BA161C Examensarbete (15 hp) Malmö universitet
OPTIMERING AV
VÄTSKEKROMATOGRAFISKA PARAMETRAR VID
KVANTIFIERING AV LÄKEMEDEL I SERUM MED LC-MS/MS FÖR
KLINISK DIAGNOSTIK
SOFIE EDLUND
OPTIMERING AV
VÄTSKEKROMATOGRAFISKA PARAMETRAR VID
KVANTIFIERING AV LÄKEMEDEL I SERUM MED LC-MS/MS FÖR
KLINISK DIAGNOSTIK
SOFIE EDLUND
Edlund, S. Optimering av vätskekromatografiska parametrar vid kvantifiering av läkemedel i serum med LC-MS/MS för klinisk diagnostik. Examensarbete i Biomedicinsk laboratorievetenskap 15 högskolepoäng. Malmö universitet:
Fakulteten för hälsa och samhälle, institutionen för biomedicinsk vetenskap, 2021.
Vid Klinisk kemi och farmakologi, Specialkemi, vid Skånes universitetssjukhus, Lund, utförs kvantifiering med LC-MS/MS av antipsykotiska och antidepressiva läkemedelskoncentrationer i serum med acetonitril (ACN) som mobilfas. ACN är på grund av sin höga elueringsstyrka ett av de vanligaste organiska
lösningsmedlen vid reversed phase (RP) kromatografi, men uppvisar samtidigt en hög toxicitet med risk för stora leveransproblem. I syfte att reducera mängden ACN undersöktes därför möjligheten till ett mobilfasbyte till metanol (MeOH).
Ordinarie metod jämfördes med tre nyutvecklade metoder med MeOH-baserad mobilfas. I en av metoderna ändrades endast mobilfas och elueringsgradient, medan två av metoderna även använde andra sorters RP-kolonner med anpassade elueringsgradienter. Samtliga analyter uppvisade godkänd separation och
retention vid eluering med MeOH, men stor fluktuation från referensmetod sågs vid kvantifieringen av flera analyter, däribland olanzapin, desmetylolaznapin och mirtazapin. Liknande avvikelser med avseende på regression och
kvantifieringsdifferens observerades vid eluering med andra sorters RP-kolonner.
Detta indikerar att vidare optimering av andra vätskekromatografiska och masspektrometriska parametrar bör utföras innan metoderna kan valideras.
Nyckelord: acetonitril, LC-MS/MS, metanol, metodjämförelse, reversed phase kromatografi, terapeutisk läkemedelsövervakning
OPTIMIZING
CHROMATOGRAPHIC PARAMETERS FOR QUANTIFICATION OF
PHARMACEUTICALS IN SERUM WITH LC-MS/MS FOR CLINICAL USE
SOFIE EDLUND
Edlund, S. Optimizing Chromatographic Parameters for Quantification of Pharmaceuticals in Serum with LC-MS/MS for Clinical Use. Degree project in Biomedical Science 15 credits. Malmö University: Faculty of Health and Society, Department of Health and Society, 2021.
The quantification of antipsychotics and antidepressants in human serum with LC- MS/MS is usually performed with acetonitrile (ACN) as mobile phase. ACN is one of the most common organic solvents in reversed phase (RP) chromatography thanks to its high elution strength but is also highly toxic and can at times suffer from major delivery problems. The present study investigated the possibility of replacing ACN with methanol (MeOH) as primary organic solvent with the purpose of reducing the total ACN-usage. Three newly developed methods for chromatographic analysis of antipsychotic and antidepressant drugs using MeOH as organic solvent as part of the mobile phase were compared to the routine method in regard to analyte separation and retention, as well as the relative quantification of substance. In one of the methods only the mobile phase and elution gradient was changed whereas different types of RP columns were applied in addition to the changed mobile phase in the other two. All substances showed acceptable separation and retention when eluted with MeOH but displayed large fluctuations in the quantification of the analyzed substances, more specifically olanzapine, desmethylolanzapine and mirtazapine, in comparison to the reference method. Similar deviations in terms of regression and quantification bias were observed when analytes were eluted with MeOH through other types of RP columns. This indicates that further optimization of other parameters relating to the chromatography and mass spectrometer should be performed before
validation.
Keywords: acetonitrile, LC-MS/MS, methanol, method comparison, reversed phase chromatography, therapeutic drug monitoring
FÖRORD
Jag vill rikta ett stort tack till min handledare Anders Blomgren för din expertis och ditt oändliga tålamod. Din handledning och hjälp har varit oerhört värdefull.
Jag vill även tacka Johan Kahrle Atterlord för ditt vänliga stöd och din goda feedback.
Slutligen vill jag även tacka alla medarbetare vid Specialkemi på Klinisk kemi och farmakologi, Skånes universitetssjukhus, Lund att ni gett mig möjligheten att tillhandahålla er otroliga kunskap och använda er utrustning.
INNEHÅLLSFÖRTECKNING
INLEDNING _____________________________________________________ 5 Reversed phase liquid chromatography _______________________________ 5 Tandem mass spectrometry ________________________________________ 6 Analysmetod LC-MS/MS 2 ________________________________________ 7 SYFTE OCH FRÅGESTÄLLNINGAR ________________________________ 8 MATERIAL OCH METOD _________________________________________ 8 Kemikalier och reagens ___________________________________________ 8 Instrument _____________________________________________________ 9 Provmaterial och provupparbetning __________________________________ 9 Vätskekromatografiska tester ______________________________________ 10 Statistik och datahantering ________________________________________ 11 Godkännandekriterier ____________________________________________ 11 Etisk bedömning________________________________________________ 12 RESULTAT OCH DISKUSSION ____________________________________ 12 Initiala metanoltester ____________________________________________ 12 Metodjämförelse: Kinetex Biphenyl MeOH __________________________ 14 Kolonntester ___________________________________________________ 15 Metodjämförelse: Luna Omega MeOH ______________________________ 16 Metodjämförelse: HSS T3 MeOH __________________________________ 18 Signal-till-brusförhållande och toppform _____________________________ 20 Metoddiskussion _______________________________________________ 22 SLUTSATS _____________________________________________________ 23 REFERENSER __________________________________________________ 24 BILAGA I - BEREDNINGSANVISNINGAR __________________________ 27 BILAGA II - METANOLTESTER ___________________________________ 28 BILAGA III – KOLONNTESTER ___________________________________ 29 BILAGA IV – LUNA OMEGA MEOH _______________________________ 30 BILAGA V – HSS T3 MEOH _______________________________________ 31
INLEDNING
Kvantitativ analys av läkemedel och deras metaboliter i biologisk matris (serum, helblod, plasma, urin, saliv m.fl.) har stor betydelse inom klinisk kemi och farmakologi vid utvärdering och tolkning av biotillgänglighet, behandlingseffekt och doseringsintervall. De senaste decennierna har liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) spelat en allt större roll vid kliniska laboratorier på grund av dess höga selektivitet och känslighet, med tillämpningar inom endokrinologi, hematologi, och toxikologi [1].
Reversed phase liquid chromatography
På Specialkemi vid Klinisk kemi och farmakologi på Skånes universitetssjukhus, Lund, utförs analyser av bland annat steroider, cancermarkörer, vitaminer, droger och läkemedel med avancerad analysutrustning så som HPLC, GC-MS och LC- MS/MS. Vid kvantifiering av läkemedelskoncentrationer i serum, så kallad terapeutisk läkemedelsövervakning, används reversed phase high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (RP HPLC-MS/MS) med elektrosprayjonisering (ESI). HPLC separerar molekyler i ett prov genom att extraherat provmaterial tillsammans med flytande mobilfas under högt tryck transporteras genom en kolonn packad med stationär fas. RP-kromatografi kan i sin tur hantera föreningar med varierande molekylvikt, polaritet och lipofilicitet, och är på grund av sitt breda applikationsområde den vanligaste
separationstekniken vid HPLC [2]. RP-kolonner är packade med ligandtäckta kiselkulor där liganderna framför allt utgörs av mättade, alifatiska kolväten, vanligen C18 eller C8, eller andra opolära funktionella grupper så som fenyl, bifenyl, difenyl, fenyl-hexyl eller amidgrupper [3]. Fördelningen av en analyt mellan den mobila och stationära fasen beror på interaktionerna mellan provet och den stationära fasen. Opolära molekyler har högre affinitet för opolära kemiska grupper kovalent bundna till den stationära fasen och kommer därför ha längre retentionstid och högre retentionsfaktor än polära föreningar [4].
Mobilfaser
Endast ett fåtal organiska lösningsmedel är lämpliga som mobilfas vid LC- MS/MS, och vid val av mobilfas måste flera egenskaper tas i beaktning, bland annat polaritet, viskositet, elueringsstyrka, separationsselektivitet, pris,
användarsäkerhet och miljöpåverkan. MS-systemet kräver även flyktiga
mobilfaser då icke-flyktiga ämnen kan orsaka saltbildning i masspektrometerns prob eller jonkälla [2]. De vanligast förekommande mobilfaserna vid RP-
kromatografi utgörs av organiska lösningsmedel, huvudsakligen acetonitril (ACN) eller metanol (MeOH), i kombination med vatten. Mobilfastillsatser så som ammoniumacetat, ammoniumformat, ättiksyra och myrsyra kan även användas för att effektivisera joniseringen i massanalysatorn, samt som buffert för att reglera mobilfasens pH [2, 5].
ACN har ett högre dipolmoment än MeOH och uppvisar generellt även en högre elueringsstyrka [6]. Användande av ACN kan därför resultera i snabbare eluering av analyter och kortare analystider [2]. Vid användning av MeOH-baserade mobilfaser kan högre koncentrationer organiskt lösningsmedel krävas för eluering av vissa analyter. Samtidigt kan den högre koncentrationen modifierare leda till mer effektiv avdunstning av mobilfasen i jonkällan [5]. Fortsättningsvis har MeOH en högre viskositet än ACN och kommer därför utsätta kolonnen och
systemet för högre mottryck. Denna effekt kan till viss del motverkas med en temperaturhöjning [2]. Vardera analyt kommer även interagera olika med ACN respektive MeOH som resultat av modifierarens inbördes kemi. MeOH (CH3OH) är ett protiskt lösningsmedel eftersom den innehåller väte (H) bundet till syre (O) och därmed kan donera en elektron för att bilda en vätebindning. ACN (CH3CN) är ett aprotiskt lösningsmedel och kan därför inte donera en elektron till en vätebindning [6].
Det är inte bara de modifierarnas kemiska egenskaper som bör tas i beaktning vid val av mobilfas. Både ACN och MeOH är flyktiga vätskor som är skadliga vid förtäring och inhalering, men ACN uppvisar generellt högre toxicitet än MeOH (LD50, råtta, MeOH: 5,628 mg/kg; LD50, råtta, ACN: 2,460 mg/kg) [7], troligen då ACN i kroppen kan omvandlas till cyanid och på så vis kan interferera med
cellernas syreupptag. MeOH är brandfarligt och avger vid brand kraftigt
irriterande koloxider, och kan vid förtäring orsaka allvarlig acidos och skador på näthinnan [7]. ACN är också mycket brandfarligt och kan vid brand avge ytterst toxiska cyanidgaser. Samtidigt är ACN, på grund av sina goda egenskaper som lösningsmedel, en stapelvara inom den kliniska diagnostiken och
läkemedelsindustrin [8]. Majoriteten av ACN-produktion sker som en biprodukt av akrylnitrilproduktion inom plast- och gummiindustrin, som i sin tur är högst känslig för konjunktursvängningar eller oljeprisförändringar. En begränsad efterfrågan eller tillgång på akrylnitril har direkta konsekvenser på ACN- produktionen, vilket efter börskraschen 2008 samt under Covid-19 pandemin 2020 orsakat allvarliga leveransproblem. Under bristperioder ökar leveranstider- och kostnader avsevärt, vilket fått kliniska avdelningar och
läkemedelsproducenter att söka efter andra, mer pålitliga alternativ till ACN [8].
Gradienteluering
Vattnet i mobilfasen har svag elueringsstyrka jämfört med det organiska
lösningsmedlet varpå analytretentionen och separationen kan kontrolleras genom att justera proportionerna organiskt lösningsmedel och vatten. Analyterna elueras därmed ut ur kolonnen genom en successiv ökning av organiskt lösningsmedel och därmed minskning av mobilfasens polaritet, s.k. gradienteluering, varpå molekylerna separeras utifrån affinitet för liganderna bundna till den stationära fasen [2]. I gradienteluering varieras alltså mobilfasens procentuella komposition av polär och opolär eluent vilket i sin tur påverkar elueringsstyrkan [4]. Vid analys av komplexa prover med flera analyter som uppvisar olika polaritet är gradienteluering att föredra då det ofta ger större toppkapacitet med smalare toppar än vid isokratisk eluering (konstant koncentration på mobilfasen) samt går avsevärt snabbare. Gradienteluering ger även möjlighet att eluera ut oönskade substanser, så som salter, hydrofila substanser, fetter och lipoproteiner.
Gradientmetoder är mer komplexa eftersom retention och selektivitet påverkas av flertalet faktorer, bland annat inledande och avslutande mobilfaskoncentration och gradienttid [2].
Tandem mass spectrometry
Med masspektrometriska metoder separeras joner i vacuum utifrån förhållandet mellan deras massa och laddning (m/z). Masspektrometern utgörs av en jonkälla, ett ESI, en massanalysator och en detektor. Analyter separerade med HPLC transporteras till jonkällan för elektrosprayjonisering [9]. ESI är en s.k. mjuk joniseringsteknik eftersom den, vid optimala förhållanden, inte orsakar fragmentering av molekyler vid jonisering av analytjonerna [10]. En typisk
tandem-masspektrometer utgörs av tre kvadrupoler placerade efter varandra, i en s.k. trippel kvadrupol masspektrometer. Inom kvadrupolerna bildas ett
oscillerande elektriskt fält med hjälp av alternerande laddningar. Det elektriska fältet påverkar jonernas passage genom kvadrupolen baserat på deras m/z [9, 11].
Kvadrupolerna kan därmed programmeras så att endast molekyler med en viss m/z kan förflyttas genom kvadrupolen och vidare genom spektrometern. Efter fragmentering av selekterad moderjon i spektrometerns kollisionscell tillåts endast fragment med m/z inom ett förutbestämt m/z-intervall vandra fram till detektorn, s.k. multiple reaction monitoring (MRM). MRM möjliggör detektion av en signal vid en specifik m/z endast om motsvarande fragmentjon skapats från en specifik moderjon, och skiljer på så vis analytjonen från ospecifika matrixföreningar.
MRM möjliggör även separat detektion av sameluerande analyter, vilket underlättar vid LC-MS/MS-analys av komplicerade matriser [9]. Eftersom analyter separeras utifrån (m/z) kan analyter som inte uppnår baslinjeseparation med LC ändå separeras utifrån skillnaden av deras massor. Komplett
baslinjeseparation behöver därför inte vara ett krav vid användning av MS som detektionsmetod [12]. Detektorn utgörs av en kanalelektronmultiplikator (CEM) i vilken en serie elektroder är anordnade diagonalt motsatt varandra som omvandlar detekterade fragment till en signal där signalens styrka är proportionell mot mängden analyt. Ett datahanteringsprogram översätter därefter signalen till ett kromatogram [11].
Analysmetod LC-MS/MS 2
Läkemedelsanalyserna vid Specialenheten på Klinisk kemi och farmakologi är indelade i 9 olika metoder som innefattar 55 substanser inklusive metaboliter.
Kvantifiering görs utifrån en internstandard (IS) och kalibreringskurva för vardera analyt. Analysernas riktighet kontrolleras kontinuerligt genom medverkan i externa kontrollprogram (LGC Standards Proficiency), i vilka majoriteten av analyter är representerade. Detta projekt kommer huvudsakligen fokusera på metoden LC-MS/MS 2. I LC-MS/MS 2 analyseras haloperidol, olanzapin och risperidon som tillhör gruppen antipsykotiska läkemedel, samt mirtazapin och vortioxetin, som faller under benämningen antidepressiva läkemedel [13].
Metoden analyserar även metaboliterna till ovanstående läkemedel, däribland paliperidon (9-OH-risperidon), desmetylolanzapin, desmetylmirtazapin och karboxyvortioxetin [14]. För fullständig sammanställning av analyter med tillhörande IS se tabell 1.
Tabell 1. Översikt av substanser och metaboliter som ingår i metoden LCMSMS-2 med tillhörande internstanard, terapeutiskt intervall (nmol/L) och mätintervall (nmol/L). Molekylvikter hämtade från Sigma-Aldrich. Terapeutiska intervall från interna metodbeskrivningar som baserats på Heimkel et al. [15].
Analyt Internstandard Terapeutiskt intervall (nmol/L)
Mätintervall (nmol/L)
Olanzapin Olanzapin-d4 20 – 240 0,80 – 500
Desmetylolanzapin Olanzapin-d4 Inte aktuellt 0,80 – 500
Mirtazapin Mirtazapin-d3 100 – 300 0,80 – 500
Desmetylmirtazapin Mirtazapin-d3 Inte aktuellt 0,80 – 500
Risperidon Risperidon-d4 20 – 160 (avser summan risperidon
+ 9-OH-risperidon) 0,80 – 500
9-OH-risperidon 9-OH-risperidon-d4 10 – 90 0,80 – 500
Vortioxetin Vortioxetin-13C6 30 – 130 4,0 – 2500
Karboxyvortioxetin Karboxyvortioxetin-13C6 Inte aktuellt 8,0 – 5000
Haloperidol Haloperidol-d4 2 – 25 0,80 – 500
LC-MS/MS 2 är rent analytiskt en av de mer komplicerade metoderna på avdelningen på grund av de många ingående analyterna. Ordinarie
vätskekromatografiska parametrar vid LC-MS/MS 2 utgörs av en vattenhaltig mobilfas A och ACN-baserad mobilfas B. Separationen sker med gradienteluering över en Kinetex Biphenyl-kolonn (Phenomenex, Torrance, CA, USA).
Kolonntillverkaren av ordinare kolonn rekommenderar en MeOH-baserad mobilfas för optimal eluering över kolonnen [16], och även i kombination med andra kolonner har MeOH-baserade mobilfaser använts vid kvantifiering av antipsykotiska läkemedel i biologisk matris [17], dock även i kombination med extraktionsmetoder som liquid-liquid och solid-phase extraktion [18-22]. Vid Specialenheten elueras redan flera andra substanser med MeOH-baserad mobilfas, så som antiinfektionsläkemedel och hepcidin. Att byta mobilfas från ACN till MeOH hade inte bara givit en enhetlighet mellan avdelningens analyser, utan samtidigt minskat användningen av ACN.
SYFTE OCH FRÅGESTÄLLNINGAR
Syftet med följande projekt var att undersöka möjligheten till ett mobilfasbyte från ACN till MeOH vid kvantifiering av läkemedelskoncentrationer i serum med LC-MS/MS utifrån anpassning av kolonn och elueringsgradient. Syftet
konkretiseras i följande frågeställningar:
Är det möjligt att ersätta ACN med MeOH i metod LC-MS/MS 2 med bibehållna godkännandekriterier?
Kan kromatografin förbättras genom förändring av kolonn och elueringsgradient?
MATERIAL OCH METOD
Relevanta material och metoder presenteras i följande stycken. Blankprover, färdigblandade kalibratorer (1–5), höga och låga kontroller, samt spädnings- och fällningslösningar erhölls av Specialenheten på Klinisk kemi och farmakologi bilaga I, tabell Ia–Ic).
Kemikalier och reagens
Två olika mobilfaser tillverkades enligt schemat nedan (tabell 2) och förvarades därefter i rumstemperatur. För dessa användes destillerat vatten (<5 pbb), myrsyra (Formic Acid 98–100 % Merck, Kenilworth, NJ, USA), ammoniaklösning (NH3
25 % Suprapur®, Merck) acetonitril (Hypergrade for LC-MS LiChrosolv, Merck), och metanol (LC-MS grade, J.T. Baker Radnor, PA, USA).
Tabell 2. Beredningsanvisningar för mobilfas A och B för ordinarie och MeOH-baserade metoder.
Acetonitril + NH3 Metanol
Mobilfas A Mobilfas B Mobilfas A Mobilfas B
1000 mL H2O
960 mL ACN 1000 mL H2O 960 mL MeOH
1 mL myrsyra
40 mL H2O 1 mL myrsyra 40 mL H2O 160 µL NH3
1 mL myrsyra
1 mL myrsyra 160 µL NH3
Instrument
Proverna analyserades med hjälp av ett HPLC-system av modell Nexera X2 (Shimadzu, Kyoto, Japan) bestående av pumpar (LC-20AD XR), degasser unit (DGU-20A 5R), autosampler (SIL-30AC MP) och kolonnugn (CTO-20AC).
HPLC-systemet är därefter kopplat till en AB Sciex 5500 QTrap masspektrometer (AB Sciex, Framingham, MA, USA) Vid upparbetning med robot användes Hamilton Microlab STARlet Robot (Hamilton Company, Reno, NV, USA). I tabell 3 presenteras de vätskekromatografiska och masspektrometriska inställningar som är gemensamma för alla substanser.
Tabell 3. Substansgemensamma vätskekromatografiska (LC) och masspektrometriska (MS) inställningar.
LC MS
Injektionsvolym 4 µL CUR 35
Flödeshastighet 600 µL/min Nebulizing gas GS1 70 oC Kolonntemperatur 60 oC Drying gas GS2 80 oC Autosamplertemperatur 10 oC IS 5000 volt
Analystid 2,4 minuter TEM 600 oC
IHE On
CAD 9
EP (volt) 10 volt Antal cykler 576 Cykeltid 0,25 s Polaritet Positiv
I tabell 4 nedan presenteras analytspecifika inställningar för masspektrometern, däribland MRM transitioner, ”declustering potential” (DP), kollisionsenergi (CE), och kollisionscellens exitpotential (CXP).
Tabell 4. Inställningar för masspektrometern med MRM transitioner, ”declustering potential” (DP) kollisionsenergi (CE), och kollisionscell exitpotential (CXP) för samtliga analyter.
Provmaterial och provupparbetning
Innan analys avidentifierades serumprover som sparats av enheten. Därmed kunde provernas resultat inte kopplas till en särskild individ eller dennes tillstånd. Blank, samtliga kalibratorer (1–5), låg och hög kontroll samt serumprover läts anta rumstemperatur varpå 50 µL prov överfördes till eppendorfrör. Fällnings- och spädningsreagens blandades enligt bilaga I. 150 µL fällningsreagens tillsattes till rören, som mixades och centrifugerades i 14 000 g i 4 minuter. I uppmärkta glasvialer blandades därefter 900 µL spädningslösning med 90 µL supernatant,
Substans Massa (g/mol) Övergångar
Q1 / Q3 DP (volt) CE (volt) CXP (volt)
Risperidon 410,49 411,2 / 191,1 91 39 14
9-OH-Risperidon 426,49 427,2 / 207,2 81 39 14
Haloperidol 375,89 376,1 / 165,2 91 33 12
Olanzapin 312,4 313,2 / 256,1 71 31 14
Desmetylolanzapin 298,41 299,2 / 256,0 91 35 14
Mirtazapin 265,4 266,2 / 195,1 180 47 10
Desmetylmirtazapin 251,3 252,2 / 195,1 116 33 12
Vortioxetin 298,15 299,2 / 150,0 86 35 12
Karboxyvortioxetin 328,12 329,2 / 150,0 81 39 18
Mirtazapin-d3 268,4 269,2 / 195,3 91 35 16
Haloperidol-d4 379,9 380,1 / 169,3 91 33 12
Olanzapin-d8 320,4 321,1 / 261,3 80 32 5
Risperidon-d4 414,5 415,2 / 195,1 105 38 10
9-OH-Risperidon-d4 430,5 431,4 / 211,1 80 38 15
Vortioxetin-13C6 304,15 305,2 / 156,0 86 35 12
Karboxyvortioxetin-13C6 334,12 335,2 / 156,1 76 41 18
varefter proverna var redo för analys. I de fall där proverna upparbetades med pipetteringsrobot fördes 50 µL serum över till en 96-deepwell platta varefter 150 µL fällningsreagens tillsattes. Plattan mixades vid 1000 rpm i 1 minut för att sedan centrifugeras vid 4160 g i 10 minuter. 500 µL spädningslösning och 50 µL supernatant överfördes till ny 96-deepwell platta, mixades i 1 minut och
placerades i instrumentets autosampler för analys.
Vätskekromatografiska tester
Det experimentella arbetet delades in i tre olika faser: (1) Metanoltest med mål att undersöka hur kromatografin påverkas vid byte av mobilfas B från ACN till MeOH (2) Kolonntester för att finna en eller två kolonner som lämpar sig för eluering med MeOH-baserad mobilfas (3) Metodjämförelse mellan framtagna metoder och referensmetod (ordinarie metod).
Fas 1: Metanoltester
För att undersöka hur analyterna elueras med MeOH-baserad mobilfas B i stället för ACN jämfördes den ordinarie metodens kromatografi av kalibrator 3 med kromatografin som utfördes med MeOH på ett annars oförändrat LC-system.
Därmed bibehölls andra faktorer så som kolonn, flödeshastighet och
kolonntemperatur (tabell 3 och 4). Valet att i dessa initiala tester endast testa på kalibrator 3 baserades på att analyterna i denna lösning troligtvis hade tillräckligt hög koncentration för att kunna skiljas från eventuellt bakgrundsbrus utan risk att överbelasta masspektrometern. Den nyutvecklade metoden med MeOH-baserad mobilfas i det annars oförändrade LC-system benämndes Kinetex Biphenyl MeOH. Kolonnen ekvilibrerades i 20 minuter med 5 % MeOH-mobilfas för att skölja bort all kvarstående ACN. Därefter analyserades 10 initierande blankprover (bilaga I) för att stabilisera reaktionerna, och därefter kalibrator 3 för att få en uppfattning om hur kromatografin påverkades utifrån separation, retention och toppform.
Analyterna eluerades i ett första steg med samma gradient som vid ordinarie metod med en Kinetex Biphenyl kolonn med en flödeshastighet på 0,6 mL/min.
Därefter optimerades mobilfasgradienten för MeOH på kalibrator 3 för att uppnå så hög separation mellan analyterna som möjligt, men samtidigt bibehålla
toppformen och eventuellt korta ner analystiden. Metodjämförelse mellan referensmetod och Kinetex Biphenyl MeOH utfördes på 35 avidentifierade serumprover, blankprover, kalibrator 1–5 samt hög och låg kontroll. Utifrån kalibreringsproverna framställdes en kalibreringskurva vars ekvation användes för att fastställa patientprovernas koncentrationer. Därefter jämfördes kvantifieringen av serumproverna med referensmetod respektive MeOH-metod.
Överenstämmelsen mellan ordinarie och nyutvecklad metod utvärderades med korrelations- och Bland-Altman analys.
Fas 2: Kolonntester
Elva kolonner undersöktes för att finna en kolonn lämplig utifrån de ingående analyternas separation, retentionstid, toppform, toppsymmetri och toppintensitet (se bilaga III, tabell IIIa). Varje kolonn ekvilibrerades under 10 minuter med en stigande gradient. Därefter utfördes kolonntest på blankserum med tillsatt IS samt på kalibrator 3. Kolonntesterna utfördes över en rak gradient (figur 1) med start på 10 % mobilfas B, med en flödeshastighet på 0,5 mL/min. Kolonnerna
utvärderades utifrån 5 vätskekromatografiska parametrar: separation mellan analyter, en total retentionstid inom analysspannet, toppbredd mindre eller lika
stor som i referensmetod, toppsymmetri utan uttalad fronting eller tailing, och slutligen en allmän toppintensitet jämförbar med ordinarie metod.
Fas 3: Metodjämförelser
Efter val av kolonn utifrån ovan beskrivna kolonntester utformades två nya metoder:
1. Luna Omega Polar C18-kolonn (Phenomenex) med gradient optimerad för MeOH-baserad mobilfas (Luna Omega MeOH)
2. Acquity UPLC HSS T3-kolonn (Waters, Milford, MA, USA) med gradient optimerad för MeOH-baserad mobilfas (HSS T3 MeOH)
Jämförelse mellan ordinarie metod och Luna Omega MeOH utfördes på 36 serumprover av okänd koncentration. Metodjämförelse mellan ordinarie metod och HSS T3 MeOH utfördes på 55 serumprover. På grund av lagringsbrist och osäkerhet kring hållbarhet kunde samma prover inte användas till alla tester, då dessa utfördes vid olika tillfällen.
Statistik och datahantering
Kromatogram, kalibreringskurvor, retentionstider, procentuell
variationskoefficinet (CV %) och noggrannhet erhölls via programvaran Analyst 1.6 Software (AB Sciex). Korrelations- och Bland Altman-analys utfördes i Microsoft Office 365 Excel 2016 med det statistiska tillägget Analyse-IT (Analyse-IT Software Ltd, Leeds, United Kingdom).
Godkännandekriterier
För att en framtagen metod skall godkännas för bruk vid Klinisk kemi och farmakologi ska den uppfylla ett flertal kriterier (tabell 5).
Tabell 5. Godkännandekriterier för nyutvecklad metod i relation till referensmetod.
Metodparameter Godkännandekriterier
Retentionstider Retentionstider lika långa eller kortare än för referensmetod Separation mellan analyter Likvärdig eller bättre än referensmetod
Signal-till-brusförhållande Idealt >10 men godkänt >5 Toppform och toppbredd vid
50 %
Symmetriska toppar utan fronting eller tailing, med en toppbredd lika stor eller mindre än referensmetod Mätosäkerhet/differens (%) <±10 % för samtliga serumprover
Noggrannhet 100±20 % för kalibrator 1, 100±15 % för kalibrator 2–5 Variationskoefficient (CV) ≤ 20 % för kalibrator 1, ≤ 15 % för kalibrator 2–5
Determinationskoefficient R2 ≥ 0,95 % för samtliga analyter Korrelationskoefficient R ≥ 0,95 % för samtliga analyter
Figur 1. Visuell representation av gradient som användes vid kolonntester. Procentuell koncentration av MeOH-baserad mobilfas B presenteras som funktion av analystiden.
Etisk bedömning
Studien krävde inget etiskt tillstånd då ingrepp på patienter eller försökspersoner ej utfördes. Serumet utgjordes av sparade, redan analyserade prover från
Specialenheten som anonymiserades innan analys. Vid analys användes löpnummer så att proverna ej kunde spåras till någon individ.
RESULTAT OCH DISKUSSION
Syftet med denna studie var att undersöka hur en existerande LC-MS/MS-metod för kvantifiering av läkemedelskoncentrationer i serum påverkades av ett
mobilfasbyte från ACN- till MeOH-baserad mobilfas, och huruvida optimering av andra vätskekromatografiska parametrar så som gradientstyrka och kolonn kunde främja ovan nämnda byte.
Initiala metanoltester
Vid initiala tester med MeOH-baserad mobilfas upparbetades och analyserades kalibrator 3 med ordinarie gradient och kolonn för att undersöka hur systemet och de ingående analyterna påverkades av mobilfasbytet. I figur 2 presenteras
kromatogrammet för ordinarie metod.
Med identisk gradient som vid ordinarie metod var retentionstiden för samtliga analyter, exklusive olanzapin och desmetylolanzapin, för lång (figur 3).
Retentionstiden var därmed ca 0,4 min längre än för referensmetod (figur 2), med sämre baslinjeseparation mellan analyter. Toppform svår att utröna men utan markant fronting eller tailing.
Figur 2. Kromatogram av kalibrator 3 med ordinarie gradient, mobilfas B (ACN) och kolonn (Kinetex Biphenyl, Phenomenex). Kromatogram presenteras med intensitet (counts per second, cps) som funktion av tid (min). Gradient presenteras i diagram uppe t.v. med mobilfas B (%) över tid (min) med start på 5 %.
Utifrån resultatet i figur 4 justerades elueringsgradienten för att uppnå tillräcklig separation mellan ingående analyter men samtidigt bibehålla toppform och toppbredd. Resultat med MeOH-baserad mobilfas med justerad gradient presenteras i figur 4 nedan.
XIC of +MRM (16 pairs): 411.200/191.100 Da ID: S-Rispe from Sample 6 (Kal 3) of LCMS2-210127-2-1-NoSchedule-Ord.wiff (Turbo Spray) Max. 2.4e5 cps.
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.2 2.3
Time, min 0.0
2.0e4 4.0e4 6.0e4 8.0e4 1.0e5 1.2e5 1.4e5 1.6e5 1.8e5 2.0e5 2.2e5 2.4e5 2.6e5 2.8e5 3.0e5 3.2e5 3.4e5 3.6e5 3.8e5 4.0e5 4.2e5 4.4e5 4.6e5
Intensity, cps
2.10
2.16
Olanzapingrupp
Resterande analyter
Figur 3. Kromatogram av kalibrator 3 eluerad med MeOH-baserad mobilfas med ordinarie kolonn (Kinetex Biphenyl) och ordinarie gradient med toppintensitet (counts per second, cps) som funktion av tid (min). Ordinarie gradient presenteras uppe t.v. med mobilfas B (%) över tid (min) med start på 5 %.
XIC of +MRM (16 pairs): 411.200/191.100 Da ID: S-Rispe from Sample 4 (K-LCMS2 KAL 3) of LCMS2-210127-2-4-start20-50-60-tider-patientprov.... Max. 1.6e5 cps.
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.2 2.3
Time, min 0.0
2.0e4 4.0e4 6.0e4 8.0e4 1.0e5 1.2e5 1.4e5 1.6e5 1.8e5 2.0e5 2.2e5 2.4e5 2.6e5 2.8e5 3.0e5 3.2e5 3.4e5 3.6e5 3.8e5 4.0e5 4.2e5 4.4e5 4.6e5
Intensity, cps
1.39
2.11
Risperidon Haloperidol
Desmetylolanzapin Olanzapin Desmetylmirtazapin
Mirtazapin
9-OH-Risperidon Karboxyvortioxetin Vortioxetin
Figur 4. Kalibrator 3 för MeOH-baserad mobilfas med optimerad gradient med ordinarie kolonn (Kinetex Biphenyl). Justerad gradient presenteras uppe t.v. med mobilfas B (%) över tid (min) med start på 20 %.
Analyterna uppvisade godkänd retention inom det analytiska tidsspannet även om komplett baslinjeseparation ej uppnåddes mellan mirtazapin och 9-OH-risperidon, samt mellan haloperidol och risperidon, men tack vare användning av MS som detektionsmetod är detta negligerbart [11]. Den totala tiden för analys kunde inte förkortas, då vortioxetin uppvisade en retentionstid ca 0,1 min längre än med ordinarie mobilfas. Toppformen för samtliga analyter var symmetrisk, men med bredare toppar än hos referensmetod, vilket diskuteras närmare nedan.
Metodjämförelse: Kinetex Biphenyl MeOH
Totalt 35 serumprover analyserades vid jämförelse av referensmetod och metoden som benämndes Kinetex Biphenyl MeOH. I avsaknad av tillräckligt många positiva serumprover för vortioxetin och karboxyvortioxin (npos=1, tabell 6), kunde korrelations- och Bland-Altman analys ej utföras för dessa analyter.
Koncentrationsbestämning av mirtazapin uppvisade högst variation, med en medelavvikelse på -13,6 % och där 50 % av proverna avvek >10 % från
referensmetoden (tabell 6). Av samtliga analyser med positivt utslag uppvisade 23,3 % en differens > ±10 % i relation till referensmetoden.
Tabell 6. Antal positiva serumprover för respektive analyt (npos), determinationskoefficienter (R2) korrelationskoefficient (R) för analyter med npos > 1, procentuell medelavvikelse, samt procentuell andel positiva serumprover med en procentuell differens > ±10 % för referensmetod respektive Kinetex Biphenyl+MeOH,
Determinationskoefficienten (R2) synliggör stark linjaritet för majoriteten av i metoden ingående läkemedel (tabell 6). Trots att alla analyter uppnår
godkännandekriteriet på R2 > 0,95 % tyder Bland-Altmananalysen på stora variationer mellan metoderna. Exempelvis ses en kraftig förskjutning av den nya metodens mirtazapinkoncentrationer (figur 5a) där två prover avvek >10% från referensmetod (figur 5b). Större avvikelse från linjärt samband ses även hos olanzapin vid högre koncentrationer (figur 5c), där en kvantifiering låg 40% högre än referensmetoden (figur 5b). Liknande avvikelser observerades även hos
desmetylolanzapin och haloperidol. Medelavvikelsen för resterande analyter låg inom ±2SD. Det bör noteras att ovanstående resultat baseras på ett litet
provunderlag för risperidon, mirtazapin och desmetylmirtazapin.
Analyt npos R R2 Medelavvikelse (%) npos >±10 % (%)
Risperidon 3 -2,44 0,0
9-OH-risperidon 13 0,990 0,979 0,27 31
Haloperidol 9 0,998 0,996 -7,40 0,0
Olanzapin 19 0,994 0,989 -1,30 21
Desmetylolanzapin 19 0,993 0,986 4,22 37
Mirtazapin 4 1,000 0,999 -13,6 50
Desmetylmirtazapin 4 0,983 0,965 -5,57 0,0
Vortioxetin 1 - - - -
Karboxyvortioxetin 1 - - - -
I tabell IIa, bilaga II, presenteras variationskoefficienter (CV, %) och noggrannhetsvärden (%) för referens- respektive MeOH-baserad metod.
Variationskoefficienten är acceptabel för samtliga analyters kalibrator 3–5.
Samtidigt ses större variation vid lägre kalibratornivåer. För olanzapin ses
exempelvis ett CV på 31,9% för kalibrator 2. Noggrannheten (tabell IIa, bilaga II) ligger inom 100±15% för kalibrator 1–5 för samtliga analyter med både
referensmetod och ny metod. Trots godkända noggrannhetsvärden ses stor variation från börvärden vid kvantifiering av låga och höga kontroller (tabell IIb, bilaga II). Vid lägre koncentrationer sågs kontrollvärden för testmetod ligga över
±2SD från börvärde för både desmetylolanzapin, mirtazapin och vortioxetin.
Större avvikelser sågs för höga kontroller där mirtazapin, desmetylmirtazapin, olanzapin, desmetylolanzapin, vortioxeting och karboxyvortioxetin alla uppvisade minst ett kontrollvärde över ±2SD från börvärde.
Kolonntester
Med syfte att förbättra separationen och kromatografin ytterligare undersöktes elva kolonner utifrån de ingående analyternas separation, retentionstid, toppform, toppsymmetri och toppintensitet. Två kolonner uppnådde godkännandekriterierna
Figur 5. Korrelations- och Bland-Altman-analys för mirtazapin- (a och b) och olanzapin- koncentrationer (c och d) erhållna med ordinarie respektive MeOH-baserat metod med ordinarie kolonn (Kinetex Biphenyl). Grå linje i korrelationsplot anger 100 % linjärt samband mellan båda metoder. Blå, streckade linjer i Bland-Altman-grafer utgör ±95 konfidensintervall, och grå streckade linjer ±10 % differens från referensmetodens värde. Tjock blå linje utgör medeldifferensen för ny metod.
för varje parameter (se bilaga III, tabell IIIb): Acquity UPLC HSS T3 (Waters) och Luna Omega Polar C18 (Phenomenex).
Samtliga kolonner var enligt tillverkare kompatibla med HPLC, medan Kinetex Biphenyl (Phenomenex), Accucore Phenyl X (Thermo Scientific™), Acquity UPLC HSS T3, Luna Omega Polar C18 och SpeedCore Diphenyl (Fortis Technologies, Neston, Storbritannien) dessutom var kompatibla med UHPLC.
UHPLC-kolonner har generellt mindre partikelstorlek vilket påverkar analytens diffusion genom den stationära fasen, och teoretiskt sett bör förbättra analyternas toppform [5]. Acquity UPLC HSS T3 och Luna Omega Polar C18, som uppvisade bäst resultat vid kolonntesterna, har båda dessutom lägre partikelstorlek än
resterande kolonner (bilaga III tabell IIIa och IIIb). Ordinarie kolonn (Kinetex Biphenyl) uppvisade även denna godkänd retention, toppbredd, toppsymmetri och toppintensitet fastän dennas partikelstorlek var densamma som för majoriteten av resterande kolonner. Inverkan av partikelstorlek på toppbredd diskuteras mer ingående nedan. Liganderna på den stationära fasen för HSS T3 och Luna Omega skiljer sig avsevärt från ordinarie kolonn, då de består av C18-kedjor istället för bifenyl. Den vanligaste kolonnsorten vid separation av antipsykotiska och antidepressiva preparat inom biologisk matris utgörs av C18-kolonner [22], men flertalet studier har rapporterat lyckade separationer även med bland annat bifenyl- [19], phenyl-hexyl- [17] och HSS T3-kolonner [18]. Eftersom att varje kolonn erhåller en varierande kombination av hydrofobicitet, silanolaktivitet, hydrolytisk stabilitet och kemisk interaktion med analyterna, samt att kolonnernas kompletta kemi till stor del är hemligstämplad av tillverkarna, är det svårt att utröna varför analyterna beter sig så olika i respektive kolonn.
Metodjämförelse: Luna Omega MeOH
Metodjämförelsen mellan referensmetod och Luna Omega MeOH utfördes på 36 prover. Efter optimering av mobilfasgradient uppnåddes godtagbar separation mellan majoriteten av ingående analyter (se figur 6), med undantag för desmetylmirtazapin som sameluerade med mirtazapin och dess IS. Metoden uppvisade möjlighet att minska den totala analystiden eftersom den sista analyten eluerade vid ca 1,65 min jämfört med ca 1,95 min för referensmetoden.
Figur 6. Kalibrator 3 för Luna Omega MeOH. Gradient presenteras uppe t.v. med mobilfas B (%) över tid (min) med start på 5 % för att sedan hastigt öka till 30 %. Toppar för IS ej markerade.
Korrelations- (R) och determinationskoefficient (R2) låg över 95 % för 6 av 9 ingående läkemedel, vilket för dessa analyter tyder på god korrelation mellan referensmetod och Luna Omega MeOH (tabell 7). Risperidon, vortioxetin och karboxyvortioxetin kunde dessvärre inte utvärderas på grund av för litet statistiskt underlag.
Tabell 7. Antal positiva serumprover för respektive analyt (npos), determinationskoefficienter (R2) korrelationskoefficient (R) för analyter med npos > 1, procentuell medelavvikelse, samt procentuell andel positiva serumprover med en procentuell differens > ±10 % för referensmetod respektive Luna Omega MeOH.
Haloperidol och desmetylolanzapin var de enda substanser med serumprover som uppvisade en differens > ±10 % från referensmetoden (tabell 7). Störst
medelavvikelse från referensmetod sågs hos desmetylmirtazapin (6,0%), vilket sammanslaget för alla analyter är en markant förbättring i relation till eluering med MeOH-baserad mobilfas över ordinarie kolonn. I tabell IVa i bilaga IV presenteras variationskoefficienter (CV %) och noggrannhetsvärden (%) för från referensmetod och Luna Omega MeOH. Mirtazapin, olanzapin och risperidon uppvisade alla ett CV >20% för kalibrator 1 med Luna Omega MeOH, vilket kan tyda på svårigheter för metoden att kvantifiera prover med koncentrationer runt
Analyt npos R R2 Medelavvikelse (%) npos >±10 % (%)
Risperidon 1 - - - -
9-OH-risperidon 7 0,999 0,998 3,2 0
Haloperidol 14 0,991 0,981 -0,21 21,4
Olanzapin 22 0,998 0,996 -0,87 0
Desmetylolanzapin 22 0,997 0,993 0,21 5
Mirtazapin 3 0,999 0,999 -0,20 0
Desmetylmirtazapin 3 0,999 0,999 6,0 0
Vortioxetin 0 - - - -
Karboxyvortioxetin 0 - - - -
XIC of +MRM (16 pairs): 411.200/191.100 Da ID: S-Rispe from Sample 4 (K-LCMS2 KAL 3) of LCMS2-210308-LunaOmegaC18-MeOH-Batch09.wif... Max. 1.6e5 cps.
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.2 2.3
Time, min 0.0
2.0e4 4.0e4 6.0e4 8.0e4 1.0e5 1.2e5 1.4e5 1.6e5 1.8e5 2.0e5 2.2e5 2.4e5 2.6e5 2.8e5 3.0e5 3.2e5 3.4e5 3.6e5 3.8e5 4.0e5
Intensity, cps
1.25
Desmetylolanzapin Olanzapin Desmetylmirtazapin
Mirtazapin
Risperidon
Karboxyvortioxetin Haloperidol
Vortioxetin
9-OH-Risperidon
kalibrator 1 för dessa analyter. Detta understryks särskilt för olanzapin och risperidon där de låga kontrollerna ligger utanför ±2SD (tabell IVb i bilaga IV) och metoden anses därför inte som tillräckligt pålitlig vid låga koncentrationer.
Metodjämförelse: HSS T3 MeOH
I figur 7 presenteras kromatogram för kalibrator 3 för HSS T3 MeOH. Med justerad mobilfasgradient observerades godkänd separation av analyter utifrån godkännandekriterierna, men liksom vid Luna Omega MeOH sameluerade
desmetylmirtazapin med mirtazapin. Metoden uppvisade generellt en något längre retentionstid än Luna Omega MeOH men fortfarande kortare än referensmetod (figur 2).
Majoriteten av analyter uppvisade variations- (R) och determinationskoefficient (R2) över 95 % (tabell 8). Risperidon uppvisade ett starkt linjärt förhållande till referensmetoden med R och R2 = 1,00, och en god linjaritet vid korrelationsanalys (figur 8a). Samtidigt låg analyten ändå för lågt vid kvantifiering jämfört med referensmetod då 50 % av de positiva proverna avvek >±10 %. Detta tydliggörs vid Bland-Altman analys av differensen (figur 8b) där kvantifieringssvårigheter ses vid lägre koncentrationer. Mirtazapin uppnådde ej godkännandekriteriet då den uppvisade värden långt under 95 % för både R och R2 (tabell 8). Vid inspektion av analytens korrelationskurva (figur 8c, nedan) ses endast en svag korrelation mellan båda metoder eftersom HSS T3 MeOH konsekvent mäter 20–
30 % högre än referensmetod. Bland-Altmananalysen (figur 8d, nedan) synliggör att samtliga positiva mirtazapinprover uppvisade en differens >±10 % med en medelavvikelse på 20 % från referensvärdet.
XIC of +MRM (16 pairs): 411.200/191.100 Da ID: S-Rispe from Sample 69 (K-LCMS2 KAL 3) of LCMS2-210301-18-4-HSST3-MeOH-step20_patien... Max. 2.3e5 cps.
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.2 2.3
Time, min 0.0
2.0e4 4.0e4 6.0e4 8.0e4 1.0e5 1.2e5 1.4e5 1.6e5 1.8e5 2.0e5 2.2e5 2.4e5 2.6e5 2.8e5 3.0e5 3.2e5 3.4e5 3.6e5 3.8e5 4.0e5 4.2e5 4.4e5 4.6e5 4.8e5 5.0e5
Intensity, cps
1.39
Desmetylolanzapin Olanzapin Desmetylmirtazapin
Mirtazapin
Risperidon
Karboxyvortioxetin Haloperidol
Vortioxetin
9-OH-Risperidon
Figur 7. Kalibrator 3 för HSS T3 MeOH. Gradient presenteras uppe t.v. med mobilfas B (%) över tid (min) med start på 5 % för att sedan hastigt ökas till 20 %.
Tabell 8. Antal positiva serumprover för respektive analyt (npos), determinationskoefficienter (R2) korrelationskoefficient (R) för analyter med npos > 1, procentuell medelavvikelse, samt procentuell andel positiva serumprover med en procentuell differens > ±10 % för referensmetod respektive HSS T3 MeOH.
Analyt npos R R2 Medelavvikelse (%) npos >±10 % (%)
Risperidon 10 1,00 1,00 -12,6 50,0
9-OH-risperidon 17 0,994 0,988 -2,99 11,8
Haloperidol 10 0,996 0,992 -3,77 30,0
Olanzapin 31 0,997 0,993 2,85 6,45
Desmetylolanzapin 31 0,998 0,995 7,00 38,7
Mirtazapin 6 0,823 0,678 -21,2 100
Desmetylmirtazapin 6 0,983 0,967 6,03 16,7
Vortioxetin 0 - - - -
Karboxyvortioxetin 0 - - - -
Fluktuationer i kvantifieringen av mirtazapin ses även vid utvärdering av CV och noggrannhetsvärden. Mirtazapin uppvisade, tillsammans med desmetylolanzapin och 9-OH-risperidon, ett högt CV på kalibrator 1 (tabell Va, bilaga V) vilket eventuellt antyder vissa svårigheter för metoden att kvantifiera dessa analyter vid låga koncentrationer. Noggrannheten för HSS T3 MeOH kalibrator 1–5 (tabell
Figur 8. Korrelations- och Bland-Altman-analys för risperidon- (a och b) och mirtazapin- koncentrationer (c och d) erhållna med referensmetod och HSS T3 MeOH. Grå linje i korrelationsplot anger 100 % linjärt samband mellan båda metoder. Blå, streckade linjer i Bland-Altman-grafer utgör
±95 konfidensintervall, och grå streckade linjer ±10 % differens från referensmetodens värde. Tjock blå linje utgör medeldifferensen för ny metod.
Va, bilaga V) låg inom godkäntgränser för alla analyter exklusive mirtazapin (kalibrator 2) och vortioxetin (kalibrator 4).
Signal-till-brusförhållande och toppform
Signal-till-brus-förhållandet (S/N) utgör förhållandet mellan toppintensiteten för kalibrator 1 och medelintensiteten för bruset innan toppen. När analytens
intensitet understiger brusets medelintensitet uppstår svårigheter vid kvantifiering av analyten. Ett S/N ≥ 10 anses tillräckligt bra för att en topp ska kunna urskiljas väl från bakgrundsbruset, men lägre S/N kan accepteras beroende på analyskraven [11, 23]. Gemensamt för studiens tre MeOH-baserade metoder är ett S/N < 10 för flertalet analyter (tabell 9) men detta ses även hos ordinarie metod. Detta kan bland annat tyda på dålig avdunstning av mobilfas i jonkällan, vilket kan kompenseras med ett högre gasflöde eller högre temperatur [24].
Tabell 9. Signal-till-brus-förhållande för kalibrator 1 i varje körning och metod, där ”ref.” utgör referensmetod. Gulmarkerade värden ligger under 10 men över 5. Rödmarkerade värden < 5.
Analyt
Kinetex Biphenyl MeOH HSS T3 MeOH Luna Omega MeOH
Ref. MeOH Ref. HSS T3
MeOH Ref. LunaOmega MeOH
Risperidon 7,9 5,15 17,3 12,05 11,1 10,8
9-OH-risperidon 8,5 4,7 11,7 6 10,6 7,35
Haloperidol 1,6 9,1 6,1 11,4 6,5 8,85
Olanzapin 19,1 6,4 19,9 14,95 21,2 11,45
Desmetylolanzapin 4,2 5,15 6,4 7,95 5,5 2,95
Mirtazapin 5,1 1,95 4,5 6,1 5 2,4
Desmetylmirtazapin 7,1 4,05 8,2 10,35 10,3 8,55
Vortioxetin 44,8 18,8 57,1 35,95 62,3 33
Karboxyvortioxetin 14,5 14,5 29,1 23,45 31,7 31,85
För att utvärdera toppformen för respektive metod beräknades antalet teoretiska bottnar (N) för vardera analyt. Bottentalet utgör ett index för kolonnens
effektivitet och beräknas utifrån den kromatografiska toppens retentionstid och toppbredd. Ett högre bottental kan vanligen relateras till smalare toppar och effektivare separation [2]. Moderna, högpresterande HPLC- och UHPLC- kolonner uppvisar vanligen ett bottental mellan 104 – 105 bottnar men då
bottentalet även påverkas av kolonnlängden finns ingen övre gräns då längden på en kolonn i teorin alltid kan ökas [25]. Vid beräkning av N användes toppbredden vid 50% av topphöjden för att reducera inverkan av baslinjebrus och
toppasymmetri [25]. I tabell 10 (nedan) presenteras de genomsnittliga teoretiska bottentalen för samtliga tre metoder (inklusive referensmetod) för vardera analyt.
För samtliga analyter ses ett avsevärt högre bottental för referensmetoden vilket även stämmer överens med den generellt smala och symmetriska toppformen som observerades för varje analyt, medan HSS T3 MeOH generellt uppvisar ett högre bottental än Luna Omega MeOH. Kinetex Biphenyl MeOH uppvisade lägst bottental och högst toppbredd för samtliga analyter.
Tabell 10. Genomsnittligt teoretiskt bottental (N) samt toppbredd (min) vid 50% av topphöjden för vardera analyt i referensmetod, Kinetex Biphenyl MeOH, Luna Omega MeOH och HSS T3 MeOH. Värden markerade med ”*” utgör den största observerade toppbredden50% vid jämförelse av Luna Omega MeOH och HSS T3 MeOH.
Analyt Referensmetod
Kinetex Biphenyl MeOH
Luna Omega
MeOH HSS T3 MeOH
W50% N W50% N W50% N W50% N
Risperidon 0,009 23031 0,019 2977 0,0163 6751 0,0164* 9148 9-OH-risperidon 0,010 28891 0,019 4434 0,0157 6647 0,0162* 9662 Haloperidol 0,013 30931 0,020 4308 0,019* 10825 0,012 13631 Olanzapin 0,019 23016 0,035 1628 0,037* 3530 0,033 5458 Desmetylolanzapin 0,013 15107 0,027 2140 0,024* 4757 0,019 7709 Mirtazapin 0,015 36403 0,036 5626 0,032* 7566 0,025 11080 Desmetylmirtazapin 0,020 25865 0,034 4879 0,034* 6354 0,032 9325 Vortioxetin 0,014 134338 0,028 4720 0,019 21850 0,023* 36500 Karboxyvortioxetin 0,017 84847 0,025 12442 0,019 21139 0,023* 26261
Vissa begränsningar gällande användandet av antalet teoretiska bottnar för utvärdering av kolonneffektivitet bör dock tas i beaktning. Bottentalsteorin förutsätter att de toppar som analyseras antar en symmetrisk Gaussform – för assymetriska toppar med fronting eller tailing är metoden inte längre pålitlig eftersom antalet bottnar kan underskattas. Detta kan åtgärdas genom användning av toppbredd vid 50% eller 60,7% av topphöjden [4]. Till detta arbete beräknades därför bottentalet utifrån toppbredden vid 50% av topphöjden. Bottentalsteorin baseras dessutom på antagandet att det kromatografiska systemets förhållanden förblir konstanta under hela analysen, och att jämvikt (”equilibrium”) mellan stationär och mobilfas uppnåtts [2, 4] som vid isokratisk eluering. Vid gradienteluering eller temperaturförändringar över analysen kan jämvikt ej uppnås. Eftersom LCMS-2 utförs med gradienteluering är systemet i konstant förändring, varpå bottentalsteorin i själva verket inte är applicerbar [25]. Detta kan resultera i falskt höga bottental, särskilt för analyter med längre retentionstid.
I samtliga metoder eluerar vortioxetin sist, och uppvisar avsevärt högre bottental än resterande analyter inom vardera metod (tabell 10). För att få en bättre bild av skillnaden i toppbredd för vardera metod jämfördes istället toppbredden vid 50%
av topphöjden för varje analyt. Återigen sågs generellt smalare toppar vid referensmetod, men resultaten varierade därefter något mellan Luna Omega MeOH och HSS T3. Luna Omega MeOH uppvisade smalare genomsnittlig toppbredd50% på risperidon, 9-OH-risperidon, vortioxetin och karboxyvortioxetin, medan topparna för haloperidol, olanzapin, desmetylolanzapin, mirtazapin och desmetylmirtazapin var smalare med HSS T3 MeOH (tabell 10).
Flera faktorer i ett kromatografiskt system kan leda till ökad bandbredd, däribland mobilfaskomposition, packningstäthet och längd av kolonn, flödeshastigheten och kolonntemperatur [2]. Variationer i kolonnens packningstäthet och partikelstorlek påverkar analyternas diffusion genom kolonnen, s.k. Eddy diffusion, då de på så vis kan ta olika vägar mellan partiklarna i den stationära fasen. Ökad bandbredd kan på så vis orsakas av att samma analyt passerar den stationära fasen med olika hastighet, och därmed ge större variation i retentionstid för analyternas molekyler [2, 4]. Eddy diffusion ligger troligtvis inte bakom den generellt ökade
bandbredden som ses i Luna Omega MeOH och HSS T3 eftersom båda kolonner har lägre partikelstorlek än ordinarie kolonn (bilaga III tabell IIIa). Förutom Eddy diffusion påverkas bandbredden av longitudinell diffusion, d.v.s. analytens
diffusion inom mobilfasen längs kolonnen [26]. Denna påverkas huvudsakligen av flödeshastighet och mobilfasens diffusionskonstant (viskositet) och innebär att ju
längre analyten transporteras längs kolonnen desto större blir spridningen. Då MeOH generellt uppvisar högre viskositet än ACN är det rimligt att se viss bandbreddning eftersom ökad viskositet har negativ inverkan på
jämviktsinställningen mellan mobil och stationär fas i förhållande till flödeshastigheten i systemet. Kortare tid för jämviktsinställning innebär att analytmolekylärna lätt förflyttar sig mellan mobil och stationär fas, vilket
försvåras av högre viskositet i den mobila fasen. Tiden för jämviktsinställning kan dock påverkas av flertalet andra faktorer, däribland flödeshastighet, systemets temperatur, samt kolonnens partikelstorlek [4]. En ökad flödeshastighet kan eventuellt förbättra toppformen, men försvårar även möjligheten till jämvikt mellan faserna vilket rimligen kan leda till sämre separation mellan toppar [2]. En minskad flödeshastighet ökar däremot möjligheten för jämvikt mellan faserna eftersom analyterna rör sig långsammare genom systemet. En temperaturökning kan leda till lägre viskositet hos mobilfasen men leder inte nödvändigtvis till reducerad diffusion då en ökning i temperatur även ger ökad kinetisk energi hos partiklarna i mobil fas, och därmed ökad longitudinell diffusion [5]. Minskad partikelstorlek i den stationära fasen kan i sin tur förbättra flödet genom kolonnen samt förbättra jämvikten mellan mobil och stationär fas. Detta fenomen kan eventuellt förklara varför två UPLC-kolonner, med mindre partikelstorlek, uppvisade bäst resultat i kolonntesterna. För att minska den longitudinella diffusionen och minska tiden för jämviktsinställning mellan stationär och mobil fas bör framförallt flödeshastighet, temperatur och partikelstorlek i kolonn undersökas innan MeOH-baserade mobilfaser förkastas [4-5].
Metoddiskussion
Utifrån de avvikelser från godkännandekriterier och referensmetod som
presenterats ovan (tabell 5) kan varken HSS T3 MeOH eller Luna Omega MeOH införas så som de är utformade i nuläget. Trots svårigheter med kvantifiering av vissa analyter vid lägre koncentrationer, det låga signal-till-brusförhållandet och de generellt bredare topparna går det dock inte att utesluta att mer fördelaktiga förhållanden skulle kunna uppnås vid fortsatt optimering av såväl
vätskekromatografiska som masspektrometriska parametrar. Relevanta parametrar att undersöka är till exempel kolonntemperatur, temperatur (TEM) och gasflöde (GS2) i jonkälla för att underlätta avdunstning av metanol [24], eller
mobilfastillsatser så som ammoniak med MeOH-baserad mobilfas [22].
Fortsättningsvis kan matrixeffekter så som jonsuppression eventuellt störa joniseringsmekanismen för sameluerande analyter. Fenomenet associeras ofta till endogena föreningar i biologiska matriser, och i båda nyutvecklade metoder ses sameluering av olanzapin respektive mirtazapin och deras metaboliter, vilket kan ha en supprimerande effekt på joniseringen av analyterna i jonkällan [27].
Jonsuppression kan även orsakas av komponenter som återfinns i mobilfasen [11].
Det kan även vara värt att undersöka om mobilfastillsatser, så som ammoniumformat, kan öka signalintensiteten samt minska potentiellt förekommande jonsuppression [28-29].
Det bör noteras att de initiala metanoltesterna utfördes två veckor innan service av instrumentet - resultaten kan alltså ha påverkats av att instrumentet var i behov av service. Fortsatta tester med fler positiva serumprover måste utföras för att undersöka variationen mellan båda metoder närmare. Fortsättningsvis kan resultaten vid kolonntesterna ha påverkats av kolonnernas ålder och tidigare användning. Urvalet av kolonner som stod till förfogande begränsades till de som redan fanns tillgängliga på enheten. Vid framtida tester bör kolonnernas kemi, om
