2.10 MtPrsA (Rv1017c)
3.4.1 Jämförelse med andra sekvenser och strukturer av PrsA
Det fanns inga proteiner med liknande sekvens eller struktur som MtPrsA i PDB. Därför gjordes initialt ett konstrukt bestående av fullängdsproteinet med en N-terminal His6-tag, MtPrsANHis. PrsA-enzymet finns hos bakterier, växter och djur och av det humana PrsA finns det tre isoformer. MtPrsA visar 43% sekvensidentitet med dessa homologer [Wolucka, 2008].
En sekvensjämförelse från ClustalW av MtPrsA med de tre humana isoformerna av PrsA visas i Bilaga 3.
3.4.2 Kloning av MtPrsAFL och MtPrsANHis
Fullängdsgenen MtprsAFL renades fram via preparativ 1% agarosgelelektrofores (Figur 41).
Bandet motsvarande MtprsAFL var av rätt storlek (∼1 kb) och skars ut från gelen.
1 2
Figur 41. Preparativ 1% agarosgelelektrofores av MtprsAFL. Brunn 1: 200 bp DNA-stege (O’RangeRuler, Fermentas); brunn 2: MtprsAFL.
DNA-sekvensen för konstruktet MtprsANHis renades fram via preparativ 1%
agarosgelelektrofores (Figur 42). Bandet motsvarande MtprsANHis var utsmetat, men av rätt storlek (∼1 kb) och skars ut från gelen.
1 2
Figur 42. Preparativ 1% agarosgelelektrofores av MtprsANHis. Brunn 1: 200 bp DNA-stege (O’RangeRuler,
Efter ligering och transformering av MtprsANHis till kemiskt kompetenta E. coli-celler isolerades plasmider, vilka användes som templat i en analytisk PCR som analyserades med 1% agarosgelelektrofores (Figur 43). Klon 4 visade ett band med rätt insertstorlek (∼1 kb), vars sekvens sedan verifierades med DNA-sekvensering.
1 2 3 4 5 6 7 8
Figur 43. Analytisk 1% agarosgelelektrofores av MtprsANHis. Brunn 1: 200 bp DNA-stege (O’RangeRuler, Fermentas); brunn 2: klon 1; brunn 3: klon 2; brunn 4: klon 3; brunn 5: klon 4; brunn 6: klon 5; brunn 7: klon 6;
brunn 8: 200 bp DNA-stege (O’RangeRuler, Fermentas).
3.4.3 Testexpression av MtPrsANHis
En testexpression genomfördes av MtprsANHis (klon 4) och analyserades med SDS-PAGE (Figur 44). Här syns ett starkt uttryck av MtPrsANHis (35,5 kDa).
1 2 3
Figur 44. Testexpression av MtPrsANHis. Brunn 1: efter induktion; brunn 2: negativ kontroll med icke-inducerade E. coli-celler; brunn 3: LMW-stege (94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1; 14,4 kDa).
3.4.4 Storskalig proteinexpression och rening av MtPrsANHis
Den storskaliga proteinexpressionen av MtPrsANHis analyserades med SDS-PAGE (Figur 45), vilken visade att proteinet MtPrsANHis (35,5 kDa) var starkt uttryckt.
1 2 3
Figur 45. Storskalig proteinexpression av MtPrsANHis. Brunn 1: efter induktion; brunn 2: negativ kontroll med icke-inducerade E. coli-celler; brunn 3: LMW-stege (94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1; 14,4 kDa).
SDS-PAGE-analysen av proverna från lyseringen och IMAC-reningen av proteinet
MtPrsANHis visade att det var alldeles för starkt uttryckt, vilket medförde att mycket lite av proteinet var i löslig form (Figur 46).
1 2 3 4 5 6 7
Figur 46. Storskalig proteinexpression av MtPrsANHis. Brunn 1: LMW-stege (94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1;
14,4 kDa); brunn 2: olöslig pellet; brunn 3: löslig supernatant; brunn 4: IMAC flow through; brunn 5: IMAC-tvättfraktion; brunn 6: IMAC-eluat; brunn 7: LMW-stege (94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1; 14,4 kDa).
Efter att den storskaliga proteinexpressionen av MtPrsANHis gjorts om i ännu större skala var proteinet väl uttryckt, lösligt och ganska rent (Figur 47).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figur 47. Storskalig proteinexpression av MtPrsANHis. Brunn 1: LMW-stege (94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1;
14,4 kDa); brunn 2: negativ kontroll med icke-inducerade E. coli-celler; brunn 3: efter induktion; brunn 4:
olöslig pellet; brunn 5: löslig supernatant; brunn 6: IMAC flow through; brunn 7: IMAC-tvättfraktion; brunn 8:
IMAC-eluat; brunn 9: PD-10-eluat; brunn 10: LMW-stege (94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1; 14,4 kDa).
Mängden framrenat MtPrsANHis-protein uppmättes till 14 mg, vilket motsvarar ett utbyte av lösligt protein på 2,9 mg/L cellkultur.
Efter gelfiltrering på en HiLoad™ 16/600 Superdex™ 200 pg-kolonn erhölls ingen topp som motsvarade proteinet MtPrsANHis (data visas inte).
SDS-PAGE-analysen av den tredje storskaliga proteinexpressionen av MtPrsANHis visade att MtPrsANHis-proteinet var väl uttryckt, lösligt i båda gelfiltreringsbuffertarna och ganska rent.
(Figur 48).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Figur 48. Storskalig proteinexpression av MtPrsANHis. Brunn 1: LMW-stege (94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1;
14,4 kDa); brunn 2: negativ kontroll med icke-inducerade E. coli-celler; brunn 3: efter induktion; brunn 4:
olöslig pellet; brunn 5: löslig supernatant; brunn 6: IMAC flow through; brunn 7: IMAC-tvättfraktion; brunn 8:
IMAC-eluat; brunn 9: PD-10-eluat med gelfiltreringsbuffert 2; brunn 10: PD-10-eluat med gelfiltreringsbuffert 3; brunn 11: LMW-stege (94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1; 14,4 kDa).
Proteinprover efter buffertbytena på PD-10-kolonnerna till gelfiltreringsbuffert 2 respektive 3 analyserades med hjälp av SDS-PAGE (Figur 49), vilken visade att MtPrsANHis-proteinet fortfarande var lösligt i båda gelfiltreringsbuffertarna och att proteinet var rent.
1 2 3
Figur 49. Storskalig proteinexpression av MtPrsANHis. Brunn 1: LMW-stege (94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1;
14,4 kDa); brunn 2: PD-10-eluat med gelfiltreringsbuffert 2; brunn 3: PD-10-eluat med gelfiltreringsbuffert 3.
Mängden framrenat MtPrsANHis-protein i gelfiltreringsbuffert 2 uppmättes till 2,1 mg och i gelfiltreringsbuffert 3 till 2,0 mg MtPrsANHis, vilket motsvarar ett utbyte av lösligt protein på 1,0 mg/L i båda fallen.
Efter gelfiltrering på en HiLoad™ 16/600 Superdex™ 75 pg-kolonn av MtPrsANHis erhölls på nytt ingen topp motsvarande proteinet, varken med gelfiltreringsbuffert 2 (Figur 50) eller 3 (Figur 51).
Figur 50. Gelfiltrering av MtPrsANHis med gelfiltreringsbuffert 2.
Figur 51. Gelfiltrering av MtPrsANHis med gelfiltreringsbuffert 3.
SDS-PAGE-analysen efter buffertbytet till gelfiltreringsbuffert 2 av resterande E. coli-celler från den storskaliga proteinexpressionen av MtPrsANHis visade att proteinet var uttryckt och lösligt i gelfiltreringsbuffert 2, men inte så rent (Figur 52).
1 2 3 4 5 6 7 8
Figur 52. Storskalig proteinexpression av MtPrsANHis. Brunn 1: LMW-stege (94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1;
14,4 kDa); brunn 2: olöslig pellet; brunn 3: löslig supernatant; brunn 4: IMAC flow through; brunn 5: IMAC-tvättfraktion; brunn 6: IMAC-eluat; brunn 7: PD-10-eluat med gelfiltreringsbuffert 2; brunn 8: LMW-stege (94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1; 14,4 kDa).
Mängden framrenat MtPrsANHis-protein uppmättes till 12 mg, vilket motsvarar ett utbyte av lösligt MtPrsANHis-protein på 3,1 mg/L cellkultur. En brunaktig färg hos proteinlösningen kunde urskiljas på filtret, vilket kan indikera att MtPrsANHis binder järn.
Efter att IMAC-reningen gjorts om med en gradient av imidazol i elueringsbufferten visade SDS-PAGE-analysen att MtPrsANHis-proteinet i IMAC-elueringsfraktion 7 och 8 (Figur 53) samt IMAC-elueringsfraktion 9-15 (Figur 54) var mycket renare än tidigare. Även prov efter buffertbytet till gelfiltreringsbuffert 2 av IMAC-elueringsfraktion 5-6 respektive 7-15
analyserades med SDS-PAGE (Figur 54), vilken visade att samtliga elueringsfraktioner nu innehöll rent MtPrsANHis-protein.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Figur 53. Storskalig proteinexpression av MtPrsANHis. Brunn 1: LMW-stege (94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1;
14,4 kDa); brunn 2: PD-10-eluat med lyseringsbuffert; brunn 3: IMAC flow through; brunn 4:
IMAC-tvättfraktion; brunn 5: IMAC-eluat 1; brunn 6: IMAC-eluat 2; brunn 7: IMAC-eluat 3; brunn 8: IMAC-eluat 4;
brunn 9: IMAC-eluat 5; brunn 10: IMAC-eluat 6; brunn 11: IMAC-eluat 7; brunn 12: IMAC-eluat 8.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figur 54. Storskalig proteinexpression av MtPrsANHis. Brunn 1: LMW-stege (94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1;
14,4 kDa); brunn 2: IMAC-eluat 9; brunn 3: IMAC-eluat 10; brunn 4: IMAC-eluat 11; brunn 5: IMAC-eluat 12;
brunn 6: IMAC-eluat 13; brunn 7: IMAC-eluat 14; brunn 8: IMAC-eluat 15; brunn 9: PD-10-eluat med
gelfiltreringsbuffert 2 från IMAC-elueringsfraktion 7-15; brunn 10: PD-10-eluat med gelfiltreringsbuffert 2 från IMAC-elueringsfraktion 5-6.
Mängden framrenat MtPrsANHis-protein från IMAC-elueringsfraktion 7-15 uppmättes till 5,4 mg och från IMAC-elueringsfraktion 5-6 till 1,5 mg, dvs. totalt 6,9 mg framrenat MtPrsANHis-protein och ett utbyte av lösligt protein på 1,7 mg/L cellkultur. Efter att proteinprovet från IMAC-elueringsfraktion 7-15 koncentrerats från 3,5 ml till 0,45 ml uppmättes mängden framrenat MtPrsANHis-protein i dessa fraktioner till 2,9 mg.
3.4.5 Kristalliseringsexperiment av MtPrsANHis
Efter fyra dagar kunde ett lovande brunt precipitat observeras på plattan med
kokristalliseringsförsöket av MtPrsANHis (6,4 mg/ml) tillsammans med MgSO4, ATP och R5P.
Ingen av de övriga uppsatta kristalliseringsexperimenten av MtPrsANHis gav upphov till några proteinkristaller.