Fettsyraamidhydrolas enzymaktivitet efter fruktosintag

(1)

Fettsyraamidhydrolas enzymaktivitet efter fruktosintag

Shela Erfatpour

Examensarbete i farmaci 30 hp Masterprogrammet i farmaci 120 hp Godkänd:2014-05-28

Handledare Christopher Fowler

(2)

1

(3)

2 Sammanfattning

Övervikt och fetma är växande problem i Sverige och andra länder och leder till olika komplikationer som medför minskad livskvalité för individen. För att försöka stoppa denna oroande utveckling har en rad olika studier genomförts. Cannabis sativa som är involverad i aptiten ökar kroppssvikt genom aktivering aktivering av CB

1

cannabinoidreceptorn. Den kroppsegna CB-receptorliganden anandamid har också visat sig vara inblandat i aptitstimuleringen.

Syftet med detta projekt var att studera den farmakologiska effekten av fettsyraamid hydrolas FAAH som står för nedbrytning av anandamid i tre olika hjärnregioner

prefrontal cortex, hypotalamus och hippocampus efter intag av sockerlösningar fruktos och glukos. Resultatet visar att råttor behandlade med fruktos och glukos under en vecka visar en signifikant ökad FAAH enzymaktivitet i hippocampus jämfört med kontrollen (vatten). I studien observerades ingen signifikant ökning av FAAH

aktiviteten för respektive hjärnregioner prefrontal cortex och hypotalamus efter intag av fruktos och glukos under 5 veckor.

Undersökningen visar att sockerlösningar fruktos och glukos påverkar aktiviteten av

enzymet som är involverad i nedbrytning och syntes av endocannabinoiden anandamid

i hippocampus vilket i sin tur är involverad i övervikt och fetma.

(4)

3 Abstract

Overweight and obesity are growing problems in Sweden and other countries and leads to various complications that cause reduced quality of life for the individual. To try and stop this worrying trend, a variety of studies conducted. Cannabis sativa that is

involved in appetite increases body weight through the activation of CB

1

cannabinoid receptors. The endogenous cannabinoid receptor ligand anandamide has also been shown to be involved in appetite.

The purpose of this project was to study the pharmacological effects of fatty acid amide hydrolase FAAH, which accounts for the degradation of anandamide in three different brain regions of prefrontal cortex, hypothalamus and hippocampus after intake of sugar solutions of fructose and glucose. The results show that rats treated with fructose and glucose for a week, showed a significantly increased FAAH enzyme activity in the hippocampus compared to control (water). In the study, there was no significant increase of the FAAH activity of the respective brain regions prefrontal cortex and hypothalamus following intake of fructose and glucose for 5 weeks.

The survey shows that sugar solutions of fructose and glucose affects the activity of the enzyme that is involved in the degradation and synthesis of endocannabinoid

anandamide in the hippocampus , which in turn is involved in obesity and overweight.

(5)

4

(6)

5 Innehållsförteckning

Sammanfattning………..2

Abstract……….3

Introduktion...7

 Endocannabinoida systemet……….7

 Anandamid syntes………..8

 Upptag och nedbrytning………...9

 FAAH (fettsyraamidhydolas)………...9

 Målsättning………...9

Material och metod...10

 Homogenisering av hjärnregionerna..………..10

 Proteinkoncentration bestämning………10

 FAAH kol-metoden………..10

 Statistik………..…10

Resultat...11

 Analys av FAAH enzymaktivitet………12

Diskussion och slutsats………...13

Tackord………14

Referenser...15

(7)

6

(8)

7 Introduktion

Andelen övervikt och fetma ökar i Sverige och andra delar av världen. I OECD-länderna organisationen för ekonomi och utveckling beräknas mer än 50 % av den vuxna

befolkningen vara överviktiga (1). Två-tredjedels av amerikanska befolkningen beräknas vara drabbade av denna folksjukdom. Orsaken kan vara många t.ex. livsstil och miljöfaktorer men även arv. Mycket tyder på att det är främst livsstilsrelaterad d.v.s. hög konsumtion av energirika livsmedel och sötade drycker i förhållande till vad kroppen förbränner (2).

Förekomsten av övervikt och fetma är associerat med många komplikationer, alltså ökad risk för en rad olika sjukdomar t.ex. högt blodtryck, diabetes typ 2 och

belastningsskador i lederna (3). Hormonet leptin i hypotalamus signalerar hur stor energiförrådet är, genom att aktivera eller inhibera hunger och aptit (4), och möss som har störningar i leptinsystemet är överviktiga.

Det är känt att cannabis sativa har många potentiella användningsområden. Den används i medicinska syften men även som berusningsmedel. Det är

tetrahydrocannabinol (THC) som är den primära verksamma substansen i cannabis sativa och den har många farmakologiska effekter bland annat ger den avslappning, eufori (lyckokänsla) men även identifierats som aptitstimulerande som i sin tur kan öka kroppsvikten(2).

THC utgör sina effekter genom att binda till två G-proteinkopplade receptorer CB

1

och CB

2,

även kallade för cannabinoidreceptorer (5). Dessa två receptorer finns såväl i hjärnan som i periferin. CB

1

receptorn uttrycks främst i hjärnan medan CB

2

finner man huvudsakligen i immunsystemet (6). THCs effekt på aptit förmedlas via CB

1

receptorer, och en CB

1

receptor antagonist fanns på marknaden under en kort period under 2000- talet som viktminskningspreparat (rimonabant) men avregistrerades pga. dess

biverkningar, ffa psykiatriska bekymrar som ångest och depression (7).

Upptäckten av cannabinoider som framkallar sina effekter genom aktivering av CB

1

och CB

2

receptorer ledde till en rad olika studier där forskare började söka efter kroppsegna ämnen som aktiverar dessa receptorer. I början på 1990 talet upptäcktes att vissa arakidonsyraderivater fungerade som endogena CB

1

receptorligander,

endocannabinoider (8).

Endocannabinoida systemet

Det endogena cannabissystemet är ett signalsystem som har till uppgift att reglera, modulera och upprätthålla kroppsfunktioner (9). De två mest studerade och

förekommande endocannabinoiderna är anandamid (N-arakidonoyletanolamid AEA) och 2-AG (2-arakidonoylglycerol) (5).

AEA är en neurotransmittor som trots låg affinitet till CB

1

- receptorer har visat påverka ett antal processer i kroppen. I centrala nervsystemet CNS är den inblandad i

smärtsignalering, transmittor frisättning, sömn och inte minst vid neuro-inflammation (10).

Baserat på ursprungliga observationer om THCs effekt på matintag, ytterligare undersökningar har genomförts för att studera ifall endocannabinoider påverkar aptiten. I en studie där råttor blivit injicerat med AEA ändrades ätbeteendet ändrades.

Undersökningen visade att AEA initierar aptiten genom aktivering av CB

1

-receptorer,

vilket i sin tur bevisade att endocannabinoider i hypotalamus är involverade i aptiten

(11).

(9)

8 Anandamidsyntes

AEA och 2-AG har nästan samma kemiska strukturer men syntetiseras och bryts ned på olika sätt (Figur 1).

Figur 1. Struktur av anandamider AEA och 2-AG (9).

AEA tillhör fettsyraamiden N - acyletanolamin (NAE) som bildas då flera acylgrupper är ihopkopplade till kväve atomen i etanolaminen.

Fettsyraamiden bildas från membranfosfolipider som överförs till

fosfatidyletanolamin via Ca

²⁺

- beroende kanal som då bildar N-acylfosfatidyletanolamin (NAPE). Därefter hydrolyseras NAPE m.h.a. NAPE-PLD (NAPE-selektiv fosfolipas D) katalysatorn varvid AEA bildas (10). Det har föreslagits andra syntesvägar för AEA. In vitro studier har visat att

kondensation av etanolamin och arakidonsyra (fri fettsyra) utan förbrukning av energi leder till bildning av AEA.

Denna process katalyseras av FAAH (fettsyraamid hydrolas) som är också ansvarig för nedbrytning av AEA (se

nedan). In vivo sker inte denna syntes väg då det krävs höga koncentrationer av

arakidonsyra och etanolamin och p.g.a. låg affinitet till FAAH (12).

FiguFigur 2. Syntes av AEA (9).

(10)

9 Upptag och nedbrytning

Efter intracellulära syntesen av endocannabinoiden AEA avslutas signaleringen med två stegprocesser, nämligen transport in i cellen och nedbrytning via specifika

enzymsystem (10). Endocannabinoider är lipofila substanser och den drivande kraften för intra-och extracellulära transporten av AEA tros vara koncentrationsgradient.

Frisättningen av AEA kan både stimuleras och hämmas. Ökade Ca

²⁺

nivåer aktiverar enzymer som är ansvariga för endocannabinoid syntesen från membranlipider. Som svar aktiveras AEA frisättning som vidare utövar sin effekt genom att binda till

målreceptorn CB

1

. Detta påverkar en rad olika processer som bl. a. ger ökad aptit (13).

Varken AEA eller 2-AG är lagrade intra cellulärt. Dessa produceras som svar på

fysiologiska tillstånd. Endocannabinoider AEA och 2-AG har olika metabolismvägar. 2- AG metaboliseras av monoacylglycerol lipas (MAG-lipas), medan huvudenzymet som är ansvarig för nedbrytning av anandamid är FAAH som hydrolyserar anandamid genom att klyva arakidonsyra och etanolamin (12).

FAAH (Fettsyraamidhydrolas)

FAAH är membranbundet enzym som har förmåga att metabolisera ett stort antal fettsyraamider. Detta enzym befinner sig på intracellulära membranet, innehåller en transmembrandel och en katalytisk del. FAAH uttrycks i många olika vävnader men framförallt i lever och hjärnan. Enzymets huvudsakliga funktion beträffande

endocannabinoidsignalliering är att klyva AEA genom att bryta bindningen mellan arakidonsyra och etanolamin (10).

I en studie publicerad 2010 (6) har man undersökt hypotalamus och funnit att mRNA uttrycket av enzymer involverade i syntes och nedbrytninga av AEA och 2-AG påverkas vid intag av välsmakade sockerlösningar. Råttor som hade intagit fruktoslösningar under en veckas behadling uppvisade uppreglering av mRNA uttrycket av FAAH enzymet. I studien observerades aktivering och ökad NAPE mRNA vid intag av glukos, medan enzymet MAG-lipas som metaboliserar 2-AG var nedreglerad. Slutligen kom det fram till att endocannabinoida systemet är involverad i den del av hjärnan som styr aptiten. Analysen har dock några svagheter:

 Ändringarna av nivåerna av mRNA behöver inte nödvändigtvis tyda på ändrade proteinnivåer och därmed enzymaktivitet.

 Det är enbart hypotalamus som är analyserat och det är okänd om sockerlösningar kan även påverka andra regioner i hjärnan.

 Försöksdjuren har behandlats under en vecka vilket leder till att man inte kan dra slutsatsen om effekten är kort eller långvarig.

Undersökningens svagheter medför att vidare undersöka och besvara dessa

frågeställningar åtminstone för FAAH med tanke på sin central roll i metabolismen av anandamid. Studiens hypotes är att förhöjda mRNA uttryck av FAAH borde framkalla ökad enzymaktivitet.

Målsättning

Den endocannabinoida systemet är känd sedan innan för homeostas. Den är även

involverad i reglering av födointag. Syftet med denna studie är att undersöka hur

sockerlösningar påverkar aktiviteten av FAAH som står för metabolismen av AEA som i

sin tur är involverad i aptiten.

(11)

10 Material och metod

Totalt 54 stycken Sprague Dawley råttor med vikten 200-250 g vid studiens start, exponerades till ettdera vattnet (kontrollgrupp), fruktos eller glukos under en behandlingstid på 1, 5 och 8 veckor (n=6/grupp). Alla djur fick samma tillgång till standard råttfoder. Laboratoritet för prof. Tommy Olsson, institutionen för folk och klinisk medicin, Umeå Universitet, förberedde hjärnsnitten. Från varje råtta erhölls hjärnsnitt med 20 M tjocklek som förvarades i frysen i -80. De experimentella metoderna godkändes av den lokala djurförsöksnämnden och genomfördes enligt den europeiska och svenska lagstiftningen. Min roll i projektet var att analysera FAAH aktiviteten i dessa hjärnsnitt.

Homogenisering av hjärnregionerna

Försöken initierades med uppdelning av råtthjärnsnitten i tre gruppen 1, 5, och 8 veckors behandlade grupper. Vartdera hjärnområdet d.v.s. prefrontal cortex,

hippocampus och hypotalamus som var av mest betydelse för analysen lokaliserades med hjälp av en atlas (14) och skrapades under mikroskop. Proteinproverna

homogeniserades och överfördes till eppendorfrör innehållande 10 mM tris, pH 9 (buffertmedel), därefter frystes de i -80 tills analys av proteinkoncentrations. Den tid det tog att utföra detta moment var ca 20 dagar.

Proteinkoncentration bestämning

De skrapade hjärnregionerna delades upp ytterligare: Prefrontal cortex, hippocampus och hypotalamus för proteinkoncentrations bestämning genom Bradford metoden (15).

Maskinen SPECTROstar Nano vid 595 nm användes för absorbans bestämning av proverna inklusive standardlösningar av bovin serum albumin med kända

proteinkoncentrationer. Varvid koncentrationen av proteinprover bestämdes.

FAAH kol-metoden

Metoden av Boldrup m.fl användes (16).

Proverna späddes till önskade

koncentrationer (0-2 µg protein/assay) vid varje försök. FAAH aktiviteten analyserades med användning av 0,5 M [

³

H]AEA (radiomärkt på

etanolaminedelen av molekylen) i etanol, fettsyra fri BSA och tris-HCl).

Proverna inkuberades och reaktionen stoppades på is genom tillsats av aktivt kol (1:4) löst i saltsyra (HCl). Därefter centrifugerades lösningen för att separera hydrofila vattenfasen (radiomärkt etanolamin) som har hydrolyserats av FAAH från icke hydrolyserade AEA, bunden till

kolet. Slutligen analyserades proven med avseende på kvantifiering av den

producerade etanolaminen med hjälp av skintvätskespektroskopi.

Statistik

Statistisk skillnaderna mellan grupperna undersöktes med Kruskal-Wallis test, med Dunn’s multiple comparisons post-hoc test där signifikant Kruskal-Wallis statistik uppnåddes. Dessa gjordes av handledaren med programmet GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).

F Figur 3. Analysen av FAAH aktivitet(9)

(12)

11 Resultat

Initial experiment utfördes genom skrapning av de råtthjärnområden som var av mest intresse för studien d.v.s. prefrontal cortex, hypotalamus och hippocampus (se bilden nedan).

Skrapad prefrontal- skrapad hypotalamus skrapad hippocampus cortex

Figur 4: Råtthjärnsnitt. Skrapade råtthjärnsnitten från Prefrontal cortex, hypotalamus och hippocampus.

FAAH enzymaktiviteten bestämdes m.h.a. homogeniserade AEA från råtthjärnsnitten behandlade med fruktos, glukos och vatten (kontrollgrupp) intag i 1 och 5 veckor (FAAH för 8 veckors behandlade studerades inte då tiden inte räckte till).

Initialt bestämde vi optimala betingelserna för mätning av enzymets initialhastighet.

Genom att testa olika inkuberingstider och proteinkoncentrationer är det möjligt att finna de bästa betingelser där produktion av reaktionsprodukt är linjär med såväl tid och proteinkoncentration (Fig. 5). Den koncentration som försöken utfördes på var 0,5 µg protein/assay och inkubationstiden bestämdes till 30 minuter, vilket visade den bästa linjäriteten.

Figur 5: Proteinoptimerings försök.

Koncentrationen 0,5 µg protein/assay och inkubationstiden mellan 20-40 minuter visar den bästa linjäriteten.

(13)

12 Analys av FAAH enzymaktivitet

I resultat för de tre studerade hjärnregionerna prefrontal cortex, hippocamous och hypotalamus framgår det att råttor behandlade med fruktos och glukos under en veckas period visar en signifikant (p<0,05) ökning av FAAH enzymaktivitet i hippocamus området jämfört med råttor som intagit vatten (kontrollgrupp). Ingen signifikant samband observerades för samma område efter 5 veckors behandlingsperiod. De andra råtthjärnregionerna prefrontal cortex och hypotalamus behandlade under 1 och 5 veckor med lösningar fruktos, glukos och vatten uppvisade inte heller någon signifikant uppreglering av FAAH aktivitet. FAAH aktivitet som observerades för prefrontal cortex och hypotalamus vid en veckas behandling av sockerlösningar var inte signifikant skilt från kontroll. För 5 veckors behandlade råttor uppvisar grafen en ganska stor

spridning för de olika hjärnområdena.

1 veckas behandlade 5 veckors behandlade

Figur 6: Effekten av sockerlösningar och vatten på FAAH enzymaktivitet. Data visar enskilda värdena samt medianvärden av FAAH aktivitet i varje region.*p<0.05, Dunn’s multiple comparison test efter signifikant Kruskal-Wallis statistik.

(14)

13 Diskussion och slutsats

Det är känt att endocannabinoiden AEA har aptitstimulerande effekt genom reglering av CB

1

-receptorer. Detta i sin tur har bevisats öka intaget av välsmakade kost och dryck.

Effekten av sockerlösningar på enzymer involverade i syntes och nedbrytning av endocannabinoider är inte riktig identifierade. Därför har nedbrytningsprocessen analyserats i denna studie för att öka kunskapen om hur sockerlösningar fruktos och glukos påverkar aptitregleringssystemet. FAAH aktivitetsenzymet som står för metabolismen av AEA undersöktes.

Metod-diskussion

Ett alternativ analytisk metod som skulle kunna användas för undersökning av FAAH enzym är Westernblott. Men analysen skulle endast påvisa mängden protein. I denna studie undersöktes aktiviteten av FAAH vilket är funktionellt mer relevant.

Resultatet tyder på att råttor behandlade under en vecka med fruktos och glukos får ökad FAAH aktivitet i hippocampus i jämförelse med kontrollgruppen vatten (se fig. 6 en veckas behandlade). Vilket innebär att fruktos är den mest potenta komponenten på FAAH enzymaktivitetet som i sin tur har effekt på aptitregleringssystemet i

hippocampus.

I tidigare undersökningar är det redan upptäckt att sockerlösningar fruktos och sackaros ökar mRNA uttrycket av FAAH enzymet i hypotalamus. Dessa resultat stöder hypotesen att sockerlösningar är involverade i syntes och nedbrytning av

endocannabionoider. Stödet gäller framför allt hippocampus regionen där råttor som erbjudits sockerlösningar fruktos och glukos under en vecka visade sig ge en signifikant (p<0,05) ökad mRNA uttryck av FAAH som svar på överproduktion av AEA för att upprätthålla normala nivåer av AEA. Ökad metabolisering av AEA leder till minskade aktivitet vid CB

1

receptorer och minskning av dessa receptorsignallering orsakar minskad aptit. För samma hjärnregion men längre behandlingsperiod observerades ingen signifikant ökning av FAAH aktivitet. Studiens resultat indikerar att även

prefrontal och hypotalamus inte uppvisar någon statistiskt signifikant ökning av FAAH aktivitet vid intag av fruktos och glukos under både 1 och 5 veckors behandling. En trovärdig orsak till spridning av resultatet kan vara att ribosomen som ansvarar för proteinsyntesen inte binder mRNA i translationssteget. På så sätt byggs ingen aminosyrakedja upp för att resultera i ett protein d.v.s. FAAH enzym.

Ytterligare färsk studie har dragit slutsatser i en lite annan nyans när det gäller det specifika sambandet mellan CB

1

och hög fettdiet HFD i prefrontal cortex. Ätbeteendet påverkades och en uppreglering av CB

1

observerades vid intag av HFD under 4-12 veckor. Detta i sin tur orsakades av ökad aktivitet i AEA. Efter fortsatt HFD i 16-20 veckor insågs ingen påverkan på endocannabinoida systemet vilket tros bero på normalisering av endocannabinoiden trots HFD (17).

Sammanställningen av tidigare och nyligen genomförda experiment bidrar till ökade kunskaper om FAAHs aktivitet i olika hjärnregioner vid intag av sockerlösningar.

Identifiering av de involverade mekanismerna skulle kunna ge möjlighet för upptäcken av nya läkemedel i områden där potentiering av FAAH signalering är terapeutiskt fördelaktig d.v.s. vid fetma och övervikt. I andra studier har inhibering av FAAH demonstrerats, vilket har varit till nytta för vissa patienter då hämning av AEA metabolism har resulterat i positiva effekter vid smärtlindring (6).

I fortsatt forskning skulle man kunna undersöka FAAH enzymaktivitet i levern för att

vidare studera hur AEA påverkas. Därmed upprätthålla normala nivåer av AEA så att

övervikt och fetma motverkas.

(15)

14 Tackord

Avslutningsvis vill jag tacka min handledare Christopher Fowler för all stöd under

projektets gång. Ett stort tack även till Jessica Karlsson som var till stor hjälp under

laborations veckor.

(16)

15 Referenser

1) http://www.oecdbetterlifeindex.org/topics/health/

2) Sipe JC, Waalen J, Gerber A, Beutter E. Overweight and obesity associated with a missense polymorphism i fatty acid amid hydrolyse (FAAH). Int. J. Obesity 2005;29:755-59.

3) Andrén P, Kjellström T. Fetma. 1177.se. Hämtad från: http://www.1177.se (uppdaterad 2011-11-22).

4) Letters to nature, Leptin-regulated endocannabinoids are involved in maintaining food intake.2001;410

5) Ghafouri N. Endocannabinoids and N-acylethanolamines in translational pain research: from monoacylglycerol lipas to muscle pain. PhD Dissertion

Thesis,Department of Pharmacology and Clinical Neuroscience, Umeå 2013: p.

11-15.

6) Erlandson-Albertsson C, Lundquist A. Fruktose affects enzymes involved in the syntethis and degration of hypothalamic endocannabinoids. Regul. Peptides 2010;161:87-91.

7) BareticM. Obesity drug therapy. Minerva Endocrinol 2013;38:245-54.

8) Devane WA, Hanus L. Isolation and structure of brain constituent that binds to the cannabinoid receptor. Science 1992;258:1946-49.

9) Di Marzo V, Matias I. Endocannabinoid control of food intake and energy balance. Nat. Neurosci. 2005;8:585-9.

10) Holt S. Fatty acid amide hydrolase-A target for anti-inflammatory therapies?

Department of Pharmacology and Clinical Neuroscience, Umeå 2005: p. 11-39.

11) Jamshidi N, Taylor DA. Anandamide administration into the ventromedial hypothalamus stimulates appetite in rats. Br. J. Pharmacol. 2001;134:1115-54.

12) Naughton SS, Mathai ML, Hryciw DH, McAinch AJ. Fatty acid modulation of the endocannabinoid system and the effect on food intake and metabolism. Int.

J. Endocrinol. 2013, Article ID 361895.

13) McFarland MJ, Barker EL. Anandamid transport. Pharmacol. Ther.

2004;104:117-35.

14) Paxinos G, Watson C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 2nd ed.

Orlando, FL, USA: Academic Press, Inc.; 1986.

15) Bradford, M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.

Analyt. Biochem. 72:248–254.

16) Boldrup L, Wilson SJ, Barbier AJ, Fowler CJ. A simple stopped assay for fatty acid amide hydrolase avoiding the use of a chloroform extraction phase. J.