Örebro University School of Medicine Degree project, 15 ECTS Jan 2015
Identifiering av specifka sekvenstyper av
Staphylococcus epidermidis med
mass-spektrometri
Version 2
Författare: Christian Karlsson, Läkarstudent T6 Handledare: Erik Ahlstrand, Leg. Läkare, med. dr.
Martin Sundqvist, Leg. Läkare, med. dr. Bo Söderquist, Leg. Läkare, Professor
Laboratoriehandledare: Bengt Hellmark, Leg. BMA, med. dr.
i
Sammanfattning
Bakgrund: Staphylococcus epidermidis är normalt en ofarlig bakterie som ingår i hudens
normalflora. Den kan dock orsaka infektion, speciellt hos patienter som har inopererade medicinskt tekniska produkter som ledproteser eller centrala venkatetrar. Patienter med nedsatt immunförsvar löper också ökad risk att infekteras. Det har visat sig att en specifik sekvenstyp, ST2 är mer benägen att orsaka infektion än andra sekvenstyper. Sekvenstyp (ST) identifieras med Multi Locus Sequence Typing (MLST) som är en dyr och tidskrävande metod. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) är en relativt ny metod som visat god förmåga att identifiera bakterier på artnivå. Syftet med denna studie var att beskriva huruvida MALDI-TOF MS kan användas för att skilja ut ST2 från övriga sekvenstyper hos S. epidermidis.
Material och Metoder: 75 bakterieisolat av S. epidermidis vars sekvenstyp identifierats med
MLST i en tidigare studie valdes ut. 40 av dessa tillhörde ST2. De 35 övriga isolaten utgjordes av 5 isolat per sekvenstyp av ST5, ST22, ST23, ST57, ST59, ST73 och ST215. Dessa analyserades med MALDI-TOF MS som genererar masspektrum. Dessa analyserades sedan på 3 olika sätt. Programvaran MALDI Biotyper 3.1 användes för att göra en
klusteranalys av isolaten. Spektrumen granskades manuellt med programvaran Flexanalysis. Sensitivitet och specificitet för olika tröskelvärden beräknades.
Resultat: Klusteranalysen visade att ST2 förekom i flera grupper. Vid manuell granskning av
spektrumen upptäcktes extra toppar hos 13 av 40 ST2 isolat och även hos ett flertal övriga sekvenstyper. Vid tröskelvärdet 1 identifierade MALDI-TOF MS ST2 med en sensitivitet på 95% och en specificitet på 85,7%. Vid stigande tröskelvärden sjönk specificiteten kraftigt medan sensitiviteten steg marginellt.
Diskussion: Den stora spridningen av ST2 i klusteranalysen tyder på stora skillnader i
proteinsammansättning trots begränsade genetiska skillnader. MALDI-TOF MS identifierar ST2 med låg specificitet redan vid tröskelvärdet 1. Däremot är sensitiviteten hög. Andra matrixlösningar och inställningar i programvaran inför analys skulle kunna ge annorlunda resultat avseende diskriminering av olika ST. Det är i dagsläget oklart vad de upptäckta extratopparna står för.
Slutsats: MALDI-TOF MS kan eventuellt användas som ett stöd för beslut om vidare analys
med MLST i en situation där det är kliniskt relevant att identifiera sekvenstyp. Potential finns för ytterligare forskning inom ämnet.
ii
Förkortningar
α-cyano-4-hydroxykanelsyra-matrixlösning (HCCA-matrixlösning) Central venkateter (CVK)
Koagulasnegativa stafylokocker (KNS) Mass spectra projektion (MSP)
Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)
Multi Locus Sequence Typing (MLST)
Receiver operating characteristic kurva (ROC-kurva) Sekvenstyp (ST)
Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis)
iii
Innehållsförteckning
Bakgrund……….1
Syfte………4
Material och metoder………..5
Resultat………8
Diskussion……….13
Slutsats………..15
Särskilt tack…..……….15
1
Bakgrund
Staphylococcus epidermidis
Cytostatikabehandling har gett en möjlighet att förlänga överlevnaden och ibland bota flera cancerformer, däribland maligna blodsjukdomar. [1]
Cytostatikabehandling är även associerat med svåra biverkningar då även frisk vävnad påverkats. Vilka typer och allvarlighetsgrad av biverkningar patienten drabbas av beror på cytostatikapreparatets typ och dosering. Sterilitet, håravfall, epitelskador och försämrad sårläkning är vanligt förekommande biverkningar. En annan ofta förekommande biverkan är benmärgstoxicitet med nedsatt produktion av normala blodceller, däribland erytrocyter, trombocyter, lymfocyter och granulocyter. [2]
Inom gruppen granulocyter finns de neutrofila granulocyterna. Dessa utgör en viktig del av det medfödda immunförsvaret och utgör en viktig del i första linjens försvar mot många mikroorganismer. Vid infektion mobiliseras neutrofila granulocyter och benmärgens produktion av neutrofila granulocyter kraftigt. Granulocyterna migrerar till det infekterade området där de kan fagocytera mikroorganismer, samt orsaka inflammation. Vid sjunkande antal neutrofila granulocyter har en ökad förekomst, allvarlighetsgrad och mortalitet i sjukdomar som orsakas av bakterier, virus och svampar observerats. [3, 4]
Bland de mikroorganismer som orsakat infektion hos neutropena patienter har det i ett flertal studier visat sig att grampositiva bakterier utgör den största andelen. Av dessa grampositiva bakterier orsakas de flesta sjukdomsfallen av koagulasnegativa stafylokocker (KNS) som tillhör den normala floran på människors hud och slemhinnor. [5-7]
KNS kan i vissa situationer bli invasiv och ta sig in i blodbanan genom skador på slemhinnor och hud, exempelvis orsakade av cytostatika, samt via centrala venkatetrar (CVK). En CVK är i många fall är nödvändig vid behandling av maligniteter för att administrera cytostatika.[8] Vid en närmare analys av KNS-positiva blododlingar i en studie som undersökte
kateterrelaterade infektioner framkom det att Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis) var den art som förekom oftast. [9]
S. epidermidis. har visat sig ibland ha förmågan att binda till främmande material som
opererats in i kroppen, exempelvis CVK, ledproteser eller andra inopererade medicinskt tekniska produkter. När de har lyckats etablera sig på den inopererade produkten kan de bilda en polysackaridbaserad biofilm som omsluter bakterierna och skyddar mot antibiotika, komplement, antikroppar och fagocytos. Det har även framkommit att mindre
2
kroppen via blodbanan. S. epidermidis kan i vissa fall producera cytolytiska och proinflammatoriska toxiner, men i allmänhet anses inte toxiner vara en avgörande virulensfaktor. [10, 11]
Att vistas i sjukhusmiljö och behandlas med cytostatika och antibiotika har visat sig leda till ökad risk för att mer resistenta och virulenta typer av S. epidermidis selekteras fram bland patienternas normalflora på huden vilket ökar risken för att just dessa därefter kan orsaka infektion. [12]
I ett flertal studier med syfte att undersöka långtidsepidemilogi har blododlingar från patienter med sepsis orsakad av S. epidermidis analyserats med metoden Multi Locus Sequence Typing (MLST). Metoden analyserar mikroorganismer på genetisk nivå genom att analysera
variationer i några (oftast 7) specifika så kallade housekeeping-gener. Dessa tillverkar proteinaser som är nödvändiga för cellens normalfunktion och har därför låg grad av mutation. Skillnader i dessa används för att dela upp bakterierna i så kallade sekvenstyper (ST). [13, 14]
Antibiotikaresistens och förmåga till att orsaka invasiv sjukdom (invasivitet) har visat sig variera mellan olika sekvenstyper av S. epidermidis. En specifik sekvenstyp (ST2) har visat sig dominera bland sjukhusförvärvade infektioner orsakade av S. epidermidis hos känsliga patienter såsom de som vårdas på intensivvårdsavdelningar och patienter med inopererat främmande material, t ex ledproteser. Detta har observerat på sjukhus i flera världsdelar. [15-18]
Även vid den hematologiska vårdenheten vid Universitetssjukhuset i Örebro har en dominans av ST2 noterats. I en studie inkluderande samtliga S. epidermidis- positiva blododlingar mellan 1980-2009 analyserats med MLTS. ST2 förekom i en majoritet av dessa. [19]
Mass-spektrometri
Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) är en relativt ny metod som kan användas för att med hög precision artbestämma mikroorganismer utifrån deras proteinsammansättning. En odlad mikroorganism som ska analyseras placeras på en platta och där kapslas in i en matrixlösning. Sedan beskjuts provet med en ultraviolett laser vilket exiterar matrixen vilket i sin tur leder till joniserade proteiner. Proteinerna fångas sedan upp i ett definierat elektriskt fält varefter de storlekssepareras i en vakuumtunnel och träffar en detektor i rörets bortre ände. Ju större ett protein är, desto längre tid tar det för proteinet att färdas genom röret. Baserat på såväl energin som frisätts i detektorn som den tid det tar för den laddade molekylen att nå detektorn räknas proteinernas massa ut.
3
Även mängden proteiner av samma storlek registreras. Resultatet redovisas som ett mass-spektrum där proteinstorleken representeras på x-axeln normalt inom intervallet 0-20000Da. På y-axeln redovisas mängden joniserat protein av en viss storlek. Artbestämningen sker sedan genom att mass-spektrat jämförs mot en databas som innehåller referensspektrum över ett stort antal kända mikroorganismarters proteinsammansättning. Från databasen presenteras sedan förslag på de mikroorganismarter som bäst stämmer överens med det registrerade mass-spektrat. [20]
MALDI-TOF MS har visat sig kunna identifiera de olika arterna inom gruppen KNS med hög säkerhet.[21, 22]
I de fall MALDI-TOF MS inte kunnat avgöra mikroorganismens art har i många fall resultatet förbättrats genom att på förväg lysera bakteriecellerna med hjälp av bland annat myrsyra och på så vis kunna extrahera mikroorganismernas proteiner i löst form inför inbäddning i
matrixlösningen. Detta ger ett renare prov hos grampositiva bakterier då bland annat den tjocka cellväggen skiljs från de interna proteinerna och inte inkluderas i analysen. [23] MALDI-TOF MS har i vissa studier påvisat skillnader i proteinsammansättningen mellan olika genetiska linjer av Staphylococcus aureus. Denna förmåga har dock ifrågasatts i andra studier. [24-26]
MALDI-TOF MS har visat sig vara en snabb och billig metod för att identifiera en stor andel bakterier på artnivå och dessutom kunnat skilja på vissa egenskaper inom arter. Många andra analysmetoder är dyrare och mer tidsödande. [21, 22, 24, 25]
Eftersom ST2 är en betydande orsak till infektioner hos neutropena patienter så inriktar sig det aktuella projektet på att undersöka om MALDI-TOF MS kan skilja ut ST2 från övriga sekvenstyper.
4
Syfte
Att beskriva huruvida MALDI-TOF MS kan användas för att skilja ut Sekvenstyp 2 från övriga sekvenstyper hos Staphylococcus epidermidis.
5
Material och Metoder
Bakteriestammar
Från en tidigare studie [18] fanns 373 isolat av S. epidermidis sparade vid
Laboratoriemedicinska länskliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset i Örebro (USÖ). Samtliga isolat hade sitt ursprung i positiva blododlingar som tagits från patienter som vårdats på den hematologiska sektionen på Medicinska kliniken, USÖ mellan 1980-2009. De hade förvarats frysta i -70°C. Isolatens sekvenstyp hade tidigare identifierats med MLST. [19] Bland dessa isolat valdes 75st ut till den aktuella studien. Ungefär hälften av isolaten planerades att tillhöra ST2 för att kunna jämföra dem sinsemellan och avgöra om det fanns några variationer i proteinsammansättningen inom sekvenstypen. Den andra hälften
planerades bestå av andra sekvenstyper för att kunna avgöra om det fanns skillnader mellan dessa och ST2. Isolaten från 80-talet exkluderades helt på grund av att det från dessa patienter saknades viss klinisk information om exempelvis sepsisförloppet, som skulle kunna vara av intresse vid framtida forskning inom området. I vissa fall förekom flera isolat som tagits från samma patient. I dessa fall valdes enbart en odling per patient. Efter inkluderingen hade 40st isolat från ST2 valts ut. Från de övriga sekvenstyperna valdes 5st vardera. Dessa tillhörde sekvenstyperna 5, 22, 23, 57, 59, 73 och 215. Initialt planerades även att sekvenstyperna 6 och 38 skulle inkluderas. Eftersom antalet isolat av dessa, som uppfyllde inklusionskriterierna, var färre än 5st exkluderades de i denna analys.
Generering av Mass-spektra
Isolaten odlades ut på agarplattor med 5% hästblod och inkuberades över natt i luft med en temperatur på 36 grader. Dagen därpå odlades samtliga isolat om på nya blodagarplattor och inkuberades återigen över natten.
Nästa dag analyserades varje isolat med MALDI-TOF i duplikat. Rena tandpetare användes för att placera en tunn bakteriefilm på provplattor i rostfritt stål (Bruker Daltonics). Över varje prov applicerades sedan 1µL α-cyano-4-hydroxykanelsyra-matrixlösning
(HCCA-matrixlösning) som fick torka. HCCA-matrixlösningen var en blandning av acetonitril (Sigma-Aldrich), trifluorätticksyra (Sigma-Aldrich) och vatten i volymsproportionerna 50:2,5:47,5. Efter att dessa kemikalier blandats mättas lösningen med α-cyano-4-hydroxykanelsyra (Sigma-Aldrich).
Proverna analyserades sedan i en MALDI-TOF masspektrometer, Microflex LT med tillhörande programvara (Biotyper 3.1 och Flexanalysis, Bruker Daltonics, Bremen,
6
Tyskland). Samma inställningar användes som vid identifiering av bakterier. Totalt erhölls 150 spektrum, 2 per isolat. Vid analys jämfördes spektrumen mot den databas som ingår i MALDI biotyper och de 10 troligaste bakteriearterna presenterades i fallande
sannolikhetsordning.
Samtliga bakterieisolat analyserades sedan ännu en gång efter att ha genomgått en fullständig extraktion. 2-3 bakteriekolonier per isolat löstes upp i 300µL sterilt vatten. Därefter tillsattes 900µL 99,5% etanol. Suspensionen blandades med hjälp av vortex och centrifugerades sedan i 2 minuter på 15000 RCF. En pellet hade då bildats i botten av röret. Supernatanten hälldes av och centrifugeringen upprepades. Därefter pipetterades resterande supernatant bort och pelleten fick lufttorka. Sedan tillsattes 20µL 70% myrsyra. Lösningen rördes om med pipettspetsen så att pelleten blandades ordentligt med vätskan. Efter 2,5 minuter tillsattes 20µL 100% acetonitril. Lösningen blandades sedan med hjälp av vortex och centrifugerades återigen i 2 minuter på 15000 RCF. En ny pellet hade då bildats som innehöll bland annat resterna av mikroorganismernas cellvägg. Proteinerna som skulle analyseras var lösta i supernatanten. 1 µL supernatant placerades på målplattan. När supernatanten torkat tillsattes även 1µL HCCAmatrix som sedan också fick torka innan proverna analyserades i
masspektrometern. De fullständigt extraherade isolaten analyserades 5 gånger vardera. Totalt erhölls då 375 masspektrum.
Analys av Mass-spektra
Programvaran MALDI biotyper 3.1 användes för att bilda ett medelvärde för de 5 mass-spektra som erhölls för varje isolat. Detta skapar så kallade mass spectra projektion (MSP), totalt 75 stycken, ett per isolat. Dessa kategoriserades sedan efter sekvenstyp. Med hjälp av dessa MSP bildades en helt ny databas där de olika sekvenstyperna fanns representerade. Mot denna kunde sedan spektrum från de icke-extraherade proverna jämföras.
I programvaran MALDI biotyper 3.1 analyserades alla MSP i relation till sekvenstyp med klusteranalys (parvis jämförelse). Alla MSP jämfördes med varandra. De MSP som var mest lika varandra grupperades. Även ett avståndsvärde räknades ut beroende på hur lika varandra spektrumen var. Ett lågt avståndsvärde tyder på låg differentiering mellan de jämförda
spektrumen. Denna parvisa gruppering och avståndsnivån mellan de olika MSP visualiserades i ett dendrogram (Figur 1).
I tillägg jämfördes de icke extraherade isolatens spektrum mot den nybildade MSPdatabasen för att se om den aktuella sekvenstypen skulle överensstämma med föreslagen sekvenstyp
7
från databasen. Även här lämnades förslag på de 10 mest överensstämmande spektrumen i MSPdatabasen.
Programvaran Flexanalysis (Bruker Daltonic) användes för att manuellt leta efter likheter och skillnader mellan de olika isolaten. Samtliga 375 masspektrum från de extraherade isolaten analyserades. I ett första steg undersöktes varje bakterieisolats 5 mass-spektra för att se vilket spektrum som bäst representerade det aktuella isolatet. Sedan analyserades spektrumen inom de individuella sekvenstyperna för att se vilket spektrum som bäst representerade sin
sekvenstyp. Inom ST2 analyserades spektrumen även för att upptäcka eventuella skillnader i spektrumen inom sekvenstypen.
Statistisk metod
Antalet isolat som MALDI-TOF MS identifierade som ST2 (ST2-positiva) jämfördes mot det antal isolat som referensmetoden MLST identifierade som ST2. Denna jämförelse skedde i fyrfältstabeller.
Sensitiviteten beräknades genom att räkna antalet sant positiva / (antalet sant positiva + antalet falskt negativa).
Specificiteten beräknades genom att räkna antalet sant negativa / (antalet sant negativa + antalet falskt positiva).
Dessa beräkningar gjordes vid tröskelvärde 1-5 för att kunna bilda en ROC-kurva (Figur 2) som visade på sambandet mellan sensitivitet och specificitet för olika tröskelvärden. [27]
Etiska överväganden
Under detta projekt utfördes tester enbart på bakterieisolat utan koppling till information om de patienter som isolaten kom ifrån. Inga experiment utfördes på vävnad från människa. Vid inkludering av proverna användes en lista som innehöll information om olika patienter vars blododlingar isolaten tagits från. Detta för att ge en bättre spridning så att flera olika isolat inte skulle ha sitt ursprung i samma patient i de fall flera positiva blododlingar tagits från samma patient. Dessa patientuppgifter var kodade och kunde av författaren till detta dokument inte härledas till patienten i fråga.
8
Resultat
För alla isolat som analyserades föreslogs S. epidermidis som mest sannolikt art med score-värde > 2,0 vid jämförelse mot MALDI Biotypers egen databas.
I MSP databasen gjordes en klusteranalys som grupperade ihop MSP efter hur lika varandra de var, samt illustrerade avståndet mellan de olika isolatens MSP. Likheter och skillnader mellan dessa MSP visualiserades i ett dendrogram (Figur 1). Klusteranalysen visade på stor variation i proteinsammansättningen inom ST2. Enstaka ST2 isolat parades ihop med isolat som tillhörde andra sekvenstyper. Skillnaden i proteinsammansättningen, kallad avståndsnivå, illustrerades på dendrogramets x-axel. Låg avståndsnivå mellan parade isolat tyder på små skillnader i proteinsammansättningen. Vid var 100:e avståndsnivå undersöktes hur många grupper som fanns samt i hur många av dessa ST2 förekom. Klusteranalysen visade att de 75 isolaten var uppdelade i 31 grupper vid avståndsnivån 100. ST2 förekom i 15 av dessa. Vid avståndsnivån 200 fanns det 17 grupper. ST2 förekom i 6 av dessa.
ST2 förekom i 3 av 10 grupper vid avståndsnivån 300. Vid avståndsnivån 400 förekom ST2 i 2 av 5 grupper. Vid avståndsnivån 500 syntes ST2 i 2 av totalt 3 grupper.
9
Figur 1. Del av dendrogram som visar på differentieringen av sekvenstyperna i
MSP-databasen. Avståndsnivån illustreras på X-axeln. Bilden avsiktligt beskuren för att förbättra läsbarheten.
10
För att definiera de olika tröskelvärdena användes den lista på 10 förslag av isolat som programvaran presenterar när ett isolats spektra jämförs med spektrumen i MSP-databasen. Vid tröskelvärdet 1 antogs isolatet tillhöra ST2 om ST2 var det förslag som presenterades som mest sannolikt av databasen (Tabell 1). Vid tröskelvärdet 2 antogs isolatet tillhöra ST2 om ST2 förekom som det mest sannolika eller näst mest sannolika förslaget. Detta upprepades sedan upp till tröskelvärde 5 för att kunna bilda en receiver operating characteristic kurva (ROC-kurva) (Figur 2).
Resultaten från jämförelsen av de icke-extraherade isolaten och MSP-databasen vid
tröskelvärde 1 redovisas i nedanstående fyrfältstabell. Det som undersöktes var huruvida den av den nya databasen föreslagna sekvenstypen var överensstämmande med ST2 eller inte. Som referensmetod användes den tidigare MLST analysen.
Tabell 1. Fördelning av ST2-positiva och ST2-negativa isolat enligt referensmetoden MLST och testmetoden MALDI med tröskelvärdet 1.
ST2 enligt MLST Icke ST2 enligt MLST Total ST2 enligt MALDI 38 5 43 Icke ST2 enligt MALDI 2 30 32 Total 40 35 75
För tröskelvärdet 1 beräknades sensitiviteteten beräknas till 95% och specificiteten till 85,7%. För tröskelvärdet 2 steg sensitiviteten till 97,5% medan specificiteten sjönk till 71,4%.
För tröskelvärdet 3 steg sensitiviteten till 100% medan specificiteten sjönk till 48,6% Specificiteten fortsatte sedan sjunka till 28,6% och 20% för tröskelvärdena 4 respektive 5.
11
Sambandet mellan sensitivitet och specificitet för de olika tröskelvärdena illustrerades på en ROC-kurva. (Figur 2) Det tröskelvärde som ger det bästa förhållandet mellan sensitivitet och specificitet är det tröskelvärde vars punkt på kurvan befinner sig närmast det övre vänstra hörnet.
Figur 2. ROC-kurva som visar sambandet mellan sensitiviteten och specificiteten för
testmetoden MALDI vid tröskelvärdena 1-5.
1 2 3 4 5 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Sensitivitet 1-Specificitet
12
Vid manuell analys i Flexanalysis kunde inga tydliga variationer i masspektrumen upptäckas som kunde användas för att skilja ut sekvenstyp 2 från de övriga. Däremot upptäcktes att i 13 av de 40 ST2 isolaten förekom det extra toppar i masspektrumen (Figur 3). Proteinerna som dessa toppar representerade hade massan 2442 Da respektive 4893 Da. Dessa toppar förekom alltid tillsammans. Denna variation förekom även inom samtliga isolat av ST215 och vissa isolat av ST22 och ST5.
Figur 3. Del av två spektrum från två olika ST2 isolat. Det undre isolatet har extra toppar vid
13
Diskussion
S. epidermidis av ST2 har beskrivits som mer patogen än andra sekvenstyper och det kunde
därför vara kliniskt relevant att hitta en enkel metod för att identifiera dessa. Syftet med studien var att beskriva om MALDI-TOF MS kan skilja ut ST2 från övriga sekvenstyper av S.
epidermidis. Metoddiskussion
Utifrån 373 isolat valdes 75 stycken ut till denna studie för att representera de viktigaste sekvenstyperna hos S. epidermidis. Av de flesta sekvenstyperna fanns endast enstaka isolat. Det hade dock funnits möjlighet att inkludera fler isolat av ST73, ST215 och ST2. Det är dock oklart hur detta skulle ha påverkat resultatet, men med tanke på de resultatvariationer som setts i studier där S. aureus analyserats med MALDI-TOF MS är möjligheten stor att förändringar i resultatet kommer observeras. [24, 26]
Inför analys behandlades samtliga isolat likvärdigt vad gäller exempelvis inkubering, mängden tillsatta kemikalier och kemikaliernas exponeringstid. Vid analysen användes den matrixlösning och de mjukvaruinställningar som används vid rutinanalyser på
Laboratoriemedicinska länskliniken vid USÖ.
Ett par gånger under laborationsprocessen kontaminerades pipettspetsar som fick kasseras för att minimera kontaminationsrisken. Det finns inga garantier för att oupptäckt oavsiktlig kontamination inte inträffat under laborationen.
I andra studier har möjliga variationer i masspektrumen observerats vid användandet av olika agarplattor, buljonglösningar och inkubationstider. Olika matrixlösningar har visat sig ge variationer i storlek och intensitet av de proteiner som detekteras. Vissa matrixlösningar är exempelvis mer lämpade för att detektera stora proteiner. [20]
Analys av de olika isolaten med variation av faktorer som inkubationstid, andra
matrixlösningar och andra mjukvaruinställningar inför analys skulle möjligen kunna leda till ytterligare information om masspektrumet.
Resultatdiskussion
Vid analys av data beräknades en relativt hög sensitivitet även vid låga tröskelvärden. Däremot var specificiteten lägre redan vid ett tröskelvärde på 1. Denna fortsatte att sjunka kraftigt allteftersom tröskelvärdet ökade. Enligt ROC-kurvan (Figur 3) uppmättes det bästa resultatet vid tröskelvärdet 1. Detta borde därför vara det tröskelvärde som passar bäst för att
14
beskriva sannolikheten att isolatet tillhör ST2. Utifrån detta förhållande tycks MALDI-TOF MS vara en alltför ospecifik metod för att säkert kunna skilja ST2 från övriga sekvenstyper. Däremot verkar metoden pålitlig i det avseendet att den sällan missar en sann ST2. Särskilt vid ett tröskelvärde på 3 eller högre. Om det skulle uppstå en klinisk eller forskningsmässig situation då det är av intresse att avgöra om en okänd S. epidermidis är av sekvenstyp 2 eller inte skulle MALDI-TOF MS med den nytillverkade databasen som stöd kunna användas som ett stöd när det ska avgöras om en MLST ska utföras eller inte.
Klusteranalysen visade på stora skillnader i proteinsammansättningen mellan isolaten. Även de som tillhörde samma sekvenstyp. ST2 parades ofta ihop med isolat av andra sekvenstyper. Detta tyder på att även om det finns en liten genetisk skillnad så är skillnaden stor i
proteinsammansättningen. Däremot är de stora avstånden generellt intressanta då de tyder på att det finns en stor variation i isolaten som beror på något annat än sekvenstypen.
En studie av S. aureus visade på betydligt mindre avståndsnivå mellan isolaten. [24]
Det är i dagsläget oklart vad denna stora skillnad i avståndsnivån beror på. Men från vilket år isolatet isolerades, patientens diagnos och/eller egenskaper hos bakterien som exempelvis resistensmekanismer kan möjligen visa sig vara associerade med detta.
Vid manuell granskning av spektrumen i programmet Flexanalysis upptäcktes extra toppar i vissa isolat (Figur 3). Dessa har inte kunnat förklaras i dagsläget, men de behöver inte vara två separata proteiner. Möjligheten finns att ett protein kan dubbeljoniseras och på så vis registreras med olika stor massa. Dessa extratoppar skulle möjligtvis kunna förklara
spridningen i dendrogrammet. Att isolat grupperas ihop utifrån om de har dessa extra toppar snarare än att de grupperas efter sekvenstyp. Detta behöver undersökas närmare.
Andra studier som utförts på S. aureus har kunnat visa ett visst samband mellan variationer i spektrumet då bakterien utsatts för stress eller uttrycker vissa resistensmekanismer. [24, 28] De isolat som har dessa extra toppar, även de av andra sekvenstyper än ST2 skulle kunna undersökas närmare för att avgöra om topparna är kopplade till vissa specifika egenskaper såsom resistens, toxinproduktion eller ökad invasivitet.
15
Slutsats
I dagsläget har MALDI-TOF MS visat viss potential att kunna skilja ST2 från övriga sekvenstyper. Men den aktuella metoden är inte tillräckligt specifik för att kunna ersätta andra, säkrare metoder som exempelvis MLST. Däremot skulle den kunna användas som en preliminär analys och vara ett stöd i ett eventuellt beslut om huruvida MLST ska göras eller inte.
Potential finns för ytterligare forskning inom ämnet.
Särskilt tack
Jag vill först och främst tacka samtliga handledare. Era kunskaper inom varierade expertisområden har varit värdefulla både under laborationens gång och vid granskning/feedback av det skriftliga arbetets innehåll.
Jag vill även tacka personalen på Laboratoriemedicinska länskliniken, Mikrobiologi. Jag har känt mig välkommen hos er från första stund.
Slutligen vill jag tacka Lars-Gunnar Gunnarsson för en bra insats som ordförande vid examinationsseminariet.
16
Referenser
1. Haut A, Altman SJ, Cartwright GE, Wintrobe MM. The Influence of Chemotherapy on Survival in Acute Leukemia. The Journal of Hematology 1955 Sep;10(9):875-895.
2. Rang HP, Dale MM, Ritter JM, Flower RJ, Henderson G. Rang and Dale’s Pharmacology. 7th ed. London: Churchill Livingstone; 2007.
3. Murphy K. Janeway’s Immuno Biology. 8th ed. New York:Garland Science; 2012. 4. Bodey GP, Buckley M, Sathe YS, Freireich EJ. Quantitative Relationships Between Circulating Leukocytes and Infection in Patients with Acute Leukemia. Annals of Internal Medicine 1966 Feb;64(2):328-340.
5. Huoi C, Vanhems P, Nicolle M-C, Michallet M, Bénet T. Incidence of Hospital-Acquired Pneumonia, Bacteraemia and Urinary Tract Infections in Patients with Haematological Malignancies, 2004-2010: A Surveillance-Based Study. PLOS ONE 2013 Mar;8(3).
6. Kjellander C, Björkholm M, Cherif H, Kalin M, Giske CG. Hematological: Low all-cause mortality and low occurrence of antimicrobial resistance in hematological patients with bacteremia receiving no antibacterial prophylaxix: a single-center study. European Journal of Haematology 2012;88:422-430.
7. Wisplinghoff H, Seifert H, Wenzel RP, Edmond MB. Current Trends in the Epidemiology of Nosocomial Bloodstream Infections in Patients with Hematological Malignancies and Solid Neoplasms in Hospitals in the United States. Clinical Infectious Diseases 2003;36:1103-1110.
8. Costa SF, Miceli MH, Anaissie EJ. Mucosa or skin as a source of coagulase-negative staphylococcal bacteraemia?. The Lancet Infectous Diseases 2004 Maj;4:278-286. 9. Nouwen JL, van Belkum A, de Marie S, Jaqueline S, Wielenga JJ, Kluytmans JAJW, Verbrugh HA. Clonal Expansion of Staphylococcus epidermidie Strains Causing Hickman Catheter-Related Infections in a Hemato-Oncologic Department. Journal of Clinical Microbiology 1998 Sep;36(9):2696-2702.
10. Ryan KJ, Drew WL. Pathogenic Bacteria. In: Ryan KJ, Ray CG, editors. Sherris Medical Microbiology. 5th ed. New York: McGraw-Hill; 2010. p. 440-441.
17
11. Otto M. Staphylococcus epidermidis – the “accidental” pathogen. Nat Rev Microbiol. 2009 Aug;7(8):555-567.
12. Ahlstrand E, Persson L, Tidefelt U, Söderquist B. Alteration of the coagulase-negative staphylococci in patients undergoing treatment for hematological malignancy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2012;31:1679-1687.
13. Thomas JC, Vargas MR, Miragaia M, Peacock SJ, Archer GL, Enright MC. Improved Multilocus Sequence Typing Scheme for Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Microbiology 2007 Feb;45(2):616-619.
14. Miragaia M, Thomas JC, Couto I, Enright MC, de Lencastre H. Inferring a Population Structure for Staphylococcus epidermidis from Multilocus Sequence Typing Data. Journal of Bacteriology 2007 Mar;189(6):2540-2552.
15. Li M, Wang X, Gao Q, Lu Y. Molecular characterization of Staphylococcus epidermidis strains isolated from a teaching hospital in Shanghai, China. Journal of Medical Microbiology 2009;58:456-461.
16. Widerström M, McCullough CA, Coombs GW, Monsen T, Christiansen KJ. A Multidrug-Resistant Staphylococcus epidermidis Clone (ST2) Is an Ongoing Cause of Hospital-Acquired Infection in a Western Australian Hospital. Journal of Clinical Microbiology 2012
Jun;50(6):2147-2151.
17. Iorio NLP, Cabolo RF, Azevedo MB, Barcellos AG, Neves FPG, Dmoingues RMCP, dos Santos KRN. Characteristics related to antimicrobial resistance and biofilm formation of widespread methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis ST2 and ST23 lineages in Rio de Janeiro hospitals, Brazil. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 2012;72:32-40. 18. Cherifi S, Byl B, Deplano A, Nagant C, Nonhoff C, Denis O, Hallin M. Genetic characteristics and antimicrobial resistance of Staphylococcus epidermidis isolates from patients with catheter-related bloodstream infections and from colonized healthcare workers in a Belgian hospital. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials 2014;13(20). 19. Ahlstrand E, Hellmark B, Svensson K, Söderquist B. Long term molecular epidemiology of Staphylococcus epidermidis blood culture isolates from patients with haematological malignancies. PLOS ONE 2014 Jun;9(6).
18
20. Giebel R, Worden C, Rust SM, Kleinheinz GT, Robbins M, Sandrin TR. Microbial Fingerprinting using Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS): Applications and Challenges. Advances in Applied Microbiology 2010;71:149-184.
21. Carbonelle E, Beretti J-L, Cottyn S, Quense G, Berche P, Nassif X, Ferroni A. Rapid Identification of Staphylococci Isolates in Clinical Microbiology Laboratories
Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry. Journal of Clinical Microbiology 2007 Jul;45(7):2156-2161.
22. Dubois S, Leyssene D, Chacornac JP, Kostrzewa M, Schmit PO, Talon R, Bonnet R, Delmas J. Identification of a Variety of Staphylococcus Species by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry. . Journal of Clinical Microbiology 2010 Mar;48(3):941-945.
23. Matsuda N, Matsuda M, Notake S, Yokokawa H, Kawamura Y, Hiramatsu K, Kikuchi K. Evaluation of a Simple Protein Extraction Method for Species Identification of Clinically Relevant Staphylococci by by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry. Journal of Clinical Microbiology 2012 Dec;50(12):3862-3866.
24. Wolters M, Rohde H, Maier T, Belmar-Campos C, Franke G, Scherpe S, Aqpfelbacher M, Christner M. MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages. International Journal of Medical Microbiology 2010.
25. Wang YR, Chen Q, Cui SH, Li FQ. Characterization of Staphylococcus aureus Isolated from Clinical Specimens by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry. Biomed Environ Sci 2013;26(6):430-436.
26. Johansson Å, Rhod Larsen A, Skov R, Sundqvist M. Importance of a Diverse Isolate Collection When Defining Genotype-Specifik Mass Spectra in Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Microbiology 2014 Jul;52(7):2738-2739.
27. Bland M. An introduction to medical statistics. 3rd ed. New York: Oxford University Press;2006.
19
28. Josten M, Reif M, Szekat C, Al-Sabti N, Roemer T, Sparbier K, Kostrzewa M, Rohde H, Sahl H-G, Bierbaub G. Analysis of the Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization –Time of Flight Mass Spectrum of Staphylococcus aureus Identifies Mutations That Allow
Differentiation of the Main Clonal Lineages. Journal of Clinical Microbiology 2013 Jun;51(6):1809-1817
