Kristalliseringsexperiment av MtPrsA NHis

Kristalliseringsexperiment av MtPrsANHis sattes upp genom att använda ångdiffusionsmetoden med hjälp av screenerna JCSG+, Mini screen och PACT vid rumstemperatur. De 0,8 µl stora sittande dropparna innehöll 0,4 µl proteinlösning (6,5 mg/ml MtPrsA_NHis i gelfiltreringsbuffert 2) och 0,4 µl reservoarlösning. Eftersom MtPrsANHis-proteinlösningen hade en låg ytspänning och inte kunde forma ordentliga droppar gjordes en buffertscreen på en 24-brunnsplatta där droppar med 1 µl proteinlösning och 1 µl buffertlösning inkuberades vid rumstemperatur.

Bufferten från brunn D11 från screenen JCSG+ användes för att sätta upp

kristalliseringsförsök med eftersom möjliga hexagonala kristaller av MtPrsANHis kunde obeserveras i denna brunn efter 3 dagars inkubationstid. De 2 µl stora sittande dropparna innehöll 1 µl proteinlösning (6,5 mg/ml MtPrsA_NHis) och 1 µl reservoarlösning (buffert från JSCG+ brunn 11). Även kokristalliseringsförsök av MtPrsANHis med liganderna MgSO4

(10 mM), ATP (10 mM) och ribos-5-fosfat (10 mM) sattes upp.

3 Resultat och diskussion 3.1 MtIspD (Rv3582c)

3.1.1 Jämförelse med andra sekvenser och strukturer av IspD

Proteiner med sekvenser eller strukturer liknande MtIspD hittades med hjälp av Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) och sökning i Protein Data Bank (PDB) av IspD. En sekvensjämförelse från ClustalW av dessa visas i Bilaga 3.

Förutom att undersöka fullängdsproteinet med en His6-tag, MtIspDNHis, valdes även, med utgångspunkt från fullängdsproteinet MtIspDFL, att skapa konstruktet MtIspDNHisN4 genom att N-terminalt trunkera fyra aminosyror. Eftersom de enligt sekvensjämförelsen (Bilaga 3) inte förekommer i de IspD-varianter från E. coli som har lyckats strukturbestämmas och de inte deltar i dimeriseringsprocessen så är de troligtvis inte viktiga för enzymets funktion. För att minska risken att denna flexibla del av proteinet vid kristallbildning skulle kunna störa kontaktpunkterna mellan proteinmolekylerna trunkerades de bort. Anledningen till att fyra aminosyror trunkerades bort och inte sex stycken är att den femte aminosyran, A, återfinns i E. coli-proteinerna i sekvensjämförelsen. Eftersom det finns konstrukt som är längre än MtIspD-konstruktet C-terminalt, men som ändå har kunnat strukturbestämmas, valdes att inte göra någon trunkering där.

3.1.2 Från kloning till testexpression av MtIspDFL

Fullängdsgenen MtispD_FL renades fram via preparativ 1% agarosgelelektrofores (Figur 6).

Bandet motsvarande MtispD_FL var av rätt storlek (∼700 bp) och skars ut från gelen.

1 2

Figur 6. Preparativ 1% agarosgelelektrofores av MtispD_FL. Brunn 1: 200 bp DNA-stege (O’RangeRuler, Fermentas); brunn 2: MtispDFL.

Efter ligering och transformering av MtispD_FL till kompetenta E. coli-celler isolerades plasmider, vilka användes som templat i en analytisk PCR som analyserades med 1%

agarosgelelektrofores (Figur 7). Klon 1 visade ett svagt band (∼700 bp), vars sekvens sedan verifierades med DNA-sekvensering.

1 2 3 4 5 6 7 8

Figur 7. Analytisk 1% agarosgelelektrofores av MtispD_FL. Brunn 1: 200 bp DNA-stege (O’RangeRuler, Fermentas); brunn 2: klon 1; brunn 3: klon 2; brunn 4: klon 3; brunn 5: klon 4; brunn 6: klon 5; brunn 7: klon 6;

brunn 8: 200 bp DNA-stege (O’RangeRuler, Fermentas).

Testexpressionen av plasmider från klon 1 av MtispDFL analyserades med hjälp av SDS-PAGE (Figur 8). Här syns ingen klar expression av MtIspDFL, men ett svagt band med korrekt molekylmassa (24,0 kDa) kunde urskiljas.

1 2 3

Figur 8. Analys av testexpression av MtIspD_FL med SDS-PAGE. Brunn 1: LMW-stege (94,0; 67,0; 43,0;

30,0; 20,1; 14,4 kDa); brunn 2: klon 1 negativ kontroll med icke-inducerade E. coli-celler; brunn 3: klon 1 efter induktion.

3.1.3 Kloning av MtIspD_NHis och MtIspD_NHisN4

Konstrukten MtispDNHis och MtispDN4 renades fram via preparativ 1% agarosgelelektrofores (Figur 9). Inget band motsvarande MtispD_NHis och endast ett svagt band motsvarande

MtispDN4 (∼700 bp) kunde urskiljas.

1 2 3

Figur 9. Preparativ 1% agarosgelelektrofores av MtispD_NHis och MtispD_N4. Brunn 1: 200 bp DNA-stege (O’RangeRuler, Fermentas); brunn 2: MtispD_NHis.; brunn 3: MtispD_N4.

Efter att ha ändrat renatureringstemperaturen vid PCR-reaktionerna från 60°C till 57°C kunde konstrukten MtispD_NHis, MtispD_N4 och MtispD_NHisN4 renas fram via preparativ 1%

agarosgelelektrofores (Figur 10). Starka band motsvarande MtispD_NHis, MtispD_N4 och MtispD_NHisN4 (∼700 bp) kunde observeras på gelen. Banden motsvarande MtispDNHis och MtispDNHisN4 skars ut från gelen.

1 2 3 4

Figur 10. Preparativ 1% agarosgelelektrofores av MtispD_NHis, MtispD_N4 och MtispD_NHisN4. Brunn 1: 200 bp DNA-stege (O’RangeRuler, Fermentas); brunn 2: MtispD_NHis; brunn 3: MtispD_N4; brunn 4: MtispD_NHisN4.

Efter ligering och transformering av MtispDNHis och MtispDNHisN4 till kemiskt kompetenta E. coli-celler isolerades plasmider som använde som templat i en analytisk PCR som analyserades med 1% agarosgelelektrofores (Figur 11). Klon 5 av konstruktet MtispD_NHis respektive klon 1 av konstruktet MtispDNHisN4 visade svaga band med rätt insertstorlek (∼700 bp), vilkas sekvenser sedan verifierades med DNA-sekvensering.

A 1 2 3 4 5 6 7 B 1 2 3 4 5 6 7

Figur 11. Analytisk 1% agarosgelelektrofores av (A) MtispD_NHis och (B) MtispD_NHisN4.

A. MtispD_NHis. Brunn 1: 200 bp DNA-stege (O’RangeRuler, Fermentas); brunn 2: klon 1; brunn 3: klon 2;

brunn 4: klon 3; brunn 5: klon 4; brunn 6: klon 5; brunn 7: klon 6.

B. MtispD_NHisN4. Brunn 1: 200 bp DNA-stege (O’RangeRuler, Fermentas); brunn 2: klon 1; brunn 3: klon 2;

brunn 4: klon 3; brunn 5: klon 4; brunn 6: klon 5; brunn 7: klon 6.

3.1.4 Testexpression och rening av MtIspD_NHis och MtIspD_NHisN4

Plasmider från klon 5 av konstruktet MtispDNHis respektive från klon 1 av konstruktet MtispDNHisN4 transformerades in i kemiskt kompetenta E. coli-celler. En testexpression genomfördes och analyserades med hjälp av SDS-PAGE (Figur 12). Testexpressionen visade att båda proteinerna, MtIspDNHis och MtIspDNHisN4 (24,0 kDa), var uttryckta och rena.

A 1 2 3 4 5 6 7 8 B 1 2 3 4 5 6 7 8

Figur 12. Testexpression av (A) MtIspD_NHis klon 5 och (B) MtIspD_NHisN4 klon 1. Brunn 1: LMW-stege (94,0;

67,0; 43,0; 30,0; 20,1; 14,4 kDa); brunn 2: negativ kontroll med icke-inducerade E. coli-celler; brunn 3: efter induktion; brunn 4: olöslig pellet; brunn 5: löslig supernatant; brunn 6: IMAC flow through; brunn 7: IMAC-tvättfraktion; brunn 8: IMAC-eluat.

3.1.5 Storskalig proteinexpression och rening av MtIspD_NHis

Vid SDS-PAGE-analys av den storskaliga proteinexpressionen av konstrukten MtIspDNHis var en stor del av proteinet olösligt, men det fanns trots allt en liten del protein i löslig form. Efter buffertbyte på PD-10-kolonnen verkar en del protein gå förlorat (Figur 13).

A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figur 13. Storskalig proteinexpression av MtIspD_NHis klon 5 efter induktion med (A) 0,2 mg/ml L-arabinos respektive (B) 0,02 mg/ml L-arabinos. Brunn 1: LMW-stege (94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1; 14,4 kDa); brunn 2:

negativ kontroll med icke-inducerade E. coli-celler; brunn 3: efter induktion; brunn 4: olöslig pellet; brunn 5:

löslig supernatant; brunn 6: IMAC flow through; brunn 7: IMAC-tvättfraktion; brunn 8: IMAC-eluat; brunn 9:

PD-10-eluat; brunn 10: LMW-stege (94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1; 14,4 kDa).

Efter gelfiltrering av en del av MtIspDNHis-provet (1,75 ml av totalt 7 ml) var det mycket lite protein kvar (Figur 14).

Figur 14. Gelfiltrering av MtIspD_NHis.

Vid SDS-PAGE-analys av elueringsfraktionerna från HiLoad™ 16/600 Superdex™ 75 pg-kolonnen av konstruktet MtIspD_NHis kunde inget MtIspD_NHis-protein urskiljas (data visas inte).

Detta kan bero på liten mängd protein, men troligen på att förhållandena för proteinet inte var gynnsamma i bufferten.

En annan buffert, innehållandes NaH₂PO₄ istället för Na₂SO₄, användes vid buffertbyte på en PD-10-kolonn. Detta gjordes för att undersöka huruvida bufferten med NaH2PO4 är mer gynnsam för proteinet. Gelfiltrering kördes inte utan koncentrationen mättes direkt på detta prov, vilket innebär att en del orenheter fanns kvar. Mängden framrenat MtIspD_NHis-protein från 1,07 L cellkultur uppmättes till 11,7 mg. Utbytet av lösligt MtIspDNHis-protein var således 10,9 mg/L cellkultur.