2.5.1 Radiomärkt ligand
Kraven på radioliganden i denna kompetitionsstudie är följande:
den ska vara en HIV-proteas hämmare
den ska ha en radioaktivitet som kan detekteras i vätskescintillatorn
det ska finnas prisinformation om den
Utifrån dessa krav valdes [3H]ritonavir, som är en HIV-proteashämmare precis som indinavir och de 100 analogerna. Ett företag som säljer [3H]ritonavir är American Radiolabeled Chemicals, Inc. I deras katalog finns ett stort utbud av radiokemikalier och även andra HIV- proteashämmare finns tillgängliga. Ritonavir hade dock högre radioaktivitet än vad andra alternativ, som t.ex. saqunavir, hade.
Det är inte bara valet av radioligand som måste motiveras utan även valet av koncentrationen i provserien. Enligt teorin ska koncentrationen vara lägre än Kd, som är
dissociationskonstanten mellan HIV-proteas och ritonavir. Ritonavir förutspås ha ett Kd på
5,9 · 10-9 M och därför sattes koncentrationen i provserien till 10-9 M.
2.5.2 HIV-proteas
Koncentrationen i provserien ska vara anpassad enligt följande krav:
det ska bli en kompetition mellan radioligand och omärkt ligand
radioaktiviteten av bundet ritonavir ska kunna detekteras
rimligt pris per analog
lätt att blanda till stamlösning
Det HIV-proteas som vi har valt säljs av Anaspec. En förpackning består av 5 µg enzym med molvikten 10 – 12 kDa. Detta är molvikten för en subenhet, men för att enzymet ska bli aktivt måste två subenheter gå ihop och bilda en homodimer.
Enzymet är av typen ”wild type” och är anpassat för att användas i FRET-assays. Eftersom FRET-metoden kräver att proteinet är aktivt och fungerade så borde enzymet även kunna användas till vår kompetitionsstudie. Enzymet är aktivt när det kan klyva det som binder till bindningsstället. Alltså måste bindningsstället vara intakt i detta proteas.
För att det ska bli en kompetition mellan analog och radioligand om bindningsställen så får det inte finnas för mycket HIV-proteas. Dock får det inte bli för låg koncentration av HIV- proteas eftersom det då finns en risk att radioaktiviteten blir för låg för att kunna detekteras. Valet av koncentration blir därför en vägning mellan de två ovanstående argumenten. Det borde vara rimligt att tänka att vid den lägsta koncentrationen av analog så ska all omärkt ligand och all radioligand kunna binda till HIV-proteaset. Men enzymet är endast aktivt när det bildar en homodimer. Så vi har utgått ifrån att substansmängden homodimer ska vara lika stor som summan av den lägsta substansmängden ritonavir och analog. Enligt våra beräkningar så kommer koncentrationen homodimer att bli 90 nM i provserien om två
31
förpackningar HIV-proteas blandas med 5 ml buffert. Detta gör att resonemangen kring substansmängderna uppfylls ungefärligt. Orsaken till att det blir ungefärligt är dels det att vi inte har en exakt molvikt för proteaset och även att vi vill att tillberedningen ska bli enkel. Dessutom så har vi antagit att alla monomer går ihop till homodimerer samt att enzymet inte genomgår autoprotolys.
Det som är nackdelen med att köpa in HIV-proteaset från en leverantör är att det blir väldigt dyrt. Det kan mycket väl vara så att det lönar sig att framställa HIV-proteas själv istället i labbet. Detta kan man åstadkomma genom en metod som heter transfektion. Metoden går ut på att man introducerar främmande material, oftast manipulerade plasmider, antingen in vitro eller in vivo. Syftet är att få cellerna att producera ett visst protein eller att minska cellernas produktion av ett protein. Så man skulle kunna få celler att producera HIV-proteas och sedan rena fram det.
Att framställa HIV-proteaset genom transfektion är något som vi tycker borde undersökas närmare. Speciellt om projektet kommer att förstoras. Vi ser att kostnaderna för att köpa in proteaset är väldigt betydande i jämförelse med andra komponenter i bindningsassayen. Vi ser stora möjligheterna att kunna sänka kostnaderna genom att utveckla en transfektionsprocess om projektet beslutas att bli mer omfattande. Till en början kommer det dock bli en stor investering att utveckla denna metod eftersom den kommer att kräva utrustning, kunnig personal och optimering. Så när det gäller ett projekt i denna storlek så tycker vi inte att detta är värt. Men som sagt, för ett större projekt så kommer kostnaderna för transfektionsprocessen att löna sig i längden jämfört med att köpa in HIV-proteaset.
2.5.2 Buffert
Kraven på bufferten i bindningsassayen är att den:
inte ska denaturera HIV-proteaset
ska vara blandbar med alla komponenter (radioligand, omärkt ligand o.s.v)
ska kunna gå att sätta ett pris på
Vi utgick ifrån att det mest känsliga ämnet i assayen kommer vara HIV-proteaset. Bufferten ska därför vara anpassad för detta ämne. Vi valde att inte komma på en egen buffert utan att följa ett recept på HIV-proteas-buffert som vi hittade på Sigma-Aldrich hemsida. På hemsidan finns ett informationsblad där företaget ger exempel på utförande av kinetikstudier på HIV-proteas med substrat/inhibitor. I det här informationsbladet anger de receptet på bufferten. Eftersom kompetitionsstudien är en kinetikstudie så borde bufferten fungera i vårt fall.
2.5.3 Kravet på koncentrationsintervallet för analogerna i provserien
När det gäller koncentrationerna av analog i provserien så finns huvudsakligen två krav:
IC50-värdet för analogerna ska finnas inom intervallet
det ska vara ett brett intervall så en bra kurva erhålls
IC50-värdet hos våra analoger kan troligtvis jämföras med IC50-värdet för indinavir eftersom
32
analoger skilja sig från indinavir till det bättre/sämre och därför är det bra att välja ett ganska brett intervall. Utifrån detta valde vi att i provserien ha fem koncentrationer av analogerna i intervallet 10-4 - 10-8 M.