48
2011
Projektet ”Me-too” läkemedel
49
Bilaga 1: Analoger
Kombination, A01B01C01A´02 Kombination, A01B01C01A´03 Kombination, A01B01C02A´01 Kombination, A01B01C03A´01 Kombination, A01B01C01A´0150 Kombination, A02B01C01A´01 Kombination, A01B01C04A´01 Kombination, A01B01C05A´01 Kombination, A01F02C01A´01 Kombination, A03B01C01A´01
51 Kombination, A04B01C01A´01 Kombination, A05B01C01A´01 Kombination, A06B01C01A´01 Kombination, A07B01C01A´01 Kombination, A02F01C02A´02
52 Kombination, A02F01C02A´03 Kombination, A03F02C03A´03 Kombination, A03F02C04A´03 Kombination, A04F01C04A´03 Kombination, A04F01C05A´03
53 Kombination, A05F01C05A´03 Kombination, A06F02C05A´03 Kombination, A07F02C05A´03 Kombination, A07F02C06A´03 Kombination, A06F02C06A´03
54 Kombination, A05F01C06A´03 Kombination, A04F01C06A´03 Kombination, A03F02C06A´03 Kombination, A02F01C06A´03 Kombination, A07F02C06A'02
55 Kombination A06F02C06A'01 Kombination A07B01C06A'02 Kombination A07B01C06A'01 Kombination A07B01C05A'01 Kombination A07B01C04A'01
56 Kombination A07B01C03A'01 Kombination A07B01C02A'01 Kombination A07F02C05A'01 Kombination A07F02C04A'01 Kombination A07F02C03A'01
57 Kombination A07F02C02A'01 Kombination A04F01C05A'01 Kombination A04F01C04A'01 Kombination A04F01C03A'01 Kombination A04F01C02A'01
58 Kombination A05F01C05A´01 Kombination A05F01C04A´01 Kombination A05F01C03A´01 Kombination A05F01C02A´01 Kombination A06F02C05A´01
59 Kombination A03F02C03A´01 Kombination A06F02C04A´01 Kombination A06F02C03A´01 Kombination A06F02C02A´01 Kombination A03F02C02A´01
60 Kombination A03F02C04A´01 Kombination A03F02C05A´01 Kombination A02F01C02A´01 Kombination A02F01C03A´01 Kombination A02F01C04A´01
61 Kombination A01C01A'01 Kombination A02F01C05A´01 Kombination A01C01A'02 Kombination A01C01A'03 Kombination A01C02A'03
62 Kombination A01C03A'03 Kombination A01C04A'03 Kombination A01C05A'03 Kombination A02C05A'03 Kombination A03C05A'03
63 Kombination A04C05A'03 Kombination A05C05A'03 Kombination A06C05A´03 Kombination A07C05A´03 Kombination A07C05A´02
64 Kombination A07C05A´01 Kombination A07C04A´01 Kombination A07C03A'01 Kombination A07C02A'01 Kombination A07C01A'01
65
66
2011
Projektet ”Me-too” läkemedel
Förberedelser inför samt
instruktioner för bindningsassay
67
Förberedelser inför bindningsassay
Beredning av analogstamlösning
Det som finns tillgängligt är:
Analog
Avjoniserat vatten
Analogstamlösning bereds så att dess koncentration blir högre än 1· 10-3 M, vilket är den högsta koncentrationen i spädningsserien (se avsnittet Instruktioner för bindningsassay nedan).
Beredning av buffert
Bufferten har pH-värdet 5,5 och består av:
100 mM natriumacetat
1 M natriumklorid
1 mM EDTA
1 mM DTT
10 % glycerol
Det som finns tillgängligt är:
3 M natriumacetat
5 M natriumklorid
0,5 M EDTA
1 M DTT
≥ 99,9 % glycerol
Om exempelvis 1 liter buffert önskas behövs: 33,33 ml natriumacetat
200 ml natriumklorid 2 ml EDTA
100 ml glycerol 1 ml DTT
Fyll upp till 1 liter med avjoniserat vatten. Blanda till natriumacetat, natriumklorid och EDTA och glycerol i förväg och tillsätt sedan DTT precis innan bufferten ska användas.
Beredning av radioligandstamlösning
Det som finns tillgängligt är:
[3H]ritonavir med en radioaktivitet på 5 – 25 Ci/mmol i etanol/vatten-lösning (1:1) med koncentrationen 1 mCi/ml
68
En förpackning innehåller 250 µCi och till en förpackning behövs ca 330 ml avjoniserat vatten för att få den önskade koncentrationen. Koncentrationen hos stamlösning ska vara 10-9 M. Blanda med fördel bara till den volym radioligandstamlösning som behövs för en dags arbete.
Molmassan för ritonavir är 721 g/mol. I en förpackning finns det ca:
Beredning av HIV-proteasstamlösning
Det som finns tillgängligt är:
HIV-1-proteas, recombinant 5 µg med MW = 10 – 12 kDa Buffert
Förpackningen innehåller 5 µg HIV-proteasmonomer. Enzymet är dock endast aktivt när det bildar homodimerer. Koncentrationen homodimer ska vara ungefär 9,09 · 10-8 M. Det innebär att två förpackningar av HIV-proteas ska blandas ner i 5 ml buffert för att få den önskade koncentrationen.
Till en analog krävs 1,5 ml HIV-proteaslösning, se förteckningen av kemikalier för en analog nedan. Det innebär att 5 ml räcker till tre analoger. Eftersom lösningens hållbarhet är begränsad kan den inte tillberedas alltför långt innan användning. Men lösningen borde hålla i några timmar. Förslagsvis tillbereds så mycket av lösningen som ska användas under dagen. För ett dagsarbete på tjugo analoger behövs 30 ml HIV-proteaslösning. Detta innebär att 12 förpackningar HIV-proteas blandas ner i 30 ml buffert.
Referens och ospecifik bindning
Det som finns tillgängligt är:
[3H]ritonavir
Buffert
HIV-proteas stamlösning
Indinavir i avjoniserat vatten med koncentrationen 0,01 M
Gör triplettprover. Referenslösningen ska innehålla 880 µl buffert, 20 µl [3H]ritonavir och 100 µl HIV proteas. Den ospecifika lösningen ska innehålla 780 µl av buffert, 100 µl av indinavirlösning, 20 µl [3H]ritonavir och 100 µl HIV-proteasstamlösning.
Låt proverna inkubera i inkubator (37 oC) i ca 1 timme. Filtrera varje provrör på varsitt filterpapper i filterenheten. Skölj alla filter med ca 4 ml buffert. Placera filtren i varsitt scintrör och fyll rören med ca 3 ml scintvätska. Mät sedan radioaktiviteten i scintmätaren. För mer noggranna instruktioner om utförandet, se steg 3 – 5 i avsnittet Instruktioner för bindningsassay nedan.
69
Instruktioner till bindningsassay
Förteckning av material och kemikalier som behövs per analog
Kemikalier
Analogstamlösning 72 ml buffert
0,3 ml stamlösning av radiomärkt ritonavir 1,5 ml stamlösning av HIV-proteas Avjoniserat vatten 50 ml scintvätska Utrustning 15 provrör 15 scintrör 15 whatman filter Pincett Dispenserpipett Vätskavskiljare Vakuumslangar
Spetsar till dispenserpipett (1 st 12,5 ml och 1 st 5 ml) Automatpipett 20 – 200 µl
Spetsar till automatpipett (7 st) 1 provrörsställ
Scintmätare Dator med Excel Inkubator
För information om beredningar av stamlösningar och buffert, se avsnittet Förberedelser inför bindningsassay ovan.
Se bifogad manual till filterenhet och scintmätare för ytterligare information om hur dessa används.
70
Utförande
Steg 1. Spädningsserie
Späd analogstamlösningen till följande koncentrationer som ses i tabell 1:
Tabell 1. Koncentration av analog i de fem provrören i spädningsserien
Provrör A B C D E
Koncentration (M) 1 x 10 -3 1 x 10-4 1 x 10-5 1 x 10-6 1 x 10-7 Spädningsserien görs via stegvis spädning från stamlösning av analog. Slutvolymen ska alltid vara 1000 µL. Spädning upp till slutvolym görs med avjoniserat vatten.
Steg 2. Provserie
Gör tripplettprover, alltså tre identiska provrör av varje koncentration. Detta ger totalt 15 provrör. Fyll först alla provrör med buffert med dispenserpipetten (12,5 ml spets). Byt pipettspets till 5 ml och tillsätt sedan HIV-proteasstamlösningen till provrören. Använd sedan automatpipetten för att tillsätta det radiomärkta ritonaviret till provrören.
När analogen ska tillsättas, följ då nedanstående schema:
Från provrör E i spädningsserien till provrör 13-15 i provserien
Från provrör D till provrör 10-12
Från provrör C till provrör 7-9
Från provrör B till provrör 4-6
Från provrör A till provrör 1-3
Gör du på det här sättet behöver du endast använda en pipettspets till alla provrören eftersom eventuella rester av analogen i spetsen kommer få liten inverkan när du går från låg till hög koncentration. I tabell 2 nedan visas vilka mängder som ska pipetteras ner i provrören, alla mängder är i µl.
Tabell 2. "Recept" för tillberedningen av lösningarna i provserien
Prov 1-3 Prov 4-6 Prov 7-9 Prov 10-12 Prov 13-15 Buffert 780 780 780 780 780 Analog 100 (Provrör A) 100 (Provrör B) 100 (Provrör C) 100 (Provrör D) 100 (Provrör E) [3H]ritonavir 20 20 20 20 20 HIV proteas 100 100 100 100 100 Total volym 1000 1000 1000 1000 1000 Ur alla provrör i spädningsserien tas 100 µl av lösningen och späds till 1000 µl. Det innebär att koncentrationen av analog blir tio gånger lägre i provserien jämfört med spädningsserien. Detta måste tas till hänsyn när resultaten ska analyseras, se nedan.
71
När alla provrör att gjorda, vänd alla (SKAKA EJ!) några gånger för att få innehållet väl blandat. Låt provrören sedan stå och inkubera i inkubatorn (37 oC) i ca 1 timme. Under tiden blötlägg 15 whatman filter som ska användas i filtreringen nedan.
Steg 3. Filtrering
Lägg de blöta filterpapprena på filterenheten med en pincett. Skruva fast locket och skapa undertryck med hjälp av vakuumuttaget i dragskåpet. Se till att en vätskeavskiljare är kopplad mellan filterenheten och vakuumuttaget. Häll sedan på proverna. Skölj sedan alla filter med ca 4 ml buffert. Den buffert som användes för att blötlägga whatman filtrena kan användas för denna sköljning.
Steg 4. Mätning med vätskescintillator
Lägg filtrena i varsitt scintrör med hjälp av pincett. Häll på scintvätska så att filterpapprena blir helt täckta (ca 3 ml). Sätt på locket på provrören och märk dem med lämpligt nummer för att underlätta att proverna inte blir hopblandade. Mät sedan radioaktiviteten med scintmätaren. Från scintmätaren erhålls resultaten som en utskrift med siffervärden. För analys av dessa värden se nedan.
Steg 5. Analys av radioaktivitetsmätningen
Provernas mätvärden uttrycks som cpm (counts per minute). Detta är det uppmätta radioaktiva sönderfallet per minut. Cpm står direkt i relation med mängden [3H]ritonavir på filterpapprena. För in alla mätvärden i Excel.
För att kunna plotta och få fram analogens IC50-värde måste följande göras: Analysera mätvärdena och uteslut de som verkar orimliga
Räkna ut ett medelvärde på cpm för de fem analogkoncentrationerna
Räkna ut den specifika bindningen i procent för varje analogkoncentration
För att kunna räkna ut den specifika bindningen i procent krävs värden på ospecifik bindning samt referensbindning. Hur dessa värden erhålls kan läsas i avsnittet Förberedelser inför bindningsassay ovan. Den specifika bindningen i procent beräknas med följande formler:
Nu kan koncentrationen analog plottas mot specifik bindning av radioligand. X-axeln, alltså analogkoncentrationen, ska vara logaritmisk. Ur plotten kan analogens IC50-värde avläsas.