Vacciner mot hepatit C - vad har framtiden att erbjuda?: En studie om framtida potentiella vacciner för att förhindra smitta med hepatit C.

Fakulteten för hälso- och livsvetenskap

Examensarbete

Vacciner mot hepatit C – vad har

framtiden att erbjuda?

En studie om framtida potentiella vacciner för att

förhindra smitta med hepatit C.

Namn: Jennifer Allansson Handledare: Ran Friedman Termin: VT-2020

Ämne: Farmaci Nivå: Grundnivå Kurskod: 2FA01E

Vacciner mot hepatit C – vad har framtiden att erbjuda?

Intern handledare: Docent, Ran Friedman Linnéuniversitetet

Inst. för Kemi och Biomedicin SE-391 82 KALMAR

Examinator: Universitetslektor, Kristina Magnusson Linnéuniversitetet

Inst. för Kemi och Biomedicin SE-391 82 KALMAR

Sammanfattning

Introduktion: Hepatit C är en inflammation av levern orsakad av hepatit C-viruset. Runt 71 miljoner människor världen över är drabbade av den kroniska formen. Effektiva läkemedel finns för att bota sjukdomen, men dessa är dyra och således behövs ett vaccin. Problemet med viruset är den stora variationen av genotyper och subtyper, vilket försvårar vaccinutvecklingen eftersom vaccinet framför allt kommer vara effektivt för en viss grupp smittade. En rad prekliniska studier har gjorts på olika djurslag, där fokus oftast ligger på att generera både antikroppar och att framkalla effektiva T-celler. Tyvärr har dock ingen större framgång gällande vaccinutvecklingen setts till ännu.

Syfte: Litteraturstudiens syfte gick ut på att analysera olika hepatit C-vacciners effekter med avsikten att försöka få en insikt i hur dessa kommer att tillverkas i framtiden för att de ska ge en fullgod effekt hos människor och förhindra smittspridning.

Material och metod: Databasen PubMed användes för att hitta fem olika vetenskapliga artiklar att analysera. Sökorden som användes för att hitta samtliga av dessa studier var ”vaccines hepatitis c”. Endast prekliniska studier valdes ut för analys.

Resultat: Över lag sågs kraftiga responser från immunförsvarets sida till följd av stimulering med olika typer av vacciner. Responserna förmedlades av antikroppar samt cytotoxiska celler och T-hjälparceller, ofta genom en produktion av interferon gamma respektive tumörnekrosfaktor alfa. I processen skapades även minnesceller som snabbt kunde reagera vid återexponering av samma antigen.

Slutsats: Fler prekliniska experiment kommer att behöva genomföras innan vaccinen kan ta sig vidare till klinisk fas. Exakt när i framtiden ett vaccin kommer hittas, och om det kommer hittas, är svårt att förutspå. Under tiden finns antivirala läkemedel att tillgå i brist på en mer effektiv lösning.

Nyckelord

Hepatit C, HCV, vaccin, T-celler, antikroppar, cytokiner, immunologi.

ABSTRACT

Background: Hepatitis C is an inflammation of the liver caused by the hepatitis C

virus. Around 71 million people worldwide are affected by the chronic form of the infection. Effective drugs are available to cure the disease, but these are expensive and thus a vaccine is needed. The problem with the virus is the wide variety of genotypes and subtypes, which complicates vaccine development since the vaccine will be especially effective for a particular group of infected individuals. A number of

preclinical studies have been conducted on different animal species, where the focus is usually on generating both antibodies and producing efficient T lymphocytes.

Unfortunately, no major success regarding vaccine development has yet been seen.

Aim: The purpose of this literature study was to analyze the effects of various hepatitis

C vaccines with the intention of trying to gain an insight into how these will be manufactured in the future in order to generate an adequate effect in humans and prevent the spread of infection.

Materials and methods: The database PubMed was used to find five different

scientific articles to analyze. The keywords used to find each of these studies were "vaccines hepatitis c". Only preclinical studies were selected for evaluation.

Results: Overall, strong responses were seen from the immune system as a result of

stimulation with different types of vaccines. Responses were mediated by antibodies as well as cytotoxic T cells and T helper cells, often through the production of interferon gamma and tumor necrosis factor alpha. In the process, memory cells were also generated that could react rapidly upon re-exposure of the same antigen.

Conclusion: More preclinical experiments will need to be carried out before the

vaccines can move forward to clinical trials. Exactly when in the future a vaccine will be found, and if it will be found, is difficult to predict. Meanwhile, antiviral drugs are available in the absence of a more effective solution.

FÖRKORTNINGAR

Brett neutraliserande antikroppar (BnAbs)

Dimethyldioctadecylammonium bromide (DDA)

Direktverkande antiviralt läkemedel (DAA)

DNA-launched self-amplifying RNA replicon (DREP)

Enzyme-linked immunospot assay (ELISpot)

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Hepatit C-virus (HCV)

Interferon (IFN)

Interleukin (IL)

Intracellular cytokine staining (ICS)

Modified vaccinia virus Ankara (MVA)

Monomycolol glycerol (MMG)

Multiple antigenic peptide (MAP)

Non-structural (NS)

Peripheral blood mononuclear cell (PBMC)

Plaque-forming unit (PFU)

Polyinosinic-poly(C) (poly(I•_C)

T-hjälparcell (Th-cell)

INNEHÅLLSFÖRTECKNING

INTRODUKTION ________________________________________ - 1 -

SYFTE _________________________________________________ 6

MATERIAL OCH METOD ________________________________ 6

-RESULTAT _____________________________________________ - 6 -

Studie 1 _________________________________________________________ - 8 -

Preclinical evaluation of multi antigenic HCV DNA vaccine for the prevention of Hepatitis C virus infection

Studie 2 ________________________________________________________ - 11 - Potent Anti-hepatitis C Virus (HCV) T Cell Immune Responses Induced in Mice Vaccinated with DNA-Launched RNA Replicons and Modified Vaccinia Virus Ankara-HCV

Studie 3 ________________________________________________________ - 15 - A multiepitope peptide vaccine against HCV stimulates neutralizing humoral and persistent cellular responses in mice

Studie 4 ________________________________________________________ - 18 - Immunization With a Subunit Hepatitis C Virus Vaccine Elicits Pan

Genotypic Neutralizing Antibodies and Intrahepatic T-Cell Responses in Nonhuman Primates

Studie 5 ________________________________________________________ - 22 - Broadening CD4+ _{and CD8}+ _{T Cell Responses against Hepatitis C Virus by}

Vaccination with NS3 Overlapping Peptide Panels in Cross-Priming Liposomes

DISKUSSION __________________________________________ - 24 -

TACK _________________________________________________ 33

REFERENSER _________________________________________ 34

-INTRODUKTION

Hepatit C

Allmänt

Hepatit C är en inflammationssjukdom orsakad av hepatit C-viruset (HCV). Smitta med HCV leder till att levern blir inflammerad och i längden kan detta ge upphov till

allvarligare komplikationer, såsom levercirros och levercancer. Det är den kroniska formen som kan ge upphov till detta och de allra flesta hepatit C-infektioner är just kroniska, ca. 70%, vilket motsvarar runt 71 miljoner människor runt om på jorden (1-3). Omkring 30% av hepatit C-infektionerna tas effektivt om hand av immunförsvaret, d.v.s. ungefär 30% är akuta infektioner som till slut läker ut (1, 3). I Sverige har antalet drabbade, både av den akuta och den kroniska formen, minskat för varje år enligt statistik från de senaste fem åren. År 2018 hade ca. 1 600 svenska medborgare någon variant av hepatit C (4). Smitta från person till person sker främst via blod och missbrukare som delar sprutor med varandra är en stor riskgrupp (3, 4).

Akut hepatit C ger i de flesta fallen inte några symtom alls, men de som får symtom märker till en början av aptitlöshet och illamående. Huvudvärk och feber samt trötthet och smärta i hela kroppen är också symtom som förekommer under den första perioden. Dessa symtom brukar sedan klinga av, förutom tröttheten, som brukar bli bestående under hela den akuta infektionstiden och även en tid efter att infektionen försvunnit. Efter att symtom som huvudvärk m.m. har klingat av är det inte ovanligt att få gula ögon och gulaktig hud samt mörkare urin och ljusare avföring. Om sjukdomen sedan går över i kronisk fas eller inte går att testa med ett blodprov. Den kroniska fasen brukar inte ge några symtom och det kan därför vara svårt att veta om sjukdomen gått över eller om behandling krävs (3). Från början behandlades HCV-infektioner med interferon, men dessa hjälpte endast vissa människor och biverkningarna var svåra. Efteråt kom direktverkande antiviraler (DAAs) med lindrigare biverkningar och som hjälper de allra flesta smittade, ca. 90 – 95%, att bli av med den kroniska infektionen. Även om DAAs är mycket effektiva, finns det ändå en del problem relaterade till dem, ex. kostnaderna för behandlingen och risk för resistensutveckling plus att de inte

förhindrar att en ny HCV-infektion drabbar samma individ längre fram i tiden. Av dessa anledningar behövs ett vaccin (1, 5, 6).

Hepatit C-viruset

Familjen som HCV tillhör kallas Flaviviridae och viruset är ett positivt, enkelsträngat RNA-virus. HCV har gener som ger uttryck för de strukturella proteinerna core, E1 och E2, samt de icke-strukturella proteinerna NS-2, -3, -4A, -4B, -5A och -5B (se nedan,

Figur 1). Viruset kan även ge upphov till protein p7, som varken tillhör de strukturella

eller de icke-strukturella proteinerna (7). Samtliga nämda proteiner har olika förmåga att framkalla immunresponser och de har därför använts i olika prekliniska prövningar i hopp om att hitta ett eller flera framtida vaccin(er) mot hepatit C (1, 5, 6, 8, 9).

Det finns flera olika genotyper av HCV, närmare bestämt åtta stycken, s.k. genotyp 1 – 8. Allra vanligast runt om i världen är genotyp 1 och näst vanligast är genotyp 3. Genotyp 8 upptäcktes för inte alls länge sedan och fall har rapporterats för endast ett fåtal individer. Utöver den breda upplagan av genotyper finns en ännu bredare upplaga

av subtyper, ca. 90 stycken. Detta beror på en hög frekvens av mutationer hos HCV som ger upphov till ett brett intervall av genetiska variationer (10).

Figur 1. Figuren visar de strukturella och icke-strukturella proteiner som hepatit C-virusets

gener kodar för (Källa: Wikipedia, Public Domain. Länk:

https://en.wikipedia.org/wiki/Hepacivirus_C#/media/File:HCV_genome.png).

HCV och immunförsvaret

Cellresponser

För en effektiv kontroll av hepatit C är det viktigt med väl fungerande T-celler, både cytotoxiska T-celler och T-hjälparceller (Th-celler). T-celler som är effektiva ger kraftiga och specifika cellsvar samt en bred respons, d.v.s. respons mot flera olika antigen/epitop. Vid de flesta infektioner framkallas en T-cellsrespons som främst riktar sig mot vissa epitop, s.k. dominanta epitop, men inte mot vissa andra, s.k. subdominanta epitop.

Vid akut hepatit C ses både effektiva cytotoxiska T-celler och Th-celler, med följden att infektionen försvinner och immunitet skapas. Minnes-T-celler bildas som vid nästa infektion känner igen viruset och på så sätt kan ta sig an det direkt. Tvärtom gäller vid den kroniska formen. Vid kronisk hepatit C är T-cellerna till en början bra på att jobba mot infektionen, men efter en tid fungerar de sämre och deras effekt blir mindre optimal (1, 9, 11). Cytotoxiska T-celler, som har förmågan att döda virusinfekterade värdceller,

ger bl.a. en svagare respons p.g.a. utmattning, vilket innebär att cytokinproduktionen minskar (10, 11). T-cellerna får även svårigheter att känna igen epitop som de vanligtvis riktas mot, eftersom HCV muterar på dessa ställen. Ytterligare ett problem vid kroniska HCV-infektioner är att Th-celler finns i en mindre mängd (11). Th-cellerna reglerar responsen av cytotoxiska T-celler och B-cellers produktion av antikroppar. Studier på djur har visat att frånvaron av Th-celler vid en andra HCV-infektion leder till att immunförsvaret inte klarar av att bekämpa infektionen, även om cytotoxiska T-celler, som är riktade mot HCV, finns kvar från en tidigare infektion (9, 11). Th-cellerna besitter fler egenskaper än att endast fungera som regulatorer. Exempelvis kan vissa av dem generera cytotoxiska effekter och på så sätt avdöda infekterade celler (11).

Vikten av cytokiner

Cytokiner kan produceras av T-celler och är en viktig del av immunförsvaret när det kommer till HCV-infektioner. I den kroniska fasen ses en låg produktion av cytokiner, vilket inte är fallet vid akuta infektioner. Några av cytokinerna som spelar en viktig roll vid hepatit C är interferon gamma (IFN-gamma), tumörnekrosfaktor alfa (TNF-alfa), interleukin 2 (IL-2), IL-4 (12) och IL-28B. IL-28B ökar frisättningen av IFN-gamma, som dels gör att cytotoxiska T-celler får ökad cytotoxicitet och som dels stimulerar till Th1-cellsutveckling, en subtyp av Th-celler. Th1-celler hjälper i sin tur till att aktivera cytotoxiska T-celler. Cytotoxiciteten av cytotoxiska T-celler hos personer drabbade av kronisk hepatit C är inte tillräcklig, vilket bl.a. innebär en minskad produktion av IFN-gamma (1). En annan funktion av IFN-IFN-gamma är att det kan hämma hepatit C-virusets replikering (8). TNF-alfa ger, precis som IFN-gamma, också cytotoxiska T-celler ökad cytotoxicitet (1). IL-2 och IL-4 stimulerar celldelningen av T-celler samt B-celler. IL-4 kan även stimulera differentiering av T-celler till mogna effektorceller samt se till att B-celler utvecklas till antikroppsproducerande plasmaB-celler (13, 14). Utöver cytokiner finns det olika markörer som bidrar till immunförsvarets funktioner. En av dem är markören CD107a, som finns på aktiverade cytotoxiska T-cellers ytor och som är en degranulerande faktor, d.v.s. den sköter frisättningen av cytotoxiska molekyler från de aktiverade cellerna (5, 15).

Humorala responser

Det är inte bara T-celler som arbetar för att bli av med HCV-infektioner, även B-celler deltar genom att producera antikroppar, som bidrar i processen med sina neutraliserande effekter. Neutralisering innebär att antikroppar fäster in på virusets yta och förhindrar på så sätt detta att interagera med en värdcell, vilket leder till att denna värdcell skyddas från att bli infekterad (11, 16). Oftast bildas antikroppar mot en viss genotyp av HCV (17). Dock finns det antikroppar som kan neutralisera fler än en genotyp och dessa kallas då för brett neutraliserande antikroppar (BnAbs) (18).

Ett samspel mellan samtliga av ovan nämnda komponenter är viktigt för att så effektivt som möjligt få bukt på olika typer av HCV-infektioner. Nedan (Tabell I) presenteras respektive mediator med tillhörande funktion(er) på ett övergripande sätt.

Tabell I. En sammanfattande överblick av immunförsvarets olika komponenter, som är viktiga

för kontrollen av HCV-infektioner, samt deras funktion(er).

Typ Funktion

Cytotoxiska T-celler - Cytotoxisk inverkan på målceller - Cytokinproduktion

Th-celler - Reglerar T- och B-celler - Cytokinproduktion - Cytotoxiska egenskaper

Th1-celler - Kan aktivera cytotoxiska T-celler

B-celler/plasmaceller - Producerar antikroppar

Minnes-T-celler - Aktiveras direkt vid ny infektion

Neutraliserande antikroppar - Neutraliserar en viss HCV-genotyp

Brett neutraliserande antikroppar - Neutraliserar minst två HCV-genotyper

IFN-gamma - Ökar cytotoxiciteten av T-celler - Ger differentiering till Th1-celler - Hämmar replikation av HCV

TNF-alfa - Ökar cytotoxiciteten av T-celler

IL-2 - Proliferation av T- och B-celler

IL-4 - Proliferation av T- och B-celler - Differentiering av T- och B-celler

IL-28B - Ger frisättning av IFN-gamma

Metoder för mätning av cellsvar/antikroppsproduktion

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) är en immunologisk metod som kan användas för att exempelvis mäta koncentrationen av antikroppar som produceras i ett experiment. Det finns några olika varianter av ELISA och en av dem är direkt ELISA. Vid denna typ täcks en platta med brunnar med ett antigen. Efteråt tillsätts antikroppar som får chansen att binda in till antigenen. Överflödiga antikroppar sköljs sedan bort med någon form av tvättande vätska. På varje antikropp sitter ett enzym och slutligen tillsätts ett ämne som fungerar som substrat för enzymet. Detta ämne kommer då att omvandlas så att ett färgomslag sker, till följd av den färgade produkten som bildas. För att bestämma koncentrationen av molekylen som användes i experimentet mäts

absorptionen i respektive brunn vid en specifik våglängd (19).

ELISpot

Denna metod, enzyme-linked immunospot assay (ELISpot), kan användas för att kvantifiera antalet celler som producerar ett visst cytokin och påminner en del om det som sker vid ELISA. Celler tillsätts till brunnar på en platta tillsammans med fångande antikroppar. Samtidigt som cellerna inkuberas kommer de att producera cytokiner som binder till antikropparna. Efteråt kommer cellerna att tvättas bort och detekterande antikroppar tillsätts som binder till cytokinen. Enzymet som är fäst vid antikropparna kommer att omvandla sitt, sedan tillsatta, substrat till en produkt som fälls ut på botten. Detta gör att fläckar bildas som kan räknas och där varje fläck representerar en enda cell som producerar cytokin (20).

ICS

Intracellular cytokine staining assay (ICS) används för att studera cellers uttryck av olika markörer på deras ytor samt deras tillverkning av olika typer av cytokiner (21). För detta används flödescytometri som detekterande hjälpmedel. Metoden börjar med att celler blir aktiverade i närvaro av ett eller flera antigen. För att cytokinerna som produceras inte ska frisättas från cellen används en inhibitor som hämmar

transportprotein. Efteråt följer tvättning för att cellerna ska släppa från ytan de är fästa vid. Sedan tillsätts antikroppar som binder in till de olika markörerna som cellerna uttrycker. I nästa steg fixeras cellerna och plasmamembranet görs mer permeabelt. Sist sker tillsatsen av en antikropp riktad mot cytokinerna och flödescytometri används (22).

Vacciner

Avsikten med att vaccinera är att framkalla en immunrespons genom att introducera immunförsvaret för någon typ av infektiös partikel, ett antigen. Antigenet ska dock inte ge upphov till sjukdom, utan endast förbereda immuncellerna att ge en respons mot framtida infektiösa agens för att förhindra att sjukdom uppstår (23). Det är inte ovanligt att någon typ av adjuvans adderas till vaccinet. Detta görs för att framkalla extra starka responser från immunförsvarets sida (24). I dagsläget finns inget vaccin som utgör ett skydd mot hepatit C-smitta, men forskare jobbar ideligen med att försöka utveckla ett sådant (2, 10). Med tanke på antalet genotyper och subtyper som HCV uppvisar, p.g.a. ständiga mutationer, samt att det med jämna mellanrum uppmärksammas fall av HCV-infektioner av nya genotyper, är det svårt att hitta ett vaccin som passar alla (10). De flesta studier som har gjorts på levande individer har varit prekliniska och oftast inte lyckats gå längre än så. Målet med de allra flesta av dessa studier har varit att generera neutraliserande antikroppar, helst BnAbs, och/eller att framkalla T-cellsresponser,

förmedlade av cytotoxiska T-celler och Th-celler, specifikt riktade mot HCV (25). Det finns lite olika sätt att gå till väga på vid utformningen av ett nytt vaccin, ex. att producera DNA- och peptidvacciner. Studier har gjorts som har inkluderat alla hepatit C-virusets strukturella och icke-strukturella proteiner samt p7 (1, 5, 6, 8, 9).

DNA-vacciner består av en eller flera plasmider. Dessa plasmider besitter gener som kodar för de proteiner som ska agera antigen i kroppen hos den vaccinerade individen. (23). För att transportera DNA-vaccin in i cellerna kan elektroporering användas, som ger upphov till att plasmamembranet blir instabilt till följd av att det utsätts för

elektriska stötar. Hålrum skapas då i membranet som gör att vaccinet kan passera detta och ta sig in i cellen. (26).

Några eller flera korta peptidfragment kan även tillsammans utgöra ett vaccin, då kallat för ett peptid-vaccin. Dessa är mindre bra på att framkalla immunresponser och kräver ofta någon form av adjuvans eller vektor, d.v.s. en bärare av vaccinet som på sin yta kan uttrycka önskade antigen, ex. ett adenovirus eller modified vaccinia virus Ankara

(MVA) (27-29).

Eftersom ett skydd av hepatit C, i form av ett vaccin, saknas var syftet med studien att analysera fem vetenskapliga artiklar som fokuserar på vaccinutvecklingen mot HCV-infektioner.

SYFTE

Syftet med föreliggande litteraturstudie var att undersöka effekterna av olika vacciner mot hepatit C, hos djur, med avsikten att förutspå hur hepatit C-vacciner kan tänkas framställas i framtiden för att ge fullgod effekt hos människor.

MATERIAL OCH METOD

För att hitta olika studier som passade till det valda syftet i denna litteraturstudie användes hemsidan för Linnéuniversitetets universitetsbibliotek som hjälp. Via

hemsidan valdes databasen PubMed som utgångspunkt för att hitta fem olika studier att analysera. Sökorden ”vaccines hepatitis c” användes för att hitta samtliga studier. För att begränsa sökningen bockades ”Free full text” och ”Full text” i. Studierna skulle ha publicerats inom de senaste fem åren och ”Other Animals” kryssades i vid val av art som studierna gjorts på. Antalet träffar utan filter var 3 997 stycken, men minskade betydligt efter filtret ställdes in och antalet träffar reducerades till 156 stycken. Samtliga av dessa 156 studier gjordes på djur och var maximalt fem år gamla. De fem studier som valdes blev utvalda just för att de olika vaccinen som testades såg lovande ut, baserat på säkerheten och slutresultaten, för framtida användning på människor.

Endast prekliniska studier, gjorda på möss och apor, valdes ut för analys eftersom vacciner mot hepatit C fortfarande befinner sig i utvecklingsfas. Valet av endast

prekliniska studier gjordes även för att värdera effekterna av olika vacciner hos djur för att försöka förutspå huruvida de kan bli potentiella vacciner till människor.

RESULTAT

Resultaten från de fem olika studierna som valts ut presenteras i tur och ordning under nedanstående tabell där första studien som analyserats benämns ”Studie 1”, andra studien ”Studie 2”, o.s.v. För att få en överblick över vilka studier som valts ut för analys samt tillhörande syfte – se Tabell II nedan.

Tabell II. Tabellen visar en översikt av vilka studier som analyserats i arbetet samt syftet med

respektive studie.

Nr. Titel Syfte

1 Preclinical evaluation of multi antigenic HCV DNA vaccine for the prevention of Hepatitis C virus infection

Syftet var att vaccinera möss med olika doser vaccin för att sedan mäta T-cellsresponsen, funktionen av IL-28B samt bedöma vaccinets säkerhet.

2 Potent Anti-hepatitis C Virus (HCV) T Cell Immune Responses Induced in Mice Vaccinated with DNA-Launched RNA Replicons and Modified Vaccinia Virus Ankara-HCV

Studiens syfte var att testa och jämföra fyra olika vacciners effekter avseende T-cellsrespons, antikroppsproduktion och bildandet av minnes-T-celler.

3 A multiepitope peptide vaccine against HCV stimulates neutralizing humoral and persistent cellular responses in mice

Syftet med studien var att immunisera möss med olika doser av vaccin för analys av T-cellsrespons, produktion av antikroppar och neutralisering av virus.

4 Immunization With a Subunit Hepatitis C Virus Vaccine Elicits Pan-Genotypic Neutralizing Antibodies and Intrahepatic T-Cell Responses in Nonhuman Primates

Syftet var att analysera T-cellssvar och produktion av neutraliserande

antikroppar hos rhesusapor efter immunisering med olika doser sE2-vaccin.

5 Broadening CD4+ and CD8+ T Cell Responses against Hepatitis C Virus by Vaccination with NS3

Overlapping Peptide Panels in Cross-Priming Liposomes

Studiens syfte var att analysera T-cellsrespons i form av en

cytokinproduktion, T-cellsrespons mot olika peptider, T-cellsrespons

inducerad av AdNS3 samt

cytotoxiciteten av cytotoxiska T-celler respektive Th-celler.

Studie 1

Preclinical evaluation of multi antigenic HCV DNA vaccine for the prevention of Hepatitis C virus infection (1)

Bakgrund

HCV-infektioner som läkt ut på egen hand, d.v.s. akuta fall, anses utgöra ett skydd mot återkommande infektioner av HCV. Detta beror på det cellssvar som uppstår. T-cellerna hjälper till att bekämpa viruset som finns i kroppen till dess att blodet är fritt från virus och infektionen försvunnit. I processen skapas även minnes-T-celler med lång livslängd som snabbt aktiveras om infektion med samma virus sker igen.

De personer som lider av kronisk hepatit C har T-celler vars förmåga att ge ett svar och bekämpa infektionen inte är tillräcklig. Det var detta som eftersträvades med det

aktuella vaccinet i studien, d.v.s. att inducera T-cellssvar. DNA-vaccinet, som döptes till VGX-6150, var multiantigent och bestod av fyra olika plasmider. Tre utav plasmiderna kodade för olika typer av proteiner som kan hittas hos hepatit C-viruset, närmare bestämt NS3/4A, NS4B och NS5A. Den fjärde plasmiden kodade för cytokinet IL-28B, som fick agera som ett adjuvans.

Syfte

Studiens syfte var att analysera T-cellsresponsen i möss till följd av exponering av antigen samt att analysera funktionen av IL-28B och bedöma säkerheten av vaccinet.

Metod

T-cellsrespons. Mushonor i åldrarna sex till tio veckor delades in i tre olika grupper, där

varje grupp bestod av tjugofyra möss och där varje grupp fick varsin dos av DNA-vaccin. Doseringarna var 5 g/dos, 20 g/dos respektive 40 g/dos. Varje mus fick vaccin injicerat i lårmuskeln totalt tre gånger med två veckors mellanrum mellan varje immunisering. Vaccinet injicerades tillsammans med sterilt vatten i en mängd av 30 l och efteråt tillämpades metoden elektroporering för att föra in vaccinet i cellerna. För att analysera T-cellsresponsen användes gamma ELISpot, som mätte antalet IFN-gammafläckar/miljon mjältceller.

Funktion av IL-28B. Sexton möss delades, på hälften, in i två olika grupper. Den ena

gruppen fick en intramuskulär injektion bestående av 16 g vaccin (inklusive IL-28B)/dos och den andra gruppen fick 16 g vaccin (exklusive IL-IL-28B)/dos injicerat intramuskulärt. Varje mus fick totalt tre injektioner med två veckors mellanrum mellan varje injektion och varje immunisering efterföljdes av elektroporering. T-cellsresponsen mättes med hjälp av IFN-gamma ELISpot.

Säkerhet av vaccinet – en dos. Totalt 96 möss delades in i fyra olika grupper med 24

möss i vardera grupp. En grupp benämndes T1, den andra T2, den tredje T3 och en kontrollgrupp. Kontrollgruppen fick en dos steriliserat vatten injicerat intramuskulärt, följt av elektroporering. T1-, T2- och T3-gruppen fick en dos vaccin injicerat

intramuskulärt i mängder av 40 g, 400 g samt 800 g respektive. Elektroporering efterföljde varje immunisering.

Säkerhet av vaccinet – flera doser. Fyra grupper bildades med 24 möss i respektive

grupp. Grupperna benämndes T1, T2, T3 och en kontrollgrupp. Varje mus injicerades intramuskulärt sammanlagt 14 gånger varannan vecka i 26 veckor följt av

elektroporering efter varje injektion. Mössen i kontrollgruppen fick injektioner av steriliserat vatten. Mössen i T1-, T2- och T3-gruppen blev injicerade med vaccin i doser av 40 g, 400 g samt 800 g respektive. Efter sista injektionen fick mössen återhämta sig i antingen fyra eller åtta veckor.

Resultat

T-cellsrespons. Mössen i den grupp som fick 5 g-doser uppvisade ett medelvärde på

ca. 750 IFN-gammafläckar/miljon mjältceller (se nedan, Tabell III). I gruppen med möss som fick 20 g/dos sågs ett medelvärde på ca. 2 000 IFN-gammafläckar/miljon mjältceller och i gruppen med möss som fick 40 g vaccin/dos uppmättes ett

medelvärde av 1 750 IFN-gammafläckar/miljon mjältceller.

Funktion av IL-28B. Ett medelvärde närmare 1 000 IFN-gammafläckar/miljon

mjältceller (Tabell III) uppmättes då IL-28B inte ingick i vaccinet, medan ett

medelvärde av närmare 2 000 IFN-gammafläckar/miljon mjältceller sågs med IL-28B närvarande.

Säkerhet av vaccinet – en dos. Ingen av grupperna uppvisade några tecken på toxicitet

och engångsdoser av vaccin upp till 800 g bedömdes som säkra för administrering. I muskeln, där injektionen ägde rum, uppmättes först höga koncentrationer av vaccinet, som sedan avtog under 15-36 dagar. Ackumuleringen i andra organ visade sig vara låg eftersom vaccinet snabbt bröts ner i blodet.

Säkerhet av vaccinet – flera doser. Inga skillnader sågs mellan kontrollgruppen och

övriga tre grupper efter fyra respektive åtta veckors återhämtning med avseende på bland annat dödlighet, kroppsvikt, urinsammansättning, organvikt, m.m., vilka var några av de faktorer som analyserades för att avgöra toxiciteten av vaccinet. Doser upp till 800 g vaccin anses således inte ge några oönskade effekter. Efter fyra veckors återhämtning sågs heller ingen ackumulering av vaccinet i varken muskeln där injektionen skedde eller i andra organ.

Tabell III. Översikt över de olika djurgrupperna samt vilken respons de gav upphov till och hur

stor responsen var.

Grupp Respons

5 g-gruppen 750 IFN-gammafläckar/miljon mjältceller

20 g-gruppen 2 000 IFN-gammafläckar/miljon mjältceller

40 g-gruppen 1 750 IFN-gammafläckar/miljon mjältceller

16 g med IL-28B 1 000 IFN-gammafläckar/miljon mjältceller 16 g utan IL-28B 2 000 IFN-gammafläckar/miljon mjältceller

Studie 2

Potent Anti-hepatitis C Virus (HCV) T Cell Immune Responses Induced in Mice Vaccinated with DNA-Launched RNA Replicons and Modified Vaccinia Virus Ankara-HCV (5)

Bakgrund

Olika strategier har testats för att försöka utveckla ett potent vaccin mot hepatit C, varav två av dessa metoder har varit att använda sig av DNA- och MVA-vacciner. Fördelen med DNA-vacciner är bl.a. att de är lätta och billiga att tillverka, de transporteras lätt i kroppen, med häjlp av elektroporering, till platsen där de ska verka och de är säkra att använda. Dock är de mindre effektiva om de ges utan booster-doser (tilläggsdoser), d.v.s. deras immuna effekter är kortvariga och immunsvaret blir svagare. För att förbättra dessa egenskaper kan därför ett MVA-vaccin användas som en booster.

DREP-vacciner är en typ av DNA-vaccin som innehåller molekyler, s.k. RNA-replicons. RNA-molekylerna har gener som kodar för enzymet replikas. Replikas amplifierar RNA-molekylerna, som är dubbelsträngade, och bildar flera kopior av dem. Dessa dubbelsträngade RNA-molekyler har en stimulerande verkan på apoptotiska vägar, vilka leder till att immunförsvaret blir effektivare. DREP-vacciner har alltså förmågan att, p.g.a. de dubbelsträngade RNA-molekylerna, framkalla ett starkare immunsvar än vad vanliga DNA-vacciner, som inte är av DREP-typ, kan göra. Replikas katalyserar även bildandet av mRNA, som innehåller information som kodar för

främmande antigen. För att ytterligare förstärka DREP-vaccinet, förutom att använda ett MVA-vaccin som booster, kan en enhancer tillsättas. Denna enhancer ger ett ökat genuttryck av generna som kodar för antigenen och därmed ett förstärkt immunologiskt svar.

Föreliggande studie gick ut på att analysera effekten av fyra olika alfavirusbaserade DREP-vacciner som kodade för antingen de strukturella proteinerna som kan hittas hos HCV eller som kodade för de icke-strukturella proteiner hos samma virus inklusive p7. Samtliga proteiner var av genotyp 1a. De strukturella proteinerna var core, E1 och E2, de icke-strukturella proteinerna var NS2 respektive NS3 plus p7. Till två utav

vaccinerna tillsattes även en enhancer. Således skapades alltså fyra olika vacciner; (1) DREP, utan enhancer, som kodade för de strukturella proteinerna; (2) DREP, utan enhancer, som kodade för de icke-strukturella proteinerna (inkl. p7); (3) DREP, med enhancer, som kodade för de strukturella proteinerna; (4) DREP, med enhancer, som kodade för de icke-strukturella proteinerna (inkl. p7). Efter varje immunisering med respektive vaccin injicerades en booster-dos med MVA-vaccin. De fyra vaccinerna jämfördes även med en kontrollgrupp, som endast fick MVA-vaccin.

Syfte

Syftet med studien var att analysera T-cellsresponsen (inklusive cytokinfrisättningen av IL-2, TNF-alfa och IFN-gamma samt uttrycket av CD107a) och produktionen av antikroppar gentemot HCV-antigen samt uppkomsten av minnes-T-celler.

Metod

Möss delades in i olika grupper, där varje grupp innehöll tio möss. Grupp 1 blev injicerade intramuskulärt med 25 g DREP-vaccin, utan enhancer, innehållande de strukturella proteinerna och 25 g DREP-vaccin, utan enhancer, innehållande de icke-strukturella proteinerna. Grupp 2 vaccinerades på samma sätt, men med DREP-vaccin med enhancer. DREP-vaccinen injicerades tillsammans med fosfatbuffrad saltlösning i en mängd av 50 l. Grupp 3, d.v.s. kontrollgruppen, blev immuniserade intraperitonealt med 1 x 107 _{PFU av MVA-vaccinet. MVA-vaccinet injicerades tillsammans med 200 l} av fosfatbuffrad saltlösning. Efter femton dagar fick samtliga möss en intraperitoneal booster-dos av MVA-vaccinet i en mängd av 1 x 107 PFU.

Tio respektive femtiotre dagar efter andra immuniseringen dödades fem möss från varje grupp. Deras mjältar användes sedan för att analysera T-cellsresponsen respektive antalet minnes-T-celler med hjälp av ICS. Tio dagar efter andra immuniseringen togs även blodprover från tio utav mössen för att mäta antikroppsproduktionen med hjälp av ELISA.

Resultat

T-cellsrespons. T-cellsresponsen innebar en produktion av IL-2, TNF-alfa, IFN-gamma

respektive CD107a. T-cellsresponsen i grupp 1 och grupp 2 var signifikant högre och även mer potent än T-cellsresponsen i grupp 3. Detta gällde för både Th-celler och cytotoxiska T-celler. Ungefär 5% av Th-cellerna i grupp 1 respektive grupp 2 visade på en respons, medan endast knappt 1% gav respons i grupp 3 (se nedan, Tabell IV). Omkring 60% av de cytotoxiska T-cellerna i grupp 1 uppvisade en T-cellsrespons mot HCV-antigenen och ca. 70% av de cytotoxiska cellerna i grupp 2 visade på en T-cellsrespons mot samma antigen. Denna skillnad var signifikant. Endast ca. 20% av de cytotoxiska T-cellerna i grupp 3 gav en respons.

Andelen av Th-celler, i både grupp 1 och grupp 2, som producerade samtliga

faktorer/markörer som mättes, d.v.s. IL-2, TNF-alfa, IFN-gamma och CD107a, var ca. 2-3%. Grupp 3 producerade också samtliga faktorer/markörer, men antalet Th-celler som uppvisade denna produktion var signifikant lägre, ca. 0,5%, än i grupp 1 och grupp 2. En större andel av de cytotoxiska T-cellerna i grupp 1 och grupp 2, ca. 25-30%, producerade IFN-gamma och CD107a. En mindre andel cytotoxiska T-celler i de båda grupperna, ca. 15-20%, producerade TNF-alfa, IFN-gamma respektive CD107a och ca. 13-20% av de cytotoxiska T-cellerna producerade endast CD107a. Bara en liten andel av de cytotoxiska T-cellerna i grupp 1 och grupp 2, ca. 5-6%, producerade samtliga faktorer/markörer. Grupp 2 låg några procent högre än grupp 1 i samtliga fall. Andelen cytotoxiska T-celler i grupp 3 som producerade de olika faktorerna/markörerna var låg.

Th-cellerna i grupp 1 och grupp 2 gav störst respons gentemot HCV-antigenen E1 och E2. Th-cellerna i grupp 1 svarade framför allt mot E2, medan Th-cellerna i grupp 2 främst svarade mot E1. Th-cellsresponsen i grupp 1 och grupp 2 var signifikant högre än Th-cellsresponsen i grupp 3. De cytotoxiska T-cellerna uppvisade en respons mot framför allt NS2 och NS3. Detta gällde för alla de tre grupperna, men grupp 2

uppvisade en T-cellsrespons som var signifikant högre än den respons som grupp 1 och grupp 3 uppvisade mot NS2 och NS3.

Minnes-T-celler. Andelen minnes-T-celler som uppvisade en respons i grupp 1 och

Grupp 2 gav ett större svar än grupp 1 vad gällde både minnes-Th-cellerna och de cytotoxiska minnes-cellerna, men större andelen minnes-celler var cytotoxiska T-celler. Ungefär 0,5% minnes-Th-celler gav ett svar i grupp 1, ca. 1,3% i grupp 2 och ca. 0,2% i grupp 3, medan ungefär 20% cytotoxiska minnes-T-celler visade respons i grupp 1, drygt 40% i grupp 2 och ca. 6% i grupp 3 (Tabell IV).

Större andelen minnes-Th-celler producerade alla faktorerna/markörerna, alltså IL-2, TNF-alfa, IFN-gamma och CD107a, i alla de tre grupperna. Produktionen i grupp 2 var dock signifikant högre än produktionen i grupp 1 och grupp 3. Minnes-Th-cellerna i grupp 2 gav störst produktion. Den största andelen cytotoxiska minnes-T-celler i alla grupperna producerade antingen alla faktorer/markörer eller tre utav dem, närmare bestämt TNF-alfa, IFN-gamma och CD107a. Grupp 2 stod för den största produktionen, vilken var en signifikant skillnad jämfört med grupp 1 och grupp 3.

De flesta minnes-Th-cellerna i grupp 1 och grupp 2 gav en respons mot E1 och E2. Grupp 2 gav den största responsen mot båda antigenen och denna respons var signifikant högre än den i grupp 1. Responsen mot E1 och E2 i grupp 3 var betydligt lägre än responsen i grupp 1 och grupp 2. De cytotoxiska minnes-T-cellerna uppvisade framför allt en respons mot NS2 och NS3 i alla tre grupperna. Responsen som cellerna i grupp 2 visade var signifikant högre än responsen av cellerna i grupp 1 och grupp 3.

Antikroppsproduktion. Samtliga tre grupper producerade antikroppar av typen IgG mot

HCV-antigenet E2. Koncentrationerna som producerades av alla grupperna var dock mycket låga. Ingen signifikant skillnad sågs mellan grupp 1 och grupp 2, men deras produktion av IgG var högre än för grupp 3. Eftersom antalet antikroppar som producerades var för lågt lyckades inte IgG neutralisera HCV-antigenen i någon av grupperna.

Tabell IV. Översikt över de olika djurgrupperna samt vilken respons de gav upphov till och

vilken celltyp responsen förmedlades av.

Grupp Celltyp Respons

1 Th-cell

Cytotoxisk T-cell

Th-cell (minnescell)

Cytotoxisk T-cell (minnescell)

Produktion av IL-2, TNF-alfa, IFN-gamma och/eller CD107a (5%)*. Produktion av IL-2, TNF-alfa, IFN-gamma och/eller CD107a (60%)*. Produktion av IL-2, TNF-alfa, IFN-gamma och/eller CD107a (0,5%)*. Produktion av IL-2, TNF-alfa, IFN-gamma och/eller CD107a (20%)*.

2 Th-cell

Cytotoxisk T-cell

Th-cell (minnescell)

Cytotoxisk T-cell (minnescell)

Produktion av IL-2, TNF-alfa, IFN-gamma och/eller CD107a (5%)*. Produktion av IL-2, TNF-alfa, IFN-gamma och/eller CD107a (70%)*. Produktion av IL-2, TNF-alfa, IFN-gamma och/eller CD107a (1,3%)*. Produktion av IL-2, TNF-alfa, IFN-gamma och/eller CD107a (40%)*.

3 Th-cell

Cytotoxisk T-cell

Th-cell (minnescell)

Cytotoxisk T-cell (minnescell)

Produktion av IL-2, TNF-alfa, IFN-gamma och/eller CD107a (1%)*. Produktion av IL-2, TNF-alfa, IFN-gamma och/eller CD107a (20%)*. Produktion av IL-2, TNF-alfa, IFN-gamma och/eller CD107a (0,2%)*.

Produktion av IL-2, TNF-alfa, IFN-gamma och/eller CD107a (6%)*.

Studie 3

A multiepitope peptide vaccine against HCV stimulates neutralizing humoral and persistent cellular responses in mice (8)

Bakgrund

För att effektivt kunna kontrollera kroniska hepatit C-infektioner behövs ett vaccin som både framkallar ett T-cellssvar och en produktion av antikroppar. T-cellssvaret som bildas till följd av stimulering med antigen riktas främst mot icke-strukturella proteiner, bl.a. HCV-antigenen NS4B, NS5A och NS5B. Antikroppsproduktionen som sker riktas dock främst mot de strukturella proteinerna, E1 och E2, men framför allt mot E2.

Studien gick ut på att ta fram ett vaccin som hade förmågan att både ge ett T-cellssvar och en produktion av antikroppar med förmågan att kunna neutralisera replikationen av HCV. Av denna anledning syntetiserades sex olika peptid-derivat utifrån olika regioner hos proteinerna E1, E2, NS4B, NS5A och NS5B. En peptid skapades utifrån respektive protein, förutom E2, som gav upphov till två peptider. Samtliga sex peptider var av genotyp 4a och tillsammans bildade de en åttagrenad peptid (MAP) bestående av olika epitop. Vaccinet benämndes HCVp6-MAP.

Syfte

Syftet med studien var att dels analysera T-cellsresponsen mot de sex antigenen, dels att mäta antikroppsproduktionen mot samma antigen och att analysera neutraliseringen av HCV. Målet var också att få ett så specifikt svar som möjligt samt ett långvarigt svar som fortfarande höll i sig flera månader efter immuniseringen.

Metod

Totalt 48 möss delades in i fyra olika grupper, grupp 1, grupp 2, grupp 3 och en kontrollgrupp, så att varje grupp bestod av tolv möss vardera. Mössen i grupp 1

immuniserades med 800 ng av vaccinet, grupp 2 med 1 600 ng av vaccinet, grupp 3 fick en dos av 16 g vaccin och kontrollgruppen fick endast fosfatbuffrad saltlösning i en dos av 120 l. Alla injektioner var subkutana och vaccinet som mössen i grupp 1 – grupp 3 fick injicerades tillsammans med 120 l fosfatbuffrad saltlösning. Samtliga möss immuniserades totalt tre gånger, en gång vecka 0, en gång vecka 4 och en gång vecka 8, med samma dos varje gång. Blodprover togs från mössen precis innan respektive två veckor efter varje immunisering och blodet analyserades med hjälp av ELISA, för mätning av antikroppar, respektive ELISpot, för analys av T-cellssvar. Vecka 20 togs ytterligare ett blodprov från varje mus och analyserades med ELISpot för att studera T-cellsresponsen.

Resultat

T-cellsrespons. Grupp 1 uppvisade ingen T-cellsrespons förrän sex veckor efter

vaccineringen. Då beräknades medelvärdet celler, både Th-celler och cytotoxiska T-celler, som producerade IFN-gamma till 25 T-celler per brunn (totalt 96 brunnar med 20 000 celler/brunn) (se nedan, Tabell V). Medelvärdet sjönk sedan efter åtta veckor, låg kvar på ungefär samma värde efter tio veckor och ökade igen efter 20 veckor till ca. 20 T-celler per brunn. T-cellsresponsen i grupp 2 var mer stabil och fluktuerade runt ca. 20 T-celler per brunn från och med två veckor efter vaccineringen till 20 veckor efter vaccineringen. I grupp 3 sågs en T-cellsrespons redan två veckor efter vaccineringen, men denna respons var låg, ca. 6 T-celler per brunn. Medelvärdet av antalet T-celler,

som producerade IFN-gamma, ökade till åtta veckor efter vaccineringen, då responsen var ca. 17 T-celler per brunn. Efter 20 veckor låg responsen på ca. 15 T-celler per brunn. T-cellsresponserna som uppvisades i grupp 1 – grupp 3 var signifikant högre än T-cellsresponsen som kontrollgruppen uppvisade.

Antikroppsproduktion. Antikroppsproduktionen, i form av IgG-antikroppar, mättes mot

var och en av de strukturella peptiderna, s.k. peptid-315, -412 respektive -517, mot en blandning av de strukturella peptiderna och mot en blandning av samtliga strukturella och icke-strukturella peptider, d.v.s. mot HCVp6-MAP.

I grupp 1 låg absorbansen/den optiska densiteten (OD), vecka 2 och vecka 4, mellan ca. 0,1 – 0,4 för IgG som riktades mot samtliga peptider och blandningar av peptider (se nedan, Tabell VI). Vecka 6 och vecka 8 ökade koncentrationen av antikroppar och OD låg mellan ca. 0,3 och 0,6. Högst var koncentrationen antikroppar som riktades mot HCVp6-MAP; OD var ca. 0,6 vecka 6 och vecka 8. Den tionde veckan varierade OD mellan ca. 0,4 och 0,5. Även i grupp 2 var antikroppskoncentrationen som lägst under vecka 2 och vecka 4 då OD varierade mellan ca. 0,2 och 0,3. Under vecka 6 och vecka 8 steg OD till mellan ca. 0,3 och 0,5. Efter tio veckor var halten IgG som högst och OD låg mellan ca. 0,6 – 0,7 för samtliga peptider och blandningar av peptider. I grupp 3 sågs de högsta koncentrationerna av antikroppar vecka 4 och vecka 10 då OD var ca. 0,5 – 0,6 respektive 0,5 – 0,7 för alla peptider och peptidblandningar. Kontrollgruppen jämfördes med grupp 1 – grupp 3 och OD varierade mellan ca. 0,1 – 0,2 vid varje mätning. Skillnaden mellan OD-värdena för IgG som riktades mot blandningen av de strukturella peptiderna jämfört för IgG som riktades mot HCVp6-MAP var inte signifikant. Däremot var OD-värdena för blandningen av strukturella peptider och HCVp6-MAP signifikant högre än OD-värdena för varje enskild peptid.

Neutralisering med antikroppar – JFH1 (genotyp 2a). Effekten av neutraliserande

IgG-antikroppar testades i närvaro av ett HCV-isolat, kallat JFH1, av genotyp 2a. Samtliga doser av vaccinet som tilldelades de tre grupperna lyckades helt och hållet att neutralisera virusen.

Antikropparna från grupp 1 lyckades hämma ungefär 40% av virusen, grupp 2 ca. 70% av virusen och grupp 3, som fick den högsta vaccin-dosen, genererade IgG-antikroppar som neutraliserade ca. 75% av virusen.

Neutralisering med antikroppar – ED43/JFH1 (genotyp 4a/2a). De neutraliserande

IgG-antikropparnas effekt analyserades även i närvaro av virus som uppvisade två olika genotyper, 4a respektive 2a, och som benämndes ED43/JFH1.

Grupp 1 producerade antikroppar som hämmade ca. 25% av virusen, grupp 2 ca. 50% av virusen och grupp 3 ungefär 60% av virusen.

Tabell V. Översikt över de olika djurgrupperna samt vilken respons de gav upphov till. Grupp Respons 1 Produktion av IFN-gamma (25 st., v. 6)* Produktion av IFN-gamma (20 st., v. 20)* 2 Produktion av IFN-gamma (20 st., v. 2 - 20)* 3 Produktion av IFN-gamma (6 st., v. 2)* Produktion av IFN-gamma (17 st., v. 8)* Produktion av IFN-gamma (15 st., v. 20)* Kontroll ---

(Antal, v)* Antalet T-celler som gav respons samt hur många veckor efter vaccineringen responsen gavs

Tabell VI. Antikroppsproduktionen i form av IgG under olika veckor, mätt i optisk densitet.

Grupp Vecka OD 1 2 och 4 6 och 8 10 0,1 – 0,4 0,3 – 0,6 0,4 – 0,5 2 2 och 4 6 och 8 10 0,2 – 0,3 0,3 – 0,5 0,6 -0,7 3 4 10 0,5 – 0,6 0,5 – 0,7

Studie 4

Immunization With a Subunit Hepatitis C Virus Vaccine Elicits Pan-Genotypic Neutralizing Antibodies and Intrahepatic T-Cell Responses in Nonhuman Primates (6)

Bakgrund

Eftersom det finns så många olika genotyper av HCV är det svårt att hitta ett vaccin som kan eliminera virusen och minska deras spridning. För att så effektivt som möjligt kunna kontrollera HCV-infektioner behövs ett vaccin som både kan framkalla en T-cellsrespons och en produktion av neutraliserande antikroppar riktade mot flera olika genotyper.

sE2-vaccinet, d.v.s. vaccinet som prövades i studien, innehöll antigenet och det strukturella proteinet E2. Rhesusapor blev immuniserade med olika doser av sE2-vaccinet för att analysera uppkomsten av T-cellssvar samt produktionen av neutraliserande antikroppar.

Syfte

Syftet med studien var att analysera T-cellssvar, i form av produktion av IL-4 och IFN-gamma, samt uppkomsten av minnes-T-celler. Studiens syfte var även att studera antikroppsproduktion och antikropparnas förmåga att neutralisera flera olika HCV-genotyper.

Metod

Totalt 20 rhesusapor, tio honor respektive tio hanar, delades slumpmässigt in i fyra olika grupper bestående av fem apor vardera. En av grupperna agerade kontrollgrupp och övriga tre grupper fick varsin dos vaccin plus någon form av medium att lösa vaccinet i. Immuniseringarna gjordes intramuskulärt. Kontrollgruppen benämndes grupp A och för att separera aporna blev de tilldelade varsitt nummer, således benämndes aporna A1-A5. Denna grupp fick en dos av 500 g 2%-ig alum, ett medium. Grupp B, bestående av apa B1-B5, injicerades med 200 g vaccin, som innehöll alum i en dos av 500 g. Grupp C, bestående av apa C1-C5, fick en kombination av 200 g vaccin, 500 g alum och 500 g CpG, ytterligare ett medium. Den fjärde gruppen, grupp D, som bestod av apa D1-D5 fick 200 g vaccin plus 500 g alum samt 50 g MPL, ett medium.

Injektionerna utfördes månad 0, 1 och 2 för samtliga apor. Blodprover togs varje månad i åtta månader samt en månad innan försöken påbörjades. Månad fem fick aporna en booster-dos för analys av minnes-T-celler. För att analysera T-cellsresponsen och förekomsten av minnes-T-celler togs ELISpot till som hjälpmedel. Med ELISpot mättes produktionen av IFN-gamma och IL-4. ELISA användes för att mäta produktionen av antikroppar.

Resultat

Antikroppsproduktion. I grupp B – grupp D upptäcktes antikroppar i blodproverna

redan under månad 0, d.v.s. efter den första immuniseringen. För grupp C och grupp D steg antikroppskoncentrationen till och med månad 3. Sedan sjönk den fram till månad 5 och där efter ökade koncentrationen till månad 6, där den var som högst.

Antikroppskoncentrationen sjönk sedan sakta fram till sista mätningen under månad 8. Grupp B följde samma mönster som de övriga två grupperna förutom att

antikroppskoncentrationen började sjunka en månad tidigare, d.v.s. under månad 2. Grupp D hade hela tiden en lite högre produktion av antikroppar än vad grupp B och grupp C hade. Kontrollgruppen, grupp A, uppvisade ingen signifikant produktion av antikroppar.

T-cellsrespons. De flesta aporna i grupp B – grupp D uppvisade en T-cellsrespons i

form av en IFN-gammaproduktion. Signifikanta skillnader mellan T-cellsresponsen i vaccinet jämfört med T-cellsresponsen i mediumet sågs hos alla de tre immuniserade grupperna förutom hos apa B1, C4, D3 och D5. T-cellsresponserna varierade allt från ca. 10 gammaproducerande T-celler/miljon mjältceller till ungefär 1 000 IFN-gammaproducerande T-celler/miljon mjältceller (se nedan, Tabell VII).

Kontrollgruppen uppvisade ingen signifikant T-cellsrespons hos någon av aporna. Likt IFN-gammaproduktionen sågs även en produktion av IL-4 från T-cellerna hos de flesta aporna i grupp B – grupp D. Signifikanta skillnader i T-cellsresponser mellan vaccin och medium sågs hos samtliga tre grupper med undantag för apa B1, C4, D1, D3 och D5. Variationerna i cellsresponser låg mellan ca. 10 IL-4-producerande

T-celler/miljon mjältceller och ca. 160 IL-4-producerande T-T-celler/miljon mjältceller. Även vad gällde IL-4 uppvisade inte kontrollgruppen någon signifikant T-cellsrespons hos någon av aporna A1-A5.

När IFN-gammaproduktionen mättes för samtliga fyra grupper under månad 4, sågs en signifikant skillnad i T-cellsrespons mellan vaccinet och mediumet hos grupp C och grupp D. T-cellsresponsen, i grupperna som uppvisade en signifikant skillnad, låg mellan ca. 250 IFN-gammaproducerande T-celler/miljon PBMCs (blodceller

innehållande bl.a. T-celler) och 400 IFN-gammaproducerande T-celler/miljon PBMCs (Tabell VII). Under månad 8 mättes IFN-gammaproduktionen igen och då sågs ingen signifikant responsskillnad i någon av grupperna. Det högsta antalet T-celler, som producerade IFN-gamma under månad 8, uppmättes till 100 T-celler/miljon PBMCs. Vad gällde IL-4-produktionen sågs signifikanta skillnader i T-cellsrespons, mellan vaccinet och mediumet, i grupp B och grupp D. Ca. 100 IL-4-producerande

T-celler/miljon PBMCs sågs för respektive grupp, B och D, under månad 4. Under månad 8 sågs fortfarande en signifikant skillnad hos dessa två grupper, men T-cellsresponsen var större, ca. 200 IL-4-producerande T-celler/miljon PBMCs i grupp B och en lite lägre respons i grupp D.

Under månad 8 analyserades även T-cellsresponser i levern, där samtliga immuniserade grupper, grupp B – grupp D, uppvisade signifikanta skillnader i T-cellsrespons mellan vaccin och medium för både produktionen av IFN-gamma och IL-4. Antalet T-celler, som producerade IFN-gamma respektive IL-4 i de tre grupperna, beräknades vara ca. 1 000 – 2 000 T-celler/miljon lever-lymfocyter (Tabell VII). I kontrollgruppen fanns ingen signifikant skillnad i T-cellsrespons.

Neutralisering med antikroppar. Antikropparnas neutraliserande effekter analyserades

för HCV-genotyp 1 – 7. Grupp B – grupp D lyckades neutralisera ca. 50% eller mer av tre olika virusstammar av genotyp 1b, en stam av genotyp 2a, en av 2b, en av 4a och en av 6a. De tre grupperna neutraliserade ca. 50%. eller mindre av en stam av genotyp 1a och en av 2a. Grupp B och grupp C neutraliserade även ca. 50% eller mindre av en stam av genotyp 3a, en av 5a och en av 7a, medan grupp D neutraliserade ca. 60% av tre senast nämnda genotyper. D-gruppens förmåga att neutralisera olika genotyper låg i genomsnitt högre än för grupp B och grupp C. Kontrollgruppen uppvisade ingen signifikant neutralisering av någon av genotyperna.

Tabell VII. T-cellers produktion av IFN-gamma respektive IL-4 i olika organ under olika

månader.

Grupp Organ Månad Respons

A Mjälte Blod Lever 8 8 4 8 4 8 8 8 IFN-gamma: ---* IL-4: --- IFN-gamma: --- IFN-gamma: --- IL-4: --- IL-4: --- IFN-gamma: --- IL-4: --- B Mjälte Blod Lever 8 8 4 8 4 8 8 8 10 – 1 000 IFN-gammaproducerande T-celler/miljon mjältceller 10 – 160 IL-4-producerande T-celler/miljon mjältceller IFN-gamma: --- IFN-gamma: --- 100 IL-4-producerande T-celler/miljon PBMCs 200 IL-4-producerande T-celler/miljon PBMCs 1 000 – 2 000 IFN-gammaproducerande T-celler/miljon lever-lymfocyter 1 000 – 2 000 IL-4-producerande T-celler/miljon lever-lymfocyter C Mjälte Blod 8 8 4 8 10 – 1 000 IFN-gammaproducerande T-celler/miljon mjältceller 10 – 160 IL-4-producerande T-celler/miljon mjältceller 250 – 400 IFN-gammaproducerande T-celler/miljon PBMCs IFN-gamma: ---

Lever 4 8 8 8 IL-4: --- IL-4: --- 1 000 – 2 000 IFN-gammaproducerande T-celler/miljon lever-lymfocyter 1 000 – 2 000 IL-4-producerande T-celler/miljon lever-lymfocyter D Mjälte Blod Lever 8 8 4 8 4 8 8 8 10 – 1 000 IFN-gammaproducerande T-celler/miljon mjältceller 10 – 160 IL-4-producerande T-celler/miljon mjältceller 250 – 400 IFN-gammaproducerande T-celler/miljon PBMCs IFN-gamma: --- 100 IL-4-producerande T-celler/miljon PBMCs 200 IL-4-producerande T-celler/miljon PBMCs 1 000 – 2 000 IFN-gammaproducerande T-celler/miljon lever-lymfocyter 1 000 – 2 000 IL-4-producerande T-celler/miljon lever-lymfocyter *Ej signifikant

Studie 5

Broadening CD4+ _{and CD8}+ _{T Cell Responses against Hepatitis C Virus by}

Vaccination with NS3 Overlapping Peptide Panels in Cross-Priming Liposomes (9)

Bakgrund

Effektiva Th-celler och cytotoxiska T-celler är viktiga för att förhindra att en akut HCV-infektion övergår i kronisk form. T-cellsresponserna bör riktas mot både dominanta och subdominanta epitop. Ju fler epitop T-cellerna riktas mot, d.v.s. ju bredare T-cellssvaret är, desto mindre är risken att viruset lyckas gömma sig från immuncellerna, ex. genom att mutera sig och visa upp andra epitop än tidigare.

Syftet med studien var att framkalla just kraftiga T-cellsresponser mot olika

antigen/epitop, både dominanta och subdominanta, för ett bredare T-cellssvar. Vaccinet i den föreliggande studien bestod av 62 olika peptider som tillsammans utgjorde hela sekvensen av NS3 (icke-strukturellt protein), genotyp 1b. Bärare av peptiderna, som också fungerar som ett adjuvans som ökar responsen av Th-celler och cytotoxiska T-celler, var en specifik formulering av liposomer av katjon-typ, s.k. CAF09. Vaccinet jämfördes även med ett annat vaccin innehållande en rekombinant form av NS3, rNS3, samt med ett vaccin innehållande NS3, men med ett adenovirus som bärare, s.k. AdNS3.

Syfte

Studiens syfte var att dels analysera T-cellsresponser i form av produktionen av tre olika cytokiner; IFN-gamma, TNF-alfa och IL-2, dels att analysera T-cellsresponser gentemot olika peptider, samt att mäta T-cellsresponser inducerade av AdNS3 och slutligen studera cytotoxiciteten av cytotoxiska T-celler respektive Th-celler.

Metod

Möss delades in i tre olika grupper där en grupp fick NS3 (peptidmix), en grupp fick rNS3 och den tredje gruppen agerade kontrollgrupp. NS3-gruppen fick en blandning av de 62 peptiderna, där dosen för respektive peptid var 10 g, tillsammans med CAF09, som hade sammansättningen DDA (250 g), MMG (50 g) och poly(I•_{C) (50 g).}

rNS3-gruppen fick rNS3 i en dos av 20 g plus CAF09 och kontrollgruppen fick enbart CAF09. Injektionerna gjordes intraperitonealt. Mössen injicerades varannan vecka, med vaccin plus adjuvans eller enbart med adjuvans, totalt tre gånger vardera. Mössen i NS3-gruppen blev även immuniserade en fjärde gång, tolv veckor efter första

immuniseringen. Även en AdNS3-immunisering gjordes på några av mössen en gång, vecka 4, via trampdynan i en 30 l-dos.

ELISA användes för mätningen av IFN-gammaproduktion och flödescytometri användes för att mäta T-cellernas produktion av olika kombinationer av IFN-gamma, TNF-alfa respektive IL-2.

Resultat

T-cellsrespons. T-cellsresponser mättes sex, tolv respektive 14 veckor efter första

immuniseringen. Under vecka 6 var det, i NS3-gruppen, ca. 3,7% av Th-cellerna som producerade IFN-gamma, ca. 4,3% som producerade TNF-alfa och ca. 0,8% som producerade IL-2 (se nedan, Tabell VIII). Antalet cytokinproducerande celler i denna grupp var signifikant högre än antalet cytokinproducerande celler i både rNS3-gruppen

och kontrollgruppen. I rNS3-gruppen producerade ca. 0,8% av T-cellerna IFN-gamma, ca. 1,6% TNF-alfa och ca. 0,3% IL-2. Th-cellsresponserna i båda grupperna var dock kraftiga. I kontrollgruppen sågs en mycket låg cytokinproduktion av respektive cytokin, ca. 0,1% av cellerna uppvisade en respons. Efter tolv veckor var det ca. 1% av Th-cellerna i NS3-gruppen som producerade IFN-gamma, ca. 1,75% som producerade TNF-alfa och ca. 1,5% som producerade IL-2. I rNS3-gruppen producerade ca. 1% av Th-cellerna IFN-gamma, ca. 1,6% producerade TNF-alfa och ca. 1,5% producerade IL-2. I kontrollgruppen var det ca. 0,1% av Th-cellerna som producerade respektive cytokin. Vecka 14 mättes endast Th-cellsresponsen för NS3-gruppen och

kontrollgruppen. Ca. 4% av Th-cellerna producerade då IFN-gamma, ca. 6%

producerade TNF-alfa och ca. 3% producerade IL-2. Denna produktion av cytokiner var signifikant högre än den cytokinproduktion som uppvisades i kontrollgruppen.

I NS3-gruppen var det, under vecka 6, ca. 0,9% cytotoxiska T-celler som producerade IFN-gamma, ca. 0,7% som producerade TNF-alfa och ca. 0,2% som producerade IL-2 (Tabell VIII). Cytokinproduktionen i denna grupp var signifikant högre än

produktionen av cytokiner i både rNS3-gruppen och i kontrollgruppen. Efter tolv veckor hade cytokinproduktionen i NS3-gruppen sjunkit till 0,1% eller lägre för respektive cytokin och ingen signifikant skillnad i cytokinproduktion sågs mellan någon av grupperna. Vecka 14 mättes den cytotoxiska T-cellsresponsen för NS3-gruppen och kontrollgruppen. Då producerade ca. 1% av de cytotoxiska T-cellerna IFN-gamma, ca. 0,8% producerade TNF-alfa och ca. 0,2% producerade IL-2. Cytokinproduktionen i denna grupp var signifikant högre än produktionen av cytokiner i kontrollgruppen.

T-cellsrespons gentemot olika peptider. Grupp rNS3 uppvisade en Th-cellsrespons, i

form av en produktion av IFN-gamma, TNF-alfa och/eller IL-2, mot nio olika peptider utav totalt 62 stycken. Grupp NS3 uppvisade en respons, i form av produktion av de tre cytokinerna, mot samma peptider som grupp rNS3, men även mot ytterligare fyra peptider. I grupp rNS3 uppvisade de cytotoxiska T-cellerna inte något svar alls

gentemot någon av peptiderna. I NS3-gruppen sågs en respons, i form av produktion av IFN-gamma, TNF-alfa och/eller IL-2, mot två olika peptider. Grupp rNS3 och grupp NS3 uppvisade även en produktion av enbart IFN-gamma riktad mot nio respektive 16 olika peptider. T-cellsresponserna analyserades i mjältceller från möss av stammen CB6F1.

Även en annan stam av möss, stam C3H, testades för T-cellsresponser i form av

produktion av IFN-gamma, TNF-alfa och IL-2. Grupp rNS3 gav en Th-cellsrespons mot 14 utav peptiderna. Grupp NS3 gav en Th-cellsrespons mot samma peptider plus tre andra peptider. Ingen cytotoxisk T-cellsrespons uppvisades i någon av de två grupperna.

AdNS3-inducerad T-cellsrespons. Th-cellsresponsen i AdNS3-gruppen var inte

signifikant. Däremot gav NS3-gruppen upphov till en kraftigare Th-cellsrespons i form av en produktion av de tre cytokinerna IFN-gamma, TNF-alfa och/eller IL-2. Båda dessa grupper gav dock upphov till signifikanta cytotoxiska T-cellsresponser. Den största andelen av dessa cytotoxiska T-celler, i respektive grupp, producerade både IFN-gamma och TNF-alfa.

Cytotoxicitet av cytotoxiska T-celler respektive Th-celler. Celler märkta med

fluorescerande färg, innehållande två utav de 62 peptiderna, antingen peptid 51 eller peptid 52, injicerades i möss i NS3- respektive AdNS3-gruppen under vecka 6. De cytotoxiska T-cellerna i AdNS3-gruppen dödade ca. 20,3% av målcellerna innehållande

peptid 52 och de cytotoxiska T-cellerna i NS3-gruppen dödade ca. 23% av målcellerna med peptid 52. Avdödningen av celler i dessa två grupper var signifikant högre än avdödningen i kontrollgruppen, där de cytotoxiska T-cellerna inte lyckades döda några målceller alls. Vad gällde målcellerna innehållande peptid 51 avdödades ca. 42,9% av dessa, av de cytotoxiska T-cellerna i NS3-gruppen. Avdödningen av målceller i denna grupp var signifikant högre än avdödningen i AdNS3-gruppen, där inga celler dödades alls, respektive i kontrollgruppen, där endast en låg andel målceller dödades.

Cytotoxiska Th-cellsresponser testades också genom att injicera möss i NS3-gruppen med fluorescensmärkta celler innehållande antingen peptid 46 eller peptid 60. Th-cellerna lyckades avdöda ca. 50% av målTh-cellerna innehållande peptid 46 och ca. 12% av målcellerna innehållande peptid 60. Dessa siffror var signifikanta och dessutom

signifikant högre än avdödningen i kontrollgruppen för respektive peptid.

Tabell VIII. Andelen T-celler som gav ett svar i form av produktionen av IFN-gamma,

TNF-alfa och IL-2 under olika veckor.

Grupp Celltyp Vecka Cytokin Andel i %

NS3 Th-cell Th-cell Th-cell Cytotoxisk T-cell Cytotoxisk T-cell Cytotoxisk T-cell Th-cell Th-cell Th-cell Cytotoxisk T-cell Cytotoxisk T-cell Cytotoxisk T-cell Th-cell Th-cell Th-cell 6 6 6 6 6 6 12 12 12 12 12 12 14 14 14 IFN-gamma TNF-alfa IL-2 IFN-gamma TNF-alfa IL-2 IFN-gamma TNF-alfa IL-2 IFN-gamma TNF-alfa IL-2 IFN-gamma TNF-alfa IL-2 3,7 % 4,3 % 0,8 % 0,9 % 0,7 % 0,2 % 1 % 1,75 % 1,5 % ---* --- --- 4 % 6 % 3 %

Cytotoxisk T-cell Cytotoxisk T-cell Cytotoxisk T-cell 14 14 14 IFN-gamma TNF-alfa IL-2 1 % 0,8 % 0,2 % rNS3 Th-cell Th-cell Th-cell Cytotoxisk T-cell Cytotoxisk T-cell Cytotoxisk T-cell Th-cell Th-cell Th-cell Cytotoxisk T-cell Cytotoxisk T-cell Cytotoxisk T-cell 6 6 6 6 6 6 12 12 12 12 12 12 IFN-gamma TNF-alfa IL-2 IFN-gamma TNF-alfa IL-2 IFN-gamma TNF-alfa IL-2 IFN-gamma TNF-alfa IL-2 0,8 % 1,6 % 0,3 % --- --- --- 1 % 1,6 % 1,5 % --- --- ---Kontroll Th-cell Th-cell Th-cell Cytotoxisk T-cell Cytotoxisk T-cell Cytotoxisk T-cell Th-cell Th-cell Th-cell Cytotoxisk T-cell Cytotoxisk T-cell Cytotoxisk T-cell 6 6 6 6 6 6 12 12 12 12 12 12 IFN-gamma TNF-alfa IL-2 IFN-gamma TNF-alfa IL-2 IFN-gamma TNF-alfa IL-2 IFN-gamma TNF-alfa IL-2 0,1 % 0,1 % 0,1 % --- --- --- 0,1 % 0,1 % 0,1 % --- --- ---

Th-cell Th-cell Th-cell Cytotoxisk T-cell Cytotoxisk T-cell Cytotoxisk T-cell 14 14 14 14 14 14 IFN-gamma TNF-alfa IL-2 IFN-gamma TNF-alfa IL-2 --- --- --- --- --- --- *Ej signifikant

DISKUSSION

Studie 1

Den lägsta dosen av vaccin gav upphov till ca. 750 IFN-gammafläckar/miljon

mjältceller, och den högsta dosen ca. 1 750 IFN-gammafläckar/miljon mjältceller. De möss som fick 20 g/dos genererade 2 000 IFN-gammafläckar/miljon mjältceller, vilket tyder på att denna vaccin-dos gav den största och effektivaste T-cellsresponsen.

Samtliga doser, 5 g/dos, 20 g/dos respektive 40 g/dos, visade sig även vara säkra att använda eftersom dosen som låg så högt som 800 g inte uppvisade några tecken på toxicitet vid enkel administrering. Dock sågs en ackumulering av vaccinet precis efter injektionen gjorts, men eftersom koncentrationen avtog och ingen märkvärd

ackumulering uppstod i andra organ bedömdes vaccines som säkert. Även vid flera injektioner av 800 g vaccin/dos ansågs vaccinet som icke-toxiskt då ingen

ackumulering kunde skådas i kroppen efter fyra veckor. Dessutom verkar IL-28B fungera som ett bra och effektivt adjuvans då närvaron av cytokinet ledde till en högre produktion av IFN-gamma, vilket är en känd effekt av cytokinet. Utan IL-28B blev svaret ca. 1 000 gammafläckar/miljon mjältceller och med blev det 2 000 IFN-gammafläckar/miljon (1). Med tanke på resultaten ser DNA-vaccinet ut att vara ett säkert vaccin som bäst fungerar i dosen 20 g och med IL-28B närvarande. Möjligtvis kan detta bli ett framtida vaccin som kan förhindra smitta med hepatit C och bota den kroniska formen om det visar sig vara säkert i människor samt ge en fullgod effekt.

Studie 2

I grupp 1 och grupp 2 var det ca. 5% av Th-cellerna som gav respons i respektive grupp och i grupp 3 ca. 1%. Eftersom denna skillnad var signifikant innebär det att vaccinet gör vad det är tilltänkt att göra, d.v.s. ge en ökad T-cellsrespons (5, 23). Ungefär 70% av de cytotoxiska T-cellerna gav en respons i grupp 2, vilket var ett signifikant högre värde än i grupp 1 och grupp 3, ca. 60% gav respons respektive ca. 20% av de

cytotoxiska T-cellerna. Denna skillnad tyder på att enhancern som fanns närvarande i grupp 2 gav ett ökat uttryck av generna som kodade för antigenen och därmed

framkallades ett större cellssvar. De allra flesta minnes-cellerna var cytotoxiska T-celler, ca. 40% i grupp 2, vilket var signifikant högre än för de övriga grupperna, ca. 20% i grupp 1 och ca. 6% i grupp 3. En låg andel Th-celler var minnes-T-celler, endast 1,3% i den gruppen där de var som flest, grupp 2. Dock signifikant högre än för grupp 1 och grupp 3, ca. 0,5% respektive ca. 0,2% minnes Th-celler (5). Ytterligare en gång dominerade de cytotoxiska T-cellerna och att en stor andel av dem var minnes-T-celler innebär en minskad risk för återinsjuknande i hepatit C om viruset tar sig in i kroppen vid ett senare tillfälle. Minnes-T-cellerna kan då snabbt aktiveras och börja bekämpa den främmande kroppen (1).

I alla tre grupperna producerades samtliga faktorer/markörer, men antalet Th-celler som stod för produktionen skiljde grupperna emellan. I grupp 1 och grupp 2 producerade Th-cellerna, ca. 2-3%, alla dessa faktorer/markörer och antalet som gjorde det var

signifikant högre än i grupp 3, ca. 0,5%. Även om skillnaden var signifikant var andelen Th-celler, som gav en bredare respons, låg. De cytotoxiska T-cellerna i grupp 1 och grupp 2 producerade mest av antingen IFN-gamma och CD107a, 25-30% av cellerna, eller IFN-gamma, TNF-alfa och CD107a, 15-20%. Endast ca. 5-6% av cellerna i grupp