Institutionen för Kemi och Biomedicin
Examensarbete
Har endocannabinoider skyddande effekter vid Alzheimers sjukdom?
Marwa Salem
Huvudområde: Farmaci Nivå: Grundnivå Kurskod: 2FA01E
2 Har endocannabinoider skyddande effekter vid Alzheimers
sjukdom?
Marwa Salem
Examens Examensarbete i farmaci, 15 hp Filosofie kandidatexamen
Farmaceutprogrammet 180 hp Linnéuniversitet, Kalmar
Handledare:
Thomas Näsström
Biträdande lektor, Med Dr Examinator:
Sven Tågerud
Professor
Sammanfattning
Bakgrund:
Alzheimers sjukdom (AD) är en av de vanligaste former av demenssjukdomar. Sjukdomen karaktäriseras av hjärnatrofi och minnesförlust. Sjukdomen drabbar människor i ålder 65 år och uppåt.
150 000 patienter i Sverige som har demenssjukdom, varvid 90 000 personer har diagnostiserats till AD.
Det finns två huvudtyper av Alzheimers sjukdom, den mest vanliga är senil demens vilken utgör 97 % av fallen. Förekomsten av AD karakteriseras av förhöjda beta-amyloid nivåer i hjärnan. Där beta amyloid aggregerar och blir toxiskt samt medför skador på nervceller och dess signaler. Syfte: Syftet med arbetet var att studera rådande forskningsläge gällande endocannabinoider och deras potentiella effekter vid Alzheimers sjukdom. Utifrån syftet ställdes frågeställningar upp, Hur verkar endocannabinoider vid Alzheimers
sjukdom? Vilken terapeutisk potential har endocannabinoider vid AD? Metod: Olika databaser bland annat PubMed använts för att hitta information om Endocannabinoider och Alzheimers sjukdom. Resultat:
Studierna visade betydelse för närvaro av endocannabinoider och dess skyddande effekt på råttor, cellmodeller samt prover från post mortem patienter med AD. I studie 1 visades olikheter hos människor och råttor i de receptorerna som var viktiga vid fettsyraamid hyrdolas (FAAH) reglering. Det främsta receptorn i FAAH reglering hos råttans hjärna var cannabinoid receptor typ 2, däremot var cannabinoid receptor typ 1 receptor viktig i människans hjärna. Dessa olikheter kan bero på de olika isoformerna av FAAH som uttrycks hos människor till skillnad från det som uttrycks hos råttor. Och det resulterade stimulering av anandamidnedbrytning i humana kontrollprover. Resterande studier visade att hämningen av FAAH ökade anandamidnivåer. Det visade också anandamids möjlighet för skyddande effekter såsom neuroprotektiva, antiinflammatoriska och antioxidativa effekter. Endocannabinoider kan skydda lysosomer från amyloidtoxicitet in-vitro. I studie 2 till skillnad från andra studierna, visades minskningar av amyloid precursor proteinnivåer hos möss som saknade FAAH. Det resulterade minskningar i neuritiska plack som vanligen bildas vid AD. Slutsats:effekter av endocannabinoider hos råttor, cellkulturer samt hjärnstam från post mortem patienter visade ha neuroprotektiv effekt och kan därmed anses inneha en viktig roll i
patogenesen av AD. Effekterna av de utvalda studierna var gjorda på möss, råttor och cellmodell då detta kan försvåra att bevisa och dra en slutsats gällande hur endocannabinoider kan agera hos människor.
Inst. för kemi och biomedicin Linnéuniversitetet i Kalmar SE-391 82 Kalmar
S E
- 3 9 1 8 2 K a l m a r
S E
- 3 9 1 8 2 K a l Inst. för kemi och biomedicin
Linnéuniversitetet i Kalmar SE-391 82 Kalmar
Summary
Background: Alzheimer’s disease (AD) is the one of the most common forms of dementia disease. Alzheimer’s disease is characterized by brain atrophy and memory loss. One of the highest risk factors of developing AD is old age, and it often debuts at around 65 years of age. Out of 150 000 patients in Sweden having dementia, 90 000 are diagnosed with AD.
There are several main types of Alzheimer’s disease; the most common is senile dementia, which constitutes 97 % of cases.
Elevated beta amyloid levels in the brain characterize the presence of AD, where the beta amyloid aggregates and becomes toxic as well as causes damage to nerve cells and its signals. Hyperphosphorylation of tau-protein is also one of the reasons for presence of AD. High Fatty acid amide hydrolase (FAAH) activity can result in more pro inflammatory molecules.
Objective: the aim of this study was to investigate current research on
endocannabinoid’s and their potential effects in Alzheimer’s disease. Based on the aim of the study questions were raised. How do endocannabinoids affect Alzheimer’s disease and which therapeutic potential do endocannabinoids have?
Method: Various databases including PubMed were used to find information about Endocannabinoid’s and Alzheimer’s disease.
Result: The studies revealed presence of endocannabinoids in-vivo and in-vitro as well as its protective effect on rats, cell cultures and brain from post-mortem patients.
Study1 showed that cannabinoid receptor type1 is important for FAAH regulation in human brain, while cannabinoid receptor type2 is important in rat brain for FAAH regulation.
Inhibition of FAAH showed decreasing anandamide hydrolysis, with anandamide previously shown to exhibit neuroprotective and anti-oxidative effects.
The results from study 4 showed endocannabinoids prevent lysosomes from beta amyloid toxicity.
Conclusion: The studies showed effects of endocannabinoids, and these levels were decreased in AD patients. The effect of endocannabinoids was seen on mice, rats and cell models, which can make it difficult to draw a conclusion about how
endocannabinoids can act in humans.
It is still unclear how endocannabinoids as drug targets can work on humans.
With more knowledge and trials on humans it might open the way to use endocannabinoids as therapeutic drugs for treatment in AD.
Förord
Detta examensarbete motsvarar 15 högskolepoäng och gjordes inom ämnet farmaci under vårterminen 2018, omfattar 10 veckors arbete. Arbetet ingår i
Farmaceutprogrammet på Linnéuniversitet i Kalmar.
Ett stort tack till min handledare Thomas Näsström som har stöttat mig under arbetets gång med hans vägledning och positiva inställning. Samt vill jag tacka min kära familj och vänner som har motiverat mig under hela utbildningen.
Malmö, 2018-05-21 Marwa Salem
Förkortningar
Aβ – Amyloid-beta
ACDS-ADL – Alzheimer’s Disease Cooperative Study-Activities of Daily Living AD - Alzheimer’s Disease
ADAS-cog - Alzheimer's disease Assessment scale APOE – Apolipoprotein E
APP- Amyloid precursor protein FAD - Familjär Alzheimers sjukdom MMSE – Mini-mental State examination
ICD- international statistical classification of diseases and related health problems MAPK- Mitogenaktiverad proteinkinas
NINCDS-ADRDA- National institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke Alzheimer Disease and Related Disorders Association
PSEN- presenilin
MWM- Moris Water Maze
ELISA- Enzyme linked immunosorbent assay FAAH- Fatty acid amide hydrolase
CB1- Cannabinoid receptor typ 1 CB2- Cannabinoid receptor typ 2 AEA- Anandamid
2-AGA- 2 arachidonoylglycerol Nb- Numb
NCT-Nicastrin
Innehållsförteckning
Summary ... 3
Förkortningar ... 5
Introduktion ... 7
Orsaker ... 8
Symtom ... 10
Diagnos ... 10
Tester för att mäta minne och kognitiv förmåga ... 11
ADAS-cog ... 11
MMSE testet ... 11
Klocktest ... 11
Morris Water Maze ... 12
Behandling ... 12
Endocannabinoidsystemet... 12
Endocannabinoidsystemet vid AD ... 13
Syfte ... 14
Frågeställningar ... 14
Material och metod ... 14
Resultat ... 15
Studie 1 ... 17
Studie 2 ... 18
Studie 3 ... 19
Studie 4 ... 20
Studie 5 ... 21
Diskussion ... 23
Slutsats ... 26
Referenser: ... 27
Introduktion
Alzheimers sjukdom (AD) är en av flera progressiva neurodegenerativa sjukdomar och är den vanligaste orsaken till demens (Bedse et al. 2015). Alzheimers sjukdom upptäcktes av den tyske läkaren Alois Alzheimer i början av 1900-talet, då han märkte den tidiga presenila formen hos en människa som var yngre än 45 år gammal.
Alzheimers sjukdom är en av de vanliga dödsorsakerna efter hjärtsjukdomar, cancer och slaganfall. Livslängden minskas med en tredjedel för personer med AD;
sjukdomen uppkommer gradvis och försämras med tiden.
Alzheimers sjukdom är en åldersrelaterad sjukdom och det finns ungefär 150 000 patienter i Sverige som har demenssjukdom, varav 90 000 patienter har
diagnostiserats med AD. Prognoser visar att år 2050 kommer antalet drabbade av AD att ökas ungefär dubbelt så mycket i Sverige (Ekman et al. 2011). Cirka 35,6 miljoner människor i världen drabbas av AD, och förekomsten av sjukdomen förväntas
påverka cirka 115 miljoner år 2050 (Bedse et al. 2015). Det blir svårt för de anhöriga att leva med någon med en sådan kronisk sjukdom. De flesta patienter med
demenssjukdom behandlas i öppenvård då de bor hemma och har någon av familjen som kan hjälpa. De anhöriga kan vara till stor hjälp genom att de blir de första som förstår sjukdomen och därmed börja ställa mindre krav och inte ha lika stora
förväntningar som tidigare på patienten. Det är till stor hjälp att ha någon anhörig som stödjer den drabbade då det påverkar den psykiska hälsan på ett positivt sätt vilket bidrar till mer trygghet hos den sjuke. Samtidigt kallas denna sjukdom för ¨de anhörigas sjukdom¨ eftersom det blir ökad psykisk påfrestning då anhöriga ägnar stora delar av sina liv åt patienten och förlorar sina vanliga behov som sömn, fysisk aktivitet och andra livsvanor (Ekman et al. 2011).
Det finns två huvudtyper av Alzheimers sjukdom, den mest vanliga är senil demens vilken utgör 97 % av fallen. Senil demens uppkommer hos personer som är över 65 år gamla. Den andra typen är presenil Alzheimers sjukdom som debuterar tidigare i åldern. Åldersgruppen är mellan 60-64 år då prevalensen ligger på 0,4 % och i åldern 50-59 år är prevalensen under 0,1 % dvs. presenil AD är ovanligt (Marcusson et al.
2011).
Det finns en del riskfaktorer associerat med utvecklingen av AD. Hög ålder är en av de största riskfaktorerna följt av ärftlighet. Om en av föräldrarna har/haft AD ökar risken att man blir drabbad av sjukdomen. Andra riskfaktorer som högt blodtryck, diabetes och utbildningsnivå kan också öka risken att få Alzheimers (Svenskt
Demenscentrum). Alzheimers sjukdom är uppdelad i tre olika svårighetsgrader; mild, medelsvår och svår demens där mild fas karaktäriseras av att patienten förstår att han eller hon lider av en sjukdom och har minnessvårigheter. Däremot vid svår demens har stora delar av hjärnan blivit drabbade och patienter upplever bland annat talsvårigheter (Alzheimerfonden).
Orsaker
Alzheimers sjukdom klassificeras i två typer baserat på genetiskt stöd. Den första typen är ärftlig dvs. familjär AD (FAD) och den andra typen är sporadisk AD.
Familjär Alzheimers sjukdom visar tidiga förändringar i hjärnan, medan sporadiska AD-fall oftast utvecklar störning vid senare ålder (Bedse et al. 2015). Familjär Alzheimers sjukdom uppstår då det sker mutationer i de tre generna; Presenilin 1, presenilin 2 och amyloid prekursorproteinet (APP) (Ekman et al. 2011).
Beta amyloid är en peptid som klyvs från ett prekursorprotein APP.
Amyloidprecursorproteinet APP är ett membranbundet protein som har lång extracellulär del och kort intracellulär del och som bildas i alla kärnförande celler i kroppen. Klyvningen av APP sker med hjälp av flera olika enzymer som kallas för sekretaser. Först klyvs APP ut av β-sekretas där den extracellulära delen av APP utsöndras. Efteråt klyvs APP av γ-sektretas i membranet och på så sätt bildas fritt beta amyloid. Det bildas Aβ1-40 eller 1-42-aminosyror (Marcusson et al. 2011).
Amyloidprekursorprotein-genen finns på kromosom 21 och resulterar i duplikationer dvs. med APP-gener på samma sätt som Downs syndrom vilket leder till ökad mängd APP och orsakar då i sin tur ökad halt av beta-amyloid (Marcusson et al. 2011).
Förekomsten av AD karakteriseras av förhöjda beta-amyloidnivåer i hjärnan. Beta amyloid aggregerar och blir toxiskt samt medför skador på nervceller och dess
signaler (Ekman et al. 2011). Den förhöjda nivån av beta amyloid orsakas bland annat av mutationer i APP-genen. Vid mutationer är det lokaliserat nära ställe på APP där sekretaserna klyver beta amyloid eller i mitten av amyloidsekvensen. En
dubbelmutation är lokaliserad innan N-terminal delen av β-amyloid och det kallas den svenska mutationen.Mutationer i APP proteinet gör att β-sekretas och γ-sektretas har lättare att kunna klyva ut APP beta amyloid 1-42, speciellt mutationer i APP716 och APP717 som leder till ökad produktion av beta-amyloid 42 (Aβ42) (Marcusson et al.
2011).
I takt med att det är mycket hydrofoba amyloid-betafragment som klyvs ut kan dessa börja binda till varandra och på så sätt bildas olösliga plack, vilket kan påvisas i vissa regioner i hjärnan. Parallellt med dessa plack som återfinns i hjärnan ser man också att hjärnan förtvinar och blir mindre. Detta orsakas av den omfattande
nervcellsförlusten och det är också denna förlust av celler i hjärnan som är orsaken till symptomen för sjukdomen dvs. minnesproblem och de övriga kognitiva
svårigheterna.De flesta familjära Alzheimers sjukdomar orsakas av presenilinmutationer (Marcusson et al. 2011).
Förekomsten av Alzheimers sjukdom påverkas av genetiska faktorer som kan öka risken för AD. APO lipoprotein E är ett protein som kopplats till stor risk att få Alzheimers sjukdom. Det finns tre varianter av APOE hos individer, nämligen APOE4, APOE3 och APOE2 där APOE4 är mindre vanlig men kan medföra ökad risk att drabbas av Alzheimers sjukdom. APO lipoprotein E-genen har två
uppsättningar som är nedärvd från föräldrarna (Ekman et al. 2011). På ytan av lipoproteiner finns det APO lipoprotein E som har som funktion att ta upp lipoproteiner och dessa APO lipoproteiner bildas i hjärnan. APO lipoproteiner
produceras vid skada i hjärnan så att den ska kunna ta upp kolesterol från nervcellerna som har förstörts, och vidare kunna återbygga nervcellerna med hjälp av
återanvändning av lipoproteiner (Marcusson et al. 2011). APO lipoprotein E fungerar som igenkänningssignaler för receptorer och enzymer (Rang et al., 2014)
Vanliga formen av AD dvs. inte de ärftliga, karakteriseras av neuronal förlust,
nervcellsdegeneration, synaptisk skada tillsammans med extracellulära olösliga plack och intracellulära neurofibriller. En stor del av bevisen bygger på tanken att AD- patogenesen är relaterad till en progressiv ackumulering av amyloid beta-protein på grund av en obalans mellan amyloid beta-produktion, aggregering och clearance (Bedse et al. 2015). Samt kan sjukdomen orsakas av att nervcellerna dör i några områden i hjärnan. Hjärnans storlek påverkas dvs. minskar i storlek och detta sker när hjärncellerna dör och hjärnan skrumpnar (atrofi) (Ekman et al. 2011). Nervcellsförlust är fördelad i hjärnan och drabbar stora områden speciellt hos pyramidala celler som finns i hjärnans cortex. Neuronal förlust påvisas bland annat hos kolinerga,
noradrenerga, serotoninerga och dopaminerga kärnor (Marcusson et al. 2011).
Beta-amyloid stimulerar spleen tyrosine kinas (SYK) tyrosinkinaser och andra kinaser som i sin tur aktiverar mitogenaktiverad proteinkinas (MAPK), samt
transkriptionsfaktorn NF-kappa B (nuclear factor-kappa B) som krävs för
proinflammatoriska cytokiner och reaktiva syrearter (Bedse et al. 2015). Aggregation av beta-amyloid extracellulärt leder till ökad frisättning av fria radikaler intracellulärt, som till exempel reaktiva syreradikaler (ROS) som medför oxidativ stress. Reactive oxygen species (ROS) orsakar toxicitet genom att reagera med proteiner och lipider via oxidation respektive peroxidation (Sun et al. 2015). Beta amyloid framkallar en kaskad av neuroinflammatoriska förlopp vilket resulterar i neurodegenerering.
Inflammationen medieras av bland annat aktivering av gliaceller och mikroglia.
Mikrogliaceller producerar olika cytokiner t.ex. interleukiner som är
proinflammatoriska molekyler. Aktiverade mikrogliaceller ackumuleras vid beta amyloid och aktiverar samt eliminerar aktivt Aβ avlagringar (Bedse et al. 2015).
Förutom aggregation av beta-amyloid och utfällning till senila plack är
hyperfosforylering av tauproteinet vanligt förekommande vid Alzheimers sjukdom.
Tau-proteinet är naturlig fosforylerat och finns i axonet där det stabiliserar de långa axonerna och binder till mikrotubuli. Vid hyperfosforylering av tau-proteinet som sker bland annat i samband med Alzheimers sjukdom påverkas axonala
transportförmågan och bindningen till mikrotubuli påverkas, där det blir ökad tendens till att tau aggregeras, proteinaggregat bildas och formar sig som parade spiralfilament som samlas i neurofibrillära tangles. Detta leder i sin tur till neuronal dysfunktion (Bedse et al. 2015). Notch-1 signaleringsvägen är starkt inblandad i
utvecklingsprocesser, den kontrollerar bland annat neuritisk tillväxt och
långtidsminne. Notch-1 signalvägen aktiveras vid neuronal degenerering för att kunna kompensera det neuronal förlust. Kompensationen sker genom att Notch-1 främjar celltillväxt. Numb (Nb) reglerar Notch-1 vägen negativt genom att göra neuroner mer känsliga för amyloid beta. Detta åstadkoms genom ändring av kalciumhomeostas samt uppreglering av p53-tumörsuppresorproteinet (Tanveer et al. 2012).
Som tidigare nämnts så har γ-sektretas viktiga funktioner bland annat att klyva APP.
γ-sektretas består av presenilin1, presenilin2 och nicastrin (Nct). Nicastrin är ett typ 1 transmembranprotein och det fungerar som receptorplats för substrat samt för
stabilisering av sekretaser. Vid förlust av Nct framkallas en apoptotisk fenotyp (Tanveer et al. 2012).
Symtom
Symtomen märks inte i början av sjukdomsförloppet eftersom Alzheimers utvecklas långsamt. Det vanliga tidiga symtomet som märks är minnessvårigheter dvs. det episodiska minnet som ansvarar för händelseinformationen. Det börjar också
frambringa ångest och oro (Marcusson et al. 2011). Det finns två grupper av symtom, de kognitiva och dessa inkluderar till exempel talsvårigheter och minnesförlust. Andra gruppen av symtom omfattar icke-kognitiva och kan även kallas för psykiatriska symtom och dessa inkluderar agitation, hallucinationer och vanföreställningar (Barage et al.2015). Symtomen varierar beroende på demensens svårighetsgrad. Vid mild demens är minnesstörning ett vanligt symtom och patienten kan uppleva att ha svårt med att uppfatta och förstå komplexa diskussioner samt svårigheter att koppla ihop sin muskelrörelse (dyspraxi). Talstörning är också ett av symtomen i mild demens där patienten har svårigheter att hitta rätt ord (dysfasi) (Marcusson et al. 2011). Vid medelsvår och svårare demens är symtomen allvarligare och patienten börjar ha andra svårigheter som bland annat att kunna räkna, koncentrera sig och inte kan klara sig själv i hemmet. Vid den svårare fasen av demens känner inte patienten igen sina närstående samt klarar inte av att äta eller klä på sig. Under hela sjukdomsförloppet har patienten depression och får därför antidepressiv behandling. I slutstadierna av demensen sköter personal patientens urin- och faeces-inkontinens, och alla symtomen uppträder på grund av en irreversibel förlust av neuron hos AD patienter (Marcusson et al. 2011).
Diagnos
Personer som misstänks ha Alzheimers sjukdom går på en medicinsk utredning för att kunna säkerställa diagnos och få farmakologisk behandling samt eliminera andra sjukdomstillstånd. ICD-10 används för att diagnostisera Alzheimers sjukdom där ICD-10 kriterier utesluter andra demenssjukdomar dvs. andra orsaker till demens.
ICD-10 kriterier visar om Alzheimers sjukdom är i tidig debut dvs. före 65-75 år eller sen debut. Vid tidig debut ser man symtom som dysfasi och dyspraxi jämfört med sen debut där man inte kan se markanta symtom.
ICD-10 kriterierna för Alzheimers sjukdom är följande:
Demens med nedsättning av högre kortikala funktioner samt minne, tänkande, inlärning, orientering, räkneförmåga, förståelse, omdöme och språk.
Patienten får en smygande debut samt långsam försämring av demenssymtomen.
Avsaknad av kliniska tecken på andra typer av sjukdomar som till exempel hypotyreos, hyperkalcemi och vitamin B12-brist.
Patienten har även avsaknad av plötslig debut med fokala neurologiska symtom t.ex. känselnedsättning, synfältsdefekt och ataxi (Marcusson et al.2011).
En annan typ av diagnostik som används för att kunna ställa diagnos för Alzheimers sjukdom är National institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke Alzheimer Disease and Related Disorders Association (NINCDS-ADRDA).
Det framställdes år 1984 av McKhann och andra medarbetare i NINCDS-ADRDA.
Kriterierna grundar sig på exklusionskriterier samt andra kriterier för att på så sätt
säkerställa diagnos för AD och eliminera andra demenssjukdomar. Bland dessa kriterier ingår obligata kriterier t.ex. progressiv demens, avsaknad av konfusion vid diagnostillfället, inträder mellan 40 och 90 års ålder och avsaknad av systemisk sjukdom eller en annan hjärnsjukdom som förklarar symtomatologin.
Det finns även stödjande kriterier som omfattar följande:
Progressiva instrumentella symtom
Försämrad ADL-funktion och förändrat beteende
Exklusionskriterier vid NINCDS-ADRDA är kramper eller gångstörning tidigt under sjukdomstillståndet, plötslig debut med stroke och fokala neurologiska symtom.
Den tredje typen av diagnostik kallas Dubois-kriterier som är baserad på
biomarkörer för att kunna identifiera positiva fynd som visar Alzheimers sjukdom, visar till och med tidigare stadier av sjukdomen. Dessa kriterier grundar sig i ett kärnkriterium dvs. tidig minnesstörning tillsammans med andra stödjande kriterier.
De kriterierna inkluderar progressiv störning av episodiskt minne med duration längre än 6 månader samt kan minnesstörningen vara avskild eller kombinerad med
kognitiva störningar. I stödjande kriterierna krävs magnetisk resonans tomografi (MRT) som är till hjälp att visa atrofi i mediala temporalloben. Den atrofi som finns i mediala temporalloben skall senare värderas i förhållandet till en väl karakteriserad åldersmatchad kontrollgrupp. Samt visar analyser positiv biomarkör dvs. låg beta amyloid och hög tau eller fosforylerat tau (Marcusson et al.2011).
Tester för att mäta minne och kognitiv förmåga
ADAS-cogAlzheimer’s Disease Assessment scale cognition (ADAS-cog) är ett test för att utreda global kognitiv förmåga. Testet är passande för patienter som har mild till måttlig AD.
Elva olika kognitiva delfunktioner kan bedömas med hjälp av Alzheimer’s Disease Assement scale cognition som t.ex. minne, orientering, språkförmåga, förståelse av talat språk och konstruktionspraxis. Testet tar 30-45 minuter (Nordberg et al. 2013).
MMSE testet
För att kunna mäta den kognitiva förmågan hos patienter med AD används även mini mental testet (MMT) eller MMSE. Testet består av både frågor samt enkla uppgifter där frågorna handlar om tid och är tankekrävande uppgifter. Testet används för och kunna kategorisera vilket stadium av kognitiv nedsättning patienten har. Det finns fyra olika stadier beroende på var patienten befinner sig i. De fyra stadierna är:
mycket lindrig (MMSE ≥ 24), lindrig (23≥MMSE≥19), måttlig (18≥MMSE≥13) och svår kognitiv nedsättning (12≥MMSE). Testet är enkelt att genomföra därför kan det användas senare för att följa sjukdomsförloppet. MMSE används tillsammans med andra tester för att fastställa kognitiva funktioner (Nordberg et al. 2013).
Klocktest
Klocktestet innebär att patienten ska rita en klocka som visar tio minuter över elva.
Testet är inte just för demenssjukdom men det hjälper till att mäta de kognitiva
funktionerna, bestämmer således förståelse, tidsuppfattning och konstruktionsförmåga.
Blodprover tas vid misstanke om familjär Alzheimers sjukdom trots att det inte finns direkta blodprov som är diagnostiska. Blodprover för identifiering av APP och PSEN (presenilin) generna utreds med hjälp av DNA-teknik för att se mutationer av generna (Marcusson et al. 2011).
Morris Water Maze
Morris Water Maze (MWM) är en metod för att kunna bestämma rumsligt och långsiktigt minne dvs. minnet och den kognitiva förmågan. Testet utförs på möss och råttor. Det består av 6 dagars försök där råttor/möss placeras i ett stort vattenbad med samma temperatur varje dag. I vattenbadet finns en dold plattform placerad under vattenytan. Möss fick simma i 60 sekunder, när de hittat den dolda plattformen så får de sitta kvar där i 5 sekunder. Första dagarna är plattformen synlig därefter dag 2-5 byts det till dold plattform (Bromley et al.2011).
Behandling
Läkemedel som används vid Alzheimers sjukdom är kolinesterashämmare som till exempel donepezil, rivastigmin och galantamin (Eriksson et al.2018). Dessa kolinesterashämmare verkar genom att hämma enzymet acetylkolinesteras, detta enzym bryter ner signalsubstansen acetylkolin. Genom att hämma detta enzym så fås en ökad mängd av acetylkolin i de kolinerga synapserna (Marcusson et al., 2011).
Rivastigmin som också är en kolinesterashämmare fast inte selektiv som donepezil eftersom den hämmar både acetylkolinesteras och buturylkolinesteras i hjärnan (Eriksson et al.2018). Hämning av buturylkolinesteras leder till ökad kolinerg aktivitet (Marcusson et al., 2011).Galantamin ökar känslighet hos postsynaptiska receptorer samt en ökad presynaptisk acetylkolinfrisättning genom att galantamin verkar på kolinerga nikotinreceptorer och på så sätt förbättrar de kognitiva funktioner hos patienten med AD. Kolinesterashämmare ges vid lätt till måttligt svår AD.
Extensionsstudier har visat att kolinesterashämmare kan ibland ge effekt efter 2-3 års behandling.
Det finns en annan behandling som är en icke kompetitiv receptorantagonist verkar på NMDA (N-metyl-D-aspartat)-receptorer. Det hämmar på så sätt glutamat eftersom vissa studier har visat att vid Alzheimers sjukdom har nervcellsdegeneration pga. en ökad glutamataktivitet. Det sker genom aktivering av NMDA-receptorer, därför används Ebixa för att minska glutamataktivering och förbättra kognitiva funktioner (Marcusson et al., 2011) (”Ebixa - FASS Vårdpersonal”).
Endocannabinoidsystemet
Det endocannabinoida systemet består av två olika G-proteinkopplade
membranreceptorer där CB1-receptorer finns i flera vävnader framförallt i nerver, till skillnad från CB2-receptorer som är begränsade till celler som finns i immunsystemet (Benito et al. 2007).
Det aktiveras när det blir en avvikelse från homeostas i kroppens funktioner då det börjar reagera genom att syntetisera endocannabinoider då de fungerar som
neurotransmittorer. Endocannabinoidernas uppgift är hjälpa kroppen att uppnå homeostas (Alger et al. 2013).Endocannabinoider produceras naturligt i kroppen.
Cannabisväxter producerar cannabinoider i form av delta-9 tetrahydrocannabinol (THC) (Karl et.al. 2012)
Endocannabinoidsystemet består av endogena ligander, arakydonyletanolamin (anandamid) som isolerades först år 1992 och 2-arakidonoylglycerol (2-AG). Dessa endogena ligander skiljer sig som lipofila föreningar vilket i sin tur leder till
skillnader i deras egenskaper som endogena agonister för endocannabinoidreceptorer.
2-arakidonoylglycerol är en agonist för CB1 och CB2 receptorer. Däremot är
anandamid en partiell agonist för CB1-receptorer samt svag partiell agonist-antagonist för CB2-receptorer (Pazos et al. 2004).
Både anandamid och 2-AG frisätts från postsynaptiska neuron och tas upp av presynaptiska neuron. Transporten av endocannabinoider sker framförallt genom ämnen tar sig över cellmembranet från område med hög koncentration till en med låg koncentration eller transporteras med hjälp av en specifik transportör. Efter diffusion kommer substanserna att binda till endocannabinoida receptorer (CB1 och/eller CB2) (Rang et al., 2014)
Cannabinoid receptor typ 1 uttrycks framför allt i pre-synaptiska neuroner i hjärnan och bidrar till olika effekter såsom ökad aptit, minskat illamående, balans i hjärnan samt modulation av stress och ångest (Pacher et al. 2013). Däremot CB2 förekommer på immunceller i perifer vävnad och uttrycks vid aktivering av mikroglia i det centrala nervsystemet. Tidigare studier visade att cannabinoidreceptorer finns i specifika B- lymfocyter, mjälte och lymfkörtlar. Andra studier visade att aktivering av CB2- receptorer kan ändra flera immunrelaterade variabler samt har CB2-receptorer påverkan på inflammatoriska processer som påverkar hjärnan (Pazos et al. 2004).
Endocannabinoidsystemet vid AD
De senaste studierna har visat att det endocannabinoida systemet (CB1 och CB2- receptorer) spelar en stor roll vid AD. Cortex och hippocampus är två av de
hjärnregionerna som drabbas av sjukdomen. Dessa regioner är viktiga för bland annat lärandet och minnesfunktionen. CB1-receptorer befinner sig i stor mängd i cortex och hippocampus. Vid en aktivering av CB2-receptorer som är lokaliserade på gliaceller så minskas produktionen av flera viktiga pro-inflammatoriska molekyler samt kommer inte mikrogliaceller att kunna aktiveras. Detta leder till ökad eliminering av Aβ och Aβ kan på så sätt minska. Cannabinoider har bland annat visat sig ha
neuroprotektiv, antioxidativ och antiinflammatorisk effekt (Bedse et al. 2015).
Studierna har även visat att beta amyloid inducerad neurotoxicitet kan förhindras via en anandamid CB1 medierad mekanism. Anandamid inaktiveras av enzymet
fettsyraamid hydrolas (FAAH) till arakidonsyra och etanolamin. Arakidonsyra kan omvandlas till prostaglandiner som i sin tur ökar pro-inflammatoriska molekyler.
Detta sker i astrocyter. (Bedse et al. 2015).Endocannabinoider har en neuroprotektiv egenskap då det binder och aktiverar CB receptorer (Bisogno et al. 2008).
Genom dessa vetenskapliga fynd är det därmed intressant att undersöka
endocannabinoiders terapeutiska potential, vilket detta examensarbete syftar till att försöka besvara.
Syfte
Syftet med arbetet var att studera rådande forskningsläge gällande endocannabinoider och deras potentiella effekter vid Alzheimers sjukdom.
Frågeställningar
1. Hur verkar endocannabinoider vid Alzheimers sjukdom?
2. Vilken terapeutisk potential har endocannabinoider vid AD?
Material och metod
Studien baseras på vetenskapliga artiklar som söktes i databasen PubMed år 2017 november med sökord ”Alzheimer`s disease” AND ”Endocannabinoid” där 20
artiklar hittades. Av dessa 20 artiklar valdes endast orginalartiklar ut för vidare analys i detta litteraturarbete. Utvalda artiklar fick inte vara publicerade innan 2010. För detta litteraturarbete exkluderades artiklar innehållandes patientprover från sekundära sjukdomar såsom stroke, cancer och diabetes. Litteraturstudien inkluderade studier gjorda på möss, råttor och humana primärkulturer.
Resultat
Studie Syfte Deltagare Resultat
Studie 1
Normal aging in rats and
pathological aging in human
Alzheimer’s disease decrease FAAH activity:
Modulation by cannabinoid agonists.
(Pascual et al.
2014)
Undersöka
anandamidnedbrytning samt dess reglering genom CB1 och CB2 receptorer
Post-mortem prover från18 patienter undersöktes, varav 9 AD patienter och 9 kontrollpatienter . Andra delen av studie var vuxna och gamla råttor
Resultatet visade membran-
associerad anandamid-
hydrolys minskade signifikant med 32
%. Aβ påverkade fettsyraamid hydrolas (FAAH) aktivitet och minskade det med 76 %.
Minskning av anandamid- hydrolys med 66
% hos en vuxen råtta jämfört med hos de åldrande råttorna där minskningen var med 83 % pga.
närvaro av FAAH hämmare.
Studie 2
Endocannabinoid regulation of amyloid-induced neuroinflammatio n
(Vázquez et al.
2015)
Utvärdera
farmakologiska effekter och genetiska
inhiberingen av
anandamidnedbrytande enzymer FAAH hos en musmodell av AD.
Möss med 5xFAD mutationer.
Mössen var 6 månader gamla
Resultat visade att inaktivering av FAAH
motverkade minnesunderskotte t hos möss med 5xFAD mutation samt uppvisades signifikant förhöjning av inflammatoriska cytokiner. Vid CB1 receptor antagonist sågs signifikant ökning av COX-2.
Studie 3
An amyloid β42-
Undersöka
endocannabinoider som
38 frysta hjärnor post mortem
Uppvisade statistiska Tabell 1. Sammanfattning av de 5 studierna
in anandamide mobilization is associated with cognitive dysfunction in Alzheimer’s disease (Jung et al. 2012)
post mortem patienter med AD
kontrollpatienter . AD patienter var 80,5 ± 1,2 år gamla och kontrollpatienter var 80,4 ± 2,1
kontrollgruppen och AD patienter på nivåer av anandamid i midfrontal cortex samt höjningar av FAAH hittades i temporal cortex hos AD patienter.
Studie 4 The
Endocannabinoid, Anandamid, Augments Notch- 1 Signaling in Cultured Cortical Neurons Exposed to Amyloid-β and in the Cortex of Aged Rats (Tanveer et al.
2012)
Undersöka
endocannabinoider, anandamid och 2- arakidonoylglycerol på Notch-1 vägen i en in vitro-modell av AD
1 dag gammal Wistar råtta, dess cerebrala cortex användes i studie.
Anandamid uppreglerade Notch-1
signaleringen samt ökade ”site” 2- klyvning av Notch-1
Studie 5
Endocannabinoids Prevent β-
Amyloid- mediated Lysosomal Destabilization in Cultured Neurons (Noonan et al.
2010)
Syftet var att studera om endocannabinoider har skyddande effekter för lyosomer mot Amyloid- β toxicitet samt mot membranpermeabiliserin g
Cellkultur av kortikala neuroner
Visade en ökning av andelen apoptotiska celler från 2,7 ±0,4 % i kontrollcellerna till 22,38 ± 2,5 % efter behandling med Aβ (2μM, 48 tim).
Studie 1
Normal aging in rats and pathological aging in human Alzheimer’s disease decrease FAAH activity: Modulation by cannabinoid agonists
(Pascual et al. 2014) Syfte
Syftet med studien var att undersöka anandamidnedbrytning samt dess reglering genom CB1 och CB2 receptorer hos både råttor och äldre människor med Alzheimers sjukdom.
Metod och deltagare
Studien utfördes först hos människor där prover från främre cortex togs från avlidna patienter med Alzheimers sjukdom och från en kontrollgrupp där patienterna inte hade någon form av klinisk neuropsykiatrisk sjukdom.
Totalt var det 18 patienter som undersöktes varav 9 AD-patienter och 9 personer i kontrollgruppen. Det var mest kvinnor i båda grupperna. Patienterna som hörde till kontrollgruppen var mellan 60-89 år gamla jämfört med patienter som ingick i AD gruppen, vilka var mellan 64-90 år gamla. Patienterna i båda grupperna hade olika dödsorsaker.
Andra delen av studien var att undersöka anandamidnedbrytning hos råttor. Både hanar och honor Wistar-stam råttor användes för försöket. Vuxna råttor som var 4 månader gamla och åldrande råttor 28 månader gamla avlivades genom dekapitering.
Cerebral cortex togs och direkt analyserades dvs. 2-4 minuter efter avlivningen av råttorna. Sen lagrades proverna vid -80 °C tills de används vid försöket.
Resultat
Anandamidhydrolysen analyserades i AD-prover och visade att membranassocierad anandamidhydrolys minskade signifikant med 32 % i jämförelse med
kontrollgruppen. I de humana proven från det främre cortexmembran visade en minskning av anandamid-nedbrytning hos patienter med Alzheimers sjukdom samt i det humana kontrollmembran med Aβ1-40 (1 μM) i jämförelse med normala
individer. Resultatet visade att Aβ påverkade fettsyraamid hydrolas (FAAH) aktivitet och minskade det med 76 %. Halter av fettsyraamid hydrolas i membranfraktioner från både kontrollpatienter och AD-patienter visade ingen förändring. Effekten vid behandling med FAAH-hämmaren URB597 (0,1 μM) visade en minskning av
anandamid-hydrolytisk aktivitet med 64 % hos human kontrollgrupp samt minskning av anandamid-nedbrytning med 54 % i human AD-hjärna. Minskning av anandamid- hydrolys pga. närvaro av FAAH hämmaren med 66 % hos en vuxen råtta i det
kortiskta membranet. Det visade också en minskning med 83 % anandamid-hydrolys i de åldrande råttorna.
Resultatet visade att det fanns andra enzymer vilka var involverade i anandamid- katabolism hos både råtta och humana cerebrala cortex utöver FAAH.
Vid närvaro av en selektivt samt blandad CB1/CB2 agonister påverkade anandamid- hydrolysen. Vid en selektiv CB2-agonist stimulerades anandamid-hydrolys med 11 % i den humana kontrollgruppen medan inga förändringar visades i humana AD-hjärnor.
Hos vuxna råttor sågs en minskning av anandamid-hydrolysen med 42 % i det cerebrokortiska membranet jämfört med synaptosomer som hade minskning av anandamid-hydrolys med 89 %. Däremot hade en blandad CB1/CB2- agonist annorlunda effekter. Det inhiberade 34 % av anandamid-hydrolys hos
kontrollgruppen samtidigt som den ökade anandamid-hydrolys med 23 % i AD- humana hjärnor. Anandamidhydrolysen minskade hos båda de vuxna och åldrande råttor med 63 % i vuxna råttors membran jämfört med åldrande membran som minskade med 41 %.
Studie 2
Endocannabinoid regulation of amyloid-induced neuroinflammation (Vázquez et al. 2015).
Syfte
Syftet med studien var att utvärdera den farmakologiska effekten samt genetiska inhiberingen av anandamidnedbrytande enzymer hos en musmodell av AD.
Material och deltagare
Detta var en djurbaserad studie där möss användes som uttryckte 5 familjära AD- mutationer 5xFAD. Möss som hade mutation (deletion) av genen för FAAH parades med 5xFAD möss i 10 generationer.
Mössen var 6 månader gamla, tidigare studier har visat att störningen i 5xFAD upptäcktes först vid 6 månaders ålder hos möss. Dessa möss har alltså 5 mutationer som bidrar till en aggressiv förekomst av plack i hjärnan samt nervcellsförlust.
Försöksprotokollet följde de europiska reglerna för skydd av försöksdjur.
Mössen injicerades med föreningar innehållande FAAH-hämmare och CB1
receptorantagonist 12 dagar i rad. På åttonde dagen av behandlingen testades mössen med Moris water maze testet (MWM). Moris water maze användes för och studera minnet och rumsuppfattningen hos möss. Under 4 dagar i rad fick mössen 4 försök per dag att simma i 60 sekunder på grumligt vatten mot väggen från 4 olika
positioner. Det placerades en dold plattform under vattennivå under hela försöket samt ledtrådar användes såsom proximala och distala ledtrådar för att hitta plattformen.
I slutet av studien avlivades möss samt hjärnor isolerades ut där hälften hjärnhalvorna frystes direkt i isopentan och bevarades tills det analyseras. Däremot nedsänktes den andra hjärnhalvan i 4 % paraformaldehyd i fosfatbuffrad saltlösning och nedbäddad i paraffin för senare histologiska studier. Hjärnan undersöktes efter förekomsten av plack. Andra metoder som användes var att mäta cytokiner och amyloida proteiner med hjälp av enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) metoden samt bestämma endocannabinoidnivån i hjärnan. Bestämning av amyloid-relaterade proteiner gjordes med hjälp av Western blot. Western blot är molekylärbiologisk metod som nyttjas för att identifiera proteiner genom antikroppar.
Resultat/Diskussion
Resultatet visade att genetisk inaktivering av FAAH motverkar minnesunderskottet hos 5xFAD möss. Det visade en signifikant förbättring av 5xFAD/FAAH möss av deras förmåga att få rumsligt minne som var mer tydligt under de sista 2 dagarna av försöket. De specifika CB1 antagonisterna hade inte samma effekt som den genetiska deletionen av FAAH. Nivåerna av flera inflammatoriska cytokiner visade en
signifikant förhöjning som konsekvens av sjukdom där 5xFAD möss hade ökade mRNA nivåer samt TNFa (”tumor necrosis factor-alpha”) i hippocampus. Vid behandling med CB1 receptor antagonist sågs signifikant ökning av COX-2
(cyklooxygenas-2) däremot påverkades inte expressionen av COX-2 vid sjukdomen.
Amyloid orsakade ett inflammatoriskt svar i hippocampus som var signifikant försämrat i 5xFAD möss. Nivåerna av cytokiner analyserades med hjälp av ELISA och visade en signifikant ökning av IL1 beta (interleukin1 beta) i cortex hos 5xFAD möss. Inga signifikanta ändringar av IL6 sågs hos 5xFAD och 5xFAD/FAAH möss.
Ytterligare utredningar i det hippocampala området hos 6 månader gamla 5xFAD möss visade höga halter av amyloida plack.
Hos 5xFAD/FAAH möss hittades signifikanta minskningar av neuritisk plack.
Nivåerna av APP (amyloid precursor protein) minskade signifikant som en följd av FAAH genetisk inaktivering. När hjärnnivåerna bestämdes märktes att den
farmakologiska behandlingen med FAAH-inhibering innebar signifikanta ökningar av anandamid och palmitoyletanolamidnivåer.
Studie 3
An amyloid β42 – dependent deficit in anandamide mobilization is associated with cognitive dysfunction in Alzheimer’s disease. (Jung et al. 2012)
Syfte
Syftet med studien var att undersöka om endocannabinoid uppträder i hjärnan hos post mortem patienter med AD.
Metod och deltagare
Totalt undersöktes 38 frysta postmortem hjärnor med AD och 17 kontrollpatienter.
Det var 10 män och 7 kvinnor i kontrollgruppen, AD gruppen var 20 män och 18 kvinnor. Tre delar av hjärnan användes för undersökning, dessa områden var cerebellum, midfrontal cortex och temporal cortex. Prover från post mortem
kontrollgruppen passade ihop med AD i ålder och i post mortem intervall se tabell 1.
Tabell 1. Patienters ålder och post mortem tid, medelvärden ± sem (”standard error of the mean”).
Ålder (år) Postmortem tid (timmar) AD patienter 80,5 ± 1,2 4,5 ± 0,4 Kontrollgrupp 80,4 ± 2,1 4,2 ± 0,3
Fallen med AD testades med hjälp av kriterierna för Alzheimers sjukdom. Mini- mental State Examination (MMSE) användes vid bestämning av den kognitiva funktionen.
Cellodling användes som en av metoderna. En annan metod var att extrahera lipider från vävnader. Lipider extraherades från celler i cellkulturer. Andra markörer som användes för mått var ELISA, Western blot och PCR (”polymerase chain reaction) analyser.
Resultat
Resultatet visade ingen påverkan av ålder, kön och post mortemintervall på
anandamid. Emellertid statistiska skillnader hittades mellan kontrollgruppen och AD patienter på nivåer av anandamid i midfrontal cortex P= 0,047 och temporal cortex (P=0,034) däremot inga skillnader upptäcktes i cerebellum. Anandamidnivåer hade sänkts. Förhöjningar av FAAH hittades i mRNA-nivåer i temporal cortex hos patienter med AD men denna förhöjning var inte statistiskt signifikant.
Det fanns inga samband mellan nivåer av anandamid i midfrontal cortex och MMSE- testet. Samtidigt så har nivåerna av 2-AG och palmitoyletanolamid inte heller
samband med dessa tester.Resultatet visade även höga koncentrationer av de lösliga samt de olösliga formerna av Aβ42 och Aβ40 hos AD patienter i midfrontala cortex jämfört med kontrollgruppen.
Det hittades några signifikanta korrelationer mellan anandamid och Aβ40 däremot upptäcktes en negativ korrelation mellan anandamid och Aβ42 vilket då bidrog till försämring av anandamid i hjärnan och ledde i sin tur till kognitiv dysfunktion i Alzheimer sjukdom.
Studie 4
The Endocannabinoid, Anandamid, Augments Notch-1 Signaling in Cultured Cortical Neurons Exposed to Amyloid-β and in the Cortex of Aged Rats
(Tanveer et al. 2012) Syfte
Syftet med studien var att undersöka endocannabinoid, anandamid och 2-
arakidonoylglycerol på Notch-1 vägen och deras endogena reglering i en in vitro- modell av AD.
Metod och deltagare
Material som användes i denna studie var en cellkultur av kortikala neuroner. Wistar råtta som var 1 dag gammal avlivades genom dekapitering. Cerebrala cortex togs och dissekerades. Andra metoden var behandling av kortikala neuron med amyloid β1-42
och amyloid β42-1. Cellerna utsattes för Aβ1-42 i båda närvaro av endocannabinoid samt avsaknad av det för och utvärdera Notch-1 signalering.
Annan metod som tillämpades var att injicera levande råttor. Det var Wistar råttor, unga råttor som var 3 månaders gamla och vägde 250-350 g och åldrande råttor som var mellan 26-30 månader och vägde 550-600g. Råttorna delades i två grupper där en grupp fick fettsyraamid hydrolas hämmare i subkutan injektion varannan dag.
Samtidigt fick vehikelkontroller 30 % DMSO saltlösning också varannan dag i 28 dagar.
Western blot användes också samt kvantifiering av amyloid β1-42 med hjälp av sandwich immunoassay.
Resultat
Resultatet visade att i de odlade kortikala neuronerna att anandamid uppreglerade Notch-1 signaleringen. I de primära odlade neuroner som behandlades med
anandamid 10 nM eller 2-arakidonoylglycerol 10 nM uppvisades en ökning av ”site”
2-klyvning av Notch-1 receptorn. Det upptäcktes att anandamid och hämmaren av FAAH URB597 ökade Notch-1 receptorklyvning.
Anandamid ökade Nicastrinfluorescens signifikant från 160 ±9 (medelvärde ± sem) enheter till 237 ± 16 enheter.
Amyloid β1-42 ökade Nb-uttryck (Numb-uttryck) hos de odlade kortikala neuronen.
Det ökade Nb-uttrycket förhindrades med hjälp av 2-arakidonoylglycerol och anandamid.
Studie 5
Endocannabinoids Prevent β-Amyloid-mediated Lysosomal Destabilization in Cultured Neurons
(Noonan et al. 2010) Syfte
Syftet med studien var att bevisa endocannabinoidsystemet kan stabilisera lysosomer mot Aβinducering. Och att bevisa intracellulära CB1-receptorer har en viktig roll för stabilisering av lysosomer mot Amyloid-toxicitet.
Metod och deltagare
Material som användes i denna studie var en cellkultur av kortikala neuroner. Wistar råtta som var 1 dag gammal avlivades genom dekapitering. Cerebrala cortex togs och dissekerades.
Skyddande effekt av CB1-receptorer analyserades med hjälp av användandet av olika antagonister som till exempel SR 141716A. Det användes lyosomal Integrity Assay
och Kathepsin D lokalisering. Kathepsin D är en typ av lysosomala proteaser.
Kathepsin L aktivitet mättes också.
Resultat
Resultatet av de odlade cellkulturerna uppvisade en signifikant ökning av andelen apoptotiska celler från 2,7 ±0,4 % (medelvärde ± sem) i kontrollcellerna till 22,38 ± 2,5 % (P<0.001, ANOVA, n=5) efter behandling med Aβ 2 μMunder 48 timmar och det förhindrades av kaspas-3 hämmare. Det visade också endocannabinoiders förmåga att stabilisera lysosomer vid amyloid beta 2μM i 48 timmar. Stabiliseringen skedde genom att förhindra Aβ från att framkalla tumörsuppressorproteinet p53.
Diskussion
Hur verkar endocannabinoider vid Alzheimers sjukdom?
I studie 1 (Pascual et al. 2014) undersöktes anandamidnedbrytning samt hur nedbrytningen påverkades vid olika omständigheter såsom närvaro av en selektiv FAAH hämmare, CB2 selektiv agonist och blandad CB1/CB2 agonist. Frontala cortex erhölls från 9 AD patienter och 9 kontrollpatienter. Patienterna var mellan 60-89 år.
Andra delen av försöket var på cerebral cortex som hade tagits direkt efter
avlivningen av råttorna. Vuxen råtta var 4 månader gammal och en åldrande som var 28 månader. Resultatet visade anandamidhydrolys ökade hos de åldrande råttorna däremot hittades minskning av de enzymatiska aktiviteterna hos synaptosomala fraktionen med ca 60 % i jämförelse med kontrollgruppen.
Vid närvaro av CB2 agonist minskade anandamidnedbrytning med 42 % i
cerebralkortisk membran hos vuxna råttor och med 89 % i synaptosomer. Det visade även positiv effekt hos åldrande råttor då anandamidnedbrytningen inhiberades med 51 % i synaptosomer samt nedbrytningen upphävdes i membraner (Pascual et al.
2014). Det visar att vid närvaro av CB2 agonister upprätthålls höga nivåer av anandamid vilket i sin tur leder till ökade skyddande effekter som överensstämmer med tidigare studie (Bedse et al. 2015). Däremot ökade en CB2 agonist anandamid- hydrolys med 11 % i human kontrollhjärna men visade ingen förändring i AD gruppen. Anandamidnedbrytning minskade vid närvaro av en kombinerad CB1/CB2 agonist i human kontrollgrupp (Pascual et al. 2014). Detta tyder på att båda
cannabinoidreceptorer kan kontrollera anandamid-hydrolys på olika sätt. De receptorer som anses vara viktiga vid FAAH-reglering hos människor och råttor är olika. Den främsta receptorn i FAAH reglering i råttans hjärna är CB2, däremot är CB1 receptorn viktig i människans hjärna. Dessa olikheter kan bero på de olika isoformerna av FAAH som uttrycks hos människor till skillnad från det som uttrycks hos råttor (Wei et al. 2006). Författaren rapporterar att anandamidtillgängligheten är högre vid minskad FAAH aktivitet i AD hjärna. Författaren föreslår att
cannabinoidagonister kan fungera som en potentiell terapi då det skulle främja höga anandamidnivåer. Det skulle bidra till skyddande effekt pga. dess antiinflammatoriska effekter. Däremot skulle behandling med blandade CB agonister vara skadligt för alzheimerpatienter då det visat öka FAAH aktivitet. Ökad FAAH aktivitet leder till anandamidnedbrytning. När anandamid bryts ner frisätts arakidonsyra som i sin tur omvandlas till prostaglandiner. Prostaglandiner bidrar till pro-inflammatoriska effekter (Bedse et al. 2015).
Studie 1 besvarade inte endocannabinoiders funktion vid Alzheimers sjukdom utan visade hur anandamidnivåer varierade på råttor och på prover från postmortem med AD samt kontrollgrupp. Det finns dock studier som diskuterade endocannabinoidens roll i neurologiska sjukdomar bland annat vid Alzheimers sjukdom (Iannotti et al.
2016). Vid Alzheimers sjukdom minskas CB1 receptorexpression i cortex och hippocampus. Dessa hjärnregioner är ansvariga för lärande samt minnesfunktion.
Fettsyraamid hydrolas (FAAH) enzymet visades öka i prover från postmortem AD hjärna. Ökning av FAAH leder i sin tur till att mer anandamid inaktiveras till arakidonsyra och etanolamin (Iannotti et al. 2016).
I studie 2 (Vázquez et al. 2015) studerades farmakologisk hämning och genetisk inaktivering av FAAH i en djurmodell av AD. Det var möss som studerades, mössen hade 5 familjära AD mutationer 5xFAD. Mössen var 6 månader gamla och fick injektion med FAAH-hämmare och CB1receptorantagonist i 12 dagar. Resultatet visade att genetisk eliminering av FAAH hindrade minnesunderskott hos 5xFAD möss. Det visades också en signifikant förbättring av rumsligt minne hos
5xFAD/FAAH möss. Genom att genetiskt eliminera FAAH enzymet förändrades beta amyloid produktionen vilket ledde till signifikanta minskningar av APP och neuritiska plack i hjärnan hos 5xFAD/FAAH möss samt hittades höga nivåer av
proinflammatoriska cytokiner. I denna studie amyloidpatologin gav upphov till en signifikant ökning av cytokinnivåer i hippocampus hos 5xFAD/FAAH möss och detta bekräftades i en tidigare studie (Benito et al. 2012). Det har även visats att ökning av cytokinnivåer gett en negativ inverkan på kognitiva funktionen i AD. Möss med 5xFAD/FAAH uppvisade öka mRNA-nivåerna av IL1b men utan en signifikant ökning av proteinnivåer. Andra studier visade att ökning av IL1b produktion
medförde en reduktion av neuritisk plackbildning. Resultatet från studien indikerade på att inaktivering av FAAH påverkade APP och minskade neuritiska plack i hjärnan samt förbättrade nivåerna av IL6 vilket kan reducera neuritisk plackbildning. Detta resultat besvarar hur endocannabinoiderna verkar vid AD på indirekt sätt. Studien hade dock gjorts på försöksmöss och det kan ha påverkat resultatet.
I studie 3 (Jung et al. 2012) var syftet att undersöka om endocannabinoid uppträder i hjärnan hos post mortem patienter med AD. Resultatet visade en statistisk skillnad mellan kontrollpersoner och AD patienter i anandamidnivåerna i midfrontal cortex P=0,047 och i temporala cortex med P=0,034. Vid AD visades minskning av
anandamid men inte av de andra endocannabinoider t.ex. 2-AG hade inga signifikanta förändringar. Detta resultat stärks av en studie (van der Stelt et al. 2006) som visade att injektioner av neurotoxisk Aβ42 i råttans hippocampus orsakade ökning av 2-AG nivåer. Flertal studier visade ackumulation av Aβ42 kan påverka
anandamidproduktion genom att påverka dess prekursor samt anandamidnedbrytning genom att öka FAAH.
Sammantaget utifrån frågan om hur endocannabinoider verkar vid AD, visade de 3 studierna bland annat den viktiga rollen vid närvaro av endocannabinoider då det kan hindra beta amyloid aktivering. Endocannabinoider kan minska produktion av
proinflammatoriska molekyler. Beta amyloid neurotoxicitet och ökad produktion av proinflammatoriska molekyler anses vara orsaker för uppkomst av AD därför har endocannabinoider en viktig roll vid AD men det bevisar inga direkta skyddande effekter utifrån de 3 studierna.
I Studie 4 (Tanveer et al. 2012) studerades endocannabinoid, anandamid och 2-AG på Notch-1 vägen samt dess endogena reglering. Studien gjordes in-vitro med kortikala neuroner och cerebrala cortex som togs från råtta. Anandamid uppreglade Notch-1 signaleringen däremot kunde inte 2-AG påverka Notch-1 signaleringen. Anandamid och 2-AG förhindrade Aβ1-42 medierad ökning i Nb. Minskning av Nct visade sig vara orsaken till reducerad Notch-1 signalen i åldrade råttor. Endocannabinoider ger neuroprotektion samt kan förbättra Notch-1 signalering i en in vitro modell av AD den ger på så sätt möjlighet till endocannabinoidbaserad behandling.
I studie 5 (Noonan et al. 2010) studerades huruvida endocannabinoider verkar
skyddande för lysosomer dels mot Amyloid-β toxicitet och membranpermeabilisering vilka båda kan orsaka celldöd. Resultatet visade att endocannabinoider kan skydda lysosomer mot amyloidtoxicitet dvs. hindrar Aβ ökning i DNA fragment och därmed hindrar uppreglering av p53. Det visades att amyloid beta kan öka lysosomernas luminala pH och på så sätt främja translokationen av de lysosomala enzymerna cathepsin D och L. Dessa enzymer aktiverar bland annat de apoptotiska proteinerna.
I denna studie kunde påvisas att endocannabinoider dvs. CB1 receptorer kunde skydda lysosomer mot amyloidtoxicitet.
Studie 4 och 5 var de enda studierna som besvarade frågeställning 1 dvs.
endocannabinoiders skyddande effekt dels genom att förbättra Notch-1 signalering in- vitro och dels genom att skydda lysosomer mot amyloidtoxicitet. Båda studierna använde prover från Wistar-råttor.
Vilken terapeutisk potential har endocannabinoider vid AD?
Studie 1 har visat att hämning av anandamidnedbrytande enzymet FAAH kan påverka anandamidnivåer. Anandamidnedbrytning minskade och på så sätt kan dess
neuroprotektiva verkan öka. För att vidare undersöka anandamidnedbrytning användes en CB2 selektiv agonist. Det visade ökning av anandamidhydrolys i de humana kontrollprover men visade också en minskning av anandamidhydrolys i råttornas cerebrokortikala membraner.
Studie 2 har visat att möss som hade deletion i genen för FAAH resulterade i minskning av amyloidnivåer. Minskningen orsakades genom att FAAH-påverkade prekursorproteinet APP. Neuritisk plack minskade också. Anandamidnivåer ökade vid inaktivering av FAAH.
I studie 1 och 2 visades att hämningen av FAAH lede till ökade nivåer av anandamid, där anandamid från tidigare studier hade neuroprotektiva och antiinflammatoriska egenskaper. Dessa egenskaper är viktiga då bland annat en ökad inflammation ses som orsak hos AD patienter.
I studie 3 undersöktes uppkomsten av endocannabinoid hos postmortem patienter med Alzheimers sjukdom och hos möss. Resultatet visade förhöjningar av FAAH i mRNA.
Det var dock inga signifikanta förhöjningar. Det visades också minskning av anandamid men inte av de andra endocannabinoiderna.
Studie 4 visade att anandamid påverkade och uppreglerade Notch-1 signalering.
Notch-1 har en viktig roll för reglering av neuronal tillväxt. Och det kan ha skyddande effekter vid AD. Studie 5 visade att endocannabinoider kan skydda lysosomer från amyloidtoxicitet.
Sammanfattningsvis utifrån frågeställning 2 visade de flesta av dessa studier på att hämning av FAAH kan ge positiva effekter på anandamidnivåer i hjärnan. Hämning av FAAH kan ha en terapeutisk potential vid AD men särskilt hos möss. Studie 3 visade ökade nivåer av FAAH i mRNA i postmortem prover med AD. Det var dock inga statistiskt signifikanta ökningar
Studierna hade vissa begränsningar, där olika mätmetoder användes för att bedöma
jämfört med prover från postmortempatienter. Och detta kan påverka bedömningen att kunna besvara frågeställning 2 dvs. hur endocannabinoiderna har terapeutisk potential hos patienter med AD.
Styrkorna i studie 4 och 5 var att det tydligt visade endocannabinoiders skyddande effekter, visade också specifik påverkan på Notch-1 signalering och skyddade lysosomer från toxicitet.
Sammantaget visar effekterna av endocannabinoider på dessa biokemiska system ett terapeutiskt mål för fortsatt utveckling mot nya läkemedel vid AD.
De utvalda studierna är mestadels gjorda på råttor, möss och cellmodell och effekten av endocannabinoider kan vara svåra att extrapolera till människor.
Slutsats
Syftet med arbetet var att studera rådande forskningsläge gällande endocannabinoider och deras potentiella effekter vid Alzheimers sjukdom. Utifrån frågeställningar visade studierna effekter av endocannabinoider hos råttor, cellkulturer samt humana prover från post mortem patienter. Det visar att endocannabinoider har neuroprotektiv effekt och spelar en viktig roll i patogenesen av AD. Effekterna av de utvalda studierna är gjorda på möss, råttor och cellmodell då detta kan försvåra att kunna dra en slutsats gällande hur endocannabinoider kan agera hos människor. Det är fortfarande oklart hur endocannabinoider som läkemedelsmål kan verka hos en levande människa med AD. Det krävs vidare kliniska studier i människa för att kunna ta reda på den
terapeutiska relevansen av endocannabinoider som behandling av AD.
Referenser:
”Alzheimers sjukdom - Svenskt demenscentrum - Svenskt Demenscentrum”
Åtkomstdatum 15 maj 2018. http://www.demenscentrum.se/Fakta-om- demens/Demenssjukdomarna/Alzheimers-sjukdom/.
”Alzheimers sjukdom och symtom”. Alzheimerfonden. Åtkomstdatum 15 maj 2018.
https://www.alzheimerfonden.se/demenssjukdom/alzheimers-sjukdom.
Alger, Bradley E. 2013. ”Getting High on the Endocannabinoid System”. Cerebrum:
the Dana Forum on Brain Science 2013 (november).
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3997295/.
Barage, Sagar H., och Kailas D. Sonawane. 2015. ”Amyloid Cascade Hypothesis:
Pathogenesis and Therapeutic Strategies in Alzheimer’s Disease”. Neuropeptides 52:
1–18. https://doi.org/10.1016/j.npep.2015.06.008.
Bedse, Gaurav, Adele Romano, Angelo M. Lavecchia, Tommaso Cassano, och Silvana Gaetani. 2015. ”The Role of Endocannabinoid Signaling in the Molecular Mechanisms of Neurodegeneration in Alzheimer’s Disease”. Journal of Alzheimer’s Disease 43 (4): 1115–36. (7).
Benito, Cristina, Estefanía Núñez, María Ruth Pazos, Rosa María Tolón, och Julián Romero. 2007. ”The Endocannabinoid System and Alzheimer’s Disease”. Molecular Neurobiology 36 (1): 75–81. https://doi.org/10.1007/s12035-007-8006-8.
Benito, Cristina, Rosa María Tolón, Ana Isabel Castillo, Lourdes Ruiz‐Valdepeñas, José Antonio Martínez‐Orgado, Francisco Javier Fernández‐Sánchez, Carmen Vázquez, Benjamin F. Cravatt, och Julián Romero. 2012. ”Β−Amyloid Exacerbates Inflammation in Astrocytes Lacking Fatty Acid Amide Hydrolase through a
Mechanism Involving PPAR‐α, PPAR‐γ and TRPV1, but Not CB1 or CB2 Receptors”. British Journal of Pharmacology 166 (4): 1474–89.
https://doi.org/10.1111/j.1476-5381.2012.01889.x.
Bisogno, Tiziana, och Vincenzo Di Marzo. 2008. ”The Role of the Endocannabinoid System in Alzheimer’s Disease: Facts and Hypotheses”. Current Pharmaceutical Design 14 (23): 2299–3305.
Bromley-Brits, Kelley, Yu Deng, och Weihong Song. 2011. ”Morris Water Maze Test for Learning and Memory Deficits in Alzheimer’s Disease Model Mice”. Journal of Visualized Experiments : JoVE, nr 53 (juli). https://doi.org/10.3791/2920.
Dani, M., D. Brooks, och P. Edison. 2016. ”Tau Imaging in Neurodegenerative Diseases”. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 43 (6):
1139–1150. https://doi.org/10.1007/s00259-015-3231-2.
”Ebixa - FASS Vårdpersonal”. Åtkomstdatum 24 juni 2018.
https://www.fass.se/LIF/product?userType=0&nplId=20020515000030.
Ekman, S.L., Eriksdotter Jönhagen, M., Fratiglioni, L., Graff, C., Jansson, W., Kivipelto, M, et al. (2011). Alzheimer. Värnamo: Karolinska institutet.
Eriksson, Ingvar Karlsson, Karl-Axel. u.å. ”Demens | Läkemedelsboken”.
Åtkomstdatum 24 juni 2018.
https://lakemedelsboken.se/kapitel/psykiatri/demens.html.
Iannotti, Fabio Arturo, Vincenzo Di Marzo, och Stefania Petrosino. 2016.
”Endocannabinoids and Endocannabinoid-Related Mediators: Targets, Metabolism and Role in Neurological Disorders”. Progress in Lipid Research 62: 107–28.
https://doi.org/10.1016/j.plipres.2016.02.002.
Jung, Kwang-Mook, Giuseppe Astarita, Sevil Yasar, Vitaly Vasilevko, David H.
Cribbs, Elizabeth Head, Carl W. Cotman, och Daniele Piomelli. 2012. ”An Amyloid Β42-Dependent Deficit in Anandamide Mobilization Is Associated with Cognitive Dysfunction in Alzheimer’s Disease”. Neurobiology of Aging 33 (8): 1522–32.
https://doi.org/10.1016/j.neurobiolaging.2011.03.012.
Karl, Tim, David Cheng, Brett Garner, och Jonathon C. Arnold. 2012. ”The Therapeutic Potential of the Endocannabinoid System for Alzheimer’s Disease”.
Expert Opinion on Therapeutic Targets 16 (4): 407–20.
https://doi.org/10.1517/14728222.2012.671812.
Marcusson, J., Blennow, K., Skoog, I., & Wallin, A. (2011). Alzheimers sjukdom och andra kognitiva sjukdomar. 3e uppl. Liber AB
Noonan, Janis, Riffat Tanveer, Allan Klompas, Aoife Gowran, Joanne McKiernan, och Veronica A. Campbell. 2010. ”Endocannabinoids Prevent β-Amyloid-Mediated Lysosomal Destabilization in Cultured Neurons”. The Journal of Biological
Chemistry 285 (49): 38543–54. https://doi.org/10.1074/jbc.M110.162040.
Nordberg, A. (2013) Alzheimers sjukdom. Polen. Studentlitteratur AB. Lund.
Pacher, Pál, och George Kunos. 2013. ”Modulating the Endocannabinoid System in Human Health and Disease – Successes and Failures”. The FEBS Journal 280 (9):
1918–43. https://doi.org/10.1111/febs.12260.
Pascual, A. C., A. M. Martín-Moreno, N. M. Giusto, M. L. de Ceballos, och S. J.
Pasquaré. 2014. ”Normal Aging in Rats and Pathological Aging in Human Alzheimer’s Disease Decrease FAAH Activity: Modulation by Cannabinoid Agonists”. Experimental Gerontology 60 (december): 92–99.
https://doi.org/10.1016/j.exger.2014.10.011.
Pazos, M. R., E. Núñez, C. Benito, R. M. Tolón, och J. Romero. 2004. ”Role of the Endocannabinoid System in Alzheimer’s Disease: New Perspectives”. Life Sciences 75 (16): 1907–1915. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2004.03.026.
Rang, H. P., Ritter, J. M., Flower, R. J., & Henderson, G. (2014). Rang & Dale's Pharmacology. Elsevier Health Sciences.
Stelt, M. van der, C. Mazzola, G. Esposito, I. Matias, S. Petrosino, D. De Filippis, V.
Micale, m.fl. 2006. ”Endocannabinoids and Beta-Amyloid-Induced Neurotoxicity in Vivo: Effect of Pharmacological Elevation of Endocannabinoid Levels”. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS 63 (12): 1410–24. https://doi.org/10.1007/s00018- 006-6037-3.
Sun, Xiaojuan, Wei-Dong Chen, och Yan-Dong Wang. 2015. ”β-Amyloid: The Key Peptide in the Pathogenesis of Alzheimer’s Disease”. Frontiers in Pharmacology 6:
221. https://doi.org/10.3389/fphar.2015.00221.
Tanveer, Riffat, Aoife Gowran, Janis Noonan, Sinead E. Keating, Andrew G. Bowie, och Veronica A. Campbell. 2012. ”The Endocannabinoid, Anandamide, Augments Notch-1 Signaling in Cultured Cortical Neurons Exposed to Amyloid-β and in the Cortex of Aged Rats”. The Journal of Biological Chemistry 287 (41): 34709–21.
https://doi.org/10.1074/jbc.M112.350678.
Vázquez, Carmen, Rosa M. Tolón, M. Teresa Grande, Marina Caraza, Marta Moreno, Erin C. Koester, Borja Villaescusa, m.fl. 2015. ”Endocannabinoid Regulation of Amyloid-Induced Neuroinflammation”. Neurobiology of Aging 36 (11): 3008–19.
https://doi.org/10.1016/j.neurobiolaging.2015.08.003.
Wei, Binqing Q., Tarjei S. Mikkelsen, Michele K. McKinney, Eric S. Lander, och Benjamin F. Cravatt. 2006. ”A Second Fatty Acid Amide Hydrolase with Variable Distribution among Placental Mammals”. Journal of Biological Chemistry 281 (48):
36569–78. https://doi.org/10.1074/jbc.M606646200.
Widmaier, E.P., Raff, H. och Strang, K.T. Vander ́s Human Physiology. The mechanisms of Body Function. McGrawHill, 12:e upplagan.
391 82 Kalmar Tel 0480-446200 info@lnu.se Lnu.se
