DX CT/NG/MG AUTO ASSAY

(1)

1 [SE]

*

DX CT/NG/MG AUTO ASSAY

5 x 96 37015

1 x 96 37029

Direkt detektion av Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae och Mycoplasma genitalium med realtids-PCR

881151 - 2014/03

(2)

2 [SE]

Innehållsförteckning

1. AVSEDD ANVÄNDNING 2. ÖVERSIKT ÖVER TEST 3. TESTPRINCIPER 4. REAGENSER

5. VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER 6. PROVER

7. METOD

8. TESTBEGRÄNSNINGAR 9. FÖRVÄNTADE VÄRDEN 10. PRODUKTEGENSKAPER 11. BIBLIOGRAFISKA REFERENSER

(3)

3 [SE]

1. AVSEDD ANVÄNDNING

Dx CT/NG/MG Auto Assay är ett testpaket för in vitro-amplifiering av nukleinsyra som direkt kan detektera Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae och Mycoplasma genitalium i samma provrör med kliniska prover från individer med eller utan symptom. Dx CT/NG/MG Auto Assay är avsett för endocervikal-, vaginal- och analpinnprover¹ (män och kvinnor) tagna av kliniker, vaginalpinnprover¹ tagna av patient samt urinprover från män och kvinnor.

1 Tagna med kitet Dx Collection System 50-F (kat. nr 37012) eller ESwab™ collection kit (COPAN, cat.# 480 CE).

2. ÖVERSIKT ÖVER TEST

Chlamydia trachomatis är en obligat intracellulär parasitbakterie som orsakar den mest spridda sexuellt överförda infektionen i industriländerna. Ca 89 miljoner smittas varje år enligt WHO (1). Chlamydia trachomatis-infektioner ger oftast inga symptom hos varken män eller kvinnor och har allvarliga följder om de inte behandlas, t.ex. inflammationssjukdomar i bäckenet (PID), utomkvedshavandeskap, tubarinfertilitet (2) hos kvinnor eller icke-gonokock uretrit och epididymit hos män (3).

Tester med molekylär diagnostik är att föredra för detektion av Chlamydia trachomatis-infektioner, eftersom de har högre känslighet och är mer exakta i förhållande till andra metoder (4).

Neisseria gonorrhoeae är en icke-motil gramnegativ diplokockbakterie som orsakar ca 62 miljoner nya fall av gonorré varje år (1). Följderna liknar dem som orsakas av Chlamydia trachomatis, men ofta är symptomen allvarligare. Cellodling, som vanligtvis används för detektion av N. gonorrhoeae, är i hög grad beroende av korrekt provhantering och bakteriens viabilitet i provet.

Molekylärdiagnostiska test kan därför med fördel kombineras med konventionella tekniker för detektering av N. gonorrhoeae.

Mycoplasma genitalium är en liten bakterie som nyligen fastställdes vara en viktig orsaksagent för uretrit hos män och infektioner i de nedre genitalierna hos kvinnor. Symptom och mikroskopiska tecken liknar de som observerats hos Chlamydia trachomatis. M. genitalium-infektioner misstänks också kunna orsaka tubarinfertilitet hos kvinnor (5-13).

Tester med molekylär diagnostik är en metod som med fördel används för detektion av Mycoplasma genitalium, eftersom den är extremt svår att odla.

3. TESTPRINCIPER

Dx CT/NG/MG Auto Assay omfattar två huvudsteg: provberedning och amplifiering/detektering av mål-DNA med hjälp av realtids-PCR. Amplifieringsprodukterna detekteras med fluorescerande färger under PCR-körningen.

För varje prov extraheras, famplifieras och detekteras en intern kontroll systematiskt på samma sätt som mål-DNA, vilket ger kontroll av extraktionen och detektion av PCR-inhibition.

Provberedningen (DNA-extraktion) sker helt automatiskt med hjälp av Bio-Rad Dx Prep System och Dx Automated Extraction Assay (kat. nr 37016) eller NucliSens^® easyMAG^® system med motsvarande reagenser (bioMérieux).

Kitet Dx CT/NG/MG Auto Assay innehåller alla reagenser som behövs till amplifiering och detektering för 480 test.

Provberedning

Automatisk DNA-extraktion utförs på alla provtyper som anges i kapitlet ”Prover” med hjälp av Bio-Rad Dx Prep System och Dx Automated Extraction Assay (kat. nr 37016). Nukleinsyror fångas in av magnetiska kulor. Därefter tvättas de, elueras och överförs automatiskt till en Dx PCR plate med 96 brunnar.

En negativ kontroll utförs under hela provberedningen samtidigt med proverna.

Den interna kontrollen (C1) läggs till varje prov och den negativa kontrollen i början när provet förbereds.

NucliSENS^® easyMAG^® Provberedning

Automatisk DNA-extraktion utförs på alla provtyper som nämns i kapitlet "Prover" med hjälp av bioMérieux NucliSENS^® easyMAG^® system enligt bruksanvisningen.

En negativ kontroll utförs under hela provberedningen med proverna.

Den interna kontrollen (C1) läggs till varje prov och den negativa kontrollen i början av provberedningen.

PCR-amplifiering/-detektion i realtid

Bio-Rad Dx Prep System tillsätter automatiskt amplifieringshuvudblandningen i Dx PCR plate med 96 brunnar tillsammans med extraherat DNA.

Efter extraktion i NucliSENS^® easyMAG^® system fördelas extraherat DNA manuellt i 24-well Dx PCR Strips, och likaså huvudförstärkningsblandningen.

Vid PCR i realtid används specifika fluorescerande oligonukleotider för att detektera DNA under amplifieringen genom att hybridisera amplifieringsprodukterna. I Dx CT/NG/MG Auto Assay används fyra olika oligonukleotider:

• C. trachomatis-oligonukleotid, som matchar en krypten-plasmidsekvens; målsekvensen finns utanför området som tagits bort i den nya stammen i C. trachomatis (nvCT) som nyligen karakteriserats (14).

• N. gonorrhoeae-oligonukleotid, som matchar en sekvens ipilE-genen;

• M. genitalium-oligonukleotid, som matchar en sekvens i MgPa-genen.

• Detektionsoligonukleotid som fungerar som intern kontroll.

Om inget mål-DNA finns för en viss oligonukleotid, avges ingen fluorescens och ingen signal detekteras. När det finns mål-DNA ökar fluorescensen vid varje steg av amplifieringen. Under varje PCR-cykel, i hybridiseringssteget, mäter den optiska modulen i Dx Real-Time System fluorescensen från varje fluorofor. Dx Real-Time Software jämför ljusintensiteten med antalet cykler. Till sist analyserar Dx Real-Time Software automatiskt resultaten av alla prover och kontroller.

(4)

4 [SE]

4. REAGENSER 4.1. Beskrivning

Det finns tillräckligt många reagenser i kitet för att kunna utföra 480 tester (kat. nr 37015) eller 96 test (kat. nr 37029). Alla reagenser är enbart avsedda för in vitro-diagnostik.

Etikett Reagens Förpackning

37015 (480 test) Förpackning 37029 (96 test) R1 Amplification

Mix Koncentrerad amplifieringsblandning, 10X: DNA- polymeras i en PCR-buffert som innehåller primer, fluorescerande oligonukleotider, dNTP och MgCl2.

Konserveringsmedel: 0,05 % natriumazid.

10 x 150 μl För utspädning genom tillsats av

R2

2 x 150 μl För utspädning genom tillsats av

R2 R2 Amplification

Mix Diluent

Utspädningsmedel för amplifieringsblandning:

PCR-buffert med MgCl2. Konserveringsmedel: 0,05 % natriumazid.

10 x 900 μl

Färdig att använda 2 x 900 μl Färdig att använda C1 Internal Control Intern kontroll: Icke-infekterande DNA i en

buffertlösning. Konserveringsmedel: 0,03 % ProClin™

300.

5 x 1300 μl

Färdig att använda 1 x 1300 μl Färdig att använda C2 Negative

Control Negativ kontroll: TE-buffert.

Konserveringsmedel: 0,03 % ProClin™ 300. 10 x 1100 μl

Färdig att använda 2 x 1100 μl Färdig att använda C3 Positive Control Positiv kontroll för CT, NG, MG: Icke-infekterande

DNA från CT, NG och MG i en buffertlösning. Gul färg.

Konserveringsmedel: 0,03 % ProClin™ 300.

5 x 100 μl

Färdig att använda 1 x 100 μl Färdig att använda

4.2. Förvaring och hantering

Kitet måste förvaras vid en temperatur på 2–8 °C. Då kan reagenserna i Dx CT/NG/MG Auto Assay användas till bäst före- datumet på etiketten.

Identifiering Förvaring efter öppning C2 (Negativ kontroll) 15 dagar vid 2–8 °C. Varje vial kan användas två gånger.

Kassera reagensen om den kontaminerats.

C3 (Positiv kontroll) 1 månad vid 2–8 °C. Varje vial kan användas upp till 4 gånger.

Kassera reagensen om den kontaminerats.

R1+R2 (rekonstituerad blandning)

4 timmar vid 18–30 °C eller 16 timmar vid 2–8°C eller 2 veckor vid -20 °C. I fruset skick kan den rekonstituerade blandningen tinas endast en gång.

Dx Prep System extraktion

C1 + bindningsbuffert 1 månad vid 2–8 °C. Kassera reagensen om den kontaminerats.

Bindningsbufferten ingår i Dx Automated Extraction Assay (ref. 37016).

NucliSENS^® easyMAG^® system extraktion

Premix C1 + Kiseldioxid 14 dagar vid 2-8°C. Om någon av dessa reagenser kontamineras ska den kasseras..

Kiseldioxidet är en del av NucliSENS^® easyMAG^®- reagesen.

5. VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER Endast för in vitro-diagnostiskt bruk.

5.1. Försiktighetsåtgärder för hälsa och säkerhet

• Använd engångshandskar, laboratorierock och skyddsglasögon när du hanterar reagenser och prover.

• Tvätta händerna noga när du hanterat reagenser och prover. Det är inte tillåtet att äta, dricka eller röka i arbetsområdet.

• Hantera alla prover som om de kan smitta enligt rutiner för god laboratoriesed.

• Hantering och kassering av kemiska produkter ska genomföras enligt rutiner för god laboratoriesed.

• Ett säkerhetsdatablad kan fås av din lokala Bio-Rad-försäljare.

5.2. Försiktighetsåtgärder i samband med förfarandet

• Det här paketet får endast användas tillsammans med DxReal-Time System(Bio-Rad) och Dx Real-Time Software.

• Automatisk DNA-extraktion måste genomföras antingen med kitet Dx Automated Extraction Assay (Bio-Rad, kat. nr 37016) i Dx Prep System (Bio-Rad) eller i NucliSENS^® easyMAG^® system med motsvarande reagenser.

• Använd endast Dx Collection System 50-F för endocervikal- vaginal- och analpinnprover tagna av kliniker samt vaginalpinnprover tagna av patient(Bio-Rad, kat. nr 37012) eller ESwab™.. Systemet får inte användas hemma.

• Använd rena behållare av polypropylen utan konserveringsmedel för prover av den första urinen. Prover från den första urinen måste överföras till ett Dx Transfer System-rör (Bio-Rad, kat. nr 37014) om provet ska kunna laddas i Dx Prep System.

Om DNA-extraktion utförs i NucliSENS^® easyMAG^®-systemet, laddas prover (urin eller Dx Collection System 50-F ellerr ESwab™.) direkt i "skytteln".

• Använd inte Dx Collection System 50-Fom förpackningen är skadad eller om det läckt från röret. Kassera oanvända eller läckande system enligt rutiner för god laboratoriesed.

(5)

5 [SE]

• Om laboratoriet tar emot ett pinnprov som inte tagits och transporterats med Dx Collection System 50-F eller ESwab™ eller ett provrör som inte innehåller något eller två pinnprover får inte provet användas.

• Använd inte utgångna reagenser.

• Blanda inte reagenser från paket med olika partinummer.

• Ändra inte testförfarandet.

• Undvik korskontaminering i de steg där prover hanteras: Se till att provbehållarna inte kommer i kontakt med varandra; om handskarna kommer i kontakt med prover ska de genast slängas.

• Rekonstituera noggrant förstärkningsblandningen och undvik all kontaminering.

• Kontrollera noggrannheten för pipetterna och annan utrustning och att de fungerar korrekt.

• Undvik att spilla prover eller lösningar som innehåller prover. Spill måste sköljas med blekmedel som spätts till 10 %.

Materialet som används för rengöring måste kastas i en behållare för smittfarligt avfall.

• Arbetsytor, pipetter och annan utrustning måste dekontamineras regelbundet med blekmedel som spätts till 1 %.

6. PROVER

6.1. Pinnprover som insamlats med Bio-Rad Dx Collection System 50-F

Dx CT/NG/MG Auto Assay används för endocervikal- vaginal- och analpinnprover (män och kvinnor) tagna av kliniker, vaginalpinnprover tagna av patient.

Prover får endast insamlas och transporteras med Dx Collection System 50-F eller ESwab™.. Mer information om insamling och transport av prover finns i bipacksedeln till Dx Collection System 50-F(Bio-Rad, kat. nr 37012) eller bipacksedeln till ESwab™.

Endast Dx Collection System 50-F eller ESwab™, kan användas med Dx CT/NG/MG Auto Assay.

Ett transportrör som innehåller en pinne som inte kommer från Bio-Rad, flera pinnar eller ingen pinne kan inte användas med Dx CT/NG/MG Auto Assay.

Blod, sperma och vaginalbehandlingar kan påverka PCR-reaktionen. För mer information om störande substanser, se kapitlet

”Produktegenskaper”.

Pinnprover kan sparas i 28 dagar vid en temperatur på 18–30 °C. Prover som insamlas med ESwab™ ska bearbetas inom 5 dagar vid förvaring i rumstemperatur(18-30°C), 7 dagar vid 2-8°C, och 2 månader vid -20°C.

6.2. Urinprover

Dx CT/NG/MG Auto Assay kan användas för urinprover från män och kvinnor med och utan symptom.

OBSERVERA! Patienten får inte ha urinerat minst en timme innan provet tas.

1. Samla 10–20 ml av den första urinen i en ren behållare av polypropylen som inte innehåller konserveringsmedel.

2. Stäng behållaren och märk den med patientuppgifterna och datum/tid.

3. Transportera proverna till testanläggningen i rumstemperatur (18–30 °C). Urinprover är stabila i 24 timmar vid rumstemperatur. Om provet inte kan analyseras inom 24 timmar ska det förvaras vid en temperatur på 2–8 °C och analyseras inom 14 dagar.

4. Urinprover som analyseras på externa testanläggningar måste transporteras dit inom 24 timmar. Om proverna ska transporteras i rumstemperatur ska de förvaras vid en temperatur på 2–8 °C innan de transporteras och när de kommer fram. De får inte förvaras i rumstemperatur längre än sammanlagt 24 timmar.

5. Om stegen för DNA-extraktion utförs i Dx Prep System, ska 3 ml av varje urinprov överföras till ett Dx Transfer System-rör (Bio-Rad kat. nr 37014). Röret kommer att laddas i Dx Prep System. Om extraheringen utförs i NucliSENS^® easyMAG^® system ska provet laddas direkt från behållaren till "skytteln".

Efter insamlingen kan urinproverna förvaras i upp till 14 dagar vid 2–8 °C eller upp till 60 dagar vid -20 °C. Efter infrysning kan urinproverna tinas högst två gånger.

7. METOD

Följ dessa instruktioner noggrant och tillämpa rutiner för god laboratoriesed.

7.1. Nödvändigt material 7.1.1. Material som ingår

• Dx CT/NG/MG Auto Assay 480 tester (Bio-Rad, kat. nr 37015, endast för användning vid extraktion i Dx Prep System) ) eller 96 tester (Bio-Rad, kat nr 37029 för användning både vid extraktion i Dx Prep System och NucliSENS^® easyMAG^®- systemet.

7.1.2. Nödvändigt material som bifogas separat För Dx Prep System extraktion

• Dx Prep System med tillbehör (Bio-Rad, kat.nr 94500)

• Dx Automated Extraction Assay (Bio-Rad, kat.nr 37016)

• Dx Real-Time System med tillbehör (Bio-Rad, paket kat.nr 94000)

• Dx Strip Cap Tool (medföljer i paketet med Dx Real-Time System, Bio-Rad kat.nr 94000)

• Dx Collection System 50-F (Bio-Rad, kat.nr 37012) för tagning och transport av pinnprover från kvinnor och anala pinnprover eller ESwab™.

• Dx Transfer System (Bio-Rad, kat. nr 37014) för överföring av prover från den första urinen.

• Capture Cap Set (Bio-Rad, kat. nr 37017) för försegling av provrör efter användning.

(6)

6 [SE]

• Dx PCR Plates & caps (Bio-Rad, kat.nr 94023)

• Dx Processeringsplatta (kat.nr. 94534)

• Dx Elueringsplatta (kat.nr. 94022)

• Dx Prep filter tips 1100 µl (kat.nr. 94531)

• Dx Prep Filter tips 300 µl (kat.nr. 94532)

• Dx Prep Filter tips 50µl (kat.nr. 94533)

För NucliSENS^® easyMAG^® system extraktion

• Dx Real-Time System med tillbehör (Bio-Rad, paket kat.nr 94000)

• Dx Strip Cap Tool (ingår i paketet med Dx Real-Time System, Bio-Rad kat. nr 94000)

• Dx Collection System 50-F (Bio-Rad, kat.nr 37012) för tagning och transport av pinnprover från kvinnor och anala pinnprover eller ESwab™.

• Capture Cap Set (Bio-Rad, kat. nr 37017) för försegling av provrör efter användning Dx 24-well PCR Strips och Caps (kat. nr 94020)

7.1.3. Nödvändigt material som inte medföljer För Dx Prep System extraktion

• Rena behållare av polypropylen utan konserveringsmedel för urin

• Vortexmixer

• Kalibrerade pipetter för 1 000–1 200 µl

• Sterila pipettspetsar med filter

• Engångshandskar utan puder

För NucliSENS^® easyMAG^® system extraktion

• Rena behållare av polypropylen utan konserveringsmedel för urin

• NucliSENS^® easyMAG^®, reagenser och tillbehör från bioMérieux: EasyMAG extraheringsbuffert 1, 2 och 3 (kat. nr 280130, 280131, 280132), EasyMAG magnetisk kisel (kat. nr 280133), EasyMAG lyseringsbuffert (kat. nr

280134) och EasyMAG engångsartiklar (kat. nr 280135).

• Vortexmixer

• Bordscentrifug

• 1,5-2 ml rör (för C1+ kiselblandning)

• Inställningsbara mikropipetter (P 200 µl och 1 000 µl), kalibrerade

• Flerkanalig pipett (P 10 µl), kalibrerad

• Sterila pipettspetsar med filter

• Doseringspipett med sterila, separat förpackade 1,25 ml-spetsar

• Engångshandskar utan puder

7.2. Reagensberedning För Dx Prep System extraktion:

1. Ta en flaska med bindningsbuffert (BB) från Dx Automated Extraction Assay och en vial med intern kontroll (C1) från Dx CT/NG/MG Auto Assay.

2. Tillsätt 1 200 µl intern kontroll (C1) till flaskan med bindningsbuffert (BB) och blanda försiktigt genom att vända.

3. Spara den tomma vialen med intern kontroll (C1). Den kommer att laddas i Dx Prep System.

Blandningen ”Bindningsbuffert + intern kontroll” är stabil i en månad vid 2–8 °C.

För NucliSENS^® easyMAG^® system extraktion

Under provlysfasen i NucliSENS^® easyMAG^® system blandas den interna kontrollen (C1) med kisel i enlighet med följande volymer.

Vortexa kort efter beredning.

1 test 12 tester 23tester

Kisel Volym 50µl 600µl 1200µl

C1 Volym 10µl 120µl 240µl

Obs! Alternativt så är det möjligt att lägga till 50 µl kisel och 10 µl C1 i varje individuell extraheringsbrunn i NucliSENS^® easyMAG^® - skytteln.

Rekonstituering av amplifieringsblandning

Före rekonstitueringen ska vialerna R1 (koncentrerad amplifieringsblandning, 10X) och R2 (utspädningsmedel för amplifieringsblandning) vortexblandas i 5 sekunder och sedan centrifugeras i 15 sekunder.

Tillsätt 867 µl utspädningsmedel för amplifieringsblandning (R2) i en vial med koncentrerad amplifieringsblandning (R1).

Vortexblanda i 15 sekunder och centrifugera sedan kort.

En vial med rekonstituerad amplifieringsblandning (R1+R2) räcker till 48 PCR-reaktioner i realtid. Förbered så många vialer med rekonstituerad amplifieringsblandning (R1+R2) som behövs (t.ex. 2 vialer om 96 tester ska bearbetas).

Den rekonstituerade amplifieringsblandningen (R1+R2) kan användas direkt eller delas upp i alikvoter och förvaras i -20 °C i upp till 2 veckor.

(7)

7 [SE]

7.3. Prövningsprocedur med Dx Prep System

7.3.1. Automatisk DNA-extraktion och PCR-förberedelse

Slå på Dx Prep System och sedan datorn. Se till att frontluckan på Dx Prep System är stängd.

1. Dx Prep Software startar automatiskt. Ange användarnamn och lösenord i fönstret ”Login”.

2. Ladda instrumentet genom att öppna metallfliken på Dx Prep System.

3. Ladda proverna:

Obs! Se till att provvolymen i transportröret är minst 1 ml innan proverna laddas.

a. Vortexblanda varje provrör.

b. Samla dropparna genom att försiktigt knacka rören mot bänken.

c. Förprover insamlade med Dx Collection System 50-F, öppna provröret och slang korken samt pinnen och placera röret i Dx Prep Sample Racks.

Förprover insamlade med ESwab™, späd provet (1/5) med ESwab™ medium. Exempel: pipettera 250 μl prov

Insamlat med ESwab™ (första ESwab™ provröret) och späd I ett nytt ESwab™ rör. Mixa röret, släng korken och placera i ett Dx Prep Sample Rack.

a. Ladda Dx Prep Sample Racks i Dx Prep System i enlighet med indikationerna på instrumentet (blinkande lampor).

b. Om ett Dx Prep Sample Rack inte är fullt så bekräftar du det genom att markera den i Dx Prep Software och sedan klicka på knappen ”Confirm rack”.

Obs! Undvik att ladda fler än 94 prover per körning, eftersom Dx CT/NG/MG Auto Assay kräver att en negativ och en positiv kontroll finns i varje körning.

4. Klicka på knapparna ”Extraction” och sedan på ”Defining test orders” i Dx Prep Software.

5. Välj ”STD” i listan ”Analyte group(s)”.

6. Se till att testuppgifterna är korrekta för alla prover.

7. Klicka på knappen ”Defining the Run”.

8. Välj ”STD” i listorna ”Extraction” och ”PCR setup”.

Obs! Det går också att utföra endast extraktion utan PCR-förberedelse. Om endast extraktion utförs, så kan de eluerade proverna i elueringsplattan förvaras i upp till 16 timmar vid rumstemperatur eller upp till 4 dagar vid 2–8 °C.

Mer information finns i bruksanvisningen för Dx Prep System.

9. Klicka på knappen ”Loading Plates”.

10. Dra ut plattlådan och ladda Dx Processing Plate, Dx Elution Plate och Dx PCR Plate i Dx Prep System i enlighet med indikationerna i Dx Prep Software.

11. Stäng plattlådan. Dx Prep System läser automatiskt av streckkoderna på plattorna.

12. Klicka på knappen ”Loading Reagents”.

13. Ta en uppsättning Dx Automated Extraction Assay-reagenser (magnetiska kulor, proteinas K, tvättbuffert och elueringsbuffert).

Obs! Det går också att ladda två uppsättningar reagenser (exempelvis en redan öppnad uppsättning och en ny). Mer information finns i bruksanvisningen för Dx Prep System.

14. Vortexblanda MB-flaskan i 5 sekunder. Blanda vialerna med PK, WB och EB försiktigt genom att vända.

15. Placera uppsättningen med Dx Automated Extraction Assay-reagenser och den tomma vialen med intern kontroll (C1) på Dx Prep Extraction Rack i Dx Prep System i enlighet med bruksanvisningen för Dx Prep System.

16. Ladda Dx Prep Extraction Rack i Dx Prep System i enlighet med indikationerna på instrumentet (blinkande lampor).

17. Om racket inte är fullt så bekräftar du det genom att markera den i Dx Prep Software och sedan klicka på knappen ”Confirm rack”.

18. Om loten där Dx Automated Extraction Assay- eller Dx CT/NG/MG Auto Assay-kitet ingår används för första gången klickar du på knappen ”Kit Lot Input”. Ange därefter lotinformationen genom att läsa av tillhörande lotkort med streckkodsläsaren.

Mer information finns i bruksanvisningen för Dx Prep System.

19. Vortexblanda vialerna med negativ kontroll (C2) och positiv kontroll (C3). Centrifugera därefter hastigt.

20. Placera vialerna med negativ kontroll (C2), positiv kontroll (C3) och rekonstituerad amplifieringsblandning (R1+R2) på Dx Prep PCR rack i Dx Prep System i enlighet med bruksanvisningen för Dx Prep System.

21. Ladda Dx Prep PCR Rack i Dx Prep System i enlighet med indikationerna på instrumentet (blinkande lampor).

22. Om racket inte är fullt så bekräftar du det genom att markera den i Dx Prep Software och sedan klicka på knappen ”Confirm rack”.

23. Klicka på knappen ”Loading Tips”.

24. Dra ut spetslådan och ladda spetsbrickorna om det behövs. Om det inte finns tillräckligt med spetsar klickar du på ”Show loading selection” och fyller på spetsar enligt förslaget som visas i Dx Prep Software. Klicka sedan på ”Accept suggestion”.

Stäng spetslådan.

Obs! Det finns spetsar i 3 olika storlekar: 50 µl (gul låda), 300 µl (brun låda) och 1 100 µl (grå låda). Se till att den lådtyp som laddas är densamma som anges i Dx Prep software. Du måste validera alla ändringar av förslaget genom att klicka på motsvarande plats i Dx Prep Software. Ange sedan spetsstorlek och antalet spetsar i lådan.

25. I Dx Prep Software visas nivån av fast och flytande avfall:

a. Om nivån av fast avfall är för hög visas meddelandet ”Failed”. Byt behållaren mot en ny och klicka på knappen ”Change bin”.

(8)

8 [SE]

b. Om nivån av flytande avfall är för hög visas meddelandet ”Failed”. Töm behållaren enligt god laboratoriesed, sätt tillbaka den och klicka på knappen ”Empty waste”.

26. Klicka på knappen ”Final Check”.

27. Om laddningen är korrekt så visar Dx Prep Software meddelandet ”Passed” i fönstret ”Run Status”.

28. Stäng metallfliken och klicka på knappen ”Run Status”.

29. Klicka på knappen ”Start run”.

Obs! Öppna aldrig frontluckan till Dx Prep System under en pågående körning. Metallfliken får ENDAST öppnas när knappen ”Unload samples” blir aktiv i Dx Prep Software, och bara under en begränsad tid. Mer information finns i bruksanvisningen för Dx Prep System.

30. Öppna metallfliken på Dx Prep System efter avslutad körning och dra ut plattlådan.

31. Ta ut Dx PCR Plate från Dx Prep System. Ställ den på bänken och placera Dx 8-Cap Strips på Dx PCR Plate.

Obs! Om den sista kolumnen på Dx PCR Plate är tom så sätter du dit propparna ändå, så att det uppvärmda locket till Dx Real-Time System kommer i balans.

32. Fortsätt med PCR-förstärkning/detektering i realtid (se 8.3) inom 30 minuter efter preparering av Dx PCR Plate.

33. Ta bort proverna från Dx Prep System: ta bort provracken, förslut provrören med nya proppar (Capture Cap Set, Bio-Rad, kat. nr 37017) och förvara eller kassera dem enligt god laboratoriesed.

34. Ta ut Dx Prep Extraction och PCR racks, förslut varje reagens med tillhörande propp och förvara dem vid 2–8 °C utom den rekonstituerade förstärkningsblandningen som måste förvaras vid -20 °C. Kassera tomma flaskor och vialer i enlighet med god laboratoriesed.

Ta ut och kassera Dx Processing Plate i enlighet med god laboratoriesed. Vid behov kan Dx Elution Plateförvaras i upp till 16 timmar vid rumstemperatur eller upp till 4 dagar vid 2–8 °C. Kassera den i annat fall enligt god laboratoriesed.

7.3.2. PCR-förstärkning/-detektion i realtid

Mer detaljerade anvisningar finns i bruksanvisningen för Dx Real-Time System.

1. Slå på datorn och sedan Dx Real-Time System. Öppna Dx Real-Time Software.

Ange ditt användarnamn

2. Klicka på knappen ”Run” till vänster. I fönstret ”Run” klickar du på ”Open Lid”.

3. Ladda Dx PCR Plate i Dx Real-Time System och använd Dx Strip Cap Tool för att säkra Dx 8-Cap Strips på den laddade Dx PCR Plate. Dx Real-Time Software identifierar automatiskt Dx PCR Plate och importerar plattkartan från Dx Prep System.

4. Klicka på knappen ”Close lid” och sedan på knappen ”Start run”.

5. När realtids-PCR-reaktionen är klar tar du bort Dx PCR Plate från Dx Real-Time System, placerar den i en förslutningsbar plastpåse och kasserar den i enlighet med god laboratoriesed.

6. Klicka på "Results" (Resultat) för att få en översikt över resultaten

7.4 Prövningsprocedur med NucliSENS^® easyMAG^® system 7.4.1 NucliSENS^® easyMAG^® extraktion

Systemberedning

- Slå först på NucliSENS^® easyMAG^® system, och därefter datorn.

- När NucliSENS^® easyMAG^® system lyser grönt anger du användarnamn och lösenord.

- Klicka på "Instrument" i huvudmenyn, undermenyn visas automatiskt.

Skanna först streckkoden på etiketten för en position och därefter reagensens streckkod. Upprepa detta för alla reagenser.

OBS! Kontrollera att vialerna på reagenslocken är rena (inga kristaller). Rengör vid behov med vatten eller etanol.

Definiera extraheringsbeställningar

- Klicka på « Routine » (Rutin) i huvudmenyn så visas undermenyn « define extraction orders» (definiera extraheringsbeställningar) automatiskt.

- Skapa en lista av prover genom att välja följande inställningar:

-Protocole (Protokoll): Generic 2.0 -Matrix: other (övrig)

- Sample volume (provvolym): 0,500 ml för tagning av medium och 1 ml för urin för Dx Collection System, 0.350 ml för Eswab™

Prover.

-Elution volume (elueringsvolym): 60 µl -Type: primary (Typ: primär)

- Ange prov-ID för varje prov

- Klicka på "ENTER" på tangentbordet

Skapa en arbetslista för extraktion

- I huvudmenyn « Routine» (Rutin), klicka på knappen "dubbel grön pil" och därefter på "sol"-ikonen för att skapa en körning.

- ange namnen på arbetslistan för extrahering och validera det arbetsflöde som föreslås som standard.

- klicka på "OK"

- Överför prover från extraheringsbeställningarna till arbetslistan genom att klicka på ">>>".

Ladda prover

Fördela 500 µl negativ kontroll (C2) och prover i skytteln (500 μl för Dx Collection System 50-F-prover, 350 μl för ESwab™- prover och 1 ml för urin).

(9)

9 [SE]

-

Klicka på "skyttel"-knappen.

-

Ladda skytteln och skanna först streckkodspositionen och därefter skyttelns streckkod

-

För in pipetteringskammen och kontrollera på skärmen att kammen är korrekt placerad (grönt ljus)

Obs! För tillvalet spårbarhet, i undermenyn "barcode registration" (streckkodsregistrering) - på skärmens vänstra del:

1. klicka på knappen "tube" (rör) och ange streckkoden för den interna kontrollen, 2. klicka därefter på knappen "bead" (sikta) och skanna den magnetiska kiselns streckkod.

Lyserings- och extraheringsprocess

-

Klicka på ikonen "lysis buffer distribution" (distribution av lyseringsbuffert) på skärmens högra del (lyseringsläget inläst)

-

Förbered förblandningen kisel + intern kontroll under lyseringen genom att tillföra 120 µl intern kontroll (C1) i röret med 600 µl kisel

-

När lyseringen är avslutad tillförs 60 µl av förblandningen till alla brunnar (blanda förblandningen igen innan pipettering)

-

Blanda med BIOHIT multipipett

-

Klicka på “grön pil”-knappen för att starta extraheringsfasen

-

När körningen är avslutad ska de extraherade proverna (eluat) föras över från skytteln till rör eller bricka.. Extraherade prover kan förvaras i upp till 16 timmar i rumstemperatur eller i 4 dagar vid 2-8 °C.

7.4.2 Beredning av PCR-brickor

1. Rekonstituera så många vialer med förstärkningsblandning som behövs enligt beskrivningen i kapitel 7-2 (testantal = n prover + 1 positiv kontroll + 1 negativ kontroll).

2. Placera så många Dx 24-Well PCR Strips på en hållare och fördela 20 µl rekonstituerad förstärkningsblandning (R1+R2) noggrant i varje brunn med doseringspipetten.

3. Tillsätt 5 µl extraherat DNA eller extraherad negativ kontroll eller icke-extraherad positiv kontroll (C3) i respektive brunnar;

följ plattkartan.

4. Placera Dx 8-Cap Strips på Dx 24-Well PCR Strips och stäng dem ordentligt.

5. Centrifugera Dx 24-Well PCR Strips i 30 sekunder vid 400 g så att alla bubblor försvinner i brunnarna.

7.4.3.PCR-förstärkning/-detektion i realtid

Mer detaljerade anvisningar finns i bruksanvisningen för Dx Real-Time System.

1. Slå på datorn och sedan Dx Real-Time System. Öppna Dx Real-Time Software.

Ange ditt användarnamn.

Klicka på "Setup" (Ställa in)

Klicka på "create a new plate" (skapa en ny platta) och välj PCR kitnamn i "PCR kit". Kontakta din lokala support för mer information om PCR kitnamn.

Obs! Det är också möjligt att importera testbeställningar till Dx Real-Time-programmet. Kontakta din lokala support för mer information

2. Klicka på knappen "Run" (Kör) och därefter på "Open Lid" (Öppna lock).

3. Ladda 24-well Dx PCR Strips i Dx Real-Time System och använd Dx Strip Cap Tool för att placera Dx 8-Cap Strips på den laddade 24-well Dx PCR Strips.

4. Klicka på knappen ”Close lid” (Stäng lock) och sedan på knappen ”Start run” (Starta körning).

5. När realtids-PCR-reaktionen är klar tar du bort 24-well Dx PCR Strips från Dx Real-Time System, placerar den i en förslutningsbar plastpåse och kasserar den i enlighet med god laboratoriepraxis

6. Klicka på "Results" (Resultat) för att få en översikt över resultaten

7.5. Kalibrering

Under varje PCR-cykel, i hybridiseringssteget, mäter den optiska modulen i Dx Real-Time System fluoroscensen från varje fluorofor, och Dx Real-Time Software jämför fluoroscensintensiteten med antalet cykler. Till sist analyserar programmet automatiskt resultaten av alla prover och kontroller.

Dx Real-Time Software använder en egenutvecklad matematisk algoritm för att fastställa värden av matematiska parametrar (bl.a. Ceep och Cmin) för varje PCR-kurva. Dessa visas i kalkylbladet med resultat.

Cmin beräknas med en statistisk metod och motsvarar den senaste (hela) cykeln av bakgrundsfasen. Trenden hos bakgrundsfasen subtraheras därefter från hela amplifieringskurvan innan beräkningen av Ceep inleds.

Beräkningen av Ceep baseras på antagandet att PCR-reaktionens effektivitetskvot är som störst i början av reaktionen och minskar efter ett antal cykler, som varierar från ett prov till ett annat. Ceep-värdet (Ceep = cykel i slutet av exponeringsfasen) motsvarar cykeln då PCR-effektiviteten börjar minska. Ceep ligger vanligen några cykler efter Cmin. Ceep-värdet beror på både det ursprungliga antalet kopior och PCR-reaktionens effektivitetskvot. Vid idealiska PCR-förhållanden (inga reaktionsinhibitorer, hög effektivitet) så är Ceep-värdet omvänt proportionellt mot logaritmen av antalet kopior av målsekvensen i provet innan amplifieringen. Ju högre Ceep-värde desto lägre antal ursprungliga kopior.

I Dx CT/NG/MG Auto Assay baseras analysen av resultaten på Ceep-värden.

(10)

10 [SE]

7.6. Kvalitetskontroll

Positiva och negativa kontroller

En negativ och en positiv kontroll måste finnas med i varje analysomgång för att eventuella fel i provbearbetningen, amplifieringen eller detektionen ska kunna upptäckas.

Om Ceep-värdena för kontrollerna ligger utanför de förväntade värdena, ogiltigförklarar Dx Real-Time Software hela analysen och visar en av följande flaggor:

* Negativ kontroll: :

Flagga Innebörd - Invalid_IC : Ogiltig intern kontroll

- CT_conta : kontaminering av CT DNA - NG_conta : kontaminering av NG DNA - MG_conta : kontaminering av MG DNA - CTNG_conta : kontaminering av CT och NG DNA - CTMG_conta : kontaminering av CT och MG DNA - NGMG_conta : kontaminering av NG och MG DNA - CTNGMG_conta : kontaminering av CT, NG och MG DNA

* Positiv kontroll:

Flagga Innebörd - CT_out : CT-värde ej inom tillåtet intervall - NG_out : NG-värde ej inom tillåtet intervall - MG_out : MG-värde ej inom tillåtet intervall

- CTNG_out : CT- och NG-värden ej inom tillåtet intervall - CTMG_out : CT- och MG-värden ej inom tillåtet intervall - NGMG_out : NG- och MG-värden ej inom tillåtet intervall - CTNGMG_out : CT-, NG- och MG-värden ej inom tillåtet intervall

Alla prover och kontroller i analysen måste köras om från DNA-extraheringen.

Upptäckt av hämmare: Intern kontroll

Den interna kontrollen läggs till varje prov och den negativa kontrollen i början av DNA-extraheringen och detekteras med en specifik oligonukleotid under PCR-reaktionen.

Prover där den interna kontrollens Ceep-värde ligger över det förväntade värdet (kan då vara hämmat) tolkas av Dx Real-Time Software enligt följande:

• Prover med Ceep-värde <48 för ett mål (CT, NG eller MG) rapporteras som ”positive” för målet.

• Prover utan Ceep-värde eller med Ceep-värde >48 för ett mål rapporteras som ”failed” för målet.

Alla prover som har ett misslyckat resultat för målet måste köras om från DNA-extraheringen.

7.7. Testvalideringsvillkor Analysen är giltig när:

• Den positiva kontrollens Ceep-värde ligger inom det förväntade intervallet för de tre målen CT, NG och MG, och

• Den negativa kontrollen inte har något Ceep-värde eller ett Ceep-värde >48 för de tre målen CT, NG och MG

Om analysen är giltig, anger Dx Real-Time Software bearbetningsstatusen som ”Passed”. I annat fall anger Dx Real-Time Software bearbetningsstatusen som ”Failed”

Om bearbetningsstatusen är ”Failed” anges alla testresultat i bearbetningen som ”Invalid”, och alla prover och kontroller måste köras om från DNA-extraheringen.

7.8. Beräkning/utvärdering av resultaten

Dx Real-Time Software beräknar automatiskt resultaten och Ceep-värdena för CT, NG och MG och för den interna kontrollen i prover och kontroller.

Om testet är godkänt anges prover (hämmade eller inte) med ett Ceep-värde <48 för ett mål (CT, NG eller MG) som ”positive”

av Dx Real-Time Software. Om till exempel ett prov är positivt för CT är den rapporterade statusen ”CT_POS”.

Om testet är godkänt, så kommer prover som inte är hämmade och som saknar Ceep-värde (eller har ett värde >48) för ett mål (CT, NG eller MG) att anges som ”negative” av Dx Real-Time Software. Om till exempel ett prov är negativt för CT är den rapporterade statusen ”CT_neg”.

Om testet är godkänt så kommer prover som är hämmade och som saknar Ceep-värde eller har ett Ceep-värde >48 för ett mål (CT, NG eller MG) att anges som ”failed” av Dx Real-Time Software, som sedan rapporterar statusen ”Failed” med flaggan

”Invalid_IC”. Provet måste analyseras om från DNA-extraheringen.

OBS! Om ett hämmat prov är ett urinprov bör det frysas över natten i -20 °C innan det bearbetas igen eftersom eventuella hämmare då försvinner.

Om provet fortfarande är hämmat ska ett nytt prov tas och testas.

(11)

11 [SE]

8. TESTBEGRÄNSNINGAR

• Hur bra testet lyckas beror på kvaliteten på proverna. Följ därför alla instruktioner i kapitlet ”Prover”.

• Analysera endast angivna provtyper. Andra typer av prover är inte godkända.

• Blod, slem, sperma och vaginalbehandlingar kan påverka PCR-reaktionen. För mer information om störande substanser, se kapitlet ”Produktegenskaper”.

• Inverkan av andra faktorer som flytningar, användning av tamponger eller vaginaldusch har inte fastställts.

• Endast personal om utbildats för Dx CT/NG/MG Auto Assay, Dx Prep System, Dx Automated Extraction Assay, Dx Real- Time System och Dx Real-Time Software får använda analysen.

• Ett negativt resultat utesluter inte en eventuell infektion eftersom resultaten beror på flera variabler. Felaktig provtagning och provhantering, hämmare eller tekniska fel kan ge missvisande resultat.

• I sällsynta fall kan Dx CT/NG/MG Auto Assay leda till felaktigt positiva resultat om provet innehåller Neisseria meningitidis serogrupp C eller D.

• Vaginal-, anal- eller urinprover ersätter inte cervikala undersökningar och endocervikalprover för att diagnostisera urogenitala infektioner hos kvinnor. Patienterna kan ha cervicit, uretrit, infektioner i urinvägarna eller vagina av andra orsaker eller andra infektioner med andra patogener.

• Dx CT/NG/MG Auto Assay är inte avsedd för bedömning av misstänkt sexuellt utnyttjande eller andra rättsmedicinska indikationer.

• Om en behandling varit framgångsrik eller inte kan inte avgöras med Dx CT/NG/MG Auto Assay eftersom patogen-DNA kan finnas även efter en antimikrobiell behandling.

• Precis som vid andra diagnostiska tester ska resultaten av Dx CT/NG/MG Auto Assay tolkas tillsammans med andra laboratoriska och kliniska fynd.

9. FÖRVÄNTADE VÄRDEN

Förekomsten av positiva prover för C.trachomatis, N.gonorrhoeae och M. genitalium hos de populationer som undersökts beror på klinisk bild, ålder, riskfaktorer, kön och testmetod.

Förekomsten som observerats med Dx CT/NG/MG Auto Assay i kliniska undersökningar på de två olika anläggningarna visas i tabellerna nedan:

Tabell 1: CT/NG/MG-prevalens anläggning 1

Population

anläggning 1 Kön N

Chlamydia trachomatis

Neisseria gonorrhoeae

Mycoplasma genitalium CT +

N % NG +

N % MG + N %

Utan symptom ♀ 141 17 12,2 % 1 2,6 % 6 4,3 %

Med symptom ♀ 8 2 25,0 % 0 0,0 % 1 12,5 %

Med symptom ♂ 37 8 21,6 % 2 5,4 % 2 5,4 %

Utan eller med symptom ♀ 308* 16 5,2 % 1 0,3 % 4 1,3 % Utan eller med symptom ♂ 162 19 11,8 % 15 9,3 % 6 3,7 %

Totalt ♀+ ♂ 656 62 9,5 % 19 2,9 % 19 2,9 %

* 1 patient positiv för CT och misslyckades för NG och MG Tabell 2: CT/NG/MG-prevalens anläggning 2

Population Anläggning 2 Kön N

Mycoplasma genitalium

CT + NG + MG +

N % N % N %

Prospektiv Utan symptom eller med symptom

Provtagningscenter 1

♀ 75 2 3 % 0 0 % 1 1 %

♂ 6 1 17 % 1 17 % 0 0 %

Provtagningscenter 2

♀ 36 1 3 % 0 0 % 0 0 %

♂ 1 0 0 % 0 0 % 0 0 %

provtagningscenter 3

♀ 30 1 3 % 1 3 % 0 0 %

♂ 4 2 50 % 1 25 % 0 0 %

Totalt prospektivt ♀+ ♂ 152 7 5 % 3 2 % 1 1 %

(12)

12 [SE]

Tabell 3: CT/NG/MG-prevalens anläggning 1+2

POPULATION Anläggning 1 och

anläggning 2 Kön N

Mycoplasma genitalium

CT + NG + MG +

N % N % N %

Utan symptom ♀ 141 17 12 % 1 3 % 6 4 %

Med symptom ♀ 8 2 25 % 0 0 % 1 13 %

Med symptom ♂ 37 8 22 % 2 5 % 2 5 %

Utan eller med

symptom ♀ 449 20 4 % 2 0,4 % 5 1 %

Utan eller med

symptom ♂ 173 22 13 % 17 10 % 6 3 %

Totalt ♀+ ♂ 808 69 8,5 % 22 2,7 % 20 2,5 %

10. PRODUKTEGENSKAPER

* utföranden har erhållits initialt med automatisk extrahering utförd i Dx Prep System med prover som insamlats med Dx Collection System 50-F kit. Dock har ekvivalenta utföranden erhållits med prover som insamlats med ESwab™ och med extrahering i NucliSENS^® easyMAG^® system med prover insamlade antingen med Dx Collection System 50-F kit eller ESwab™.

10.1. Precisionsmätning

10.1.1 Repeterbarhet och reproducerbarhet inom laboratoriet

I enlighet med CLSI-instruktionerna EP5A2 valdes två provpaneler (en i urin och en i Dx Collection System-transportmedium), som bestod av negativa prover och CT/NG/MG-positiva prover i olika mängder (liten, medium och stor). Provpanelerna testades i en precisionsundersökning inom laboratoriet i 4 extraktionsreplikat av 1 användare.

Undersökningen genomfördes på 2 loter Dx Automated Extraction Assay med 2 Dx Prep Systems under 5 dagars tid med 1 körning per dag. Analysen fortsatte i ytterligare 15 dagar med 2 loter Dx Automated Extraction Assay och med 1 Dx Prep System och 1 användare. Funktionen Nested ANOVA användes för att mäta varianskomponenterna för varje villkor (sats - instrument - dag - replikat).

Resultaten finns angivna i tabell 4, 5 och 6.

Tabell 4: Chlamydia trachomatis: Sammanlagda resultat för precision mellan körningar och dagar per paneldeltagare – Ceep- värde för positiva prover

CT Inom körning Mellan dagar Mellan loter TOTALT

Panel Prov Extraktion

slot N Mede l

Stand ardav vikels e

CV %

CV % Stan dard avvi kels e

CV %

Urin

Lågt A 80 34,4 0,46 1,3 % 0,33 0,9 %

0,52 1,5 % 0,63 1,8 %

B 80 34,9 0,18 0,5 % 0,40 1,1 %

Medelhö gt

A 80 31,4 0,69 2,2 % 0,49 1,6 %

0,54 1,7 % 0,75 2,4 %

B 80 31,7 0,23 0,7 % 0,44 1,4 %

Högt A 80 27,3 0,16 0,6 % 0,21 0,8 %

0,38 1,4 % 0,43 1,6 %

B 80 27,5 0,22 0,8 % 0,38 1,4 %

Transport medium

Lågt A 80 33,6 0,45 1,3 % 0,54 1,6 %

0,36 1,1 % 0,69 2,1 %

B 80 33,7 0,47 1,4 % 0,50 1,5 %

Medelhö gt

A 80 30,0 0,31 1,0 % 0,35 1,2 %

0,32 1,1 % 0,42 1,4 %

B 80 30,1 0,16 0,5 % 0,33 1,1 %

Högt A 80 26,7 0,17 0,6 % 0,41 1,5 %

0,36 1,3 % 0,39 1,5 %

B 80 26,7 0,14 0,5 % 0,25 0,9 %

(13)

13 [SE]

Tabell 5: Neisseria gonorrhoeae: Sammanlagda resultat för precision mellan körningar och dagar per paneldeltagare – Ceep- värde för positiva prover

NG Inom körning Mellan dagar Mellan loter TOTALT

CV %

Urin

Lågt A 80 35,3 0,43 1,2 % 0,93 2,6 %

0,99 2,8 % 1,07 3,0 %

B 80 36,0 0,38 1,1 % 0,49 1,4 %

Medelhö gt

A 80 32,2 0,67 2,1 % 0,65 2,0 %

0,79 2,4 % 0,93 2,9 %

B 80 32,6 0,23 0,7 % 0,60 1,9 %

Högt A 80 27,1 0,16 0,6 % 0,52 1,9 %

0,74 2,7 % 0,77 2,8 %

B 80 27,6 0,23 0,8 % 0,53 1,9 %

Lågt A 80 30,6 0,22 0,7 % 0,19 0,6 %

0,20 0,6 % 0,33 1,1 %

B 80 30,8 0,23 0,8 % 0,27 0,9 %

Medelhö gt

A 80 27,1 0,42 1,5 % 0,58 2,2 %

0,38 1,4 % 0,54 2,0 %

B 80 27,1 0,20 0,7 % 0,18 0,7 %

Högt A 80 23,4 0,17 0,7 % 0,63 2,7 %

0,48 2,0 % 0,55 2,3 %

B 80 23,3 0,34 1,4 % 0,21 0,9 %

Tabell 6: Mycoplasma genitalium: Sammanlagda resultat för precision mellan körningar och dagar per paneldeltagare – Ceep- värde för positiva prover

MG Inom körning Mellan dagar Mellan loter TOTALT

CV %

Urin

Lågt A 80 34,8 0,57 1,6 % 1,16 3,3 %

1,33 3,8 % 1,4 4,1 %

B 80 35,9 0,60 1,7 % 0,71 2,0 %

Medelhö gt

A 80 31,3 0,96 3,1 % 0,71 2,3 %

0,94 3,0 % 1,21 3,8 %

B 80 32,0 0,46 1,4 % 0,71 2,2 %

Högt A 80 26,3 0,31 1,2 % 0,35 1,3 %

0,64 2,4 % 0,74 2,8 %

B 80 26,9 0,43 1,6 % 0,45 1,7 %

Lågt A 80 30,8 0,66 2,1 % 0,28 0,9 %

0,00 E/T 0,69 2,2 %

B 80 30,9 0,56 1,8 % 0,34 1,1 %

Medelhö gt

A 80 26,7 0,63 2,3 % 0,15 0,6 %

0,28 1,0 % 0,63 2,3 %

B 80 26,9 0,49 1,8 % 0,23 0,8 %

Högt A 80 23,2 0,28 1,2 % 0,20 0,9 %

0,19 0,8 % 0,36 1,5 %

B 80 23,2 0,33 1,4 % 0,15 0,6 %

10.1.2 Precision mellan system

En undersökning av precisionen mellan system utvärderades inom 3 till 5 dagar på upp till 4 Dx Prep Systems med 2 till 3 Dx Real-Time Systems (RTS), 3 loter Dx Automated Extraction Assay och 1 sats Dx CT/NG/MG Auto Assay. För undersökningen av precision mellan olika Dx Prep System-enheter användes ANOVA-envägsmetoden. Alla acceptansvillkor var korrekta:

negativa prover var negativa och positiva prover var positiva, CV (som beräknades utifrån Ceep-värde) var <=3 % för repeterbarhet och precision inom laboratoriet och <=5 % för total precision mellan loter och mellan olika system.

(14)

14 [SE]

Tabell 7: CT, NG och MG: Resultat av precision mellan system per paneldeltagare.

Prov-ID Replikat Genomsnittligt Ceep Standardavvikelse CV

CT negativ 22 Neg. ET ET

CT låg 22 32,6 0,25 0,78 %

CT medel 22 30,0 0,24 0,79 %

CT hög 22 24,8 0,35 1,40 %

NG negativ 22 Neg. ET ET

NG låg 22 31,3 0,17 0,55 %

NG medel 22 28,4 0,25 0,89 %

NG hög 22 22,6 0,43 1,92 %

MG negativ 22 Neg. ET ET

MG låg 22 31,7 0,68 2,14 %

MG medel 22 28,4 0,54 1,89 %

MG hög 22 23,0 0,46 2,02 %

10.2. Kliniska egenskaper

Kliniska egenskaper hos Dx CT/NG/MG Auto Assay undersöktes i en undersökning på två kliniska anläggningar i Frankrike.

1 102 patienter med och utan symptom på mottagningar för STI-prevention och på anonyma testmottagningar har använts i den här undersökningen.

16 patienter uppfyllde inte kriterierna ovan och har inte tagits med. De 1 086 övriga patienterna är med i undersökningen (723 kvinnor och 363 män).

Totalt 1 086 patienter med 1 255 olika prover analyserades:

Retrospektiv undersökning: 278 prover

• 125 prover av den första urinen från kvinnor

• 153 prover av den första urinen från män Prospektiv undersökning: 977 prover

• 141 självtagna vaginala prover från kvinnor,

• 364 endocervikalprover från kvinnor,

• 49 vaginala/endocervikala prover från kvinnor

• 32 vaginala prover från kvinnor,

• 130 prover av den första urinen från kvinnor,

• 1 analprover från kvinnor,

• 9 pinnprover med okänt ursprung från kvinnor

• 158 prover av den första urinen från män,

• 36 prover av den första urinen från män med prostatamassage,

• 6 urinledarprover från män,

• 51 analprover från män.

Prover:

• Kvinnliga patienter med flera provtagningsplatser: 457 kvinnor varav 121 som lämnade endocervikala pinnprover och urinprover och 7 som lämnade vaginala prover och urinprover.

• Manliga patienter med flera provtagningsplatser: 199 män varav 36 som lämnade både första urinprov (FCU) och första urinprov med postprostatamassage, 4 som lämnade FCU-prover och analprover och 1 som lämnade FCU- och urinledarpinnprover.

Alla proverna samlades in med Dx Collection Systems från Bio-Rad (insamlingskit för män och kvinnor, ref. 37013 och 37012).

Egenskaperna hos Dx CT/NG/MG Auto Assay för målet C. trachomatis fastställdes genom jämförelse med tre EU-registrerade PCR-realtidstester (1 PCR-test på anläggning 1 och 2 andra tester på anläggning 2).

Egenskaperna hos Dx CT/NG/MG Auto Assay för målet N. gonorrhoeae fastställdes genom jämförelse med tre EU-registrerade PCR-realtidstester (1 PCR-test på anläggning 1 och 2 andra tester på anläggning 2) eller med odling.

Egenskaperna hos Dx CT/NG/MG Auto Assay för målet M. genitalium fastställdes genom jämförelse med ett internt PCR-test med hjälp av TaqMan-metoden enligt Jensen. Endast de prover som testades positiva med Dx CT/NG/MG Auto Assay testades med det interna PCR-testet.

10.2.1 Egenskaper för Chlamydia trachomatis

1 255 olika prover från de två anläggningarna testades med Dx CT/NG/MG Auto Assay. Av dem testades 825 prover med PCR CT/NG-testanalys på anläggning 1, 311 prover med den första PCR CT/NG-testanalysen för anläggning 2 och 119 med den andra PCR CT/NG-testanalysen för anläggning 2. De tre jämförelseanalystesterna förklarades vara referensanalyser. 7 prover (1 självtaget vaginalt, 3 endocervikala pinnprover, 1 vaginalpinnprover, 1 första urinprov från kvinna och 1 analprov från man) uteslöts från beräkningen eftersom röret var tomt eller volymen alltför liten.

(15)

15 [SE]

Tabell 8: CT-jämförelseresultat

Referens-CT Referens-CT

Failed (underkänt)

Inv IC Totalt Negativa Positiva, tveksamma* eller

utanför mätområdet**

(prover) Dx CT- autonegativt

Dx CT- autopositivt

Dx CT- autonegativt

♀ självtaget vaginalprov 121 1^(a) 0 15+1* 2 140

♀ endocervikalt pinnprov 345 0 0 15 1 361

♀ vaginalprov 27 1^(b) 0 3 0 31

♀ vaginalt/endocervikalt pinnprov 47 0 0 2 0 49

♀ första urinen 195 1^(c) 1^(d) 57 0 254

♀ analprov 1 0 0 0 0 1

♀ ej angivet 9 0 0 0 0 9

♂ första urinen 229 0 0 82 0 311

♂ FCU efter prostatamassage 35 0 0 1 0 36

♂ urinrörsprov 4 0 0 1+1** 0 13

♂ analprov 36 0 0 13 1 43

Totalt 1 049 3 1 191 4 1 248

*Tveksamma: Det tveksamma PCR CT/NG-testprovet från anläggning 1 betraktades som positivt. Provet var ett självtaget vaginalprov och befanns vara tveksamt för CT med PCR CT/NG-testet på anläggning 1 och CT-positivt med Dx CT/NG/MG Auto Assay från Bio-Rad.

**Utanför mätområdet: PCR CT/NG-testprovet utanför mätområdet från anläggning 2 betraktades som svagt positivt. Provet var ett urinrörsprov och befanns ligga utanför mätområdet för CT med PCR CT/NG-testet på anläggning 2 och CT-positivt med Dx CT/NG/MG Auto Assay från Bio-Rad.

Diagnostisk specificitet

Proverna a, b och c exkluderades från specificitetsberäkningen eftersom de var sant positiva prover. Proverna a och b befanns vara sant CT-positiva med PCR CT-bekräftelsetestet på anläggning 1. Prov c bekräftades vara CT-positivt med tillhörande endocervikala pinnprover.

Den relativa specificiteten hos Dx CT/NG/MG Auto Assay med avseende på de 3 PCR-referensanalyserna är 1 049/1 049 = 100 % CI 95 [99,7 %–100 %].

Diagnostisk känslighet

Prov d var reproducerbart och bekräftades som avvikande med PCR CT/NG-testet i anläggning 1. Provet var också kopplat till ett endocervikalt pinnprov som testades positivt med Bio-Rad Dx CT/NG/MG Auto Assay och PCR CT-bekräftelseanalysen på anläggning 1. Den här patienten förklarades vara sant positiv.

Den relativa känsligheten hos Dx CT/NG/MG Auto Assay med avseende på de tre PCR-referensanalyserna är 191/192 = 99,5 % CI 95 % [97,1 %–100 %].

10.2.2 Egenskaper för Neisseria gonorrhoeae

1 255 olika prover från de två anläggningarna testades med Dx CT/NG/MG Auto Assay. Av dem testades 825 prover med PCR CT/NG-testanalys på anläggning 1, 311 prover med den första PCR CT/NG-testanalysen för anläggning 2 och 119 med den andra PCR CT/NG-testanalysen för anläggning 2. De tre jämförelseanalystesterna förklarades vara referensanalyser. 6 prover (3 endocervikala, 1 vaginalpinnprov, 1 första urinprov från kvinna och 1 analprov från man) uteslöts från beräkningen eftersom röret var tomt eller volymen alltför liten.

(16)

16 [SE]

Tabell 9: NG-jämförelseresultat

NG PCR-referenstest NG PCR-referenstest

Failed (underkänt)

Inv IC

Totalt Negativa Positiva eller tveksamma

Prover Dx NG-

autonegativt

Dx NG- autopositivt

Dx NG- autonegativt

♀ självtaget vaginalprov 138 0 0 1 2 141

♀ endocervikalt pinnprov 358 0 0 2 1 361

♀ vaginalprov 31 0 0 0 0 31

♀ vaginalt/endocervikalt pinnprov 49 0 0 0 0 49

♀ första urinen 245 0 1^(d) 7 1 254

♀ analprov 1 0 0 0 0 1

♀ ej angivet 9 0 0 0 0 9

♂ första urinen 278 1^(a)+ 1^(e) 0 31 0 311

♂ FCU efter prostatamassage 35 0 0 1 0 36

♂ urinrörsprov 4 0 0 2 0 6

♂ analprov 38 1^(b) 1*^(c) 9 1 50

Totalt 1 186 3 2 53 5 1 249

*Tveksamma: Det tveksamma provet betraktades som positivt. Det här analprovet (d) befanns vara tveksamt för NG med PCR CT/NG-testet på anläggning 1 och NG-negativt med Dx CT/NG/MG Auto Assay från Bio-Rad.

3 prover befanns vara avvikande mellan Dx CT/NG/MG Auto Assay och referensanalysen:

• Prov (a) kunde inte reproduceras med Dx CT/NG/MG Auto Assay och testades igen som negativt med PCR NG- bekräftelseanalysen på anläggning 1. Dessutom befanns odlingen vara negativ för gonokocker.

• Prov (b) reproducerades positivt när det testades igen med Dx CT/NG/MG Auto Assay och bekräftades vara negativt efter omtestning med PCR NG-bekräftelseanalysen på anläggning 1. Resultatet av odlingen var negativt för gonokocker. Inget prov var positivt för meningokocker under utvärderingen.

• Prov (e) kunde inte reproduceras med Dx CT/NG/MG Auto Assay och testades igen som positivt med PCR NG- bekräftelseanalysen på anläggning 2. Det här provet, med en låg mängd N. gonorrhoeae, låg vid detekteringsgränsen för PCR NG-analysen på anläggning 2 och Dx CT/NG/MG Auto Assay.

Den relativa specificiteten hos Dx CT/NG/MG Auto Assay med avseende på de 3 PCR-referensanalyserna är 1 186/1 189 = 99,8 % CI 95 [99,3 %–100 %].

2 prover befanns vara avvikande mellan Dx CT/NG/MG Auto Assay och referensanalysen:

• Prov (c) var reproducerbart och bekräftades som negativt avvikande med de tveksamma resultaten från PCR NG-analysen på anläggning 1 (bekräftat tveksamt med PCR NG-analysen på anläggning 1). Resultatet av odlingen var negativt för gonokocker. Dx CT/NG/MG Auto Assay-resultatet är i linje med odlingen.

• Prov (d) var reproducerbart och bekräftades som negativt avvikande med det första resultatet från PCR NG-analysen på anläggning 2, men testades om och befanns vara negativt med PCR NG-analysen på anläggning 2. Det här provet, med en låg mängd N. gonorrhoeae, låg vid detekteringsgränsen för PCR NG-analysen på anläggning 2.

Den relativa känsligheten hos Dx CT/NG/MG Auto Assay med avseende på de tre PCR-referensanalyserna är 53/55 = 96,4 % CI 95 % [87,5 %–99,6 %].

(17)

17 [SE]

10.2.3 Neisseria gonorrhoeae: Jämförelse med odlingen

Totalt 533 prover (201 från män och 332 från kvinnor) jämfördes med resultaten från odling av Neisseria gonorrhoeae.

Tabell 10: NG-jämförelseresultat med odling Odling NG

Negativa Odling NG

Positiva Misslyckades

– ogiltig IC Totalt Prover Dx NG-

autonegativt

Dx NG- autonegativt

♀ självtaget

vaginalprov 0 0 0 0 2 2

♀ endocervikalt

pinnprov 207 0 0 0 1 208

♀ vaginalprov 1 0 0 0 0 1

♀ första urinen 120 0 0 0 1 121

♀ analprov 0 0 0 0 0 0

♂ första urinen 112 1^(a) 0 7 0 120

♂ FCU efter

prostatamassage 36 0 0 0 0 36

♂ urinrörsprov 1 0 0 1 0 2

♂ analprov 33 1^(b) 0 8 1 43

Totalt 510 2 0 16 5 533

2 prover befanns avvika gentemot odlingen (prov a och b) och avvek också från PCR-referensanalysen (se ovanstående tabell för specificitetsavvikelse).

Den relativa specificiteten hos Dx CT/NG/MG Auto Assay med avseende på kulturen är 510/512 = 99,6 % CI 95 [98,6 %–

100 %].

Alla positiva prover som hittades med Dx CT/NG/MG Auto Assay var också positiva i odlingen.

Den relativa känsligheten hos Dx CT/NG/MG Auto Assay med avseende på odlingen är 16/16 = 100 % CI 95 [79,4 %–100 %].

10.2.4 Egenskaper för Mycoplasma genitalium

På 2 anläggningar befanns 35 prover vara positiva för Mycoplasma genitalium med Bio-Rad Dx CT/NG/MG Auto Assay: 21 prover från 19 patienter på anläggning 1 och 14 prover från 14 patienter på anläggning 2. 2 prover (1 endocervikalt, 1 vaginalt) uteslöts från beräkningen eftersom röret var tomt eller volymen alltför liten.

Totalt 36 prover från dessa 33 patienter skickades till anläggning 3 för analys med det interna TaqMan MG PCR-testet.

Tabell 11: Resultat från Bio-rad Dx MG Auto

Prover Dx MG-

autonegativt

Dx MG- autopositivt

Misslyckades –

ogiltig IC Totalt

♀ självtaget vaginalprov 133 6 2 141

♀ endocervikalt pinnprov 358 4 1 363

♀ vaginalprov 31 0 0 31

♀ vaginalt/endocervikalt pinnprov 48 1 0 49

♀ första urinen 244 10 1 255

♀ analprov 1 0 0 1

♀ ej angivet 9 0 0 9

♂ första urinen 301 10 0 311

♂ FCU efter prostatamassage 36 0 0 36

♂ urinrörsprov 6 0 0 6

♂ analprov 46 4 1 51

Totalt 1 213 35 5 1 253

(18)

18 [SE]

Tabell 12: MG-jämförelseresultat

Anläggningar Prover

Dx MG Auto Intern MG

Totalt Positiva Negativa Positiva Negativa

Anläggning 1 Urin 7 0 7 0 7

Pinne 14 1* 9 6 15

Anläggning 2 Urin 13 0 12 1 13

Pinne 1 0 0 1 1

Totalt 35 0 28 8 36

Tre patienter lämnade 2 olika prover (pinnprov och urinprov), som var reproducerbart MG-positiva förutom för 1 pinnprov som befanns vara negativt även efter omtestning.

Jämförelse med intern metod

Av de 36 prover som testades med Dx CT/NG/MG Auto Assay befanns 35 vara positiva. Av dessa bekräftades 28 som positiva med den interna Taqman-metoden för Mycoplasma genitalium som användes på anläggning 3.

Överensstämmelsen mellan Dx CT/NG/MG Auto Assay och Taqman-metoden för Mycoplasma genitalium är lika med 27/36 (75 %).

Proverna som inte befanns vara positiva med Taqman-metoden var lågkoncentrerade MG-prover. Standarddetektionen berodde inte på PCR-inhibitorer.

Den positiva överensstämmelsen var 96,4 % (=27/28) CI 95 % [81,7–100 %] med 1 prov som var negativt med Dx CT/NG/MG Auto Assay och positivt nära detektionsgränsen med Taqman PCR-analysen med Mycoplasma genitalium.

Dubbelinfektion:

Av de 35 prover som var MG-positiva med Dx CT/NG/MG Auto Assay så testades 12 prover dessutom som CT-positiva med Dx CT/NG/MG Auto Assay och CT PCR-referensanalyserna. Vi tror att dessa patienter betraktades som dubbelinfekterade riskpatienter.

10.2.5 Retrospektiv undersökning (anläggning 2)

278 frusna första urinprover (FCU) testades retrospektivt med Dx CT/NG/MG Auto Assay.

Tabell 13: C. trachomatis

Referens CT PCR Referens CT PCR

Totalt Negativa Positiva

Prover Dx CT-

autonegativt

Dx CT- autonegativt

♀ första urinen 73 0 0 52 125

♂ första urinen 87 0 0 66 153

TOTALT 245 0 0 31 278

Tabell 14: N. gonorrhoeae

Referens NG PCR Referens NG PCR

Totalt Negativa Positiva

Prover Dx NG-

autonegativt Dx NG-

autopositivt Dx NG-

autonegativt Dx NG- autopositivt

♀ första urinen 117 0 1 7 125

♂ första urinen 128 1 0 24 153

TOTALT 245 1 1 31 278