UP PSALA UNIVE RSITET
EndoC- H l -celler som model l för virus- och
diabetesstudier
Självständigt arbete Läkarprogrammet Uppsala Universitet Namn: Anna Granstam
ABSTRACT
Human Enterovirus (HEV) infections have been associated with β-cell damage in type 1 diabetes (T1D). Although being a subject for research for more than half a century, lack of appropriate models has made it practically impossible to show whether there is any distinct causality. The aim of this study is to define whether the newly developed human β-cell line, EndoC-βH1, can be infected with HEV and thereby constitute a model for outlining the potential links between HEV and T1D. EndoC- βH1 cells were infected with 14 different strains of HEVs. Subsequently, CPE was estimated with light microscope, viral titer increase was measured with TCID50 titration and immunohistochemistry was used to show presence of viral proteins. In addition, two virus strains were selected for more thorough functionality analyses, i.e. viability analysis, glucose stimulation tests and RT-PCR gene analyses. All HEV strains did cause CPE. Viral replication was confirmed by distinct titer increases by the TCID50 titrations and detection of viral proteins by immunohistochemistry. Preliminary results from the functionality analyses indicated major impairments on beta cell function upon HEV infection.
We therefore conclude that HEV can infect, and most likely also impair the function of EndoC-βH1 cells, making them suitable for studies of the potential viral etiology to T1D.
INNEHÅLL
ABSTRACT 2
FÖRKORTNINGAR 4
POULÄRVETENSKAPLIG SAMMANFATTNING 5
BAKGRUND 6
MATERIAL OCH METODER 8
DISKUSSION 18
REFERENSER 20
FÖRKORTNINGAR
BSA Bovine serum albumin
cDNA Complementary deoxyribonucleic acid CPE Cytopathic effect
CAV Coxsackie virus A CVB Coxsackievirus B DAB 3,3'-Diaminobenzidine DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium dsRNA Double stranded ribonucleic acid ECM Extracellular matrix
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay EMEM Eagles minimum essential medium GAD65 Glutamic acid decarboxylase 65
GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GMK Green monkey kidney
HEV Humane Enterovirus HLA Human leukocyte antigen IA2A Insulin associated antigen IAA Insulin autoantibody NGS Normal goat serum NHS Normal horse serum
MHC Major histocompatibility complex PBS Phosphate buffered saline
PCR Polymerase chain reaction PFA Paraformaldehyde
PV Polio virus
qPCR Real-time quantitative polymerase chain reaction RPMI Roswell Park Memorial Institute medium RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction SCID Severe combined immunodeficiency
STWS Scots tap water substitute T1D Type 1 diabetes
TCID50 Tissue culture infective dose50
VP Virus protein ZnT8 Zink transporter 8
POULÄRVETENSKAPLIG SAMMANFATTNING
Insulin öppnar kroppens celler så att de kan ta upp glukos vi får i oss via födan. Utan insulin blir för höga koncentrationer glukos kvar i blodet. β-celler finns utspridda i bukspottskörteln, och är den enda celltypen som producerar insulin. Vid typ 1-diabetes förstörs dessa celler helt, vilket ger upphov till insulinbrist. Det finns flera gener som har visats öka risken för diabetes, men genetiken kan inte förklara allt. Flera miljöfaktorer, bland annat virusinfektioner, har framförts kunna trigga insjuknande av typ 1-diabetes.
Bukspottskörteln är ett svåråtkomligt organ. Möjligheten att ta prover från patienter är i praktiken obefintlig eftersom innehållet i körteln, vars funktion är nedbrytning av makromolekyler, riskerar rinna ut, bryta ned och skada omgivande vävnad. I forskningssammanhang används istället bukspottskörtelprover från avlidna organdonatorer. Antalet organdonatorer är lågt och endast en minoritet av dessa står forskningen till förfogande. Parallellt med proverna från patienter används därför musmodeller men det finns stora skillnader mellan diabetes hos mus och människa. Den celltyp vi undersökt i detta projekt – EndoC-βH1 – är ett nytt alternativ. Denna cellinje är utvecklad ur β- celler från människa och kan odlas. Vi har studerat om EndoC-βH1-cellerna kan infekteras med olika typer av virus och visat att så är fallet. Vi har också visat att virusinfektionen påverkar EndoC-βH1- celler snabbare än HeLa-celler.
BAKGRUND OCH SYFTE
Den grundläggande orsaken till typ 1-diabetes (T1D) är att de insulinproducerande β-cellerna i de Langerhanska öarna i pankreas är förstörda. Till följd av detta uppstår en insulinbrist som leder till hyperglykemi. Tidiga manifestationer av T1D är polyuri, törst och viktnedgång och senare komplikationer är retinopati, nefropati och neuropati (1).
Immunförsvaret spelar en nyckelroll i patofysiologin bakom T1D. T1D karaktäriseras, särskilt hos patienter som insjuknar unga, histologiskt av insulit, öcellsinflammation (2). Specifika polymorfismer i de antigenpresenterande HLA-proteinerna är associerade med ökad risk att drabbas av T1D (3).
Dessutom har 70 % av nydiagnostiserade T1D-patienter autoantikroppar riktade mot intracellulära proteiner i de Langerhanska öarna (4), vilket kan jämföras med 4 % hos friska (5). Det är inte troligt att autoantikropparna orsakar β-celldöden men de är användbara biomarkörer. I klinik används framförallt autoantikroppar riktade mot Glutamatsyra dekoarboxylas (GADA), mot transmembrana tyrosinfosfataser (IA2A), mot zinktransportören ZnT8 samt insulin (IAA) (6) som biomarkörer.
Varför immunförsvaret aktiveras vid T1D är inte klarlagt. Enbart genetisk predisposition räcker inte för att T1D ska utlösas. Tvillingstudier visar förhållandevis stora konkordansskillnader (7), och incidensen av T1D ökar med upp mot 3 % per år (8) i hela världen, förutom i Västindien och Centralamerika (9). Miljöfaktorer som har misstänkts kunna aktivera immunförsvaret är, bland annat, tidig exponering för gluten (10), obalans mellan neogenes och apoptos av β-cellprogenitorer (11) och virusinfektioner (12) (13) (14).
Flera potentiella mekanismer kan förklara hur virusinfektioner kan initiera T1D. För det första skulle en direkt infektion i sig kunna skada β-cellerna. Ett annat sätt är molekylär mimik – korsreaktivitet mellan virus och β-celler. En tredje medkanism är att den virusinducerade proinflammatoriska miljön leder till en bystander activation; virus-antigenpresenterande celler råkar ”spilla över” och aktivera autoreaktiva T-celler (15). Slutligen är Hygien-hypotesen också en potentiell länk mellan T1D och virus. Hygien-hypotesen är teorin att bättre hygien ger färre infektioner tidigt i livet, vilket ger att immunförsvaret inte kan utveckla ett tillräckligt starkt skydd (16). Senare virusinfektioner får därmed fritt spelrum och kan slå ut β-cellerna. I analogi med Poliomyelitepidemierna i början av 1900-talet, där u-länder inte drabbades av epidemier medan i-länder gjorde det (17), skulle denna teori förklara varför fler drabbas av T1D i höginkomstländer med bättre hygien, än i låginkomstländer.
Humana enterovirus (HEV)-infektioner är i allmänhet milda eller asymptomatiska men kan i enstaka fall ge upphov till allvarliga tillstånd som aseptisk meningit (18), encefalit (19), hepatit (20) och myokardit (21). De är också välstuderade i diabetessammanhang (22). Coxsackievirus B4-E2-Yoon, ett HEV, isolerades från pankreas från en pojke som dog i ketoacidos vid insjuknandet. Detta virus visades sedan kunna påverka blodglukosnivåerna hos möss (23). Ett annat HEV, Echovirus 4, isolerades under en meningitepidemi på Kuba då serokonversion av diabetesrelaterade autoantikroppar uppkom hos 30 % av de drabbade. Ytterligare en intressant koppling mellan HEV och T1D, är att man vid sjukdomsdebuten kan se en intrafamiljär spridning av HEV (24). Vid epidemier av HEV har man dessutom detekterat serokonversion av öcellsautoantikroppar (25).
Diabetesstudier har hittills i stor utsträckning utförts i djurmodeller. Representativiteten hos musmodeller för den humana patofysiologin är emellertid ifrågasatt (26) (27). Detta, i kombination med att humana biopsier är svårtagna på grund av pankreas läge och att tillgången på donerat material är mycket låg (28), har hindrat forskningsområdets utveckling. Trots att forskning på HEV och T1D har pågått sedan 1960-talet (29) kvarstår stora kunskapsluckor. 2011 lanserades dock en nyutvecklad cellinje; EndoC-βH1 (30), som förenklar möjligheterna att studera T1D. EndoC-βH1 är tillverkade av
humana pankreasanlag, som har transducerats med en lientiviral vektor, transplanterats i Severe combined immunodeficiency (SCID) -möss, ånyo transducerats, fast med humant telomeras-omvänt transkriptas, och slutligen expanderats in vitro. EndoC-βH1-celler uttrycker alla β-cellmarkörer samt utsöndrar insulin vid glukosstimulering.
Syftet med den här studien är att klargöra om EndoC-βH1 kan infekteras med olika HEV, och därmed användas för att bättre studera HEVs association med T1D. Vi ämnar också studera om en sådan infektion skulle påverka β-cellspecifika funktioner och viabilitet.
MATERIAL OCH METODER
Virus
De virus som användes för att studera tropism hos EndoC-βH1 var: Echovirus 7, Echovirus 11, Coxsackievirus-B-1-11 (CVB1-11), Coxsackievirus B5 (CVB5), Coxsackievirus B4; VD2921, Coxsackievirus A16 (CAV16), Coxsackievirus A7 (CAV7), Echovirus 6 och Mumps (parotit/påssjuke-) virus 1. Utöver detta användes stammarna Coxsackievirus-B4-E2Yoon och Echovirus 4 för studier av viabilitet, genanalys och glukosstimulering. Även Polio Virus (PV) Sabin användes för viabilitetsanalys.
Celler
Humana EndoC-βH1-celler odlades vid 37°C, 5% CO2, i extra cellular matrix (ECM) - och fibronektinklädda flaskor, med låg glukos Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) och tillsatser enligt tillverkarens rekommendationer.
HeLa-celler odlades i 12-brunnsplattor i Eagles minimum essential medium (EMEM) (SVA, Sverige) och inkuberades i 37 °C i en CO2 inkubator.
Green Monkey Kidney cells (GMK-celler) odlades i 96 brunnsplattor med EMEM (SVA, Sverige) samt 5 % kalvserum (Hyclone, USA) och inkuberades vid 37 ° C i en koldioxidinkubator. När de var hopväxta till ca 80 % användes cellerna för Tissue Culture Infective Dose50 (TCID50)-titreringar.
Virusinfektion
EndoC-βH1-celler odlades i ECM/fibronektin klädda 12 brunnsplattor (Costar) med lågglukos DMEM och samtliga tillsatser utom nikotinamid. I varje brunn infekterades cellerna med 100 TCID50 av respektive virusstam. Varje dag togs 200 uL odlingsmedium ut från brunnarna och ersattes med lika mycket nytt medium. Proverna sparades i -20° C för senare TCID50-titrering. Cytopatisk effekt (CPE) uppskattades och fotograferades varje dag post infektion under ljusmikroskop.
HeLa-celler infekterades på samma vis och prover sparades i -20° C för senare TCID50-titrering. CPE uppskattades varje dag post infektion.
Cellviabilitet
Tre dagar efter infektion analyserades antal levande celler av totalt antal celler (viabilitet). Cellerna behandlades med trypsin för att bli enkelceller och analyserades med Trypan Blue uptake assay i Berkleykammare, så som beskrivet i (31).
Immunohistokemi
EndoC-βH1-celler odlades och infekterades på samma vis som tidigare beskrivits, fast på glasskivor med 4 brunnar (BD Falcon, USA). Cellerna fixerades med 4% Paraformaldehyd (PFA) (APL, Sverige) 15 min i inkubator och tvättades med PBS tre gånger. De skivor som togs med till Universitetet i Exeter förvarades i 4°C i kylskåp efter detta steg. De skivor som färgades i Uppsala permeabiliserades direkt i 10 min med 0,05% Tween 20 (Dako North America Inc, USA) i rumstemperatur. Efter ett ytterligare tvättsteg blockerades sedan endogent peroxidas med H2O2 (Dako, North America Inc, USA), 30 min i rumstemperatur, för att därefter tvättas igen och blockeras i 30 min med 5% Bovine serum albumin (BSA) (Sigma, USA) i rumstemperatur. Efter detta adderades den primära antikroppen
löst i 1% BSA, 30 min i inkubator. Efter tvätt tre gånger med Phosphate buffered saline (PBS), adderades den sekundära antikroppen i 30 min i rumstemperatur. Skivorna tvättades efter detta igen, och 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) Chromogen Substrate (Dako, North America Inc, USA) adderades och observerades direkt under ljusmikroskop. När färgförändring kunde ses, tvättades cellerna med destillerat vatten. För att kontrastfärga cellkärnorna, adderades hematoxylin i c:a 30 s. Efter detta tvättades glasskivorna med destillerat vatten och dehydrerades i 70% etanol i 3 min, 90% etanol i 3 min, 99% etanol i 3 min och slutligen xylen i två gånger 3 min. Täckglas limmades därefter fast på glasskivorna.
Immunohistokemi utfördes även med hjälp av professor Noel Morgans forskargrupp vid Universitetet i Exeter. Samma metod som ovan användes med några undantag. Cellerna permeabiliserades i 30 min i rumstemperatur med 0,5 % TritonX-100, 0,5 % Normal goat serum (NGS), och 0,5 % BSA.
Glasskivorna färgades med hematoxylin i 1 min. Efter detta doppades de i Scots tap water substitute (STWS) för att göra hematoxylinfärgningen klarare. Efter detta tvättades de i 5 min i destillerat vatten och sedan, för att förstärka DAB-färgningen, placerades glasskivorna fem minuter i 2 % CuSO4 i 0,9% NaCl-lösning och tvättades ytterligare en gång i destillerat vatten innan dehydreringen. Istället för Xylen användes Histoclear (National Diagnostics, USA).
För att blockera överflödig sekundär antikroppsinbindning, ”bakgrundsfärgning”, gjordes försök med NGS respektive Normal Horse serum (NHS). Även s.k. Antigen retrieval, 20 min i tryckkokare med citrat, följt av 20 min avsvalning, testades av samma anledning.
Immunoflourenscens
EndoC-βH1-celler odlades som tidigare beskrivits på 8-brunns kammar-glasskivor (BD Falcon).
Prepareringen var identisk med immunohistokemiproceduren ovan fram till att de primära antikropparna anti-virus protein 1 (VP1) (Dako, Danmark) och anti-double stranded ribonecleic acid RNA (dsRNA) (Scicons, Ungern), båda spädda 1:1000, adderades. Proverna lämnades i 4°C över natten. Dagen efter tvättades glasskivorna tre gånger med PBS, för att sedan blockeras med 1% BSA (Sigma, USA), en timme i rumstemperatur. Efter detta adderades den sekundära antikroppen, Alexa488 (Invitrogen, USA), spädd 1:200. Proverna inkuberades en timme i rumstemperatur i mörker.
Efter att igen tvättat tre gånger med PBS adderades 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Invitrogen, USA) i 10 min i mörker. Proverna tvättades igen och täckglas fästes med Fluoromont – G (Southern Biotech, USA).
För att bestämma vad som orsakade bakgrundsfärgning i denna metod testades att färga enbart med sekundära anti-mus respektive anti-kanin antikroppar.
Glukosstimulering och analys av insulinfrisättning
EndoC-βH1-celler odlades på samma vis som tidigare beskrivits i 12 brunnsplattor och infekterades respektive lämnades oinfekterade. Tre dagar efter infektion inkuberades cellerna i 30 min, 37°C, med RPMI-medium (SVA, Sverige) innehållandes låg glukoshalt (5,5 mM glukos), respektive hög glukoshalt (16,5 mM glukos) och hög glukoshalt med tillsatt 10 mM teofyllin. Prover från cellodlingsmedium togs. För att bestämma intracellulär insulinhalt skrapades kvarvarande celler loss från brunnarna, överfördes till eppendorfrör och frystes ned i -20°C. Insulinkoncentrationen bestämdes sedan med Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Mercodia, Sverige) enligt tillverkarens instruktioner.
RNA- extraktion och cDNA-syntes
Infekterade och icke infekterade celler samlades in dag 1, 2 och 3 efter infektion och tvättades med PBS. RNA ur cellerna renades sedan fram med RNeasy mini kit (Qiagen, Sverige), innehållandes ett gDNA-eliminatorrör, med vilken genomiskt DNA avlägsnas. RNA-koncentration och provernas kvalitet bestämdes med en nanodrop (Thermo Scientific, USA). RNA (maximalt 100 ng per prov) omvandlades med omvänd transkription till cDNA med Superscript VILO cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, USA) enligt tillverkarens instruktioner.
Realtids-PCR
Realtids- eller Real Time- Polymerase chain reaction (PCR) kördes med Power SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Sverige) i ett StepOnePlusTM Real-Time PCR-system (Applied Biosystems). Färdiga genspecifika primer-kit (QuantiTect Primer Assays, Qiagen, Sverige) användes för analys av insulingenuttryck. Uttrycksnivåerna normaliserades mot uttryck av housekeeping- generna 18S och Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) och analyserades med 2-dCT- metod.
Etiska tillstånd
Etiskt tillstånd för omhändertagande av celler: Forskningsetiknämnden vid Uppsala Universitet, 2009- 12-16. Dnr 2009/371. Etiskt tillstånd för forskning om typ 1 diabetes tidig patogenes (virusinfektion inkluderat): Forskningsetiknämnden vid Uppsala Universitet, 2009-03-25. Dnr 2009/043. Tillstånd för användning av EndoC- βH1 sökt och beviljat hos utvecklaren Endocells SARL.
Uppskattad grad CPE
RESULTAT Cytopatisk effekt
Figur 1: CPE. Representativa fotografier av CPE i icke infekterade EndoC- βH1-celler med CPE grad 0, respektive Echovirus 7- infekterade EndoC- βH1 celler med CPE grad 4, dag 1 efter infektion.
I Figur 1 ses representativa fotografier av icke infekterade EndoC-βH1-celler och EndoC-βH1-celler infekterade med Echovirus7. CPE kan ses i cellerna infekterade med Echovirus 7. Även Echovirus 11 inducerade CPE redan dag 1 efter infektion (Post Infection, P.I.). Övriga serotyper inducerade CPE dag 2 P.I. De morfologiska förändringarna graderades på en skala 0 – 4, som tidigare beskrivits i (32) där 0 är opåverkade och 4 är döda celler.
CPE i EndoC-BH1 4,5
4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Dag P.I.
Kontroll Echovirus7 Echovirus 11 CBV4, CAV7, CAV16, CBV5 och Parotitvirus1
Figur 2: CPE-grad i icke infekterade (kontroll) och HEV-infekterade EndoC-βH1-celler dag 0 - 2 P.I.
Den cytopatiska effekten i EndoC- βH1 cellerna jämfördes med HeLa-celler (Figur 3 och 4). I samma försök adderades samma virus till båda celltyperna och är i figuren nedan indikerade i samma färg.
Även här graderades de morfologiska förändringarna 0 – 4. Dag 1 post infektion var CPE-graden för de Echovirus 11-infekterade EndoC-βH1-celler 1, dag 2 och dag 3 var den 3 och dag 4 var den 4.
Echovirus 7-inekterade EndoC-βH1-celler följde samma mönster undantaget att de dag 1 nått CPE- grad 2. EndoC-βH1-celler infekterade med CBV1-3, Echovirus 6, VD2921, CBV-5 och CAV16 hade alla uppnått CPE-grad 2 dag 1, CPE-grad 3 dag 2 samt grad 4 dag 3 och 4. CBV-1-3 och CAV-7 infekterade HeLa-celler höll låg CPE-grad de första dagarna men steg sedan; CBV-1-3 nådde dag 3 grad 2,5 respektive grad 4 dag 4 och de CAV-7-infekterade cellerna graderades till 4 både dag 3 och
Uppskattad grad av CPEDelta log TCID50/100 ul virus Uppskattad grad CPE 4,5
4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0
CPE i EndoC-βH1-celler
0 1 2 3 4 5
Dag P.I.
Control Endo Echo11 Endo CBV1-3 Endo Echo7 Endo CAV16 Endo Echo6 Endo CAV7 Endo VD2921 Endo CBV5 Endo
Figur 3: CPE gradering dag 1,2,3 och 4 efter infektion i EndC-BH1-celler i det celltypsjämförande experimentet
4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0
CPE i HeLa-celler
Control Hela Echo 11 Hela CBV1-3 Hela Echo7 Hela CAV16 Hela Echo6 Hela CAV7 Hela VD2921 Hela
0 1 2 Dag P.I. 3 4 5
Figur 4: CPE gradering dag 1,2,3 och 4 efter infektion i HeLa-celler i det celltypsjämförande experimentet
Medeltiterökning i det jämförande experimentet
4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0
Hela EndoC-βH1
Celltyp
Figur 5: Medeltiterökning av de olika HEV serotyperna i HeLa- respektive EndoC-βH1-celler i det celltypsjämförande experimentet
Som synes i figur 5 orsakade virusen inte bara CPE snabbare i EndoC-βH1-cellerna, utan medeltiterökningen i TCID50 var också större i EndoC-βH1-cellerna än i HeLa-cellerna.
Delta log TCID50/100 ul virus Delta log TCID50/100 ul virus
TCID50
I figur 6 visas TCID50 – titrering av EndoC-βH1. Medeltiterökningen i odlingsmediet, dagen innan alla celler dog, var för CAV-16 103, CBV-5 104,5, Echovirus 11 105,5 samt för CAV-7 105.
Medeltiterökning i TCID50-experiment med EndoC-βH1-celler 7
6
5
4
3
2
1
0
CAV16 CBV5 Echo11 CAV7 CBV4 VD2921
Virus
Figur 6: Medeltiterökningar av två TCID50 experiment i EndoC-βH1, infekterade med CAV16, CBV5, Echovirus11 och CAV7, CBV4 and CBV4-VD2921.
Medeltiterökning i TCID50-experiment med HeLa celler 8
7 6 5 4 3 2 1 0
CAV16 CAV7 CBV1-3 VD2921 Echo11 Echo7 Echo6 CBV5
Virus
Figur 7:Medeltiterökningar av tre TCID50-experiment i HeLa-celler, infekterade med CAV16, CAV7, CBV1-3, CBV4-VD2921, Echovirus11, Echovirus7, Echovirus 6 och CBV5.
Med TCID50-titrering av HeLa-cellerna (figur 7) ses också titerökningar. Medeltiterökningen dag 2 P.I. var i CAV16 107,1, CAV7 106,3, CBV1-3 105, CBV4-VD2921 104,8, Echovirus 11 103,75, Echovirus 7 102,5, Echovirus 6 105,75 och i CBV5-infekterade celler 102,5.
Immunohistokemi
EndoC-βH1 cellerna färgades för VP1 (figur 8). Bakgrund färgades i kontroll och i infekterade celler.
Bakgrunden försvårade tolkning av färgningarna. Ett fåtal specifika infärgningar kan dock ses.
B E
Figur 8: VP1 färgade CBV4 - VD2921 infekterade EndoC-βH1 celler. De röda pilarna pekar på potentiella VP1positiva celler.
Bokstaven B indikerar bakgrund och är utsatt på ett representativt ställe i bilden. Bokstaven E indikerar EndoC-βH1-celler och är även den utsatt på en representativ plats för dessa.
Immunofluorescens
EndoC-βH1-celler dubbelfärgades för insulin och VP1 (figur 9.1 och 9.2), samt insulin och MHC klass 1 (figur 10.1 och 10.2). Även med denna metod färgades bakgrund i de röda VP1- och MHC klass 1 kanalerna, både i kontroll och i infekterade celler. Några VP1-positiva celler kan emellertid urskiljas. MHC klass 1 färgningen var mycket svag och någon skillnad gentemot kontrollen ses inte.
Den gröna insulinfärgningen var tydlig och gav ingen bakgrundsfärgning.
Varken tillsats av NGS eller NHS blockerade överflödig sekundär antikroppsinbindning. Antigen retrieval, som också testades för att minimera bakgrund, gjorde att visserligen att bakgrunden eliminerades men dessvärre även de flesta celler.
1 B 2 B
Figur 9: Insulin och VP1 färgning i EndoC-βH1-celler. Cellkärnorna är blåfärgade, insulin är färgat med grönt och VP1 med rött.
Bild 1 visar kontroll och bild 2 visar CVB1-7 infekterade EndoC-βH1-celler. Den röda pilen pekar på en potentiell VP1-positiv cell och B står för bakgrund.
1 2
Figur 10: Insulin och MHC klass 1 färgade EndoC-βH1-celler. Cellkärnorna är blåfärgade, insulin är grönfärgat och MHC klass 1 är rödfärgat. Bild 1 visar kontroll och bild 2 visar CBV1-7 infekterade EndoC-βH1-celler.
Tillsats av endast den sekundära antikroppen (mus respektive kaninantikroppar) var de som band in ospecifikt och gav den höga bakgrunden.
Insulingenen/18SUtsöndrat Insulin uU/mL
Analys av genuttryck och glukosstimulering
Glukosstimulering 2500
2000
1500
1000
500
0
Kontroll låg glukos E2 Yoon låg glukos Kontroll hög glukos E2 Yoon hög glukos Kontroll hög glukos + teofyllin
E2 Yoon hög glukos + teofyllin
Figur 11: Utsöndrad mängd insulin i kontroll och CBV4-E2Yoon infekterade celler i medium med låg glukoskoncentration, i medium med hög koncentration och i medium med hög koncentration av glukos kombinerat med teofyllin.
Figur 11 visar att mängden utsöndrat insulin i medium med låg icke stimulerande glukoskoncentration i kontrollen var 210 uU/mL och i de CBV-4-E2Yoon-infekterade cellerna 256 uU/mL (n=2). I medium med stimulerande glukoskoncentration var mängden utsöndrat insulin i kontrollen 289 uU/mL (n=2), medan den i mediet från de CBV-4- E2Yoon-infekterade cellerna var 420 uU/mL (n=2).
I medium med både hög glukoskoncentration och teofyllin var mängden utsöndrat insulin i kontrollen 1910 uU/mL (n=2) och i mediet från de CBV-4-E2Yoon-infekterade cellerna 2234 uU/mL (n=2).
Sammanfattningsvis, ses en tendens till högre insulin sekretion både vid stimulerande betingelser samt vid normalt blodkglukosnivå i de virusinfekterade cellerna.
I figur 12 (n=2), visas uttryck av insulingenen dag 1 efter infektion i icke infekterade EndoC-βH1- celler och infekterade EnsoC-βH1celler. Genen som kodar för insulin uttrycktes i EndoC-βH1- cellerna. Uttrycket av insulingenen i de CBV-4-E2Yoon-infekterade cellerna liksom i de Echovirus 4- infekterade cellerna var betydligt lägre än i de icke infekterade cellerna. Genuttrycket påverkades emellertid inte i de Poliovirus Sabin-infekterade cellerna.
Uttryck av Insulingenen dag 1 P.I.
0,009 0,008 0,007 0,006 0,005 0,004 0,003 0,002 0,001
0 CONTROL E2YOON ECHO4 PVSABIN
Figur 12: Uttryck av genen som kodar för insulin i förhållande till House keeping genen 18S i CBV4-E2Yoon, Echovirus 4 och Poliovirus Sabin infekterade EndoC-βH1-celler samt kontroll dag 1 P.I
Analys av viabiliteten hos EndoC-βH1-cellerna
I figur 13 visas att viabiliteten hos EndoC-βH1-cellerna dagen efter inokulering (dag 1), n=2, var i de icke infekterade cellerna (kontroll) 75%, i de Echovirus 4-infekterade cellerna 70%, i de CBV-4- E2Yoon-infekterade cellerna 63%, samt de i Poliovirus Sabin-infekterade cellerna 62%. Dag 2 efter inokulering, n=2, var viabiliteten i kontrollen 72%, i de Echovirus 4-infekterade cellerna 58%, i de CBV-4-E2Yoon-infekterade cellerna 62% samt i de Poliovirus Sabin-infekterade cellerna 48%.
Viabilitet Dag
P.I. 1 Dag P.I. 2
Kontroll 0,75 0,72
Echovirus 4 0,7 0,58 CBV4-
E2Yoon 0,64 0,62
Poliovirus
Sabin 0,63 0,48
Figur 13: Andel levande EndoC-βH1-celler av Echovirus 4, CBV4-E2Yoon och Poliovirus-Sabininfekterade celler samt kontroll, dag 1 och dag 2 efter infektion.
DISKUSSION
Det är tydligt att EndoC-βH1-cellerna är permissiva för samtliga undersökta HEV. Bilderna i figur 1 visar tydligt upprundade celler– virusinducerade morfologiska förändringar. Titerökningarna i TCID50- försöken visar att virus har replikerat. Detta stärks av att i både resultat från immunohistokemi och immunofluoresens detekterades VP1 i cellerna.
HEV replikerade bevisligen snabbare i EndoC-βH1-cellerna än i HeLa-cellerna. Det antyder att EndoC-βH1-cellerna innehåller ett preformerat replikationsmaskineri. Det har nyligen föreslagits att HEV replikerar på, eller i anslutning till, insulingranula (33). En annan förklaring till varför replikationen är snabbare i EndoC-βH1-celler, är att de innehåller större kvantiteter av proteiner som är nödvändiga för virusreplikation än HeLa-celler. Ytterligare en möjlig förklaring är att HeLa- cellerna skulle inducera en starkare antiviral miljö än vad EndoC-βH1-cellerna är kapabla att inducera.
Det har emellertid visats att HeLa-celler är oförmögna att bilda interferoner (34), vilket delvis motsäger denna teori. Det finns dock ett flertal proteiner med antiviral effekt som skulle kunna vara mer uttryckta i HeLa-celler än i EndoC-βH1. Att EndoC-βH1-celler är mycket permissiva för HEV gör att de är särskilt lämpade som system för att amplifiera virus i, detta kan eventuellt användas för att snabbt framställa virus.
På grund av odlingsproblematik är redovisningen av analyser av specifika EndoC-βH1-funktioner begränsad. Preliminära resultat från viabilitetsanalysen visar dock tydligt att HEV-infektionerna leder till en ökad andel döda celler. Preliminära PCR- och glukosstimuleringsresultat och tyder också på att HEV-infektioner förändrar EndoC-βH1-cellernas funktion; insulingenen uttrycks mindre i de infekterade proverna och utsöndringen av insulin vid glukosstimulering ökar. Expressionsnivåer av vissa gener, däribland insulingenen, analyserades i denna studie vid två tidpunkter post infektion. Att insulinuttrycket minskas vid infektion är inte förvånande eftersom insulinsyntesen är Cap dependent (35) och det är känt att virus hämmar Cap dependent - translation (36) så att syntes av insulin ej kan ske. Att Poliovirus sabin inte minskade insulingenuttrycket är antagligen ett falskt resultat som kommer av att antalet experiment enbart är två.
Att det verkar som att utsöndringen av insulin däremot ökade är mer anmärkningsvärt. Detta styrker att HEV replikerar på insulingranula eftersom sekretion av insulingranula då även skulle främja virusfrisätning. Eftersom det utifrån glukosstimuleringsresultaten inte går att utläsa om insulinet utsöndrats av levande celler eller läckt ut från döende, eller redan döda, celler skulle detta experiment emellertid behöva upprepas med viss modifikation; antingen bör de celler som utsatts för hög glukoskoncentration åter odlas i lågglukosmedium och därefter analyseras med ELISA igen, eller så bör den med ELISA uppmätta insulinnivån relateras till antal celler, genom att relatera den till mängden DNA per brunn.
Analys av orsaken till bakgrundsfärgningen med immunohistokemi och immunofluorescens visade att skillnaden mellan de med bakgrund och de utan berodde på att de sekundära antikropparna, anti-mus och anti-kanin, band ospecifikt medan den sekundära antikroppen som var anti-marsvin inte band till samma strukturer. Genom att använda antikroppar från andra arter kommer detta problem i framtiden kunna kringgås. Vi gjorde även andra försök för att förbättra kvaliteten på färgningarna. Att tillsätta NGS eller NHS påverkade inte utfallet. Antigen retreival däremot, minskade bakgrundsfärgningen men fick emellertid cellerna att lossna från glasskivorna. Eftersom de flesta moderna antikroppar kräver Antigen retreival är detta ett viktigt observandum för framtida immunohistokemiska analyser och kan komma att begränsa användningsmöjligheterna för denna metod.
MHC klass 1 har visats vara överuttryckt i vissa öar vid T1D (37). I EndoC-βH1 modellen sågs ingen skillnad i uttrycksnivå mellan infekterad och oinfekterade celler. Detta skulle kunna bero på att virus inte inducerar ökat uttryck av MHC klass 1. Det skulle också kunna bero på att hyperexpressionen inte uppkommer utan typ 1 interferoner syntetiserade i andra celltyper i de Langerhanska öarna än β-celler.
En annan möjlig förklaring är att EndoC-βH1 cellerna faktiskt inte reagerar på samma vis som primära humana beta celler i detta avseende.
EndoC-βH1 är inte den enda tillgängliga β-cellmodellen. 1.1B4 är en human β-cellinje (38) som svarar med insulinutsöndring vid glukosstimulering. Det har dock inte visats att denna cellinje är permissiv för HEV. En annan β-cellmodell är insulinom från råtta; RINm5F-celler. I och med att permissiviteten hos denna cellinje varierar beroende av odlingsteknik (39) är den inte lämplig för synkroniserade diabetes-, och virusstudier. En tredje β-cellmodell, HGF-behandlade pankreasduktceller från råtta (11), svarar på inflammatoriska cytokiner på samma vis som primära β-celler i råtta; med apoptos. Dessa celler studerades emellertid i orimligt hög glukoshalt och med humana antikroppar, varför de föreslagna resultaten i (11) bör bekräftas. Det finns β-cellmodeller utvunna ur möss. HEV-tropism skiljer sig dock mellan mus och människa (33). Detta sammantaget ger att EndoC-βH1 är ett bra alternativ för diabetesstudier. För att nå full förståelse för den humana patofysiologin bakom T1D är det likväl viktigt att klarlägga skillnaderna mellan primära humana β-celler och EndoC-βH1;
exempelvis är antagligen inte virusreplikation lika stark i Langerhanska öar, in vitro eller in vivo, på grund av s.k. crosstalk och induktion av antivirala miljöer. Resultat bör förslagsvis bekräftas med material från organistationer som nPOD (the Network for Pancreatic Organ Donors with type 1 diabetes).
Syftet med detta projekt var att bestämma permissiviteten för HEV hos cellinjen EndoC-βH1. Jag ämnade också analysera huruvida HEV-infektioner påverkar dessa cellers funktionalitet och viabilitet.
Med den här rapporten har jag visat att cellinjen EndoC-βH1 är permissiv för flera olika serotyper av HEV. Dessa celler är också ett effektivt system för virusamplifikation och ett möjligt användningsområde skulle kunna vara vaccinproduktion. Preliminära resultat visar dessutom att HEV infektion försämrar både cellinjens funktionalitet och viabilitet. Det här är den första beskrivningen av EndoC-βH1 som en adekvat modell för simultan HEV-, och T1Dforskning. Förhoppningsvis kommer resultat från denna cellinje kunna bidra till att förklara hur virus påverkar utvecklingen av T1D.
REFERENSER
1. Alberti, K. och Zimmet, P.Z. för WHO. Definition, Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus and its Complications. Part 1: Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus Provinsional Report of a WHO consultation. Diabetic Medicine. 1998, (15): s. 539 - 553.
2. Willcox, A., et al. Analysis of islet inflammation in human type 1 diabetes. Clinical and Experimental Immunology. 2009, 155 (2): s. 173 -181.
3. Redondo, M.J., et al. Genetics of type 1A diabetes. Recent Progress in Hormone Research. 2001, (56): s. 69-89.
4. Sabbah, E., et al. Glutamic acid decarboxylase antibodies in relation to other autoantibodies and genetic risk markers in children with newly diagnosed insulin-dependent diabetes.
Childhood Diabetes in Finland Study Group. The journal of clinical endocrinology and metabolism. 1996, 81 (7): s. 2455 - 2459.
5. Hagopian, W.A., et al. Glutamate decarboxylase-, insulin-, and islet cell-antibodies and HLA typing to detect diabetes in a general population-based study of Swedish children. The Journal of Clinical Investigation. 1995, 95(4): s. 1505 - 1511.
6. Wenzlau, J.M., Hutton, J.C. Novel diabetes autoantibodies and prediction of type 1 diabetes. Current Diabetes Reports.
2013, 13, (5): s. 608 - 615.
7. Renondo, M.J., et al. Heterogeneity of type 1 diabetes:
analysis of monozygotic twins in Great Britain and the United States. Diabetologia. 2001, 44 (3): s 354-62.
8. Harjutsalo, V., et al. Time trends in the incidence of type 1 diabetes in Finnish chidren: a cohort study. Lancet. 2008, 371 (9626): s. 1777-82.
9. Karvonen, M., et al. Incidence of childhood type 1 diabetes worldwide. Diabetes Mondiale (DiaMond) Project Group.
Diabetes Care. 2000, 23 (10): s. 1516-1526 .
10. Barbeau, W.E. What is the key environmental trigger in type 1 diabetes — Is it viruses, or wheat? Autoimmunity Reviews. 2012, 12(2): s. 295-299.
11. Anastasi, E., et al. The acquisition of an insulin-secreting phenotype by HGF-treated rat pancreatic ductal cells (ARIP) is associated with the development of susceptibility to cytokine- induced apoptosis. Journal of Molecular Endocrinology. 2005, (35): s. 367-376.
12. Coppieters, K. T., et al. Virus Infections in Type 1 Diabetes. Cold Spring Harb Perspect Med. 2012, 2(1): s. 1-14.
13. Hyöty, H., Taylor, K.W. The role of viruses in human diabetes . Diabetologica. 2002, (45): s. 1353–1361.
14. Liana G, et al. Prevention or acceleration of type 1 diabetes by viruses. Cellular and molecular Life Sciences. 2013, 70 (2): s.
239 -235.
15. Fujinami, R.S., et al. Molecular Mimicry, Bystander Activation, or Viral Persistence: Infections and Autoimmune Disease. Clinical Microbiology Reviews. 2006, 19 (1): s. 80 - 94.
16. Chapman, N.M., et al. The microbiology of human hygiene and its impact on type 1 diabetes . Islets. 2012, 4 (4): s. 253 261.
17. Tracy, S., et al. Enteroviruses and type 1 diabetes. Diabetes/
Metabolism research and reviews. 2011, (27): s. 820 - 823.
18. Milia, M.G., et al. Recent outbreak of aseptic meningitis in Italy due to Echovirus 30 and phylogenetic relationship with other European circulating strains. Journal of Clinical Virology.
2013 (publicerad på internet innan tryck).
19. Sapkal, G. N., et al. Enteroviruses in Patients with Acute Encephalitis, Uttar Pradesh, India. Emerging Infectious Diseases. 2009, 15 (2): s. 295 - 298.
20. Melnick, J.L. Classification of Hepatitis A virus as Enterovirus type 72 and of Hepatitis B virus as Hepadna virus type 1. Intervirology. 1982, 18 (3): s. 105 -106.
21. Wu, Z., et al. Recombinant Human Coxsackievirus B3 from Children with Acute Myocarditis in China. Journal of Clinical Microbiology. 2013 (publiserad på internet innan tryck).
22. Yeung W.C.G., et al. Enterovirus infection and type 1 diabetes mellitus:systematic review and meta-analysis of observational molecular studies. BMJ. 2011, (342): s.1-9.
23. Kang, Y., et al. Complete nucleotide sequence of a strain of coxsackie B4 virus of human origin that induces diabetes in mice and its comparison with nondiabetogenic coxsackie B4 JBV strain. Journal of medical virology. 1994, 44(4): s. 351 - 61.
24. Salvatoni, A., et al. Intrafamilial spread of enterovirus infections at the clinical onset of type 1 diabetes. Pediatric diabetes. 2013, 14 (6): s. 407-16.
25. Luis, S., et al. Evidence of association between type 1 diabetes and exposure to enterovirus in cuban children and adolescents. MEDICC. 2013, 15(1): s. 29-32.
26. Roep, B.O., Atkinson, M., von Herrath, M. Satisfaction (not) guaranteed: re-evaluating the use of animal models of type 1 diabetes. Nature Reviews. Immunology. 2004, 4(12):989-97.
27. Driver J.P., et al. Mouse models for the study of autoimmune type 1 diabetes: a NOD to similarities and differences to human disease. Semin Immunopathology. 2011, (33): s. 67-87.
28. nPOD, http://www.jdrfnpod.org/index.php. [Citat:
29072013.]
29. Leslie, RD, Ludvigsson J. The viral aetiology of diabetes: a tribute to Keith Taylor (1929 - 2012). Diabetic Medicine. 2012 (29): s. 419.
30. Ravassard, P., et al. A genetically engineered human pancreatic beta cell line exhibiting glucose-inducible insulin secretion. J Clin Invest.2011, 121 (9): s. 3589-97.
31. Crane, J.K., et al. Host Cell Death due to Enteropathogenic Escherichia coli Has Features of Apoptosis. Infection and Immunity. 1999, 67(5): s 2575–2584.
32. Frisk, G., Diderholm, H. Tissue culture of isolated human pancreatic islets infected with different strains of coxackievirus
B4: assessment of virus replication and effects on islets morphology and insulin release. International journal of diabetes research. 2000, 1(3): s. 165-75.
33. Hodik, M. et al. Tropism Analysis of Two Coxsackie B5 Strains Reveals Virus Growth in Human Primary Pancreatic Islets but not in Exocrine Cell Clusters In Vitro. The Open Virology Journal. 2012, 6: s. 130-137.
34. Cantrell, K. Production and Action of Interferon in HeLa Cells. The State Serum Institute, Helsinki, Finland. 1960.
35. Fred, R.G., et al. The human insulin mRNA is partly translated via a cap and eIF4-independant mechanism.
Biochemical and Biophysical Research Communications. 2011, 412 (2011): s. 693–698.
36. Joachims, M., et al. Cleavage of Poly(A)-Binding Protein by Enterovirus Proteases Concurrent with Inhibition of Translation In Vitro. Journal of Virology. 1999, 73(1): s. 718–
727.
37. Itoh, N., et al. Mononuclear cell infiltration and its relation to the expression of major histocompatibility complex antigens and adhesion molecules in pancreas biopsy specimens from newly diagnosed insulin-dependent diabetes mellitus patients. J clin Invest. 1993, 92(5): s. 2313–2322.
38. Vasu, S., et al. Cellular responses of novel human pancreatic β-cell line, 1.1B4 to hyperglycemia. Islets. 2013, 5(4): s- 1-8.
39. Berg, A.K., et al. dsRNA formed as an intermediate during Coxsackievirus infection does not induce NO production in a β- cell line with or without addition of IFN-γ. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2005, 327 (3): s. 780- 788.
