1
Elastas+ neutrofila granulocyter och
CD20+ B-celler i parodontit- respektive
periimplantitvävnad
A. Haglund
F. Rebelo Dessborn
Handledare: H. Jansson, A. Ljunggren
Masteruppsats (30hp) Malmö högskola
Tandläkarprogrammet Odontologiska Fakulteten
2
Abstract
The purpose of the current study was to investigate the presence and localization of neutrophil granulocytes (Neutrophil Elastase+) and B-cells (CD20+) in patients with chronic
periodontitis and/or peri-implantitis. These cells play an important role in the adaptive as well as the innate immune system, and can be considered as representative for responses of
different character. Inflamed tissue consisting of epithelia and connective tissue was collected from twenty sites (thirteen with periodontitis and seven with peri-implantitis) on sixteen individuals undergoing surgical treatment. The biopsies were prepared
immunohistochemically (Dako’s Two-Step Polymer Method) and analyzed in microscopes. On tissue-level a longer pocket epithelium and a greater inflammatory infiltrate in the apical portion was observed in peri-implantatis. The apical half of the peri-implant tissue generally indicated a more local inflammatory infiltrate in the contact area than in periodontitis, both concerning B-cells and neutrophil granulocytes. The level of vascularisation was also higher. B-cells were predominant in both conditions and had a general distribution in most cases. Neutrophil granulocytes occurred in a smaller extent than B-cells, above all in periodontitis.
Sammanfattning
Målet med denna studie var att undersöka förekomst och lokalisering av neutrofila granulocyter (Neutrophil Elastase+) och B-celler (CD20+) hos patienter med kronisk
parodontit och/eller periimplantit. Dessa celler utgör viktiga delar av det specifika respektive ospecifika försvaret och kan ses som representanter för inflammatoriska svar av olika
karaktär. Inflammerad vävnad innefattande epitel och bindväv insamlades från tjugo lokaler (tretton med parodontit och sju med periimplantit) på sexton individer som behandlades kirurgiskt. Vävnaden preparerades immunohistokemiskt (Dako’s Two-Step Polymer Method)
3
och analyserades i mikroskop. På vävnadsnivå iakttogs i samband med periimplantit ett längre fickepitel samt ett kraftigare inflammatoriskt cellinfiltrat längst apikalt.Den apikala hälften av periimplantitvävnaden uppvisade som regel mer lokalt koncentrerade inflammatoriska infiltrat vid kontaktytan än parodontitvävnaden, både gällande B-celler som neutrofila granulocyter. Graden av vaskularisering var även högre.B-celler dominerade i förekomst vid båda
tillstånden och hade ofta en generell spridning i vävnaden. Neutrofila granulocyter förekom i mindre utsträckning än B-celler, framförallt vid parodontit.
Förkortningar
IHC: Immunohistokemi
NE+: Infärgning med antikropp Neutrophil Elastase. ICT: Inflammatoriskt cellinfiltrat
Inledning
Under de senaste 30 åren har den implantatstödda protetiken intagit en allt större roll i behandlingen av helt eller partiellt tandlösa patienter. Långtidsprognosen anses idag vara mycket god, ur såväl funktionellt som estetiskt perspektiv (1). Behandlingsformen är dock långt ifrån komplikationsfri och misslyckanden förekommer fortfarande (2). I en systematisk översiktartikel från 2002 rapporterades en implantatförlust på 2-5 % under de första fem åren. Av dessa kunde 40-60 % härledas till biologiska komplikationer (3). Enligt Esposito et al. (2000) tyder sammantaget kliniska, radiologiska och histologiska fynd på två etiologiska huvudfaktorer vid implantatförluster, infektion och för stor ocklusal belastning i relation till benstödet (4). En annan systematisk review som också granskade överlevnaden av
4
(96,8 % överlevnad). Efter belastning uppskattades den årliga förlustsfrekvensen av fixturer till 0,28. I studien kunde man även rapportera att en stor del av implantatförlusterna var relaterade till faktorer som direktinstallation eller tidiga belastningar (5).
Den mjuk- och hårdvävnad som omger det osseointegrerade implantatet uppvisar vissa likheter med parodontiet. En stor skillnad är dock att de kollagena fibrerna ligger parallellt med implantatytan och inte fäster till den, istället för att vinkelrätt ansluta till rotcementet (2). När en tand går förlorad försvinner även det kärlplexus som omgett och försörjt
parodontalligamentet och rothinnan. Detta innebär att det implantat som senare installeras i regionen, kommer omges av en stödjevävnad med förändrad karaktär avseende
vaskularisering (6).
Trots det relativt omfattande forskningsunderlag som idag finns på periimplantit, är
kunskapen avseende etiologi, patogenes och behandling fortfarande bristfällig. Det finns ett stort antal studier gjorda på human vävnad i hänseende till parodontit, men endast ett fåtal när det gäller periimplantit. Majoriteten av forskningen har skett på mjukvävnadsnivå. Dessutom har en stor del av de kliniska studierna utförts på små populationer och framförallt baserat på biologiskt material från djur, främst hundar, där infektion skapats på konstgjord väg (4, 7, 8).
Även om parodontit och periimplantit uppvisar flera likheter, har man kliniskt iakttagit en tidvis snabbare progression av vävnadsnedbrytning kring implantat än tänder. Denna accelererade destruktion härleds av vissa författare till rent histologiska olikheter i den kringliggande vävnaden. Samtidigt kan det antas att skillnader i det immunologiska svaret ligger bakom iakttagelsen. I experimentella studier på hund, fick biofilm ackumuleras ostört på såväl tand- som på implantatytor under en 3-månadersperiod (7). Placket uppvisade då
5
liknande sammansättning på tand och implantat. Utöver detta kunde man visa att den apikala utsträckningen samt den totala storleken av det inflammatoriska infiltratet var signifikant (nästan trefaldigt) större i mukosan kring implantat än gingivan runt tänder. Av detta drogs slutsatsen att värdens svar till den bakteriella utmaningen efter tre månader var mer uttalad vid implantatmucosit än gingivit. Man kunde dock inte dra några slutsatser om huruvida liknande mönster gäller för benvävnaden.
Även i kliniska studier utförda på människor har man påvisat en större extension av det inflammatoriska infiltratet hos periimplantit än vid parodontit. Plasmaceller och lymfocyter dominerade i båda tillstånden, medan neutrofila granulocyter och makrofager relativt sätt återfanns i större antal vid periimplantit (9).
Parodontit och periimplatit är båda sjukdomar där immunsystemet spelar en central roll. Celler från både det specifika och ospecifika försvaret är aktiva såväl skyddande som nedbrytande av den omgivande vävnaden. De celltyper som väckt stort intresse de senaste åren är B-celler och neutrofila granulocyter. B-celler är en viktig del av det specifika immunförsvaret. De kan aktiveras direkt av ett antigen eller via kontakt med en T-lymfocyt som bundit till det aktuella antigenet. Resultatet blir en s.k. klonal expansion, där B-cellen multipliceras till mängder av identiska celler. Dessa utmognar till stora plasmaceller, dvs. högspecialiserade effektorceller som utsöndrar mängder med antigenspecifika antikroppar. Några av B-cellerna blir även minnesceller (10).
Neutrofila granulocyter utgör en grupp av vita blodkroppar som tillsammans med basofila och eosinofila granuclocyter ofta benmäns som PMN-celler (polymorfonukleära granulocyter).
6
Cellerna karaktäriseras av stora mängder cytoplasmatiska granula samt den typiska
flerformiga cellkärnan. Av de cirkulerande leukocyterna utgör neutrofiler ca 50-60 % av den totala mängden. Neutrofiler har en kort livslängd (3-4 dygn) och utgör tillsammans med makrofagerna första linjens försvar vid infektion eller vävnadsskada. De kan fagocytera patogener och har en ansenlig arsenal av exocytosiska vesiklar innehållande bland annat lysozym och elastas (10). Celltypen tros spela en avgörande roll i bennedbrytningsprocessen vid parodontit och anses var ett tecken på en inflammation av mer akut karaktär (11).
Samtidigt har studier visat påvisat en förhöjd elastasaktivitet i det gingivala exudatet vid periimplantit i förhållande till kliniskt opåverkade implantat (12). Den forskning som gjorts på cellsammansättningen vid mucosit och periimplantit ger dock spretande svar. Studier har redovisat mycket varierande resultat på förekomst av olika immunologiska celltyper i hård- och mjukvävnader kring implantat (1, 7, 9, 13, 14).
Målet med arbetet var att undersöka förekomst och lokalisering av neutrofila granulocyter (Neutrophil Elastase+) och B-celler (CD20+) hos patienter med kronisk parodontit och/eller periimplantit. Intresset för dessa celltyper beror, utöver de tidigare nämnda skillnaderna som observerats, på att neutrofila granulocyter och B-celler utgör viktiga delar av det specifika respektive ospecifika försvaret. De kan därför ses som representanter för inflammatoriska svar av olika karaktär, dvs. det kroniska och det mer akuta.
Material och metod
VävnadsinsamlingInflammerad vävnad innefattande epitel och bindväv insamlades från tjugo lokaler (tretton med parodontit och sju med periimplantit) på sexton (fem män och elva kvinnor,
7
kirurgiskt för parodontit och/eller periimplantit vid två specialistkliniker i Skåne. Tre vävnadsprov erhölls ifrån avdelningen för Parodontologi vid Odontologiska fakulteten, Malmö högskola och sjutton ifrån Parodontologiavdelningen på Centrum för
Specialisttandvård i Kristianstad, Folktandvården Skåne. De gingivala biopsierna utgjordes av proximala lokalisationer kring tänder och implantat som avlägsnades från den uppfällda lambåns mest koronala del. Vävnadsproverna avidentifierades och sparades i biobanken (enl. Socialstyrelsen godkänd nr. 497) på avdelningen för Oral Patologi, vid Odontologiska
fakulteten på Malmö Högskola. Proverna tilldelades här ett forskningsnummer, i detta fall inom intervallen F5 till F9 samt F11 till F21.
Etisk prövning
Protokollet för projektet granskades och godkändes av Odontologiska fakultetens etiska kommitté vid Malmö högskola. Samtliga patienter informerades om projektets syfte och disposition innan ingreppen utfördes och fick i samband med detta godkänna sitt deltagande skriftligen på en samtyckesblankett.
Preparering
Efter biopsitagning fixerades vävnaden i formalin under minst 24 timmar, varefter en dehydreringsprocess utfördes genom successiv ökning av etanolhalt. Inför
paraffininbäddningen befriades vävnaden från alkohol via s.k. clearing, med xylen som intermedium. Efter avslutad clearing impregnerades vävnadsbitarna med smält paraffin, varefter de bäddades in. 3µm snitt erhölls med rotationsmikrotom och placerades på positivt laddade objektivglas. Varje preparat snittades i serier om fem, dvs. två per antikropp samt en Mayer’s hematoxylin-eosin (HTX) standardinfärgning.
8 Immunohistokemi
Vävnaderna avparaffinerades med xylen och hydrerades med etanol i sjunkande koncentrationer (100-96 %) till destillerat vatten. De preparat som skulle färgas in med antikroppar för B-celler sänktes först ner i TEG-buffertlösning (Tetraetylen glykol) och förbehandlades med värmemedierad s.k. ”Antigen Retrieval” (program 98C-S30M) i mikrovågsugn MicroMED T/T Mega till 98°C. Härigenom bröts de metylenbryggor av korsbundna proteiner som uppstått under fixeringen och som blockerar antigena
bindingsplatser, epitoper. Eftersom epitoperna för antigen mot neutrofil elastas är känsliga för värme utfördes för dessa ingen förbehandling.
Preparering skedde med Dako’s Two-Step Polymer Method (EnVision™, Dako Sweden AB, Stockholm). Denna indirekta metod bygger på inbindning och märkning av aktuella epitoper genom primära antikroppar, till vilka markerande sekundära antikroppar sedan fäster. För att reducera bakgrundsinfärgning inkuberades glasen först i BSA-buffert (Bovine serum
albumin), som blockerar reaktiva ospecifika bindningsplatser. De primära antikropparna utgjordes av Neutrophil Elastase, DAKO M0752, klon NP57 (1:200, Dako Antibody Diluent) för neutrofila granulocyter samt CD20, DAKO M0755, klon L26 (1:200, Dako Antibody Diluent) för B-celler. Som positiv kontroll för CD20+ B-celler användes human tonsillvävnad och för neutrofil elastas utgjordes den av human Lingua geografica. Inkubering i HPBK (Väteperoxidas blocking solution) förhindrar ytterligare antigeninbinding innan sekundär antikropp tillsätts. För visualisering användes Dako REAL™ EnVision™ Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse. Till den sekundära antikroppen binder här
detektionsreagensen ENV, varefter DAB-lösning (diaminbenzidin + substratbuffert väteperoxidas) tillsätts. Detta substratsystem producerar en skarpt brunaktig fällning vid platsen för målantigenet.
9
Sköljning och placering i TRIS-buffert under en minut skedde mellan varje steg.
Hematoxylin-färgning (Dako REAL™ Hematoxylin), utfördes sedan som motfärgning för att tydliggöra övriga strukturer. Detta basiska färgämne binder till ribonukleinsyror, exempelvis i cellkärnor och ribosomer som då färgas klarblått (15).
Analys
Genomförandet, analysen och sammanställningen skedde enligt blindtestmetoden, för att undvika bias. Analysen utfördes av två observatörer. Innan analysen kalibrerade
observatörerna sig i ljusmikroskop (Nikon Eclipse 80i, Nikon instruments Europe,
Amstelveen, Nederländerna). Snitten granskades i mikroskop (Motic BA300, Motic Europe, Barcelona, Spanien) och kategoriserades individuellt av observatörerna, med fokus på
förekomst av neutrofil elastas och CD20+ celler samt lokaliseringen i den aktuella vävnaden. Resultaten jämfördes och sammanställdes. För fotografering användes ljusmikroskop Nikon Eclipse 80i (Nikon Instruments Europe, Amstelveen, Nederländerna), kamera Nikon DS-2Mv (Nikon Instruments Europe, Amstelveen, Nederländerna) samt dataprogrammet
NIS-Elements Microscope Imaging Software (Nikon Instruments Europe, Amstelveen, Nederländerna).
Resultat
Generellt kunde vi på vävnadsnivå iaktta skillnader i utseende vid parodontit och periimplantit. Den vävnad där inflammationen skedde kring implantat uppvisade längre fickepitel (Bild 1) samt ett kraftigare inflammatoriskt cellinfiltrat längst apikalt.
10
Periimplantitvävaden var innan fixering mer ödematös och som regel rikare på
granulationsvävnad. Den kom ofta trasig och i flera bitar, istället för en hel sammansatt vävnad vilket fallet var vid parodontit. Histologiskt utgjorde sårytan på 3 av 7
periimplantitbiopsier mer än hälften av den totala längden. Liknande observationer gjordes ej vid parodontit.
Det inflammatoriska infiltratet och den närmst kringliggande vävnaden vid periimplantit var generellt rikligare vaskulariserad än vid parodontit (Bild 2). Den apikala hälften av
periimplantitvävnaden uppvisade som regel mer lokala inflammatoriska infiltrat vid kontaktytan än parodontitvävnaden, både gällande B-celler som neutrofila granulocyter (Bild 3). Inflammationscellsförekomsten vid parodontit varierade, men var som regel mer generellt spridd. B-celler dominerade i förekomst vid båda tillstånden och uppvisade också den en generell spridning i vävnaden. Vid parodontit låg cellerna dock som ett band under basalmembranet i flertalet snitt (Bild 4).
Neutrofila granulocyter förekom i mindre utsträckning än B-celler, framförallt vid parodontit. Oftast dominerade neutrofila granulocyter i anslutning till sårytor eller kärlrik
granulationsvävnad (Bild 5,6,7). På vissa periimplantitpreparat sågs en mer generell infiltration av granulocyter, som då även vandrat upp genom epitelcellslagret ut mot kontaktytan (Bild 8). Ett antal vävnadssnitt, såväl parodontit som periimplantit, uppvisade endast väldigt få eller strikt lokala infiltrat av B-celler och/eller neutrofila granulocyter.
11
Diskussion
Resultatet av detta projekt bygger på uppskattningar av ett begränsat och i vissa fall
svårjämförlig urval. Det varierade utseendet innebär att entydiga svar gällande förekomst och lokalisering av neutrofila granulocyter och B-celler är svåra att ge. Studiens omfattning är dock jämförbar med tidigare forskning på periimplantit hos människor (8) och en rad tydliga trender kan identifieras.
Periimplantitvävnadens konsistens efter biopsitagning var som regel mer ödematös och kom sällan i sammanhängande bitar. Histologiskt iakttogs ett förlängt fickepitel vid periimplantit, som regel uttunnat och inflammatoriskt reaktivt apikalt åt (Bild 1). Liknande fynd har tidigare redovisats av Berglundh et al. (8, 14) där en av slutsatserna även var att sårytan i fickas mest apikla del stod i direkt kontakt med implantatet. Detta stämmer överens med fynden i vår studie (Bild 6).
Vid parodontit var inflammationen mer allmän och de inflammatoriska cellerna sprida koronalt (Bild 4). Det ICT som observerades vid periimplantit låg ofta djupt och utgjordes av mycket kärlrik bindväv, i princip till den grad att bindvävens karaktäristiska kollagena fibrer var helt ersatta (Bild 2). Detta är ett tecken på frånvaro av sjukdom, vilket antagligen beror på att antigen inte förkommer på den närstående kontaktytan (17). Samtidigt uppvisade den koronala delen en fibrös och inflammatoriskt sett cellfri bindväv (Bild 9). Detta stämmer överens med observationer i tidigare studier av Berglundh el al. (8) samt av Ericsson et al. (16). Berglundh et al kunde på humant biopsimaterial visa ett mer uttalat ICT vid
periimplantit än vid parodontit, samt att den förstnämnda i de flesta fallen var lokaliserad apikalt om fickepitelet.
12
Neutrofiler och B-celler återfanns vid både parodontit och periimplantit, men som regel med stora skillnader i antal. De parodontitbiopsier vi hade att tillgå visade en klar tendens till att domineras av B-celler, samtidigt som neutrofila granulocyter i några av dessa var fåtaliga eller saknades helt. Detta ligger i linje med tidigare redovisade resultat av Nussbaum och Shapira (18) om att neutrofiler dominerar i det tidiga stadiet, dvs. gingivit, för att sedan kraftigt avta i takt med utvecklingen av parodontit. Berglundh (8) är inne på samma spår, “Plasmaceller och lymfocyter dominerade i båda lesionerna, medan neutrofila granulocyter och makrofager återfanns i större relativa proportioner vid periimplantit än vid parodontit”.
Även de neutrofila granulocyternas lokalisation skiljde sig mellan parodontit och
periimplantit. På parodontitbiopsierna tycktes B-cellsansamlingar formera sig på två distinkta sätt, antingen som breda band under basalmembranet (Bild 4) eller som spridda laterala stråk genom bindväven. I de fall av parodontit där neutrofiler kunde identifieras, var de framförallt lokaliserade djupt och perivaskulärt.
Tidigare studier har dragit slutsatser om att neutrofiler vid parodontit skapar en barriär mellan epitel och plack i sulcus (19), vilket kan förhindra bakteriell invasion av den underliggande bindväven (13, 20). Detta fenomen kunde vi inte observera vid parodontit. Däremot kunde det ses vid periimplantit hos ett antal individer. Det föreföll i dessa fall som att neutrofiler vandrar upp genom epitelcellslagret och lägger sig i den skadade keratinytan (Bild 8). Detta kan tänkas vara en konsekvens av att epitelcellslagret skadats. Härmed rekryteras PMN-celler kemotaktiskt genom att de celler som befinner sig i omgivningen signalerar för en akut
infektion. PMN-cellerna utgör tillsammans med natural killer celler kroppens insatsstyrka (21, 22). Detta första svar är dock inte enbart skyddande. Scott et al beskrev i en nyligen
13
publicerad artikel det neutrofila skyddet som ett tveeggat svärd, där en överaktivitet kan orsaka vävnadsskada samt förlänga och förstärka den parodontala sjukdomen (23).
I samtliga parodontitbiopsier kunde neutrofila granulocyter och/eller B-celler identifieras. 6 av 7 periimplantitbiopsier uppvisade omfattande ICT. Dock skedde ingen infärgning av neutrofilt elastas eller CD20 i ett av vävnadsproven. I tidigare studier har man visat att den inflammatoriska processen i vissa periimplantitlesioner tycktes gå i skov. Detta innebär att mer stabila perioder varvades med perioder av snabbare progression, där den infekterade vävnaden nådde den alveolära benmärgen (7). Den periimplantitbiopsi där infärgning uteblev kan tänkas representera en mer stabil fas av sjukdomsförloppet.
Det fanns potentiella felkällor i studien. Urvalet utgjordes av de patienter som fanns tillgängliga på de två aktuella klinikerna och som behandlades kirurgiskt under perioden augusti 2011 till november 2011. Detta medförde en ojämn fördelning mellan de två sjukdomstillstånden. Det begränsade antalet patienter som behandlades medförde att vi ej kunde ta hänsyn till anamnesiska uppgifter såsom allmänsjukdomar, medicinering eller tobaksbruk. Dessa kan tänkas påverka sjukdomsförloppet. Biopsierna avlägsnades av olika operatörer, vilket kan ha inneburit variationer i utförande och omfattning. Den tid vävnaden fick ligga i formalin kan ha varierat eftersom en del av vävnaden skickades per post. Detta kan ha inneburit skillnader i antalet metylenbryggor av korsbundna proteiner, vilket har en inverkan på antalet epitoper tillgängliga för antikroppar. Immunohistokemin utfördes dessutom vid olika tillfällen, samt manuellt av två individer. Detta medför att mindre variationer i metoden kan tänkas ha förekommit.
14
Konklusion
Kliniskt utgjordes biopsierna vid parodontit av en sammanhängande vävnadsbit med fast konsistens. Periimplantitvävnaden var däremot trasig och ödematös. På vävnadsnivå uppvisade periimplantitbiopsierna betydligt rikligare vaskularisering. Intakt fickepitel sågs generellt betydligt längre apikalt vid periimplantit i jämförelse med parodontit. På cellnivå dominerade B-celler i förhållande till neutrofila granulocyter vid båda inflammationstyperna. Lokaliseringen av det inflammatoriska infiltratet var vid parodontit mer generellt spridd medan periimplantitvävnaden ofta uppvisade kraftiga, lokala ansamlingar vid tandköttsfickans mest apikala del.
Referenser
1. Xu L, Yu Z, Lee HM, Wolff MS, Golub LM, Sorsa T. Characteristics of collagenase-2 from gingival crevicular fluid and implant sulcular fluid in periodontitis and peri-implantitis patients: pilot study. Acta Odontol Scand. 2008; 66: 219-224.
2. Meffert RM. Periodontitis vs. peri-implantitis: the same disease? The same treatment? Crit Rev Oral Biol Med. 1996; 7: 278-291.
3. Berglundh T, Persson L, Klinge B. A systematic review of the incidence of biological and technical complications in implant dentistry reported in prospective longitudinal studies of at least 5 years. J Clin Periodontol. 2002; 29 Suppl 3: 197-212; discussion 232-3.
4. Esposito M, Thomsen P, Ericson LE, Sennerby L, Lekholm U. Histopathologic observations on late oral implant failures. Clin Implant Dent Relat Res. 2000; 2: 18-32.
15
5. Jung RE, Pjetursson BE, Glauser R, Zembic A, Zwahlen M, Lang NP. A systematic review of the 5-year survival and complication rates of implant-supported single crowns. Clin Oral Implants Res. 2008; 19: 119-130.
6. Scardina GA, Pisano T, Messina M, Rallo A, Messina P. "In vivo" evaluation of the vascular pattern in oral peri-implant tissues. Arch Oral Biol. 2011; 56: 148-152.
7. Heitz-Mayfield LJ, Lang NP. Comparative biology of chronic and aggressive periodontitis vs. peri-implantitis. Periodontol 2000. 2010; 53: 167-181.
8. Berglundh T, Zitzmann NU, Donati M. Are peri-implantitis lesions different from periodontitis lesions? J Clin Periodontol. 2011; 38 Suppl 11: 188-202.
9. Gualini F, Berglundh T. Immunohistochemical characteristics of inflammatory lesions at implants. J Clin Periodontol. 2003; 30: 14-18.
10. Murphy KP, Janeway CA, Walport M, Ehrenstein M, Travers P. Janeway's immunobiology, (7th edition). New York: Garland Science; 2008.
11. Ohlsson K, Olsson I. The neutral proteases of human granulocytes. Isolation and partial characterization of two granulocyte collagenases. Eur J Biochem. 1973; 36: 473-481. 12. Hultin M, Gustafsson A, Hallström H, Johansson LA, Ekfeldt A, Klinge B. Microbiological findings and host response in patients with periimplantitis. Clin Oral Implants Res. 2002; 349-58.
13. Gemmell E, Yamazaki K, Seymour GJ. Destructive periodontitis lesions are determined by the nature of the lymphocytic response. Crit Rev Oral Biol Med. 2002; 13: 17-34.
16
14. Berglundh T, Gislason O, Lekholm U, Sennerby L, Lindhe J. Histopathological observations of human periimplantitis lesions. J Clin Periodontol. 2004; 31: 341-347.
15. Dako M. Dako REAL™ EnVision™ Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse K5007. 201205 (3rd edition).
16. Ericsson I, Berglundh T, Marinello C, Liljenberg B, Lindhe J. Long-standing plaque and gingivitis at implants and teeth in the dog. Clin Oral Implants Res. 1992; 99-103.
17. Mackler BF, Frostad KB, Robertson PB, Levy BM. Immunoglobulin bearing lymphocytes and plasma cells in human periodontal disease. J Periodontal Res. 1977; 37-45.
18. Nussbaum G, Shapira L. How has neutrophil research improved our understanding of periodontal pathogenesis? J Clin Periodontol. 2011; 49-59.
19. Attström R SH. Effect of experimental neutropenia on initial gingivitis in dogs. Scand J Dent Res. 1979; 7-23.
20. Hemmerle J FR. Bacterial invasion of periodontal tissuesafter experimental immunosuppression in rats. J Biol Buccale. 1991; 271-82.
21. Kobayashi SD, Voyich JM, Burlak C, DeLeo FR. Neutrophils in the innate immune response. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2005; 505-17.
22. Bhatnagar N, Hong HS, Krishnaswamy JK, Haghikia A, Behrens GM, Schmidt RE et al. Cytokine-activated NK cells inhibit PMN apoptosis and preserve their functional capacity. Blood. 2010; 1308-16.
17
23. Scott DA, Krauss J. Neutrophils in periodontal inflammation. Front Oral Biol. 2012; 15: 56-83. Epub 2011 Nov 11.
Bilder
Bild 1. F14 C HTX. Periimplantitvävnad med långt fickepitel och intakt kontaktyta. Bindväven är fibrös och innehåller få inflammatoriska celler. Snittets nedre begränsning ses i bild 3. Ursprunglig förstoring x4.
18
Bild 2. F20 HTX. Rikligt vaskulariserad bindväv i ICT vid periimplantit. Pilarna pekar på tvärsnittade blodkärl med infärgade blodkroppar. Ursprunglig förstoring x4.
Bild 3. F14 C. Skillnaden i lokalisation mellan neutrofila granulocyter och B-celler i
periimplantitvävnad. (A) NE+: Neutrofila granulocyter i den inflammerade kontaktytan. (B) CD20+: Kraftiga ansamlingar av B-celler djupt i apikal riktning såväl mot implantatytan (IMPL.) som mot benet (BEN). Ursprunglig förstoring x4.
19
Bild 4. F13B. CD20+: Kraftigt infärgat band av B-celler i hela lamina propria vid parodontit. Ursprunglig förstoring x4.
Bild 5. F20. NE+: Granulationsvävnad vid periimplantit dominerad av neutrofila granulocyter. Snittet är karaktäristiskt för periimplantitvävnaden, där neutrofila granulocyter alltid sågs tätt i anslutning till kärlrik bindväv. Ursprunglig förstoring x10.
20
Bild 6. F5 NE+: Neutrofila granulocyter i anslutning till såryta vid parodontit. Dessa ansamlingar av neutrofila granulocyter, i nära anslutning till infektionskällan, sågs både vid parodontit och vid periimplantit. Ursprunglig förstoring x4.
Bild 7. F20 (A) NE+: Täta ansamlingar av neutrofila granulocyter generellt i bindväven vid periimplantit. (B) CD20+: Enstaka, glest spridda B-celler. Ursprunglig förstoring x4.
21
Bild 8. F11. NE+: Neutrofila granulocyter lokaliserade i, och strax under epitelet som legat an implantatet. Tunt epitellager med insprängda granulocyter, vilket uteslutande observerades vid periimplantit. Ursprunglig förstoring x4/x10.
Bild 9. F14C, NE+: Inflammatoriskt cellfattig koronal del av periimplantitbiopsi. Vid parodontit observerades motsatt ett mer generellt ICT spritt i hela bindväven, se bild 4. Ursprunglig förstoring x4.
22
Tabeller
Snittjocklek 3 µm. Varje biopsi snittades i serier om fem, dvs. två per antikropp samt en Mayer’s hematoxylin-eosin (HTX) standardinfärgning. Antikropparna utgjordes av CD20+ för B-celler och Neutrophil Elastase+ för neutrofila granulocyter. Biopsierna granskades med mikroskop i förstoringarna x4, x10 och x40. Efter granskning grupperades biopsierna utefter diagnos. Resultatet sammanställdes i tabellerna nedan.
1. Parodontitvävnad.
Biopsi, nr
HTX CD20+ NE+ Tendens
F5 Två sammanhållna bitar. Epitel och bindväv, en mindre sår yta på en vävnadsbiten. Inflammationsceller i hela bindväven.
ICT utgörs i huvudsak av CD20+ celler.
Kraftigt infärgat i sårytan nära anslutning till tanden. Övervägande CD20+ celler i bindväven. Elsatas i såryta och den närliggande vävnaden. F6 Huvudsakligen bindväv, den mest koronara delen är epitelklädd. En del granulationsvävnad. Cellrik bindväv. Små, täta, cellansamlingar på djupet i anslutning till tandytan.
Små områden med Elastas+, Kraftigast infärgat vid såryta och granulationsvävnad – glesare än CD20.
Något fler B-celler, ffa i ICT. Elastas återfinns vid såryta och kärl.
F7 Epitel och cellfattig bindväv. Avsaknad av såryta.
Inga celler. Mindre cell-
ansamlingar, spridda i bindväv/epitel som legat ann mot tandytan.
Få PMN-celler, inga B-celler.
F8 Lång biopsi i flera olika delar. Epitel och fibrös bindväv. En mindre sår yta i kontaktepitelet.
Kraftiga välavgränsade infärgningar strax under epitelet.
Litet infärgat område precis under epitelet i sårytan.
Betydligt fler B-celler, som lokaliserat sig som ett band i anslutning till basalmembranet.
23 F12 Epitel, ben- och
benvävnad. Inget tydligt ICT, endast utspridda stråk av celler i bindväven.
Kraftigt infärgad central ansamling med utgående stråk av celler.
Endast väldigt fåtal infärgade mängd elastas, i närheten av epitellagret och vad som förfaller var ett litet sår med
anslutande kärl.
Betydligt fler B-celler. De lilla mängd Elastas som finns är ffa kring kärl.
F13 A Epitel klädd bindväv. Intakt och
väl-avgränsad vävnad. ICT går som ett brett band under epitelcellslagret. Den underliggande bindväven är cellfattig.
Stora cellansamlingar lokaliserade som ett brett band strax under epitelet.
I princip ingen infärgning.
Betydligt fler B-celler i ett band under epitel.
F13 B Epitel klädd bindväv. Intakt och
välavgränsad vävnad. ICT går som ett brett band under
epitelcellslagret. Den underliggande
bindväven är cellfattig.
Brett band av celler strax under basalmembranet.
Inga infärgade celler. Betydligt fler B-celler i ett band under epitel
F15 Epitel, bindväv och granulationsvävnad. Bindväven innehåller fibrösa områden varvade med mer cellrika.
Utspridda koncentrerade kluster av B-celler på flera platser över hela snittet.
Enstaka celler utspritt över snittet, främst i blod eller kärl.
Betydligt fler B-celler.
F16 A Bitar med epitel och bindväv, eller bara bindväv. Generellt cellrik bindväv. Granulationsvävnad.
Enstaka utspridda B-celler generellt samt tätare, mindre
ansamlingar lokalt.
Kraftigt infärgat i granulationsvävnaden. I bitarna med epitel och bindväv i betydligt lägre grad och då främst i anslutning till blod.
Fler PMN-celler generellt, dock i princip uteslutande i granulations-vävnad eller blod.
F16 B Kraftigt epitel. Cellrik bindväv generellt, men främst apikalt åt.
Kraftigt infärgat stråk nära snittytan samt talrika, men mer utspridda B-celler djupare ner i bindväven.
Neutrofilt elasats uteslutande vid kärl eller i anslutning till blod.
Fler B-celler, PMN-cellerna lokaliserade i granulations-vävnad.
F18 Epitel och mycket cellfattig, fibrös bindväv.
Kraftigt infärgande lokala kluster, samt enstaka spridda B-celler i bindväven.
Små mängder neutrofilt elastas, huvudakligen i anslutning till blodkärl.
En del lokala ansamlingar av B-celler, få PMN-celler.
24 F19 Flera större bitar. En
med epitel och bindväv, andra med endast bindväv.
I biten med epitel ses stråkiga cellinfiltrat i bindväven. I övriga bitar finns enstaka, kraftiga och välavgränsad ansamlingar.
Ingen neutrofil elastas på någon av vävnadsbitarna.
En del B-celler, inga PMN-celler.
F21 Flera mindre bitar. En bit med epitel och lite bindväv, resten antingen eller. Benvävnad.
Ansamlingar av B-celler i lokalt i bindväven, strax under epitelet.
Mindre mängd neutrofil elastas vid sårytan av snittets mest apikala del.
B-celler lokalt i bindväven, få PMN-celler vid sårytan. 2.Periimplantitvävnad Biopsi, nr HTX CD20+ Elastas+ Tendens
F9 Epitel och bindväv ses, men vävnaden är trasig och i bitar. Orientering är svår.
Cellansamling centralt i bindväven. B-cellerna dominerar kraftigt.
Ytterst lite infärgat neutrofilt elastas. Något fler B-celler lokaliserade centralt i bindväven. Få PMN-celler.
F11 Epitel och bindväv, välavgränsat. Stort ICT, som upptar mer än halva kontaktytan.
Enstaka utspridda celler, samt ett kluster nära implantatytan.
Uspridda infärgningar strax under och i epitel, ffa vid implantatytan. Neutrofilt elastas ses även i blodkärl.
Mycket fler PMN-celler.
F14 A Endast fibrös bindväv, svår orientering.
Inga infärgade celler. Ingen neutrofil elastas. Inga B- eller PMN-celler.
F14 B Hyperkeratiniserat epitel och bindväv.
Mindre cellansamling djupast ner i fickan.
Ingen neutrofil elastas. Få B-celler, inga PMN-celler.
F14 C Epitel och bindväv Stora cellansamlingar djupt i bindväven
Mindre mängd neutrofilt elastas intill implantatytan
Fler B-celler, få PMN-celler
25 F17 Epitel och bindväv,
med epitelbitar insprängt i bindväven
Cellrikt i det epitel som är lokaliserat i bindväven Infärgningar i blod, samt insprängt i epitelet i bindväven Något fler B-celler, få PMN-celler
F20 Flera bitar, bestående främst av kärltät bindväv. Sparsamt med epitel.
Enstaka B-celler spridda i bindväven
Väldigt mycket neutrofilt elastas och infärgade celler generellt i hela bindväven Mycket fler PMN-celler
Bilaga
Immunohistokemi, manuell körning:
1. Preparat samt kontroller till antikropparna snittas på Plus-glas. Två snitt placeras per glas och torkas 40 min i torkskåp vid 65°C.
2. Avparafiniering till destillerat vatten. 3 x 7 min Xylen
3x 7 min ABS 2 x 3 min 96 % sprit 5 min dest H2O
3. De snitt vars primära antikropp utgörs av CD20 placeras i bägare med TEG-buffert och behandlas med mikrovågor under 20 minuter, med en maxtemperatur på 98°C. Övriga snitt gick direkt till steg 6.
4. Bägaren placeras under rinnande H2O i 10 min.
5. Glasen placeras 5 min i dest H2O.
6. Glasen placeras 5 min i TRIS-buffert.
7. Vävnaden täcks med 150-200 (beroende på snittstorlek) µl BSA och glasen placeras 5 min i inkubationskammare.
8. Glasen sköljs av och placeras i kyvett med TRIS-buffert 1 min.
9. Glasen torkas av på baksidan, täcks med 150-200 µl primär antikropp och inkuberas i 25 min för CD20 (1:200, DAKO M0755, klon L26) respektive 45 min för Neutrophil
26
Elastase (1:200, DAKO M0752, klon NP57).
10. Glasen sköljs av och placeras i kyvett med TRIS-buffert 1 min.
11. Glasen torkas av på baksidan och täcks med 150-200 µl HPBK och inkuberas i 5 min. 12. Glasen sköljs av och placeras i kyvett med TRIS-buffert 1 min.
13. Glasen torkas av på baksidan och täcks med 150-200 µl ENV och inkuberas i 25 min. 14. Glasen sköljs av och placeras i kyvett med TRIS-buffert 1 min.
15. Glasen torkas av på baksidan och täcks med 150-200 µl DAB och inkuberas i 5 min. 16. Glasen sköljs av och placeras i kyvett med TRIS-buffert 1 min.
17. Glasen torkas av på baksidan och täcks med 150-200 µl HTX och inkuberas i 1 min. 18. Glasen sköljs av och placeras i dest H2O i 5 min, 96 % sprit i 3-5 min, ABS i 2 min,
