Multipla mätningar på enstaka celler i ett mikroflödessystem

(1)



EMOPROTEINER

är välstuderade proteiner som finns i de allra flesta levande varelser. Deras uppgift är att levrera och lagra syre, att transportera bort farliga ämnen, eller att utföra enzymatiska funktioner. För några år sedan upptäcktes ett nytt hemoprotein som främst hittades i nervvävnad och därför benämndes neuroglobin (Ngb) [1].

Mycket forskning har gjorts på proteinet, dess 3D struktur och förekomst har utretts [2]. Därmot är funktionen än under diskussion. Mycket tyder på att det skulle kunna ha en skyddande effekt vid syrebrist [3][4]. Proteinet har mest undersökts i den renade formen men för att kartlägga om proteinet, som finns i cytoplasmat, verkar inom cellen eller med cellens omgivning behövs det studier på cell-, och vävnadsnivå.

I vår grupp har vi som mål att utveckla mätsystem som möjliggör simultana mätningar av olika parametrar under varierande kemiska miljöer. Systemet ska koppla samman patch clamp med optiska tekniker för manipulation och övervakning av cellen. Neuronen förs med hjälp av en optisk pincett genom ett gastätt mikroflödessytem till tippen av en patch clamp pipett. Det gastäta mikrofluidsystemet ger fullständig kontroll över den syrehalt som omger cellen och genom att förse systemet med flera ingångar kan cellens miljö manipuleras momentant via ett pumpsystem. Samtidigt ska innehållet av Ngb i cellen övervakas med hjälp av absorptions-, och Raman spektroskopi som båda ger information om oxidationsstadiet av proteinet. Raman spektroskopi har tidigare använts för att för att studera E. coli bakterier som överuttryckte Ngb [5]. En schematisk bild på uppställningen visas i figur 1.

I dagsläget fortskrider utvecklingen av mätcellen och samtidigt utförs experiment för att undersöka hur signaleringen hos nervceller innehållande Ngb påverkas då cellerna utsätts för syrefattiga miljöer. Etisk ansökan för nedan beskrivna förfaringssätt har gokänts av regional etisk kommité (“Stockholms södra djuförsöksetiska nämnd”, godkännande Nr. S201/04 och “Umeå djurförsöksetiska nämnd”, godkännande Nr. A17-05).

Nervceller prepareras från hjärnan hos Sprague Dawley råtthannar som väger mellan 45 och 55 g. För att simulera syrefattig omgivning flödas cellen med extracellulär vätska som försetts med kvävgas tills syrehalten sjunkit från19-21 % till 3-5 %. Syrehalten mäts med hjälp av syresensor FOXY AL300 kopplad till en fluorometer, MultiFrequency Phase Fluorometer (Ocean Optics, Dunedin, Florida, USA). Flödessystem består här av vätskefyllda sprutor kopplade till ventiler och slangar som

förser cellen med syrerik respektive syrefattig vätska. Den elektriska aktiviteten hos cellen mäts med patch clamp, en välkänd och välutvecklad teknik för att studerandet av elektrofysiologiska egenskaper hos enstaka celler [6].

Perforerad patch-clamp utförs, där antibiotika tillsätts genom mätpipetten för att skapa porer i membranet genom vilka signalerande joner kan flöda [7].

Figur 1. Schematisk bild av mätuppställningen som kombinerar optisk spektroskopi, optisk pincett och patch clamp.

Mätningarna utförs simultant i ett mikroflödesssystem.

Preliminära resultat talar för en ökad jonkanalsaktivitet under hypoxiska omständigheter.

Genom utvecklingen av det multifunktionella mikroflödessystemet utvecklas ett kraftfullt verktyg för att fortsätta utforska Ngb’s funktion i enstaka levande celler.

R

^EFERENSER

[1] Burmester T, Weich B, Reinhardt and Hankeln T, “A vertebrate globin expressed in the brain”Nature, vol. 407, pp. 520-522, 2000 [2] Pesce A et al, “Human brain Neuroglobin structure reveals a

distinct mode of controlling oxygen affinity”, Structure, vol. 11, pp. 1087-1095, 2003

[3] Sun Y et al, “Neuroglobin is up-regulated by and protects neurons from hypoxic ischemic insult”, PNAS, vol. 98, iss.26, 15306-15311, 2001

[4] Li R C et al, Hypoxia differentially regulate the expression of neuroglobin and cytoglobin in rat brain. BRAINRESEARCH, vol.

1096, iss. 173-179, 2006

[5] Ramser K, Wenseleers W, Dewilde S et al, Micro-resonanceRaman study of optically trapped Escherichia coli overexpressing human Neuroglobin, J Biomed Opt, vol. 12, iss. 4,pp. 044009, 2007 [6] Sakmann B and Neher E, “Patch Clamp techniques for studying

ionic channels in excitable membranes”, Ann Rev Physiol, vol. 46, pp. 455-72, 1984

[7] Rae J, et al, Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B, J Neurosci Methods, vol. 37, iss.1, pp.15-26, 1991