Utvärdering av ny immunkemisk metod för att mäta HbA1c i blod

Utvärdering av ny immunkemisk metod för att

mäta HbA1c i blod

Evaluation of a new immunochemical method for

measuring HbA1c in blood

Författare: Warshin Saifaldin

Vårterminen 2021

Examensarbete: Grundnivå (G2E), 15 högskolepoäng Huvudområde: Biomedicinsk laboratorievetenskap

Biomedicinska analytikerprogrammet, inriktning laboratoriemedicin BMLV, Examensarbete, 15 högskolepoäng

Institutionen för hälsovetenskaper, Örebro universitet.

Handledare: Per Bjellerup, Överläkare PhD Laboratoriemedicin Västmanland Examinator: Gabriella Lillsunde-Larsson, lektor, Örebro universitet

SAMMANFATTNING

Bakgrund: Glykerat hemoglobin i blod (B-HbA1c) speglar den genomsnittliga blodsocker-nivån de senaste 8 till 12 veckorna. B-HbA1c används för att följa behandlingen vid diabetes mellitus.

B-HbA1c kan mätas på olika sätt och mätresultaten kan ibland skilja sig åt. I detta arbete har en ny immunkemisk metod, HbA1c Advanced (Beckman Coulter, USA) (AU-metoden) utvärderats.

Metod: Med patientprover och kontroller, dubbelprover, beräknades imprecision och bias samt korrelation med laboratoriets ordinarie jonbyteskromatografiska metod, Tosoh G11 (G11-metoden).

Resultat: Imprecision inomserie blev <3 %, total imprecision 5 %, och bias var -2,8 till -5,3 %. AU-metoden gav i medeltal 2,5 mmol/mol (3,9 %) lägre värde än G11-metoden med en korrelationskoefficient på 0,9967. AU-metoden mätte korrekt de vanligaste hemoglobin-varianterna men inte en patologisk ökning av fraktionen HbF.

Slutsats: AU-metodens precision och bias uppfyller nationella kvalitetsmål och korrelationen med laboratoriets ordinarie metod är god för såväl prover utan som med de vanligare hemo-globinvarianterna. Som förväntat för immunkemiska metoder ger AU-metoden för lågt värde vid uttalad ökning av HbF.

AU-metoden fungerar så väl som en immunkemisk metod kan göra och bedöms vara lämplig för kliniskt bruk för att mäta B-HbA1c.

Nyckelord: Glykerat hemoglobin A1, diabetes mellitus, immunkemi, fosterhemoglobin, hemoglobinvarianter.

ABSTRACT

Background: Glycated hemoglobinin blood (B-HbA1c) reflects the average blood sugar level over the last 8 to 12 weeks. B-HbA1c is used to monitor the treatment of diabetes mellitus. B-HbA1c can be measured in different ways with eventual results that sometimes differ from each other. During this project, a new immunochemical method, HbA1c Advanced (Beckman Coulter, USA) (AU method) was evaluated.

Methods: With patient samples, precision and bias were calculated as well as correlation with the laboratory's ordinary ion exchange chromatographic method, Tosoh G11 (G11 method).

Results: Imprecision in-series was <3 %, total imprecision was 5 %, and bias was -2.8 to -5.3 %. On average, the AU method gave values that were lower than the G11 method (2.5 mmol/mol (3.9 %) with a correlation coefficient of 0.9967. The AU method correctly measured the most common hemoglobin variants but not a pathological increase in the HbF fraction.

Conclusion: The precision and bias of the AU method fulfill the national quality objectives and the correlation with the laboratory's ordinary method, the G11 method is good for samples both with and without the most common hemoglobin variants. As expected for immunochemical methods, the AU method gives too low a value for samples with a pronounced increase in HbF.

In conclusion, the AU method fulfills the quality goals as is expected for an immunochemical method for measuring B-hbA1c and is concidered appropriate to use in clincical work.

Keywords: Glycated hemoglobin A1, diabetes mellitus, immunochemistry, fetal hemoglobin, hemoglobin variants.

I

NNEHÅLLSFÖRTECKNING

MATERIAL OCH METODER ... 11

Prover ... 11 Kontrollmaterial ... 11 AU-metoden ... 11 G11-metoden ... 12 DCA-metoden ... 12 Statistik ... 12 RESULTAT ... 14 Imprecision ... 14 Bias ... 14

Korrelation med G11-metoden ... 15

Hemoglobinvarianter och hemoglobinfraktioner ... 17

DISKUSSION ... 19

SLUTSATS ... 21

Förkortningar

DM Diabetes mellitus T1DM Typ 1 diabetes mellitus T2DM Typ 2 diabetes mellitus HbA1c Glykerat hemoglobin A B-HbA1c HbA1c i blod

HbA Hemoglobin A

IFCC International Federation of Clinical Chemistry T-Hb Totalt hemoglobin

SD Standarddeviation CV Variantionskoefficient MV Medelvärde

INTRODUKTION

Diabetes mellitus (DM) är en grupp av metabola sjukdomar som karakteriseras av

hyperglykemi på grund av defekter i insulinsekretion, insulinresistens eller en kombination av båda (1). Sjukdomen är associerad med olika komplikationer som hjärt-kärlsjukdom,

njursjukdom, leversjukdom och cancer, vilket leder till sjuklighet och dödlighet (2).

Det finns i huvudsak två typer av DM. Typ 1 diabetes mellitus (T1DM) är en autoimmunt orsakad förstörandeprocess i beta-cellerna som leder till insulinberoende och därmed risk att utveckla akuta metabola rubbningarna och ketoacidos, medan typ 2 diabetes mellitus (T2DM) främst beror på att kroppen inte kan producera tillräcklig mängd av insulin (insulinbrist) eller kroppens celler blir resistenta mot insulinets effekter (förlorar sin insulinkänslighet) (3,4).

Insulin är ett hormon som bildas i bukspottkörtelns beta-celler och det påverkar alla kroppens celler och funktioner. Insulin är viktigt för upptag av glukos från blodet till kroppens celler. En ökad koncentration av glukos i blodet leder till stimulering av insulinsyntesen och utsöndringen från pankreas. Insulinbrist leder till att glukos i blodbanan inte kan tas upp till vävnader och organ utan blir kvar i blodet och orsakar hyperglykemi (3-5).

Målet vid behandling av DM är att patienten har en jämn och kontrollerad blodsockernivå så nära normala värden som möjligt. Det minimerar risken för följdkomplikationer orsakade av kroniskt förhöjda glukosnivåer. De vanligaste följdkomplikationerna vid DM är irreversibla skador på ögon (retinopati), njurar (nefropati) och perifera nerver (neuropati) (4-6).

HbA1c

Hemoglobin A1c (HbA1c) är hemoglobin A som glykerats, det vill säga att glukos har bundit kovalent till hemoglobinet, Glukosmolekylerna binds framför allt till aminogruppen i den N-terminala aminosyran valin i hemoglobinets β-kedja. Glykeringen sker icke-enzymatiskt i en jämviktsprocess genom exponering av hemoglobin för glukos. HbA1c bildas kontinuerligt i blodet och ju högre glukoshalten är i blodet ju mer HbA1c bildas. Mätning av HbA1c i blod (B-HbA1c) används för att uppskatta den genomsnittliga glukoskoncentrationen i blodet under de senaste 8 till 12 veckorna och värdet korrelerar väl till risken att utveckla diabeteskomplikationer (4,5).

Förutom av glukoskoncentrationen, påverkas HbA1c-värdet av erytrocyternas livslängd, i genomsnitt 120 dagar, och unga erytrocyter innehåller mindre HbA1c än äldre. Vid makrocytos, exempelvis folat eller B12-brist, uppstår ett hemolytiska tillstånd och

erytrocyternas livslängd förkortas och ger ett lägre värde för HbA1c, Mikrocytos, som vid järnbrist, kan ge högre värden. HbA1c-värdet vid dessa tillstånd kan därför vara missledande vid bedömning av glukosbalansen (2-4).

Det finns också ett flertal, ofta ovanliga, hemoglobinopatier och hemoglobinvarianter (oftast utbyte av enstaka aminosyra) som kan påverka såväl levnadstiden för erytrocyterna som möjligheten för glukos att binda till hemoglobinmolekylen. Det finns mer än 1 000 beskrivna hemoglobinvarianter och de flesta påverkar varken erytrocytens livslängd eller metodernas förmåga att mäta HbA1c. Vissa varianter kan dock ge en förkortad levnadstid, exempelvis HbAE, och vissa varianter kan störa mätmetoden. Vissa hemoglobinopatier, främst vissa talassemier kan leda både en kraftigt förkortad levnadstid och en kraftig ökning, >10 % mot normalt för vunxa <1 %, av fosterhemoglobinet (HbF) som inte har någon β-kedja och därför inte binder in glukos (2-4).

Mätning av HbA1c i blodet (B-HbA1c) används för att följa behandlingen hos patienter med DM för att kontrollera glukosnivån över tid och minimera risken för komplikationer. HbA1c kan även användas för att diagnostisera DM under vissa förutsättningar (4).

Mängden B-HbA1c anges som en kvot mellan HbA1c och den totala mängden hemoglobin och anges i enheten mmol/mol. Mätning av B-HbA1c har fått en internationellt gemensam standardisering och anges Som B-HbA1c (IFCC), en förkortning för International Federation of Clinical Chemistry (7). Referensintervallet för personer yngre än 50 år är 27-42 mmol/mol och 31-46 mmol/mol för äldre än 50 år (4). B-HbA1c stiger med åldern och personer som är över 50 år har alltså högre värden. Gränsvärdet för att ställa diagnosen T2DM är 48

mmol/mol vid upprepade mätningar. En person med HbA1c 42-47 mmol/mol kan ha förhöjd risk att utveckla diabetes (4).

Mätmetoder för B-HbA1c

Mätning av B-HbA1c gör huvudsakligen enligt fem olika principer, jonbyteskromatografi, affinitetskromatografi, immunkemisk, enzymatisk och kapillärelektroforetisk. Mätningen kan

göras med såväl patientnära instrument, då enbart med immunkemi eller affinitetskromato-grafi, som med större laboratorieinstrument (7).

Immunkemisk mätning

I en immunkemisk mätning av B-HbA1c används antikroppar som har förmåga att binda specifikt till Amadori-produkten av glukos (ketoaminobindning) i den glykerade delen av hemoglobinet i β-kedjan och graden av bindning kan sedan detekteras och kvantifieras på olika sätt (7-8).

Enzymatisk mätning

Med hjälp av ett proteas klyvs de två N-terminala aminosyrorna från beta-kedjan av och i de fall det finns glukos kopplat till dipeptiden oxideras den vidare med hjälp av

fruktosylpeptidoxidas (FPOX) varvid väteperoxid som tillsammans med en kromogen ger ett färgomslag som kan monitoreras och kvantifieras (7).

Jonbyteskromatografi

Jonbyteskromatografi separerar hemoglobinsvarianter enligt laddning. För att separera hemoglobinmolekyler används katjonbytare som är negativt laddad (den fasta fasen) och har affinitet för de positivt laddade hemoglobinmolekylerna (7).

Patientens prov hemolyseras först och en alikvot av hemolysatet injiceras på kolonnen. En buffert appliceras (den rörliga fasen) och eluerar ut provet. Jonstyrkan och pH för

elueringsbufferten väljs så att HbA1c bli mindre positivt laddat än HbA (konstituerar 97% av vuxenhemoglobin, består av α- och β-subenheter) och gör att den inte binder lika bra till det negativt laddade hartset (den fasta fasen) och elueras därför ut först. Precis efter kolonnen passerar eluatet en spektrofotometer som mäter absorbansen vid 415 nm och de olika hemoglobintopparna detekteras och kvantifieras, figur 1 (7).

Figur 1. Visar de olika delarna av en jonbyteskromatografi (pump, injektor, kolonn och detektor) och genom ett dataprogrammet kan resultat erhållas. Bilden från Shimadzu Excellence hemsida (bilden tillgänglig på:

https://www.ssi.shimadzu.com/industry/environmental/ion-chromatography.html ).

För att eluera den mer positivt laddade icke glykerade huvudhemoglobinfraktionen (HbA) används en andra buffert med annan jonstryka.

I alla jonbytarkolonnmetoder är det viktigt att kontrollera reagensens och kolonnernas temperatur för att få exakta och reproducerbara resultat (7).

Affinitetskromatografi

Affinitetskromatografi separerar HbA1c från den icke glykerade fraktionen genom att borsyra bundet på kolonnen (den fasta fasen) reagerar med cis-diol grupperna på glukosmolekylen som bundit till hemoglobinet och bildar ett reversibelt ringkomplex med fem atomer och håller selektivt HbA1c kvar på kolonnen (det icke glykerade hemoglobinet binder inte och avlägsnas i ett tvättsteg) figur 2 (7).

Figur 2. Immobiliserad borsyra binder HbA1c-molekylens N-terminala glukos för att bilda ett boronsyra-glykerat hemoglobinkomplex (med tvåkolatomer) (7).

Sedan elueras Hba1c ut genom att sorbitol tillsätts (konkurrerar om boronatets bindnings-ställen och både den icke-glykerade fraktionen och HbA1c bidrar till hämning av släckning). De bundna och icke-bundna fraktionerna mäts sedan genom absorbans vid våglängden 415 nm för att beräkna fraktionen HbA1c (7).

Kapillärelektrofores

Kapillärelektrofores är en metod som karaktäriseras av att den separerar molekyler med olika laddning i ett kapillärrör. Kapillärelektrofores på helblodshemolysat vid pH 6,3 ger bra upplösning av HbA och HbA1c. Elektroforesgelen är negativt laddad och interagerar med hemoglobinet. Efter viss tid separerar HbA1c på den katodala sidan om HbA och eluatet mäts med spektrofotometriskt vid våglängden 415 nm. Lite ändring i pH eller jonstyrka eller temperatur ger liten effekt på resultatet (7).

Kvalitetsmål

För att vara till hjälp vid såväl behandlingsuppföljning som diagnostik av DM2 är kvalitetsmålen för HbA1c-metoder relativt snäva och väl definierade (11). De nuvarande kraven från 2019 är en maximal tillåten variation på ±3,5 mmol/mol vid nivån 48 mmol/mol med 95 % sannolikhet.

Syfte

Nyligen lanserade Beckman Coulter, USA en ny immunkemisk metod för HbA1c-mätning, HbA1c Advanced (AU-metoden), som används på DxC 700 AU (Beckman Coulter, USA), ett högautomatiskt analysinstrument för mätning av komponenter inom allmänkemin.

Syftet med detta arbete var att utvärdera den nya metoden genom att använda laboratoriets ordinarie verifieringsrutin och bedöma dess användbarhet i kliniskt bruk

Frågeställning

Vilken imprecision och bias har metoden och uppfylls definierade kvalitetskrav?

Hur väl stämmer AU-metoden med laboratoriets nuvarande jonbyteskromatografiska metod, G11, Tosoh, Japan (G11-metoden)?

Etiska överväganden

Arbetet ingår i laboratoriets ordinarie arbete med metodutvärderingar och definieras därför inte som forskning. Därtill innefattar begreppet forskning inte arbete som uteslutande sker inom ramen för högskoleutbildning på grundnivå (SFS 2003:460, 2§). Därtill har allt

provmaterialet erhållits från det ordinarie kliniska arbetet med patientprover efter det att alla mätningar utförts och svar lämnats ut. Proverna har anonymiserats för denna

metodutvärdering och endast sparats några veckor extra och därför inte ingått i en biobank. Någon etikansökan eller information till patienterna har därför inte behövts.

MATERIAL OCH METODER

Prover från rutinverksamheten från Västmanlands sjukhus Västerås och Karolinska Universitetssjukhuset Huddinge användes. Proverna var tagna med tillsats av EDTA

(Ethylenediamine tetraacetic acid) för helblod (rör med lila kork). För imprecision användes tre prover och för metodkorrelationen användes 30 prover, alla färska. För bedömning av effekten av olika HbF och hemoglobinvarianter användes 23 frysta prover som hade förvarats i en -70 ºC frys och var avhällda i mindre alikvoter. Alla prover kördes som dubbelprover.

Kontrollmaterial

För de tre olika metoder användes följande interna kontroller:

1) AU-metoden

Två nivåer (Q1 och Q2) av extendSURE, HbA1c Liquid Controls, Beckman Coulter, USA. 2) G11-metoden

Två nivåer (HbAK1 och HbAK2) av Lyphockek Diabetes Control, Bio-Rad. 3) DCA-metoden

Två nivåer (Normal och Abnormal) av HbA1c Controls Atellica DCA Analyzer, Siemens Healthineers.

Båda nivåerna kördes omedelbart före och efter varje mättillfälle för respektive metod.

AU-metoden

Metoden utfördes helt enligt leverantörens instruktioner och där proverna sattes i rackar och placerades på instrumentet (13). Initialt hemolyserades 2 µL helblod med 250 µL

hemolyserings-buffert. och mängden HbA1c mättes med en turbidimetrisk immuninhibitions-metod där en bestämd mängd HbA1c-antikroppar först binder till HbA1c i provet och bildar ett löslig antigen-antikroppskomplex. Sedan binder tillsatt HbA1c-polyhaptens i reagenset överskottet av antikroppar och större agglutinationskomplex bildas och ger en ljusspridning som mäts turbidimetriskt vid våglängderna 340/700 nm. Ljusspridning är omvänt

proportionell mot mängden HbA1c i provet.

Totalt hemoglobin (T-Hb) mäts sedan kolorimetriskt i en separat kyvett genom att monitorera absorbansen vid 570/660 nm och kvoten av HbA1c och T-Hb beräknades.

G11-metoden

Efter en automatisk förspädning där 10 µL helblod späddes och hemolyserades med 2 mL hemolysat/washlösning (HSi) fördes provet in i kolonnen (TSKgel G11 Variant). Där interagerar hemoglobinfraktionerna med kolonnens adsorberande material, den fasta fasen, och tvättas sedan ut från kolonnen med en gradient av tre elueringsbuffertar, den rörliga fasen, (G11 variant Eluerings buffert HSi Variant No 1 (s) Grön, G11 variant Elueringsbuffert HSi Variant No 2 (s) Röd och G11 Eluerings buffert HSi Variant No 3 (s) Gul från Tosoh Bioscience) med olika saltkoncentration för separationen.

De relativa koncentrationerna av de vanliga de olika hemoglobinfraktionerna (HbA1a,

HbA1b, HbF, L-HbA1c, S-HbA1c och HbA0) beräknades av ett dataprogram (Extended IPU, Sysmex). Detta sker genom att separerade fraktionerna passerar en fotometer som mäter vid våglängderna 415 och 500 nm och skapar ett kromatogram (Figur 3).

DCA-metoden

Siemens Atellica DCA mäter och beräknar automatiskt koncentrationen HbA1c med hjälp av en inhibition av latexagglutineringsmetod baserad på monoklonala musantikroppar mot HbA1c. Koncentrationen av T-Hb och mäts spektrofotometriskt vid 531 nm den relativa koncentrationen av HbA1c beräknas.

En kapillärhållare tar 1 µL helblod från EDTA-rör och placeras sedan i en reagenskassett som innehåller agglutinatorn (antikroppslatex med HbA1c-specifika monoklonala musantikroppar är adsorberade till latexpartiklarna), , en buffertlösning och en oxidant. Sedan körds provet i instrumentet och efter 4 minuter får man resultat i mmol/mol.

Statistik

För bedömning av metodens imprecision beräknades standardavvikelse (SD) och variationskoefficient (CV%) för kontrollerna. För spridningsmått för alla dubbelprover användes Dahlberg´s formel. För bias beräknades procentuell avvikelse från angivna målvärden och jämfört med G11-metoden.

För metodjämförelserna beräknades korrelationskoefficient (r2_{) och korrelationsformel (räta}

För hantering av olika hemoglobinvarianter gjordes en manuell bedömning av skillnader mellan provsvaren.

RESULTAT

För undersökning av inomserie-precisionen mättes tre patientprover, med låg, mellan och hög koncentration B-HbA1c (medelvärde (MV) 31, 46 och 85 mmol/mol) 20 gånger vid samma tillfälle. Variationskoefficienten (CV%) varierade mellan 1–3 %, något högre för lägre koncentrationer (Tabell 1).

Tabell 1. Inomserie-imprecision för tre patientprover med olika koncentrationer.

Prov 1 2 3 Antal mätningar 20 20 20 MV (mmol/mol) 30,9 45,6 84,5 Max-Min (mmol/mol) 3,6 3,0 3,0 SD (mmol/mol) 0,85 0,70 0,92 CV (%) 2,76 1,53 1,09

För undersökning av totalimprecisionen mättes Q1 och Q2 av extendSURE vid flera olika tillfällen under verifieringsperioden Förväntat värde enligt leverantören var för Q1 (medel: range) 38: 31-45 och för Q2 85:71-99 mmol/mol. CV% blev 5,1 och 4,4 % för den lägre respektive högre kontrollen (Tabell 2).

Tabell 2. Total-imprecision för två olika internkontroller Q1 och Q2.

Kontroll Q1 Q2 Anta- mätningar 23 23 MV (mmol/mol) 39,5 87,5 Max-Min (mmol/mol) 7,3 11,5 SD (mmol/mol) 2,00 3,85 CV (%) 5,1 4,4

Den slumpmässiga osäkerheten i mätningen av upprepade mätningar blev enligt Dahlberg´s formel från dubbelmätning av 30 till synes normala (inga hemoglobinvarianter eller förhöjt HbF) prover för AU-metoden 0,56 och för G11-metoden 0,22.

Bias

Fyra externa HbA1c-kontroller (EQQ) från Equalis (svensk kvalitetssäkringsorganisation) mättes (Tabell 4). Åsatt värde för kontrollerna var framtaget utifrån de tre största

deltagargruppernas medelvärde (Equalis) respektive från masspektrometrisk referensmetod från European Reference Laboratory for Glycohemoglobin (ERL). I Tosoh-gruppen ingick åtta laboratorier och totalt deltog cirka 900 laboratorier. AU-metoden var i medeltal -1,8 mmol/mol, -2,8 % lägre än åsatt Equalisvärde, -1,5 mmol/mol, -3,5 % lägre än åsatt ERL-värde och -2,1 mmol/mol, -5,3 % lägre än MV för G11-metoderna.

Tabell 3. Utfallet av fyra externa kvalitetskontroller, EQQ. (*) provet räckte endast till enkelprov. Equalis-prov Åsatt värde Equalis Åsatt värde ERL Erhållet MV

G11 och alla Erhållet värde AU 1 och 2 värde G11 Erhållet Differens AU vs MV alla (abs) och (%)

2020:01 44,6 45,3 45,6 43,6 42,4 43,1 45,1 -1,2 -2,8

2020:05 34,3 34,2 35,0 34,3 32,7 --* 34,8 -1,6 -4,7

2020:08 47,6 48,3 49,5 47,5 47,0 47,3 49,5 -0,5 -1,1

2021:02 36,7 37,3 37,2 36,9 35,9 37,1 37,3 -1,0 -2,7

Korrelation med G11-metoden

I en första omgång mättes i duplikat 30 färska patientprover som bedömdes vara normala avseende hemoglobinfraktionen HbF (<1 %) och utan tecken till hemoglobinvarianter enligt kromatogrammen från G11-metoden (Figur 3).

Figur 3. Kromatogram från Tosoh G11med normal fördelning av de olika hemoglobin-fraktionerna med HbF 0,7 % och inga tecken till hemoglobinvarianter. HbA1c-fraktionen elueras vid 0,47 minuter och beräknades till 45,9 mmol/mol.

Medelvärdena för dubbelprovernas medelvärde för de 30 proverna blev 56,90 och 54,40 mmol/mol för G11 respektive AU (Tabell 4).

Tabell 4. Medelvärden, spridning skillnad mellan metoden på DxC 700 AU och Tosoh G11. (G11)

1 (G11) 2 (G11) MV AU 1 AU 2 (AU) MV G11) (abs) MV(AU- MV(G11-AU) (%) MV (mmol/mol) 56,92 56,87 56,90 54,32 54,47 54,40 -2,50 -3,7 Min (mmol/mol) 27,9 27,5 27,7 28,8 28,4 28,6 1,3 3,8 Max (mmol/mol) 157,2 157,4 157,3 149,2 150,3 149,8 -7,6 -8,6 Korrelationskoefficienten r2 _{mellan AU och G11 blev 0,9967 och dess ekvation AU = 0,93 x}

G11 + 1,56 (Figur 4). G11-värdena blev i medeltal 3,7 % högre men lägre för de lägre koncentrationerna (Figur 5). Brytpunkten AU=G11 var 21,9 mmol/mol.

Figur 4. Korrelation mellan 30 normala prover mellan AU- och G11-metoderna.

Skillnaden mellan AU-metoden och G11-metoden var som mest -2,6 till 9,3 mmol/mol med ett medelvärde på 4,7 mmol/mol (Figur 5).

y = 0,9286x + 1,563 r² = 0,9967 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 AU -M ETO D EN (M M O L/ M O L) G11-METODEN (MMOL/MOL) KORRELATIONSDIAGRAM

Figur 5. Bland-Altman differensdiagram för 30 normala prover mellan AU- och G11-metoderna.

Hemoglobinvarianter och hemoglobinfraktioner

Sammanlagt 15 prover med hemoglobinvarianter av olika typ, två prover med kraftigt förhöjt HbF samt sex prover med till synes normal kromatografi med G11 undersöktes (Tabell 5). Dessa mätningar utfördes även med Atellica DCA från Siemens (DCA-metoden) som ett komplement. DCA-metoden är en patientnära immunkemisk metod och bör ge likartade resultat som AU-metoden.

För hemoglobinvarianten E, vanlig i Thailand och omgivande länder, erhölls i stort sett likartade värden för alla tre metoderna förutom för två prover där AU-metoden gav lägre värden. För Hb Tacoma, vanlig i Finland, gav de immunkemiska metoderna lägre värden än den kromatografiska metoden. För de mer ovanliga varianterna hemoglobin D och Helsinki erhölls likartade värden för alla tre metoderna. För den mycket ovanliga varianten HbJ var det kromatografiska värdet betydligt lägre än för de immunkemiska värdena. För tre okända varianter ger den kromatografiska metoden ett värde som var lägre, ett värde som var högre och ett värde som var lika med de immunkemiska metoderna. För proverna med förhöjt HbF gav de immunkemiska metoderna lägre värden än den kromatografiska metoden. Ett av de normala proverna gav högre värde för den kromatografiska metoden jämfört med de immunkemiska.

AU-metoden och DCA-metoden var överensstämmande i samtliga fall förutom två fall med varianten HbE. För bägge metoderna var det två olika prover var där dubbelvärdena skilde sig åt med mer än 5,8 %. Varför det blev så är oklart och har inte kunnat kontrolleras då proverna inte räckte längre (Tabell 5).

-4,0 -2,0 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 D IF FER EN S G 11 -A U (MMO L/ MO L)

MEDELVÄRDE AU OCH G11 (MMOL/MOL)

Tabell 5. Mätresultat för olika varianter och fraktionsavvikelser för AU-, G11- samt DCA-metoden i enheten mmol/mol. (*) skillnaden mellan dubbelvärdena för DCA-DCA-metoden var 5,8 respektive 22,5 %. (**) skillnaden mellan dubbelvärdena för AU-metoden var 10,7 respektive 18,2 %. Fet stil, identiferade skillnader.

Hb-variant HbF Medel AU Medel G11 Medel DCA Diff G11-AU Diff DCA-AU Diff G11-DCA

Hb AE 21,1 25,3 26,0 4,3 5,0 -0,7 Hb AE 31,5 41,0 42,5 9,6 11,1 -1,5 Hb AE 38,4 37,0 42,0 -1,4 3,6 -5,0 Hb AE 43,7 51,3 53,5 7,6 9,8 -2,3 Hb AE 43,7 42,1 46,0 -1,7 2,3 -4,0 Hb Tacoma 40,0 48,0 42,0 8,0 2,0 6,0 Hb Tacoma* 93,6 107,0 89,0 13,4 -4,6 18,0 Hb AD 27,0 26,4 30,0 -0,6 3,0 -3,7 Hb AD 46,7 51,2 54,5 4,5 7,8 -3,3 Hb Helsinki 30,7 30,2 30,0 -0,5 -0,7 0,2 Hb Helsinki 66,1 57,8 65,5 -8,3 -0,6 -7,7 Hb AJ 86,6 64,5 90,0 -22,1 3,4 -25,5 Okänd 33,5 27,0 37,0 -6,5 3,6 -10,0 Okänd 36,9 36,3 37,5 -0,6 0,6 -1,2 Okänd 37,1 50,3 39,5 13,2 2,4 10,8 18,6%** 25,8 35,0 28,5 9,3 2,8 6,5 16,90% 29,9 42,5 32,0 12,7 2,2 10,5 Normal 24,4 22,2 28,0 -2,2 3,7 -5,8 Normal** 25,6 26,1 30,0 0,5 4,5 -4,0 Normal 41,1 49,4 43,0 8,3 1,9 6,4 Normal 43,8 45,9 47,5 2,1 3,8 -1,7 Normal 80,6 84,5 82,5 3,9 1,9 2,0 Normal* 106,6 110,7 101,0 4,1 -5,6 9,7 Antal-mätningar 23 23 23 23 23 23 Medelvärde _{45,8 48,3 48,6 2,5 2,8 -0,3} Min _{21,1 22,2 26,0 -22,1 -5,6 -25,5} Max _{106,6 110,7 101,0 13,4 11,1 18,0}

DISKUSSION

Regelbunden mätning av HbA1c i blod är den viktigaste uppföljningsmarkören vid behandling av diabetes mellitus. Mätningen används för att kontrollera glukosnivån hos patienter med DM över tid och bedöma risken för diabeteskomplikationer. Det finns

åtminstone fem olika mätprinciper för metoder att mäta HbA1coch mätresultaten kan ibland skilja sig åt mellan metoderna. Främst är det en ökning av HbF-fraktionen, vanligt vid vissa hemoglobinopatier, eller förekomst av olika hemoglobinvarianter som kan leda till olika mätresultat. I vår studie verifierades en ny immunkemisk metod från Beckan Colulter, AU-metoden.

Inomserie-imprecisionen för AU-metoden var 1-3 % och totalvariationen var cirka 5 % (Tabell 1 och 2). En tidigare studie visade jämförbarheten mellan kapillärelektrofores (CE) och tre olika metoder för HbA1c-mätning för 270 helblodprover. Där resultatet visade

variations-koefficienten för de alla fyra metoderna inom det accepterade målet (<2 %), vilket visar bra prestanda för alla dessa metoder (2). Den nu undersökta metoden bedöms vara likvärdig i precision med dessa.

Bias, undersökt med prover från Equalis, visar att AU-metoden ger generellt lägre värden inom provernas mätintervall på 34,3 till 47.6 mmol/mol för såväl de åsatta värdena som gentemot Tosoh’s G11metodens medelvärden. Avvikelserna mot Equalis och ERL, som var -2,8 respektive -3,5 %, ligger väl inom Equalis nationella kvalitetskrav på motsvarande nivå. AU-metoden bedöms därför väl uppfylla kvalitetskraven och via jämförelsen med G11-metoden bör det gälla för hela G11-metodens mätintervall som är 20-140 mmol/mol (12).

Med AU-metoden får man något lägre resultat än med G11 på i medeltal 2,5 mmol/mol (3,7 %) vilket bedöms vara ett bra resultat då jonbyteskromatografi (G11) anses vara den bättre metoden, ”golden standard”. Korrelationen mellan metoderna är mycket hög, r2 _blir

0,9967. Dessa resultat stämmer också väl med resultaten för de externa kontrollerna där G11-metoden ger något högre värden än medelvärdet och AU-G11-metoden ger något lägre värden. G11-värdena är på så sätt något närmare ERL:s åsatta värden framtagna med

masspektrometrisk referensmetodik vilket är bra.

Vid bedömningen av hur AU-metoden hanterar olika varianter fanns möjligheten att även prova ett annat immunkemiskt instrument, DCA-metoden. I jämförelse mellan de två

immunkemiska instrumenten erhölls för alla prover utom två likartade värden. Dessa två prover uppvisade hemoglobinvarianten HbE där resultaten förväntas vara samstämmiga för alla tre metoderna men där AU-metoden skilde sig åt. Detta var oväntat och bör undersökas ytterligare.

För de två Hb Tacoma-proverna blev det en tydlig skillnad med upp mot 20 % lägre med AU- och DCA-metoderna jämfört med G11-metoden. Detta är förväntat då G11-metoden

systematiskt överskattar HbA1c-fraktionen då Hb någon fraktion hos Tacoma-varianten interfererar med HbA1c-fraktionen i kromatogrammet och tas med i beräkningen (Figur 6) jämfört med ett ”normalt” kromatogram (Figur 3).

Figur 6. Prov från patient som är heterozygot för hemoglobinvarianten Hb Tacoma2. I kromatogrammet ses en extra topp på den uppåtgående skänkeln som göra att HbA1c överskattas med upp mot 20 %.

HbAJ är en mycket ovanlig variant som ger stor skillnad mellan de immunkemiska och den jonkromatografiska metoden. Det är oklart vilket som är det mest riktiga värdet för denna ovanliga variant.

Tre patientprover med okända varianter undersöktes och där HbA1c stämde väl mellan de immunkemiska metoderna AU och DCA men varierade olika mot G11-metoden. Detta är förväntat eftersom AU- och DCA-metoden använder immunkemisk mätprincip. Det är oklart vilka som är de mest korrekta resultaten.

För HbAD, Hb Helsinki ses inga avgörande skillnader mellan AU-metoden och de två andra metoderna, G11- och DCA-metoderna.

Vid kraftig ökning av HbF-fraktionen, oftast beroende av att patienten har en uttalad

talassemisjukdom, underskattade de immunkemiska metoderna HbA1c med drygt 30 %. Detta är förväntat då de immunkemiska metoderna inte kan registrera förekomst av HbF och därför inte kan kompensera för ökat HbF i sina beräkningar. Orsaken till att fel uppstår är att HbF inte glykeras då det har glycin som N-terminal aminosyra i stället för valin som betakedjan har. Felet i mätresultatet blir större ju större fraktionen HbF är. Enligt leverantörerna klarar G11-metoden upp till 33 % HbF, AU-metoden upp till 7 % och DCA-metoden upp till 11 %. Gränserna för de båda immunkemiska instrumenten är satta så att de medger ett visst

begränsat mätfel.

För sex prover med normala kromatogram var det ett som gav högre värde för G11-metoden jämfört med de andra metoderna. Detta kan ses ibland men orsaken är helt oklar och det finns inga bra publikationer i frågan. Man får således räkna med att ett sådant prov dyker upp då och då i produktionen.

Av oklar anledning erhölls oväntat stor skillnad mellan dubbelvärdena för två prover med AU-metoden och två andra prover med DCA-metoden (Tabell 5). Vi har bortsett från det i bedömningen av hur varianterna och HbF har hanterats.

SLUTSATS

En fördel med G11-metoden är att man kan se olika hemoglobinfraktioner och ökning av HbF vilket gör det lättare att få en bra diagnostik för vissa patienter.

En stor fördel med att använda AU-metoden är att man kan köra många prover samtidigt och analystiden är kortare jämfört med G11-metoden då AU-metoden är mer automatiserad. AU-metoden ger god precision och riktighet för prover utan förhöjt HbF samt för de vanligaste hemoglobinvarianterna.

Sammanfattningsvis visar vår verifiering att AU-metoden uppför sig som förväntat för immunkemiska metoder, har god precision och bias och kan därför användas i klinisk verksamhet.

FÖRFATTARENS TACK

Ett stort tack till min handledare Per Bjellerup, tack för din handledning genom projektet. Jag har uppskattat din tillgänglighet, dina snabba svar och tydliga handledning. Tack till

personalen på Specialkemi och Klinisk kemi som varit mycket hjälpsamma i instruktioner och stöd i det laborativa arbetet. Stort tack till min familj.

REFERENSER

1. American Diabetes Association. Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care 2012 jan; 35: 64-71.

2. Sriwimol W, Choosongsang P, Choosongsang PH, Treerut P, Muenniam B, Makkong P, et al. Strong correlation and high comparability of capillary electrophoresis and three different methods for HbA1c measurement in a population without

hemoglobinopathy. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Inverstigation, 2020 February; 80:139-150.

3. Aldskogius H, Rydqvist B. Den friska människan: Anatomi och fysiologi. 1 uppl. Stockholm: Liber AB; 2018.

4. Theodorsson E, Bergren Söderlund M. Laurells Klinisk Kemi i Praktisk Medicin. 10 uppl. Lund: Studentlitteratur AB; 2018.

5. Abbas AK, Aster JC, Cotran RS, Kumar V. Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease. 9th uppl. Elsevier; 2014.

6. HbA1c (långatidssocker) [Internet].Stockholm: Werlabs;- [uppdaterad 2021 mars 16;citeterad 2021]. Tillgänglig från:

https://werlabs.se/halsokontroll/diabetes-metabolstorning/hba1c

7. Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE. Tietz textbook of Clinical Chemistry And Molecular Diagnostics. 4th edition. USA: Elsevier; 2006.

8. Immunoassay [Internet]. USA: Creative Biolabs Immuno-Oncology; [uppdaterad 2021 mars 24; citeterad 2021]. Tillgänglig från:

https://www.creative-biolabs.com/immuno-oncology/immunoassay.htm 9. Weykamp CW, Mosca A, Gillery P, Panteghini M. The analytical Goals for

hemoglobin A1c Measurement in IFFC Units and national Glycohemoglobin Standardization Program Units Are Different. Clinical chemistry, 2011; 57:1204-1206.

10. Ejlertsson G. Statisk För Hälsovetenskaperna. 2 uppl. . Lund: Studentlitteratur AB; 2003, 2012.

11. Kvalitetsmål för HbA1c-metoder som används för diagnostik av typ 2 diabetes [Internet]. Sverige: EQUALIS; [uppdaterad 2014 april 09;citeterad 2021]. Tillgänglig från:

https://www.equalis.se/media/m0ja141g/s006_kvalitetsm%C3%A5l-f%C3%B6r-hba1c_2-1.pdf

13. Beckman Coulter. HbA1c Advanced, DxC 700 AU Whole Blood Application, 2018-08.