E-cigs påverkan på Candida albicans - Mätning av hyfbildning och proteasaktivitet

E-cigs påverkan på Candida albicans

Mätning av hyfbildning och proteasaktivitet

Marcus Eskilsson

Sohrab Korkchi

Handledare: Julia Davies

Examensarbete (30 hp)

Malmö högskola

Tandläkarprogrammet

Odontologiska fakulteten

1 / 21

Innehåll

Cell till hyf ... 4

Candida i det orala ekosystemet ... 5

Proteaser ... 5

Metalljoner ... 4

Tobaksrökning ... 3

E-cigaretter ... 4

Syfte ... 6

Material och metod ... 6

Utvärdering av stammar och medium ... 6

Framställning av e-cigarett-kondensat (ECK) ... 6

Odling av stammar i brunnar ... 7

Proteasmätning via elfores ... 7

Tillväxt och hyfinducering ... 8

Statistisk analys ... 8

Resultat ... 9

Utvärdering av stammar och medium ... 9

Odling för kontroll av vitalitet på blodagar ... 9

pH-mätning på ECK ... 12

Proteasmätning ... 12

Validering av räkningsmetoder ... 12

Tillväxt och hyfinducering ... 13

Diskussion ... 14

Konklusion ... 16

Tillkännagivanden ... 16

2 / 21

Sammanfattning

Syfte: Att utvärdera eventuell påverkan av e-cigaretts-kondensat (ECK) på två av C. albicans stora virulensfaktorer: proteasaktivitet i C. albicans sekretom och hyfbildning.

Material & metod: Två stammar av C. albicans odlades in vitro under påverkan av tre koncentrationer av ECK för att utvärdera hyfbildning och proteasaktivitet. ECK framställdes enligt metod beskriven av Semlali et al. (1)

Resultat: Det fanns en dosberoende effekt av ECK på C. albicans hyfbildning där vi såg en fyrdubblad ökning av antal hyfer vid den högsta koncentrationen av ECK (p<0.05) men ingen mätbar effekt på proteasaktivitet.

Slutsats: Denna in vitro-studie bekräftar hypotesen om att ECK har en virulensinducerande potential på C. albicans då man såg en dosberoende respons och en ökad andel hyfer i förhållande till jästceller i samtliga prövade stammar. Dock krävs vidare forskning för att bedöma huruvida detta har någon klinisk relevans. Tidigare studier har visat att e-cigaretter kan påverka PDL-celler och aerosolen innehåller metalljoner som kan ge ökad virulens hos C.

albicans. Andra hälsoeffekter är idag okända och mer forskning behövs för att tandvården ska

kunna ge råd angående hälsoeffekter och risker vid bruk av e-cigaretter.

Abstract

Purpose: To evaluate the possible effects of e-cigarette condensate (ECC) on two of C. albicans main virulence factors: protease activity in the secretome of C. albicans and hyphal formation. Methods: Two strains of C. albicans was grown in vitro under the influence of three concentrations of ECC to evaluate hyphal formation and protease activity. ECC was prepared according to the method described by Semlali et al. (1)

Resluts: There is a dose dependent response of C. albicans hyphal formation where a fourfold increase was measured in sample with the highest concentration of ECC (p<0.05) but protease activity could not be measured.

Conclusions: This in vitro study confirms the hypothesis that ECC has a virulence inducing potential on C. albicans due to the dose dependent response seen and the increased formation of hyphae in relation to yeast cells in each and all samples. More research is needed to quantify whether this is clinically significant. Previous studies have shown e-cigarettes to affect PDL cells and the aerosol contains metal ions that can increase the virulence of C. albicans. Other health effects are currently unknown and more research is therefore required so that the dental profession can give advice regarding the health effects and risks of using e-cigarettes.

3 / 21

Introduktion

Candida albicans är den vanligaste patogena svampen i munhålan och förekommer i de flesta

friska individers oropharyngeala mikrobiom där upp emot 70% av alla individer har organismen som del av sitt normala biom (2). Närvaro av C. albicans i munhålan är inte automatiskt sjukdomsalstrande eftersom den kan leva som en kommensal organism (3). C. albicans har förmåga att kolonisera slemhinneytor asymptomatiskt men under särskilda omständigheter som när immunförsvaret är nedsatt kan den spridas vartsomhelst i kroppen och orsaka systemisk infektion via blodbanan, tillståndet är associerat till hög morbiditet och mortalitet (4). Den kan gå från kommensal organism till patogen tack vare en repertoar av virulensfaktorer. Specifikt förmågan att utveckla sin form morfogenetiskt och bilda biofilmer är centrala egenskaper för patogenesen (5). Jästcellen kan förutom till epitel och hydroxyapatit adherera till ligander som förekommer på bakteriecell-ytmolekyler, extra-cellulärt-matrix proteiner och även dental akrylat (6). Personer som tidigare studerat patogeniciteten för C. albicans har mötts av en paradox: hur kan en harmlös organism för friska individer ha blivit en av de mest framgångsrika patogenerna? Forskningen har gett stöd till konceptet av en multiform organism som kan anpassa sig hos värden i hög grad för att utvecklas optimalt under alla möjliga förhållanden som uppstår eller orsakas av värden (7). De flesta svampar har förmågan att växa i två huvudsakliga olika basala morfologiska former, runda jästceller och avlånga tubliknande strukturer som kallas för hyfer. En organisms förmåga att anta en annan morfologisk struktur kallas normalt dimorfism och C. albicans besitter denna egenskap. Utöver detta kan C. albicans producera en variation av cellformer och är således egentligen polymorfisk men omnämns oftast som dimorf trots att den kan bilda ett spektrum av morfologier som t.ex. pseudohyfer, vilka urskiljs morfologiskt från sanna hyfer genom den något mera vida formen och septumbildande konstriktioner, sanna hyfers filament saknar dessa och tubernas sidor löpet helt parallellt (8,9). Denna dimorfism som C. albicans innehar är en essentiell del i dess virulens. Hyfbildning anses stå för 70% av C. albicans virulenspotential (10) och nyttjas både för att penetrera in i vävnad och för att tillåta C. albicans att ta sig ut ur celler som har fagocyterat jästceller. Normalt vid odling av C. albicans i hyfinducerande miljö kan hyfbildning ses efter ett par timmar (8). Dimorfismen styrs av genuttryck som påverkas av en uppsjö miljöfaktorer. T.ex. så har det visats att odling i substrat som innehåller N-acetylglucosamine (GlcNac) eller serum kan inducera hyftillväxt, men vissa stammar av C. albicans verkar inte reagera på GlcNac (10). Detta antyder att det finns flera separata signalsystem för att styra hyfinduktion vilket har påvisats i senare studier där man har sett att C. albicans har ett välutvecklat system för att känna av variationer i pH, kontakt med ytor, variationer i näringstillgång och temperatur. Mer ingående har man sett att om C. albicans växer i 5% CO2 och pH 7.4, vilket är den koldioxidhalt

och pH som mänskligt blod normalt ligger på, gynnas hyftillväxt (11) och vid surt pH gynnas jästcellsbildning (12). C. albicans kan också modulera pH i den lokala miljön runt sig för att göra den mer lämplig för C. albicans överlevnad. Kontakt med ytor av akrylat eller epitelial vävnad är också en stark initiator av hyfbildning (13) och det förefaller som att C. albicans trivs mycket bra på ytor som har en rå ytstruktur där den bildar sina hyfer för att följa denna struktur (14). C. albicans är väldigt bra anpassad till att klara sig under olika förutsättningar vad gäller tillgång på näring och kan tillförskaffa sig näring från miljön utifrån och spara den under perioder av svält (15). Utöver bildning av hyfer så är en viktig del av C. albicans virulens dess förmåga att utsöndra proteaser vilket hjälper C. albicans både att penetrera in i vävnader och i dess inhämtning av näring och metalljoner (16).

Tobaksrökning

Det finns ett väldokumenterat samband mellan tobaksrökning och högre incidens av oral candida, ökad sekretion av histolytiska enzymer och adhesion till dentalt akrylat (17). In vitro

4 / 21 studier har närmare studerat effekten av extrakt från cigaretter på C. albicans olika virulensfaktorer. Exponeringen aktiverade gener som kodar för adhesion, tillväxt och biofilmsbildning (1) man såg även en förhöjd sekretion av hydrolytiska och histolytiska enzymer (17) där proteasutsöndringen nådde sitt max efter 48-72h. Det är även känt att tobak kan bidra till epitelkeratinisering vilket gynnar C. albicans-kolonisering (6,18). En beståndsdel i tobaksrök är nikotin vilket i sig kan bidra till strukturella och funktionella förändringar hos keratinocyter (18,19), samt metalljoner (20) liknande de som läcker ut från ortodontisk appartur.

E-cigaretter

E-cigaretter är elektroniska handhållna apparater som värmer upp en smaksatt vätska och låter användaren andas in ångan. Vätskans sammansättning kan variera stort då ingen

standardisering finns men den innehåller i regel någon form av smakämne kombinerat med propylenglykol, glycerol, etylenglykol, polyetylenglykol samt i vissa fall nikotin (21). Studier har visat att vätskan ofta innehåller mer tungmetaller än tobaksrök (22) vilket eventuellt kan påverka C. albicans på samma sätt som metalljoner från ortodontisk apparatur. Ofta

marknadsförs e-cigaretten som ett alternativ till att röka cigaretter. Huruvida e-cigaretter är ett bättre alternativ för hälsan är omdiskuterat (23–25) och i många regioner världen över är försäljning av produkten oreglerad. Studier på e-cigaretters påverkan på den orala hälsan saknas i stort men vissa typer av e-cigarett-vätska förefaller påverka periodontala fibroblaster (26) och e-cigaretter kan möjligtvis vara en bidragande orsak till tandlossning. Parallellt med att hälsopåverkan av e-cigaretter är i stort sett okänd och försäljning ofta är oreglerad ser vi en ökning av bruket av dem inom EU och övriga västvärlden (27–29). Ur tandvårdens perspektiv är det i nuläget svårt att ge råd angående e-cigaretter då påverkan på oral hälsa är outforskad och det enda vi har att tillgå är någon enstaka in vitro-studie.

Metalljoner

Spårmineraler är essentiella för alla kända levande organismers tillväxt och överlevnad, detta inkluderar människor, djur, växter, bakterier och svampar. Bland de viktigaste metaller är järn zink, mangan och koppar. C. albicans har ett välutvecklat system för att ta upp dessa mineral (30). Av dessa är upptaget av järn och zink mest studerade. Upptaget av järn kan ske genom tre olika strategier: ett reduktivt system, ett upptagssystem där järn binds med kelatbildningar till lågmolekylära substanser med hög affinitet för trevärdiga järnjoner (så kallade sideroforer) och ett upptagssystem för hemjärn (31). C. albicans syntetiserar inte sina egna sideroforer utan stjäl järn från sideroforer som tillhör andra mikroorganismer i den lokala näringsväven. För upptag av zink utsöndrar C. albicans zinkbindande protein Pra1 (pH-regulerande antigen 1) som binder extracellulärt zink och gör det tillgängligt för C. albicans (32). Mekanismen för upptag av koppar och mangan är mindre känd. Dock anses dessa fyra nämnda metaller vara essentiella för svampens överlevnad och patogenes. Ett samband har visats mellan fast ortodontisk apparatur och en ökning av salivkoncentration av metalljoner vilket påverkar tillväxten av C. albicans och hydrolyserande SAP-aktivitet (33). Det har också påvisats att användning av fast apparatur leder till ökad mängd C. albicans i munhålan (34,35).

Cell till hyf

C. albicans cellvägg är en komplex struktur under ständig utveckling och omorganisation.

Cellväggen står för de flesta interaktioner med omgivningen och dess funktion består i att skydda organismen och bestämma dess form. Cellväggens morfologi styrs av genuttryck som moduleras av omgivningen. Cellväggen består till 90% av kolhydrater som huvudsakligen är i tre olika former: mannaner, beta-glukaner och chitiner. Mannanerna är det yttersta lagret i cellväggen som det mänskliga immunförsvaret reagerar på. Innanför detta lager finns ett lager glukaner och chitin. Detta inre cellväggslager ger stadga och struktur till cellväggen. Chitin är

5 / 21 polymera kedjor av sockerarten GlcNac som återfinns i munhålan som sidokedjor på t.ex. muciner. Olika mikroorganismer kan spjälka loss GlcNac från muciner och göra den tillgänglig för orala mikroorganismer. Hyfer har en något större andel chitin än jästceller (36,37) och det har visats att C. albicans som odlas med större tillgång till GlcNac får högre mängd hyfinduktion än odling med lägre halt tillgänglig GlcNac (38) samt att intracellulära och extracellulära halter kan ha stor påverkan på C. albicans genuttryck (39). I cellväggen finns även 10% proteiner vars huvudsakliga roll är att möjliggöra adhesiv interaktion med värdceller (40). En grupp av hyfernas strukturella komponenter - adhesiner - bidrar till aggregering av nya jästceller, hyfer och andra organismer vilket ger upphov till en biofilm som utgör en skyddad miljö där organismen kan undvika försvaret (41,42). C. albicans blir därmed en aktiv deltagare i det orala ekosystemet.

Candida i det orala ekosystemet

I munhålan ingår C. albicans ofta som en del av det orala ekosystemet där den bidrar med bildande av biofilm via ett extracellulärt matrix och kan samaggregera med kända patogena bakterier som Streptococcus mutans och Streptococcus oralis. Utöver C. albicans tidigare nämnda förmåga att adherera till epitelial vävnad har det också in vitro med hjälp av elektronmikroskopanalys påvisats att C. albicans gynnar adhesion av S. mutans. Studier på dessa arters blandade biofilmer odlade på människotänder och hydroxyapatit har bekräftat arternas förmågan att adherera till dessa ytor och till varandra då S. mutans visade hög affinitet till C. albicans hyfer (43). In vivo studier gjorda på råttor har visat C. albicans kariesinducerande potential som härleds till förmågan att tolerera och producera syror vilket resulterade i snabbt progredierande ocklusal karies (44). Den huvudsakliga mekanismen för samaggregering med andra mikroorganismer är genom att jästcellen kan adherera till ligander som förekommer på bakteriecell-ytmolekyler och extra-cellulärt-matrix proteiner (10). C.

albicans koloniserar normalt mukosan på tunga, gom och buccala ytor men kan även hittas

subgingivalt hos individer med parodontit (45). C. albicans kan möjligtvis bidra till mikrobiell kolonisering av tandköttsfickor genom adhesion till epitelceller och koaggregering med bakterier (3). Samaggregering mellan C. albicans och bakterier har även visat ökad risk för

Staphylococcus aureus-infektion via hyfer som tränger in i epitelet och skapar möjlighet för S. aureus att ta sig in i värdorganismen (43,46). C. albicans kan även påverka pH i sin lokala

extracellulära miljö (47), utsöndra proteaser som bryter ner komplexa molekyler till mer lättupptaglig näring (48–50) samt påverka mikrobiomet i den tidiga biofilmen genom att underlätta tillväxt av strikt anaeroba bakterier i en syrerik miljö (51). Essentiella steg i C.

albicans patogenes är att en yta koloniseras, där det bildas en stabil jästcellspopulation vilket

följs av hyfbildning för att tränga in i värdens celler och på så vis skapa spridning genom avknoppning av nya jästceller. För att underlätta hyfbildning uttrycks invasiner som är hydrolytiska enzym, dessa kan bryta ner bindningar mellan epitelceller för att underlätta hyfens penetration in i vävnad (10). En rad olika faktorer påverkar C. albicans virulens; ett väl utvecklat system för att känna av kontakt med olika ytor samt variation i pH i omgivningen, kontakt med serum, tobaksrökning, tillgång eller avsaknad av näring, tillgång till metalljoner, samt GlcNac.

Proteaser

Adherering till en yta eller kontakt med extracellulärt matrix resulterar i utsöndring av diverse proteaser, fosfolipaser och lipaser (52) som bryter ner komplexa molekyler till lättupptagen näring för C. albicans och andra mikroorganismer. Sammantaget beräknas sekretomet innefatta 225 proteiner, dessa bidrar till diverse olika funktioner. Som tidigare nämnt så kallas den grupp av dessa som står för vävnadspenetration för invasiner. Andra gruppers funktioner omfattar biofilmsbildning, organismens förmåga att undvika immunförsvaret, underhåll av cellvägg och tillgodogörelse av metalljoner och annan näring (53) Alla dessa proteaser katalyserar hydrolys

6 / 21 av peptid-bindningarna mellan proteiner men kan skilja sig avsevärt i specificitet och verkningsmekanism. Hydrolytiska extracellulära enzymer som är av betydelse för C. albicans är lipaser, fosfolipaser och SAPs (sekreterade aspartylproteaser). Deras funktion består i att bryta ner material till näring som kan tillgodogöras av organismen samt bryta ner bindningar mellan epitelceller och förenkla penetration in i vävnaden. En följd är att pH-värdet i den lokala miljön stiger när CO-NH bindningar bryts vilket ger molekyler som kan binda upp fria vätejoner. Aspartylproteasaktivtet är en virulensfaktor vars roll i sjukdomsutvecklingen studerats. Enzymerna är närvarande vid penetration av vävnad och har en roll vid adhesion till epiteliala celler och kan även agera som cytolysiner i makrofager efter fagocytos av C. albicans. Förekomsten av 10 olika SAP-gener, deras tillfälliga aktivering under distinkta faser av infektionsutvecklingen är bevis på att dessa har en betydande roll i organismens adaptiva svar till omgivningen (16).

Syfte

Att utvärdera eventuell påverkan av e-cigaretts-kondensat (ECK) på två av C. albicans stora virulensfaktorer: proteasaktivitet i C. albicans sekretom och hyfbildning, vilket i förlängningen kan bana väg för rådgivning vid rökavvänjning inom tandvården samt vidare forskning på e-cigaretters påverkan på oral hälsa. Frågeställningen rör alltså vilken påverkan rök-extraktet har på C. albicans proteasaktivitet och hyfbildning vilket är högst relevant då bruket av e-cigaretter är något som ökar och dess påverkan på det orala ekosystemet är okänt, medans det är känt att

C. albicans påverkas av tobaksrökning (1,54). Vår hypotes är att ECK kommer öka C. albicans

virulens på ett sätt liknande det man tidigare sett med tobak.

Material och metod

Utvärdering av stammar och medium

Frysta svampsporer från 4 olika stammar (51, 93, 133, 254/09) av C. albicans från avdelningen för Oral Biologi vid Malmö Högskola tinades upp från -87C och kultiverades på blodagar. Plattorna inkuberades anaerobt under 24 timmar i 37C, 5% CO2. Prover togs från kolonierna. 8st 5ml rör fylldes med 4 uppsättningar av två olika medium (Todd-Hewith broth samt 10% kalvserum) och dessa inokulerades sedan med de 4 stammarna. Efter skakning överfördes 130μl av varje lösning till Ibidi µ-slide som inkuberades i en fuktkammare i 37˚C, 24h, 5% CO2.

Dessa kontrollerades sedan med ljusmikroskop Olympus U-RFL-5 och mjukvaran NisElements. Försöket upprepades sedan med PBS + 1.25% GlcNac, PBS + 10% glukos och Sabouraud broth istället för TH broth. Genom visuell utvärdering av tillväxt och antal hyfer fastställdes två stammar (51 och 254/09) som de mest lämpliga för studien. För utvärderingen av hyfinduktion användes en nominell skala med stegen Liten, Medel och Stor där Liten innebar få eller inga hyfer, Stor innebar stor mängd hyfer och Medel mellan dessa två steg. Medium selekterades ut på liknande sätt för att få en positiv kontroll, en negativ kontroll och ett neutralt medium.

Framställning av e-cigarett-kondensat (ECK)

För framställning av ECK användes en modifierad variant av metod beskriven av Semlali et al. (1) 200ml PBS framställdes till ett pH av 7.4 och hälldes i en E-kolv med sidorör. Sidoröret kopplades till vakuum. En adapter som bestod av en kork som täppte till mynningen på e-kolven och ett rör som gick ner under vätskeytan i kolven samt tillät anslutning av e-cigaretten placerades i e-kolven så att ånga från e-cigaretten drogs igenom vätskan och ut via sidorör (Figur 1) . E-cigaretten aktiverades och ånga drogs med hjälp av vakuum genom PBS i 5 minuter. pH på PBS mättes igen. Till extraktionen användes en SquareSmoke XL Disposable VapePen 3ml 18mg nikotin.

7 / 21

Figur 1 – schematisk skiss över framställning av EKC

Odling av stammar i brunnar

Stam 51 och 254/09 odlades på blodagar i 37˚C, 72h, 5% CO2. 5st 5ml rör för varje stam

preparerades med vardera PBS + 1.25% GlcNac, Sabouraud dextrose broth, PBS + 10% ECK, PBS + 30% ECK, PBS + 50% ECK. Totalt 10 rör. Innehållet i samtliga rör sterilfiltrerades genom 0.22μm filter. Rören inokulerades med stammar 51 och 254/09 från blodagar och skakades. 130μl vätska från rören överfördes i fem uppsättningar per stam till Ibidi u-slide (namngivna 51AH, 51BH, 51CH, 51AP, 51BP, 254AH, 254BH, 254CH, 254AP, 254BP). Slides AH, BH, CH och AP inkuberades i 37˚C, 24h, 5% CO2. BP inkuberades i 37˚C, 48h, 5%

CO2.

Schematisk bild:

Proteasmätning via elfores

Vätska från Ibidi slides AP och BP pipetterades till kapslar som centrifugerades. Från de centrifugerade kapslarna pipetterades supernatanter till Eppendorfrör. 15μl supernatanter från varje prov blandades med 15μl Tris Glycine SDS Sample Buffer. 15μl standardlösning och 15μl Tris Glycine SDS Sample Buffer blandades. Standardlösning och supernatantlösningar tillsattes i 10% kaseingel som kördes i en apparatur för elfores. Efter seperation skakades gelen under 30 minuter i rumstemperatur i 100ml renatureringsbuffer som sedan hälldes av och ersattes med 100ml developing buffer som även den skakades under 30 minuter i rumstemperatur. Developing buffern ersattes av 100ml ny developing buffer och skakades i 24h i 36˚C. Gelen infärgades sedan under 1.5h skakning med 100ml H2O, 32ml Brilliant Blue G Colloidal

Conductor och 32ml etanol. Slutligen avfärgades gelen med 25% etanol i 1h. Den avfärgade gelen scannades in till dator. Försöket upprepades sedan med 10 gånger högre koncentration av supernatanter. Resultatet av proteasaktiviteten kommer att synas som skiftningar i färgen på gelen.

O—O Positiv kontroll (PBS + 1.25% GlcNac) O—O Negativ kontroll (Sabouraud dextrose broth) O—O PBS + 10% ECK O—O PBS + 30% ECK O—O O—O PBS + 50% ECK Ingenting

8 / 21

Tillväxt och hyfinducering

Vätska från Ibidi slides AH, BH och CH pipetterades över till objektglas (totalt 30) och 10 slumpmässigt utvalda områden per brunn fotograferades med konfokalmikroskop. Bilderna analyserades sedan med hjälp av mjukvaran MIPAR (55) och ett skräddarsytt MIPAR-recept för räknande av jästceller. För att validera om uträkningen blev korrekt jämfördes den automatiserade räkningen från 20 slumpmässigt utvalda bilder med manuell räkning av 2 operatörer. 20 bilder motsvarar 6.66% av det totala underlaget på 300 bilder och bedömdes vara tillräckligt antal för validering av metoden. Operatörerna arbetade simultant och avskilt ifrån varandra. För räkning av hyfer kodades filnamnen på samtliga 20 bilder och 2 operatörer räknade individuellt hyfer på samtliga bilder och genomsnitt av deras två resultat användes. Innan räkning synkroniserades operatörerna om vad som skulle bedömas som hyf och vad som skulle bedömas som cell med hjälp av 5 slumpvalt utvalda testbilder utifrån de 300 bilder som fanns att tillgå. Filnamnen avkodades sedan och samtliga värden protokollfördes i Microsoft Excel där det kalkylerades hur stor differens det var sinsemellan de två operatörerna och differens mellan operatörernas genomsnitt och den automatiserade räkningen.

Statistisk analys

Datan för hyftillväxten analyserades i GNU R (56) med multivariat ANOVA och post-hoc-test Tukey samt Scheffe. Samtliga 3 prover av de två stammarna analyserades samtidigt för att få samband mellan odlingsmedium och påverkan på tillväxt och hyfbildning.

9 / 21

Resultat

Utvärdering av stammar och medium

Odling för kontroll av vitalitet på blodagar

Samtliga stammar visade vitalitet vid odling. Av de fyra stammarna så bedömdes stam 51 ha minst antal hyfer och 254/09 flest antal (Figur 2, Figur 3)

Figur 2 - C. albicans stam 254/09 odlad på blodagar under 24h i 37C

Medium Hyfinduktion

Todd-Hewith broth Medel

PBS + 10% Glukos Medel

PBS + 1.25% GlcNac Stor

10% kalvserum Stor

10 / 21

Figur 3 - C. albicans stam 51 odlad på blodagar under 24h i 37C

Vid utvärdering av medium visade sig Sabouraud broth (Figur 2, Figur 3) resultera i minimal hyfinducering och 10% kalvserum samt PBS + 1.25% GlcNac gav störst hyfinducering (Figur 4, Figur 5). Övriga medium gav mindre hyfinduktion än PBS + 1.25% GlcNac men mer än Sabouraud broth. Kalvserum gav förvisso stor hyfinduktion men pga. risk att det skulle påverka mätning av proteasaktivitet valdes detta medium bort som positiv kontroll.

11 / 21

Figur 5- C. albicans stam 254/09 odlad som suspension i sabouraud broth under 24h i 37C

12 / 21

Figur 7- C. albicans stam 254/09 odlad som suspension i PBS+GlcNaC 1,25% under 24h i 37C

pH-mätning på ECK

pH på PBS innan ångor från e-cigaretten hade filtrerats genom vätskan var 7.4 och efteråt var pH 7.33.

Proteasmätning

Vi kunde inte påvisa någon proteasaktivitet.

Validering av räkningsmetoder

Differensen mellan operatörernas räkning av jästceller skilde sig i genomsnitt med 2,45 procentenheter. Differensen mellan MIPARs automatiserade räkning och genomsnittet på operatörernas räkning skilde sig i genomsnitt med 1,40 procentenheter. (Tabell 2)

Tabell 2 – Resultat av jämförelse av manuell och automatiserad jästräkning

Bild MIPAR Operatör 1 Operatör 2 avg (Op1:Op2) Diff-procent Op1:Op2 Diff MIPAR:avg Diff-procent

1 270 270 292 281 -7,53 -11 4,07 2 1105 1270 1150 1210 10,43 -105 9,50 3 194 205 197 201 4,06 -7 3,61 4 298 280 275 277,5 1,82 20,5 -6,88 5 342 320 335 327,5 -4,48 14,5 -4,24 6 1135 1050 1000 1025 5,00 110 -9,69 7 834 880 900 890 -2,22 -56 6,71 8 743 745 690 717,5 7,97 25,5 -3,43 9 360 390 350 370 11,43 -10 2,78 10 118 130 120 125 8,33 -7 5,93 11 468 440 420 430 4,76 38 -8,12 12 940 1100 980 1040 12,24 -100 10,64 13 318 360 340 350 5,88 -32 10,06 14 144 155 150 152,5 3,33 -8,5 5,90 15 692 670 650 660 3,08 32 -4,62 16 243 220 240 230 -8,33 13 -5,35 17 436 455 475 465 -4,21 -29 6,65 18 109 120 110 115 9,09 -6 5,50 19 809 770 840 805 -8,33 4 -0,49 20 89 87 90 88,5 -3,33 0,5 -0,56

13 / 21

Tillväxt och hyfinducering

Signifikant ökning av totalt antal celler och andel hyfer kunde ses i relation till ECK i odlingsmedium (p<0.05) men ingen statisk signifikant påverkan fanns i relation till stam. Positiv kontrollodling i GlcNac gav stor ökning på antal hyfer jämfört med negativ kontroll. Vid låg koncentration av ECK syntes en viss minskning av tillväxt jämfört med negativ kontroll för båda stammar. Påverkan av ECK på tillväxt verkade sedan divergera där radikal ökning av totalt antal celler syntes på stam 254/09 och en viss minskning påvisades på stam 51 (Figur 8). För båda stammar gav ökad koncentration ECK en ökning av andel hyfer (Figur 9).

Figur 8- Totalt antal celler per stam och olika medium. Y-axeln visar antal celler efter odling 24h i medium Sabouraud dextrose broth (negativ kontroll), PBS + 1,25% GlcNac (positiv kontroll), PBS + 10% ECK, PBS + 30% ECK och PBS + 50% ECK.

14 / 21

Figur 9- Andel hyfer per stam och olika medium. Y-axeln visar andel hyfer efter odling 24h i medium Sabouraud dextrose broth (negativ kontroll), PBS + 1,25% GlcNac (positiv kontroll), PBS + 10% ECK, PBS + 30% ECK och PBS + 50% ECK.

Diskussion

Vi har sett en dosberoende positiv påverkan av ECK på C. albicans på både tillväxt och hyfinduktion vilket gör fortsatt forskning på området intressant både vad gäller påverkan av e-cigarettbruk på C. albicans i mer munhålelika miljöer och utredning av vilka molekylära mekanismer som ligger bakom C. albicans virulens. Det sistnämnda är ett relativt outforskat område och denna studie bidrar med tanken att någon beståndsdel i e-cigarett-vätska kan vara en stressor som C. albicans kan reagera på. Vi har även sett att våra två utvalda stammar reagerar något olika på ECK: stam 254/09 reagerade med radikal ökning av total celltillväxt och stam 51 verkade nå en maximal gräns. Eventuellt kan dessa resultat antyda att vissa arter av C. albicans är att föredra att ha i munhålan och i kombination med att man reder ut mekanismer som ligger bakom virulensfaktorer kan man eventuellt genmodifiera fram en typ av vaccinerande stam av C. albicans. Mer forskning på området behövs. Proteasmätningen visade inte någon aktivitet alls trots att proteasutsöndring är en viktig del av C. albicans virulens och dess del i det orala ekosystemet. Detta kan eventuellt förklaras av att vi odlade C. albicans i suspension och något som tidigare har visat sig inducera proteasutsöndring är C. albicans adherering till olika ytor (2,10,57). Dock har studier på C. albicans odlade i suspension tillsammans med tobakskondensat visat ökad proteasaktivitet (17) och där såg man en maximal påverkan vid 48-72h. Trots detta kunde vi inte mäta proteasaktivitet efter varken 24h eller 48h. Möjligtvis behöver experimentet utföras under 72h för att ge utfall på proteasmätningen. Möjliga förklaringsmodeller till att vi inte såg någon proteasaktivitet kan vara att vår mätmetod

15 / 21 inte är tillräckligt känslig, alternativt att vi använde för låga koncentrationer av supernatatanter vid mätningen eller att det finns något i tobaksrök som inducerar proteasutsöndring och detta ämne inte finns i ECK. Då tidigare forskning har visat att olika stammar av C. albicans reagerar olika på stressorer så har vi försökt fånga in ett så pass brett spektrum av C. albicans-stammar som möjligt och har valt ut två extremer vad gäller benägenhet att bilda hyfer. Huruvida detta urval egentligen är relevant utifrån de stammar som egentligen finns i en genomsnittspopulation

in vivo är oklart och en större studie på vilda stammar hade varit att föredra för att sedan gå

vidare till olika former av in vivo-studier. Då C. albicans i sin naturliga miljö fäster till huvudsakligen epitelceller eller akryl hade det varit intressant att odla stammarna på epitel eller akryl och där utsätta odlingen för ECK och se hur tillväxt och virulens påverkas. I vår metod har två olika system för att räkna bilder från mikroskoperingen använts och båda två har sina eventuella brister: Först av dessa så har den manuella räkningen av hyfer utförts individuellt av två operatörer på bilder där filnamnen varit kodade och sedan användes ett genomsnitt av de två värden som operatörerna fått för varje bild. En utmaning för räknande av hyfer är att C.

albicans är en polymorf organism som kan anta morfologi som varken är hyf eller jäst och detta

försökte vi arbeta runt genom att de som räknade blev synkroniserade i vad som bedömdes som hyf och vad som bedömdes som pseudohyf. I de flesta fall gav hyfräkningen en väldigt låg interoperatörs-skillnad och genomsnittsvärdet bedöms falla inom en rimlig felmarginal. Utöver det gjordes analysen sen på ett genomsnitt av 10st bilder vilket minskar påverkan av eventuell felräkning. Procentsatsen hyfer hade inte påverkats jättemycket om det t.ex. blev räknat 75 hyfer på en bild istället för 60 då antalet jästceller ofta var över 1000. Den andra räkningen var av jästceller vilket utfördes med hjälp av MIPAR. Automatiserad räkning av bilder är i dagsläget under utveckling och optimering vilket ger metoden en rad problem. Bildkvaliteten kunde variera rätt så kraftigt vad gäller ljus och kontrast, ibland syntes flera lager av celler ovanpå varandra, och hyfer kunde sträcka sig över och under ett flertal jästceller och komplicera för algoritmisk räkning. För att komma runt denna problematik utvecklades optimerade cellräkningsalgoritmer som vi försökte validera genom att på 20 slumpmässigt utvalda bilder jämföra manuell räkning från två individuellt arbetande operatörer med det värde som MIPAR fick ut och det stämde oftast mycket väl och i genomsnitt skilde den automatiserade räkningen med cirka 1,4% gentemot manuell räkning. Samtliga bilder genomgick också visuell inspektion för att snabbt ge överblick om huruvida den automatiserade räkningen var rimlig. Slutligen bedömdes det att en felräkning av antal celler skulle få liten påverkan på statistiska analysen då vi arbetade med medelvärden på många bilder och med stora antal celler (ofta över 1000st per bild). Studien kan förbättras på ett antal sätt: flödeshastigheten på vakuumet kunde ha mätts och vi kunde ha försökt att kvantifiera exakt hur mycket av e-cigarettvätskan som lösts i PBS:en. Man hade även kunnat mäta optisk densitet i startkultur för att utvärdera efter ECK exponering och på så sätt bedöma tillväxt. Huruvida studien är kliniskt relevant är diskuterbart då miljön som vi odlat C. albicans i skiljer sig från den orala miljön på många sätt, t.ex. har vi en mycket mer statisk miljö med ett stabilt pH och inga andra organismer att ta med i beräkningarna. Det är också möjligt att ifrågasätta aerosol-molekylernas löslighet i saliv och det är osannolikt att en e-cigarett-brukare står och drar i sig ånga i 5 minuter för att sedan hålla ångan i munhålan i ett helt dygn. Vilken koncentration av nikotin och andra potentiellt virulensmodulerande ämnen som skulle kunna uppmätas i saliven efter 5 minuters exponering är okänt samt att om det skulle vid ett specifikt tillfälle mätas så gör oral clearance att eventuellt lösta partiklar i saliven ändå inte befinner sig i munhålan så pass lång tid. Tidigare studier, både

in vivo och in vitro, har visat ett tydligt samband mellan tobaksrökning och oral candidos. Hur

e-cigaretter påverkar C. albicans virulens är dock outforskat och med tanke på att försäljning av e-cigaretter ofta är oreglerad (58,59) och man ser en ökad trend i världen (27,28,60) samt att

C. albicans kan leda till allvarliga följdsjukdomar är vår bedömning att det behövs mer

16 / 21 alternativ än cigaretter och som ett hjälpmedel vid rökavvänjning. Studier om e-cigaretter faktiskt hjälper vid rökavvänjning visar tvetydiga resultat (61). Då tandvården ofta träffar patienter regelbundet och kan ha en stor påverkan i rökavvänjning krävs det forskning för att utvärdera om e-cigaretter är ett bra hjälpmedel samt om de är ett hälsosamt och riskfritt alternativ för att kunna sätta upp riktlinjer för vad tandvården ska rekommendera vad gäller bruket av e-cigaretter. Det finns sedan tidigare indikationer på att e-cigaretter har en negativ påverkan på PDL-celler (26) och denna studie bidrar med en antydan att C. albicans påverkas på ett sätt som är snarlikt den effekt tobak ger (1,54). Eventuella mekanismer för hur C. albicans påverkas av ECK är antingen via keratinisering av slemhinna likt den man ser vid tobaksrökning (62) vilket gynnar C. albicans (63) eller ökad virulens pga. exponering för metalljoner likt de man ser vid fast ortodontisk apparatur (33–35). Dessa metalljoner finns även i e-cigaretts-aerosol och tobaksrök (22). Det hade varit intressant för framtida forskning att kontrollera mängden av dessa partiklar i aerosolen och huruvida dessa metalljoner faktiskt löser sig från e-cigarett-aerosol till saliv eller PBS. Man kan sedan kontrollera huruvida detta har någon klinisk relevans. Det kan vidare vara intressant att utveckla och utforska riktade terapeutiska insatser för att interferera med C. albicans metalljonhomeostas. Som tidigare nämnt hade det också varit intressant att upprepa en liknande studie där C. albicans istället odlas på akryl eller epitelceller. Utöver detta hade det varit högst relevant att upprepa studien och jämföra e-cigaretter med och utan nikotin. Framförallt behövs in vivo-studier och här kan tandvården spela en stor roll. Förslagsvis kan man sätta upp ett centralt register över candidos och andra oönskade orala tillstånd diagnostiserade i tandvården samt även dokumentera bruk av e-cigaretter. På detta sätt kan man i framtiden ha ett gott underlag för att göra bra studier som kan vägleda i rådgivning när patienter frågar huruvida det finns orala risker med att blossa på sin e-cigarett eller inte. Värdet av studien är ett utforskande av e-cigaretters potentiella skadeverkningar på oral hälsa samt ett öppnande för framtida forskning. Forskning på området behövs då detta kan leda till minskat lidande för individer och minskade samhällskostnader då rådgivning angående e-cigaretter kan minska framtida vårdbehov.

Konklusion

Denna in vitro-studie bekräftar hypotesen om att ECK har en virulensinducerande potential på

C. albicans då man såg en dosberoende respons på ECK och en ökad andel hyfer i förhållande

till jästceller i samtliga prövade stammar. Dock krävs vidare forskning för att utröna huruvida detta har någon klinisk relevans. Tidigare studier har visat att e-cigaretter kan påverka PDL-celler och aerosolen innehåller metalljoner som kan ge ökad virulens hos C. albicans. Andra hälsoeffekter är idag okända och mer forskning behövs för att tandvården ska kunna ge råd angående bruk av e-cigaretter.

Tillkännagivanden

Vi vill tacka Julia Davies för handledning och arbete med bildtagning, Agnethe på labbet för hjälp med elfores. Stort tack till John Sosa för hjälp med design av MIPAR-recept.

Referenslista

1. Semlali A, Killer K, Alanazi H, Chmielewski W, Rouabhia M. Cigarette smoke

condensate increases C. albicans adhesion, growth, biofilm formation, and EAP1, HWP1 and SAP2 gene expression. BMC Microbiol. 2014;14(1):61.

2. Sardi JCO, Scorzoni L, Bernardi T, Fusco-Almeida AM, Mendes Giannini MJS. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. J Med Microbiol. 2013 Jan;62(Pt 1):10–24.

17 / 21 3. Sardi JC, Duque C, Mariano FS, Peixoto IT, Höfling JF, Gonçalves RB. Candida spp. in

periodontal disease: a brief review. J Oral Sci. 2010;52(2):177–185.

4. Fidel PL. Candida-host interactions in HIV disease: implications for oropharyngeal candidiasis. Adv Dent Res. 2011 Apr;23(1):45–9.

5. Whiteway M, Bachewich C. Morphogenesis in Candida albicans. Annu Rev Microbiol. 2007;61:529–53.

6. Cannon RD, Chaffin WL. Oral colonization by Candida albicans. Crit Rev Oral Biol Med Off Publ Am Assoc Oral Biol. 1999;10(3):359–83.

7. Poulain D. Candida albicans, plasticity and pathogenesis. Crit Rev Microbiol. 2015 Jun;41(2):208–17.

8. Sudbery PE. Growth of Candida albicans hyphae. Nat Rev Microbiol. 2011 Aug 16;9(10):737–48.

9. Gow NA. Germ tube growth of Candida albicans. Curr Top Med Mycol. 1997 Dec;8(1– 2):43–55.

10. Mayer FL, Wilson D, Hube B. Candida albicans pathogenicity mechanisms. Virulence. 12013 Feb 15;4(2):119–28.

11. Mardon D, Balish E, Phillips AW. Control of Dimorphism in a Biochemical Variant of Candida albicans1. J Bacteriol. 1969 Nov;100(2):701–7.

12. Davis DA. How human pathogenic fungi sense and adapt to pH: the link to virulence. Curr Opin Microbiol. 2009 Aug;12(4):365–70.

13. Kumamoto CA. Molecular mechanisms of mechanosensing and their roles in fungal contact sensing. Nat Rev Microbiol. 2008 Sep;6(9):667–73.

14. Brand A, Shanks S, Duncan VMS, Yang M, Mackenzie K, Gow NAR. Hyphal orientation of Candida albicans is regulated by a calcium-dependent mechanism. Curr Biol CB. 2007 Feb 20;17(4):347–52.

15. Candida and Candidiasis, Second Edition [Internet]. American Society of Microbiology; 2012 [citerad 11 februari 2017]. Tillgänglig vid:

http://www.asmscience.org/content/book/10.1128/9781555817176

16. Naglik JR, Challacombe SJ, Hube B. Candida albicans Secreted Aspartyl Proteinases in Virulence and Pathogenesis. Microbiol Mol Biol Rev. 2003 Sep 1;67(3):400–28. 17. Baboni FB, Barp D, Izidoro ACS de A, Samaranayake LP, Rosa EAR. Enhancement of

Candida albicans virulence after exposition to cigarette mainstream smoke. Mycopathologia. 2009 Nov;168(5):227–35.

18. Calderone RA, Braun PC. Adherence and receptor relationships of Candida albicans. Microbiol Rev.1991 Mar;55(1):1–20.

18 / 21 20. Pappas RS. Toxic Elements in Tobacco and in Cigarette Smoke: Inflammation and

Sensitization. Met Integr Biometal Sci. 2011 Nov;3(11):1181–98.

21. Hahn J, Monakhova YB, Hengen J, Kohl-Himmelseher M, Schüssler J, Hahn H, m.fl. Electronic cigarettes: overview of chemical composition and exposure estimation. Tob Induc Dis [Internet]. 2014 Dec 9 [citerad 2017 Feb 12];12(1). Tillgänglig vid:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4304610/

22. Williams M, Villarreal A, Bozhilov K, Lin S, Talbot P. Metal and Silicate Particles Including Nanoparticles Are Present in Electronic Cigarette Cartomizer Fluid and Aerosol. PLOS ONE. 2013 Mar;8(3):e57987.

23. Manzoli L, Flacco ME, Fiore M, Vecchia CL, Marzuillo C, Gualano MR, m.fl. Electronic Cigarettes Efficacy and Safety at 12 Months: Cohort Study. PLOS ONE. 2015

Jun;10(6):e0129443.

24. Manzoli L, La Vecchia C, Flacco ME, Capasso L, Simonetti V, Boccia S, m.fl.

Multicentric cohort study on the long-term efficacy and safety of electronic cigarettes: study design and methodology. BMC Public Health. 2013;13:883.

25. Farsalinos KE, Polosa R. Safety evaluation and risk assessment of electronic cigarettes as tobacco cigarette substitutes: a systematic review. Ther Adv Drug Saf. 2014 Apr;5(2):67– 86.

26. Willershausen I, Wolf T, Weyer V, Sader R, Ghanaati S, Willershausen B. Influence of E-smoking liquids on human periodontal ligament fibroblasts. Head Face Med. 2014 Sep 15;10:39.

27. Filippidis FT, Laverty AA, Gerovasili V, Vardavas CI. Two-year trends and predictors of e-cigarette use in 27 European Union member states. Tob Control. 2017;26:98-104. 28. McCarthy M ”Alarming” rise in popularity of e-cigarettes is seen among US teenagers as

use triples in a year. BMJ. 2015;350:h2083.

29. Johnson M, Pennington N. Adolescent Use of Electronic Cigarettes: An Emergent Health Concern for Pediatric Nurses. J Pediatr Nurs. 2015 Aug;30(4):611–5.

30. Hood MI, Skaar EP. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nat Rev Microbiol. 2012 Jul 16;10(8):525–37.

31. Almeida RS, Wilson D, Hube B. Candida albicans iron acquisition within the host. FEMS Yeast Res. 2009 Oct;9(7):1000–12.

32. Citiulo F, Jacobsen ID, Miramón P, Schild L, Brunke S, Zipfel P, m.fl. Candida albicans scavenges host zinc via Pra1 during endothelial invasion. PLoS Pathog.

2012;8(6):e1002777.

33. Ronsani MM, Mores Rymovicz AU, Meira TM, Trindade Grégio AM, Guariza Filho O, Tanaka OM, m.fl. Virulence modulation of Candida albicans biofilms by metal ions commonly released from orthodontic devices. Microb Pathog. 2011 Dec;51(6):421–5.

19 / 21 34. Hernández-Solís SE, Rueda-Gordillo F, Flota-Alcocer AD, Agullar-Ayala FJ,

Rodríguez-Fernández MDSC, Lama-González EM. [Influence of orthodontic appliances on the occurrence of Candida spp. in the oral cavity]. Rev Chil Infectologia Organo Of Soc Chil Infectologia. 2016 Jun;33(3):293–7.

35. Hibino K, Wong RWK, Hägg U, Samaranayake LP. The effects of orthodontic appliances on Candida in the human mouth. Int J Paediatr Dent. 2009 Sep;19(5):301–8.

36. Shepherd MG. Cell envelope of Candida albicans. Crit Rev Microbiol. 1987;15(1):7–25. 37. Braun PC, Calderone RA. Chitin synthesis in Candida albicans: comparison of yeast and

hyphal forms. J Bacteriol. 1978 Mar;133(3):1472–7.

38. Mattia E, Carruba G, Angiolella L, Cassone A. Induction of germ tube formation by N-acetyl-D-glucosamine in Candida albicans: uptake of inducer and germinative response. J Bacteriol. 1982 Nov;152(2):555–62.

39. Konopka JB. N-Acetylglucosamine Functions in Cell Signaling. Scientifica. 2012 Dec 5;2012:e489208.

40. Gow NA, Hube B. Importance of the Candida albicans cell wall during commensalism and infection. Curr Opin Microbiol. 2012 Aug;15(4):406–12.

41. Harriott MM, Noverr MC. Importance of Candida-bacterial polymicrobial biofilms in disease. Trends Microbiol. 2011 Nov;19(11):557–63.

42. Thein ZM, Seneviratne CJ, Samaranayake YH, Samaranayake LP. Community lifestyle of Candida in mixed biofilms: a mini review. Mycoses. 2009 Nov;52(6):467–75. 43. Metwalli KH, Khan SA, Krom BP, Jabra-Rizk MA. Streptococcus mutans, Candida

albicans, and the human mouth: a sticky situation. PLoS Pathog. 2013;9(10):e1003616. 44. Klinke T, Guggenheim B, Klimm W, Thurnheer T. Dental caries in rats associated with

Candida albicans. Caries Res. 2011;45(2):100–6.

45. Slots J, Rams TE, Listgarten MA. Yeasts, enteric rods and pseudomonads in the subgingival flora of severe adult periodontitis. Oral Microbiol Immunol. 1988 Jun;3(2):47–52.

46. Arzmi MH, Dashper S, Catmull D, Cirillo N, Reynolds EC, McCullough M.

Coaggregation of Candida albicans, Actinomyces naeslundii and Streptococcus mutans is Candida albicans strain dependent. FEMS Yeast Res. 2015 Aug;15(5):fov038.

47. Vylkova S, Carman AJ, Danhof HA, Collette JR, Zhou H, Lorenz MC. The Fungal Pathogen Candida albicans Autoinduces Hyphal Morphogenesis by Raising Extracellular pH. mBio [Internet]. 2011 May 17 [citerad 2017 feb 12];2(3). Tillgänglig vid:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3101780/

48. Dutton LC, Jenkinson HF, Lamont RJ, Nobbs AH. Role of Candida albicans secreted aspartyl protease Sap9 in interkingdom biofilm formation. Pathog Dis. 2016 Apr;74(3).

20 / 21 49. Ruml T, SoucĻek M. Secreted aspartic proteases of Candida albicans, Candida tropicalis,

Candida parapsilosis and Candida lusitaniae. [citerad 2015 Sep 10]; Tillgänglig vid: http://www.researchgate.net/profile/Jiri_Dostal3/publication/12013074_Secreted_aspartic _proteases_of_Candida_albicans_Candida_tropicalis_Candida_parapsilosis_and_Candida _lusitaniae._Inhibition_with_peptidomimetic_inhibitors/links/54afbaf90cf2b48e8ed68c1c .pdf

50. Monod M, Borg-von ZM. Secreted aspartic proteases as virulence factors of Candida species. Biol Chem. 2002 Aug;383(7–8):1087–93.

51. Janus MM, Crielaard W, Volgenant CMC, Veen MH van der, Brandt BW, Krom BP. Candida albicans alters the bacterial microbiome of early in vitro oral biofilms. J Oral Microbiol. 2017 Jan 1;9(1):1270613.

52. Wächtler B, Citiulo F, Jablonowski N, Förster S, Dalle F, Schaller M, m.fl. Candida albicans-epithelial interactions: dissecting the roles of active penetration, induced endocytosis and host factors on the infection process. PloS One. 2012;7(5):e36952. 53. Mardegan R de C, Foglio MA, Gonçalves RB, Höfling JF. Candida albicans proteinases.

2006 [citerad 2015 Sep 10]; Tillgänglig vid:

https://tspace.library.utoronto.ca/handle/1807/8613

54. Alanazi H, Semlali A, Perraud L, Chmielewski W, Zakrzewski A, Rouabhia M. Cigarette Smoke-Exposed Candida albicans Increased Chitin Production and Modulated Human Fibroblast Cell Responses. BioMed Res Int. 2014 Sep 11;2014:e963156.

55. Sosa JM, Huber DE, Welk B, Fraser HL. Development and application of MIPARTM: a novel software package for two- and three-dimensional microstructural characterization. Integrating Mater Manuf Innov. 2014 Dec 11;3(1):10.

56. R Development Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing [Internet]. Vienna, Austria: R Foundation for Statistical Computing; 2011. Tillgänglig vid: http://www.R-project.org

57. Soysa NS, Ellepola ANB. The impact of cigarette/tobacco smoking on oral candidosis: an overview. Oral Dis. 2005 Sep;11(5):268–73.

58. Saitta D, Ferro GA, Polosa R. Achieving appropriate regulations for electronic cigarettes. Ther Adv Chronic Dis. 2014 Mar;5(2):50–61.

59. Voigt K. Smoking Norms and the Regulation of E-Cigarettes. Am J Public Health. 2015 Oct;105(10):1967–72.

60. Mcgraw D. Current and future trends in electronic cigarette use. Int J Psychiatry Med. 2015;48(4):325–32.

61. Malas M, van der Tempel J, Schwartz R, Minichiello A, Lightfoot C, Noormohamed A, m.fl. Electronic Cigarettes for Smoking Cessation: A Systematic Review. Nicotine Tob Res Off J Soc Res Nicotine Tob. 2016 Oct;18(10):1926–36.

62. Tobacco smoke-induced alterations of cytokeratin expression in the rat nasal cavity following chronic inhalation of room-aged sidestream smoke [Internet]. [citerad 2017 Feb

21 / 21 14]. Tillgänglig vid:

http://www.sciencedirect.com.proxy.mah.se/science/article/pii/S0378427498000873 63. Dongari-Bagtzoglou A, Kashleva H, Dwivedi P, Diaz P, Vasilakos J. Characterization of

Mucosal Candida albicans Biofilms. PLoS ONE [Internet]. 2009 Nov 24 [citerad 2017 Feb 14];4(11). Tillgänglig vid: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2776351/