt 16 maj
2014]
Bilagor
Bilaga 1: Tillväxt av svampar andra omgången
61 Figur 29: Area svampar över tillväxttid
62
Bilaga 2: Resultat av GCMS, ämnen producerade av bark och respektive svamp.
Ämne Kontroll Bark
δ-Cadinol ‡ 2-Heptanol, 3-methyl- ‡ 2-Pentanol, 2-methyl- ‡ 3-Heptanol ‡ 3-Hexanol ‡‡ 3-Pentanol, 3-methyl- ‡‡ 4-Acetylpyridine, oxime ‡ Acoradien ‡‡ Chrysanthenone ‡ Cumene ‡‡ Cyclohexane ‡‡ Cyclopentane, methyl- ‡‡‡ Cyclopentanol, 1-methyl- ‡‡ Isolongifolol, acetate ‡‡ Neocembren A ‡ Pentane, 2-methyl- ‡‡ Pentane, 3-methyl- ‡‡ Styrene, p,α-dimethyl- ‡‡
Tabell 15: Ämnen producerade av barken, endast närvarande i kontrollen.
Ämne GP
1-Pentanol, 4-amino- ‡
2(10)-Pinen-3-one ‡
3-Octanone ‡‡
63 Benzeneethanamine, N-[(4-hydroxy)hydrocinnamoyl]- ‡ Borneol ‡‡ DL-Leucine, N-glycyl- ‡‡ D-Verbenone ‡ Ledene ‡‡ Limonene ‡ m-Cymene ‡‡ N-(3-Methylbutyl)acetamide ‡ Toluene, o-ethyl- ‡ β-Guaiene ‡‡‡ γ-Cadinene ‡ γ-Terpinene ‡
Tabell 15: Ämnen producerade av G. penicillata, endast närvarande i G. penicillata.
Ämne CP 1H-Naphthalen-2-one, 3,4,5,6,7,8-hexahydro-4a,8a-dimethyl- ‡‡‡ Bicyclo[2.2.1]hept-2-ene, 2,3-dimethyl- ‡‡ cis-Verbenol ‡ Epiglobulol ‡‡ Longicyclene ‡‡ L-trans-Pinocarveol ‡‡ Myrtenol ‡‡‡ Pentadecane ‡‡ Terpinolen ‡ δ-Cadinene ‡‡‡
64
Ämne OP
1-Butanol, 3-methyl- ‡‡
2,4,4-Trimethyl-3-hydroxymethyl-5a-(3-methyl-but-2-enyl)-cyclohexene ‡
3-Hydroxymandelic acid, ethyl ester, di-TMS ‡‡
9-Methoxycalamenene ‡
(Z)-β-Farnesene ‡‡
L-pinocarveol ‡
γ-Patchoulene ‡
Tabell 17: Ämnen producerade av O. picea, endast närvarande i O. picea.
Bilaga 3: Ämnen producerade av malt och respektive svamp.
Ämne Kontroll Malt
