Fakulteten för hälso- och livsvetenskap
Examensarbete
Uttrycksmönster av kiseltransportörgener
hos Chaetoceros affinis med realtids-PCR
: Författare: Nikolaj Gubonin Ämne: Molekylärekologi Nivå: Grundnivå
Examensarbetets Titel: Uttrycksmönster av kiseltransportörgener hos Chaetoceros affinis med realtids-PCR
Studentens namn: Nikolaj Gubonin
Examensarbete, Biomedicinsk laboratorievetenskap 15 hp
Filosofie Kandidatexamen
Handledare: Professor, Jarone Pinhassi Linnéuniversitetet,
Institutionen för Biologi och Miljövetenskap 44031, Hus Vita, Kalmar
Examinator: Professor, Mark Dopson Linnéuniversitetet
Institutionen för Biologi och Miljövetenskap 44032, Hus Vita, Kalmar
Examensarbetet ingår i programmet Biomedicinsk analytiker 180 hp
Sammanfattning
Diatomer är vattenlevande, fotosyntetiska protister som kännetecknas av att dess cellväggsstruktur är uppbyggd av kiseldioxid. Kisel är ett begränsande
näringsämne för diatomer. Den biotillgängliga formen av kisel i akvatisk miljö är kiselsyra. Eftersom den intracellulära koncentration av kisel är mångfaldigt högre än den extracellulära i de flesta akvatiska habitat, krävs kiseltransportörer (SIT) som aktivt pumpar in kiselsyran. Hos diatomen Chaetoceros affinis har två kiseltransportörer rapporterats, SIT1 (CaSIT1) och SIT2 (CaSIT2). Genuttrycket av CaSIT1 ökar vid låg koncentration av extracellulär kiselsyra (<30 µM),
medan vid högre koncentrationer domineras transporten av diffusion. I motsats tycks CaSIT2 inte påverkas av variationer i tillgänglig kiselsyra, och dess roll vid transport av kiselsyra är oklar. Syftet med föreliggande arbete var att med realtids-PCR undersöka det relativa genuttrycket av CaSIT1 och CaSIT2 hos C.
affinis. Diatomen odlades i två medium: en med komplett näringsinnehåll (kontroll) och en med samma näringsinnehåll förutom kisel (-Si). Därutöver odlades även C. affinis tillsammans med Cylindrotheca fusiformis, i respektive medium (mixad kultur). På grund av omfattande primer-dimers uteslöts CaSIT2 primers från analys av proverna. Det relativa genuttrycket av CaSIT1 ökade vid kiselbegränsning (ANOVA: p < 0,05), i enlighet med tidigare studier. Effekten av konkurrens resulterade däremot i en minskning av genuttryck (ANOVA: p <
0,05). Den kombinerade effekten (konkurrens och kiselbegränsning) resulterade inte i en signifikant förändring av genuttrycket (ANOVA: p = 0,38). Det var en ökad variation bland de mixade kulturerna, vilket eventuellt förklaras av
degraderat RNA då RNA-kvalitén över lag var väldigt låg för de flesta prover.
Resultaten i denna studie visar att realtids-PCR är en effektiv metod för att undersöka genuttryck av kiseltransportörgener, under förutsättning av primers utvärderats korrekt.
Nyckelord
diatom, SIT, kisel, realtids-PCR, relativt genuttryck, konkurrens
Abstract
Diatoms are photosynthetic protists that reside in aquatic environments. A unique feature of diatoms is their cell wall structure made of silica. Silicon is a limiting nutrient for diatoms. The bioavailable form of silicon in aquatic
environments is silicic acid. Since the intracellular concentration of silicon is many times greater than the extracellular concentration in aquatic habitats,
silicon transporters (SIT) are required that actively transports silicic acid into the cell. In the diatom Chaetoceros affinis two such transporters have been reported, SIT1 (CaSIT1) and SIT2 (CaSIT2). Gene expression of CaSIT1 is increased at low extracellular concentration of silicic acid (<30 µM), while at higher
concentrations the transportation is dominated by diffusion. On the contrary, CaSIT2 does not seem to be affected by variations in environmental silicic acid concentrations, and its role in the transportation of silicic acid remains unclear.
The aim of this study was to evaluate the relative gene expression of CaSIT1 and CaSIT2 in C. affinis, using realtime-PCR. The diatom was cultivated in two media: one with full nutrients (control) and one without added silicon (-Si). In addition, C. affinis was also cultivated with a second diatom, Cylindrotheca fusiformis, in respective media (mixed cultivation). Due to extensive primer- dimers, CaSIT2 was excluded from the proceeding analysis of the samples.
Analysis showed that the relative gene expression of CaSIT1 was increased by silica limitation (ANOVA: p < 0,05), in accordance with previous studies. The effect of competition however resulted in a decrease of gene expression
(ANOVA: p < 0,05). The combined effect, the interaction of competition and
silica limitation, did not result in a significant change of the gene expression
(ANOVA: p = 0,38). However, there was an increased variation among the
mixed cultures, which could be a result of RNA degradation considering the
poor RNA quality of the samples. The results from this study show that
realtime-PCR is an effective method to measure gene expression of silica
transporters, provided that the primers have been correctly evaluated.
Förkortningar
SIT kiseltransportör
TMS transmembranregioner
IBK intracellulära bindnings-komponenter SDV silica deposition vesicle
ELF elongation-like factor PCR polymerase chain reaction Ct tröskelcykel
Tm smälttemperatur
RIN RNA integritets nummer
CaSIT1 Chaetoceros affinis kiseltransportör typ 1 CaSIT2 Chaetoceros affinis kiseltransportör typ 2 CaELF Chaetoceros affinis elongation-like factor ASW artificiellt havsvatten
RT rumstemperatur
-Si lågt kisel
Innehållsförteckning
Introduktion ... 1
Vad är en alg? ... 1
Kiselsyratransportör ... 1
Modell för upptag av kiselsyra ... 1
Endocytos – är det svaret? ... 2
SIT generna ... 3
En evolutionär aspekt ... 4
Analysera genuttryck med realtids-PCR ... 4
Hushållsgener – en typ av referensgener ... 5
Beräkning av relativt genuttryck ... 5
RNA kvalitétstester ... 6
Syfte ... 7
Material och metod ... 7
Medium ... 7
Förberedelse av experiment ... 7
Start av kultivering (dag 1) ... 7
Mätning av OD och fortsatt kultivering (dag 2-3) ... 7
Kulturerna blandas (dag 4) ... 8
Experiment ... 8
Beredning av medium i experimentflaskor (dag 5) ... 8
Filtrering och start av experiment (dag 5) ... 8
Provtagning (dag 5) ... 8
RNA-extraktion ... 9
Extraktion med TRIzol och Qiagens DNase-behandling ... 9
Upprening av RNA med RNeasy kit ... 9
DNase behandling med AMBION Turbo DNA kit ... 10
TapeStation ... 10
NanoDrop ... 11
Test av primers ... 11
Realtids-PCR ... 12
Bestämning av optimal koncentration ... 12
Effektivitetstest ... 14
Test av primerkoncentration med CaSIT2-2 ... 14
Analys av prover ... 14
Statistisk analys ... 14
Resultat ... 14
Test av primers med PCR ... 14
RNA-kvalité och DNA-kontaminering ... 15
Bestämning av optimal koncentration ... 16
Test av primerkoncentrationer med CaSIT2-2 ... 17
Effektivitetstest ... 17
Analys av prover 1-12 B: ... 18
CaSIT1 genuttryck vid kiselbegränsning, konkurrens och kombinerad effekt ... 19
CaSIT1 genuttryck vid kiselbegränsning ... 19
CaSIT1 genuttryck vid konkurrens med C. fusiformis ... 20
Diskussion ... 20
Primers ... 21
RNA-kvalité ... 21
Förberedande analyser med realtids-PCR ... 21
CaSIT2-2 primer ... 22
Effektivitetstest ... 22
Genuttrycksmönster hos C. affinis ... 22
CaSIT1 genuttryck vid kiselbrist ... 23
CaSIT1 genuttryck vid konkurrens ... 23
Referensgenen CaELF ... 23
Begränsningar ... 24
Slutsats ... 24
Referenser ... 25
Bilagor ... i
Bilaga A: L1 medium med tillhörande spårämneslösning och vitaminlösning ... i
Bilaga B: Beräkning av spädningar ... ii
Bilaga C: Seriespädningar (rådata) och smältanalyser ... iii
Bilaga D: Beräkning av genuttryck samt rådata för prov 1-12B ... viii
Beräkning av genuttryck ... viii
Statistik ... xi
Rådata ... xii
1
Introduktion
Vad är en alg?
Begreppet ”alg” innefattar en heterogen grupp av organismer som inte delar ett gemensamt ursprung. Graham et al. (1) klassificerar alger i ett dussintal härstamningar. Definierande för respektive härstamning är algens egenskaper. Några avgörande egenskaper är typ av pigment, strategi att lagra näring och cellväggsstruktur. De flesta alger utövar oxygenisk fotosyntes och uppehåller sig i akvatiska habitat. De anses varken tillhöra djur- eller växtriket, utan
klassificeras som protister (2). Protister definieras som i huvudsak encelliga eukaroyter som inte är växter, djur eller svampar (3). Med det sagt ingår även vissa fotosyntetiska bakterier i gruppen alger, nämligen cyanobakterier, trots att de inte är protister.
I härstamningen fotosyntetiska stramenopiler ingår bland annat diatomen (1), vars främsta kännetecken är dess cellvägg uppbyggd av kiseldioxid. Cellväggen kallas frustule och dess otroliga diversitet gör diatomen till en av havets mest artrika organism (3). Frustulen uppfyller flera ekologiska funktioner, bland annat agerar cellväggen som ett naturligt skydd mot
enzymatiska attacker från andra mikrober och förstärker aktiviteten av kolsyraanhydras som leder till ökat upptag av koldioxid (1). Diatomer svarar för en femtedel av den globala primära produktionen och fäller ut 240 Tmol biogen kiseldioxid årligen (4). I näringsrika miljöer med hög ljusintensitet domineras fytoplanktonsamhället av diatomer, exempelvis uppvällande zoner där näringsrikt djupvatten når solbelyst ytvatten (5).
Kiselsyratransportör
Kisel är ett av flera makroämnen som vid brist begränsar tillväxt av diatomer (1). Den biotillgängliga formen är kiselsyra (Si(OH)4) och bildas vid vittring av silikatmineraler (6).
Koncentration kiselsyra i havets eufotiska (solbelysta) zon uppskattas till 10 µM (5), väldigt låg i jämförelse med den intracellulära koncentrationen hos diatomer som är hundrafaldigt högre (5). Vid höga koncentrationer kiselsyra (> 30 µM) sker diffusion genom cellmembranet (4), medan vid lägre koncentrationer utnyttjas kiseltransportörer (SIT, från engelskan silicon transporters) som aktivt pumpar in kiselsyra mot en koncentrationsgradient (7). SIT var de första proteinerna rapporterade som direkt interagerar med kisel (7). Trots att proteinet studerats i två decennier, är dess biokemiska mekanism för upptag av kiselsyra till cellen fortfarande inte fullständigt beskriven (8). Även den generella modellen för upptag och metabolism av kiselsyra har många obesvarade frågor.
Modell för upptag av kiselsyra
För att förstå hur ett protein interagerar med ett substrat, måste bland annat proteinets primära struktur dechiffreras, det vill säga aminosyrasekvensen. Thamatrakoln et al. (2006) (7)
identifierade konserverade sekvenser i SIT som låg i anslutning till transmembranregioner (TMS). Passage av kiselsyra måste ske genom TMS, därför är det troligt av vissa aminosyror i denna region interagerar med kiselsyra. Tidigare studier av andra transportörer har
demonstrerat att laddade sidokedjor av aminosyror har en avgörande effekt för proteinets funktion (7). En enkel modell för kiselsyratransport som Thamtrakoln et al. (2006) presenterar bygger på principen hos sekundära membrantransportörer: konserverade glutaminer i TMS koordinerar förflyttningen genom att binda till den extracellulära kiselsyrans hydroxylgrupper, varefter en konformationsförändring sker vilket förflyttar kiselsyran intracellulärt. Intracellulärt transporteras kiselsyran till ännu icke identifierade
”intracellulära bindnings-komponenter” (IBK) som sedan transporterar kiselsyran vidare till
2
silica deposition vesicle (SDV) där polymerisering till kiseldioxid sker. Sekundära
transportörer utnyttjar energi från en elektrokemisk gradient (9), och SIT är av typen symport, där natriumjoner utgör den drivande kraften (7). Ackumulering av natriumjoner pumpas sedan ut ur cellen med Na+/K+-ATPase (7).
Ett problem med ovan beskriven modell är avsaknad av kontroll över transporten. Således finns risk att stora mängder kiselsyra ackumuleras intracellulärt, vilket därmed fordrar ett energikrävandesystem som aktivt pumpar ut överbliven kiselsyra (7). En positiv kooperativ kinetik (sigmoidal kurva) har identifierats hos SIT vid upptag av låga (<30 µM)
kiselsyrakoncentrationer (10), kännetecknande för allosteriska transportörer. Det innebär att vid suboptimala extracellulära koncentrationer kiselsyra begränsas upptaget, vilket indikerar att någon typ av kontroll föreligger. En förklaring till det senare är att diatomen måste inta en viss mängd kiselsyra för att initiera och avsluta cellväggssyntesen. Med andra ord verkar en tröskelnivå av kiselsyra föreligga, som måste överbryggas av SIT (10).
En mer invecklad modell för upptag av kiselsyra (figur 1) involverar kapaciteten av den intracellulära poolen att omhänderta kiselsyran samt hastighet av inkorporation av kisel till cellväggen (10). Modellen innefattar två mekanismer: vid låga kiselsyrakoncentrationer (<30 µM) sker aktivt upptag av SIT (förutsatt att koncentrationen är tillräckligt högt för att initiera cellväggssyntes) och vid höga kiselsyrakoncentrationer (>30 µM) sker diffusion vilket styrs av intracellulära kapaciteten, d.v.s. mängden tillgängligt IBK. Den senare mekanismen
kännetecknas av icke-mättad kinetik (förutsatt att IBK inte begränsar upptaget), men som med tiden övergår till en mättad kinetik vilket beror på att en jämvikt inställer sig mellan den intracellulära poolen och inkorporering av kiselsyran till cellväggen via SDV. För en mer detaljerad beskrivning, se Thamatrakoln 2008 et al. (10). Hur kiselsyra överförs till IBK från SIT, och från IBK till SDV är två obesvarade frågor (7,11).
Det kan anses motsägelsefullt att diffusion av kiselsyra överhuvudtaget är möjligt, med tanke på den stora skillnad i koncentration intra- och extracellulärt. En tänkbar lösning är att när kiselsyran binder till organiska komponenter intracellulärt, som IBK, påverkas jämvikten då den kemiska formen förändras och en inåtgående koncentrationsgradient av kiselsyra upprätthålls (10).
Endocytos – är det svaret?
En annorlunda modell som också gör anspråk på förklara transport av kiselsyra baseras på pinocytos (figur 1), som är en form av endocytos där partiklar suspenderade i extracellulär vätska intas till cellen genom formation av vesiklar från cellmembranet (8). Modellen kringgår bland annat problemet med IBK eftersom vesiklarna antas kunna smälta samman med SDV. Vesiklar som sammansmälter med SDV har identifierats, till skillnad från IBK (11).
Det främsta argumentet som talar emot modellen är det faktum att endocytos, oavsett typ, medför intag av stora volymer vatten. (11). Således krävs en mekanism för borttagandet av vatten, vilket i sig är energikrävande (jämför ovan exemplet med icke-kontrollerat upptag av kisel). En lösning på problemet är att kiselsyran koncentreras genom att kondenseras till oligosilikater på diatomens yta, en idé som presenteras av Annenkov et al. (2020) (8).
Hypotesen stöds bland annat av att oligosilikater identifierats hos diatomer sekunder efter kiselabsorption (12). Annenkov et al. (2020) demonstrerade även att diatomer assimilerar negativt laddade syror innehållandes minst fyra karboxylgrupper (polyakrylsyra) i frustulen,
3
vilka antas utgöra en proxy av oligosilikater som, till skillnad från kiselsyra, är svagt laddade vid neutralt pH.
Vidare har endocytos för upptag av kväve och fosfor identifierats hos dinoflagellater (13), samt för järn hos diatomer (14). En obesvarad fråga i sammanhanget är hur uppstår kondenseringen på den externa cellytan. Möjligtvis spelar silaffiner en avgörande roll, proteiner som associeras med cellväggssyntes hos diatomer och som rapporterats kapabla till att kondensera kiselsyra (15).
Figur 1. Tre mekanismer för transport av kiselsyra i en diatomcell. Vid låga extracellulära koncentrationer kiselsyra (<30 µM) styrs transporten av SIT, en sekundär transportör av symport-typ där natriumjoner utgör den drivande kraften. Vid högre koncentrationer (>30 µM) domineras transporten av diffusion. Intracellulärt binder kiselsyran till IBK, som transporterar det vidare till SDV. Två hastighetsbegränsande steg är kapaciteten av den intracellulära poolen (d.v.s. mängden IBK) och inkorporering av kiselsyra till cellväggen via SDV. Den tredje alternativa mekanismen innefattar pinocytos. Här kondenseras kiselsyran till oligosilikater på cellens yta, varefter vesiklar formas intracellulärt som sammansmälter med SDV. Det intracellulära koncentrationen Si är mångfaldigt högre än den extracellulära, varierar mellan 19 – 340 mM. Illustration: Nikolaj Gubonin.
SIT generna
De första SIT generna identifierades 1997 av Hildebrand et al. (16) hos diatomen Cylindrotheca fusiformis, som senare visade sig vara fem olika SIT-gener (17), härefter namngivna CfSIT1-5. Storleken i antalet aminosyror varierar mellan 538 till 557, där C- terminalen svarar för variationen medan N-terminalen är konserverad.
Transmembranregioner, som tidigare nämnts, identifierades, samt s.k. ”coiled-coiled” motiv som tyder på att SIT interagerar med andra proteiner.
CfSIT1-5 transkriberas på olika sätt, där CfSIT2-5 uppregleras i ett liknande mönster efter tillskott av kisel, om än olika nivåer (17). Det maximala uttrycket av CfSIT2-5 inträffar i samband med maximalt intag av kisel. CfSIT1 verkar däremot mer verksam i ett senare skede.
4
Den naturliga frågan är varför uttrycks fem olika SIT-gener, och dessutom i olika nivåer och i olika skeden?
Hos diatomen Chaetoceros affinis har två SIT gener identifierats (CaSIT1-2) (5). När cellerna kultiveras i miljö utan tillskott av kisel, observeras en kraftig uppreglering av CaSIT1 medan uttrycket av CaSIT2 är opåverkat och mycket lägre jämfört med CaSIT1. Homologa CaSIT1 gener har identifierats hos andra arter, d.v.s. SIT som kraftigt responderar till kiselbrist, e.x.
Thalassiosira pseudonana SIT1-2. Genuttryck av TpSIT1-2 uppregleras i kiselfri miljö (18), och när sedan kisel tillsätts till den kiselfria miljön, observeras istället det motsatta där TpSIT1-2 nedregleras (19). Vidare har TpSIT1-2 lokaliserats till plasmamembranet.
Reglering av TpSIT3 är opåverkad av höga eller låga kiselkoncentrationer, och spekuleras upprätthålla intracellulär transport över organellmembran (19).
Baserat på fylogenetiska data av de SIT som hade identifierats fram till år 2012, beskrev Durkin et al. (2012) (3) fem klader: A – E. Pseudo-nitzshia multiseries SIT tillhörande klad B ökar signifikant vid kultivering i miljö med järnbrist. Även andra SIT gener tillhörande klad B i marina vatten med lågt järn har identifierats vilket sammantaget tyder på att klad B SIT påverkar upptag av kiselsyra då järnbrist råder. För mer information om kladistiken, hänvisas läsaren till Durkin et al. (2016) (4) där en mer genomgående analys presenteras.
Sammanfattningsvis råder stor variation i hur, när och varför SITs uttrycks, såväl inom en art som emellan arter.
En evolutionär aspekt
SIT-genen antas ha transkriberats av diatomer ända sedan dessa växtplanktons uppkomst, vilket uppskattas till 140 miljoner år gamla baserat på fynd av furstulfossil (4).
Koncentrationen kiselsyra i haven spekuleras ha varit mångfaldigt högre under denna epok, upp till 1 mM. Samtidigt ifrågasätts detta påstående eftersom höga kiselkoncentrationer har observerats innebära nedbrytande effekter på alger (20). Oavsett domineras transporten av diffusion i sådana miljöer (4), vilket reser frågetecken kring dåtidens funktion av SIT. SIT- genen har även identifierats hos organismer som överhuvudtaget inte metaboliserar kisel (4).
En möjlig förklaring är att SIT ursprungligen hade en motsatt funktion – borttagande av kiselsyra för att skydda cellen mot förgiftning (8,20).
Analysera genuttryck med realtids-PCR
För att kvantifiera genuttryck som SIT utnyttjas realtids-polymerase chain reaction (PCR) med fördel. Här omvandlas först mRNA till komplementärt DNA (cDNA) med enzymet reverse transcriptase, följt av analys med realtids-PCR (21). Den huvudsakliga skillnaden mellan realtids-PCR och traditionell PCR är den förras förmåga att kvantifiera templatet, d.v.s. mängden ”start-DNA”. Vid realtids-PCR mäts anhopning av amplicon (ampliferat templat) med hjälp av fluorokromer. Därtill beräknas mängden amplicon i realtid (därav namnet), vilket inte är möjligt med traditionell PCR. Principen baseras på att mängden fluorescens som registreras är proportionell mot mängden amplifierad produkt. Ett
tröskelvärde bestäms där fluorescensen ökar signifikant i förhållande till bakgrundsbruset. När provets fluorescens således överstiger tröskelvärdet, erhålls tröskelcykeln (Ct) för provet.
Desto lägre Ct desto mer templat. DNA är en inhibitor av DNA polymeras (22), och risk för inhibering ökar med ökad mängd templat. DNA binder även magnesiumjoner (23), som är essentiella för polymerasets funktion (21). Ett för högt Ct (>35 Ct) indikerar att genen
5
uttrycks väldigt lågt alternativt att kvaliteten på det undersökta materialet är av undermålig kvalité (24).
SYBR Green är en fluorokrom som binder till DNA duplex, och exciteras vid 498 nm och emitteras vid 522 nm (21). Fluorokromen används flitigt vid arbete med realtids-PCR tack vare dess ospecifika bindningsförmåga och relativt billiga kostnad jämfört med andra
fluorescerande ämnen. Den ospecifika bindningsförmågan medför dock en nackdel, nämligen att SYBR green också binder till ej avsett templat samt primer-dimers. Genom att konstruera en smältkurva kan eventuell ospecifik amplifiering upptäckas och åtgärder vidtas. Från smältkurvan erhålls produkternas smälttemperatur (Tm) vilket motsvarar den temperatur då hälften av dubbelsträngat DNA är enkelsträngat (21).
Det finns två generella sätt att mäta genuttryck på; relativ eller en absolut kvantifiering (21).
Den förra mäter förhållandet mellan genen av intresse med en referensgen och den senare utnyttjar en standardkurva. Generellt föredras relativt kvantifiering, eftersom absolut kvantifiering är betydligt mer tidskrävande (25).
Hushållsgener – en typ av referensgener
Hushållsgener är så kallade konstitutiva gener som utför grundläggande funktioner i en cell och som uttrycks i såväl friska- som patogena tillstånd (26). De utnyttjas i experimentella syften när genuttryck mäts som referensgener, eftersom de uppvisar låg variation under såväl kontroll- som experimentförsök. De ställs då i förhållande till genen av intresse. Felkällan som elimineras är förändrad transkription av genen av intresse på grund av förändrat cellantal.
Elongation-like factor protein (ELF) är en hushållsgen inblandad i translationen vid
proteinsyntes (27). En studie gjord av Kang et al. (2012) demonstrerade att ELF var stabil vid olika nivåer av tillväxtstadier, ljusintensitet och näringstillgång hos diatomer (26). Dessutom var genen specifik för de genus som mättes.
Beräkning av relativt genuttryck
Det finns olika matematiska metoder för beräkning av relativt genuttryck. Delta-delta Ct metoden (ekvation 1) utgår ifrån att primereffektiviteten för respektive gen (gen av intresse och referensgen) är ungefär densamma (28). Optimal effektivitet har ett värde på 2,0
(motsvarar 100 %) vilket innebär att för varje PCR-cykel fördubblas antalet amplicon (25). Ct motsvarar det antal cykler då fluorescensen passerar tröskelvärdet vid mätning med realtids- PCR (se ovan). Skillnad i Ct mellan gen av intresse och referens beräknas (∆Ct). Därefter bestäms en kalibrator som proverna jämförs mot genom att beräkna skillnad mellan ∆Ct och kalibrator (∆∆Ct). Två upphöjt till negativt ∆∆Ct resulterar i förändring av normaliserat genuttryck i förhållande till kalibrator (R).
𝑅 = 2−∆∆Ct (1)
En känsligare metod som tar hänsyn till skillnad i primereffektivitet är Pfaffls metod (25).
Primereffektiviteten beräknas med ekvation 2. Med ekvation 3 erhålls värdet i procent. En standardkurva baserat på en spädningsserie tas fram (med respektive primer), och den linjära kurvans ekvation beräknas. Lutningen används sedan i ekvation 4. Primers anses vara
jämförbara så länge de befinner sig inom intervallet 90 – 110 % (29). En effektivitet över 100
% är motsägelsefullt, och förklaras av att polymeraset blir inhiberat. Det innebär att Ct inte minskas även om mer templat tillsätts, vilket resulterar i att kurvans lutning minskar som i sin tur ökar effektiviteten (ekvation 2) (30). Nackdelen med Pfaffls metod är att normalisering av
6
genuttryck beräknas efter provets Ct har subtraherats från kalibratorn, vilket innebär att jämförelser där olika koncentration av RNA ingår inte är möjligt att utföra.
𝐸 = 10(−
1 𝑙𝑢𝑡𝑛𝑖𝑛𝑔)
(2)
𝐸 (%) = (10(− 1/𝑙𝑢𝑡𝑛𝑖𝑛𝑔) − 1) 𝑥 100 (3)
𝑅 =
(𝐸𝑚å𝑙)(𝐸𝑟𝑒𝑓)ΔCt ref ΔCt mål (4)I ekvation 4 anger R kvoten, Emål primereffektivitet för genen av intresse, Eref
primereffektiviteten för referensgenen, ΔCtmål skillnad i Ct mellan kalibrator och prov för genen av intresse, och ΔCtref skillnad i Ct mellan kalibrator och prov för referensgenen. Emål
och Eref erhålls från ekvation 1.
RNA kvalitétstester
God RNA kvalité är avgörande för att erhålla pålitliga resultat med realtids-PCR. Degradering av RNA är en gradvis process (31) och det är framförallt RNase som degraderar RNA.
RNaser är allestädes närvarande, de uttrycks hos mikroorganismer och utsöndras bland annat från huden (32). Därutöver är RNA uppbyggt av ribose, ett socker med en mycket reaktiv hydroxylgrupp, vilket också leder till att RNA integriteten lätt påverkas via andra enzymatiska reaktioner (33). Därför är noggrant förhållningssätt vid laboratoriearbete med RNA centralt för att minimera kontamineringsrisk. Upprenat RNA kontrolleras på olika sätt.
TapeStation är ett instrument som utför elektroforetisk separation på mikrofabricerade chip (31). Nukleinsyror separeras och detekteras med hjälp av fluorescerande molekyler.
Eukaryotiskt RNA utgörs till största del av 18S och 28S rRNA (33). I mindre mängder finns bland annat mRNA och tRNA. TapeStation beräknar koncentration RNA och framställer ett RNA integritets nummer (RIN) vilket motsvarar ett objektivt värde av RNA-kvalitén. Från ett elektroferogram som genereras, där fluorescens är avsatt mot RNA-storlek, bestäms RIN- värdet från 1 till 10. Detta genom att samtliga toppareor beräknas och jämförs (31). Den stora fördelen med denna metodik framför manuell avläsning på gel, är att resultatet baseras på en objektiv bedömning (31,32). Ett högt RIN värde närmare 10, indikerar suverän kvalité med intakt 18S och 28S rRNA (31). I motsats, ett värde nära 0 tyder på fullständig degradering och provet lämpar sig inte för vidare bearbetning.
Med NanoDrop utförs en spektrofotometrisk bestämning av nukleinsyrakvalité, genom att beräkna kvoten 260 nm / 280 nm (34). Nukleinsyror absorberar våglängder vid 260 nm;
proteiner vid 280 nm. Således kan kvoten säga något om proteinkontaminering. En kvot på 1,8 tolkas som rent DNA och 2,0 tolkas som rent RNA. Att RNA har en högre kvot beror på att uracil absorberar mer ljus vid 260 nm än tymin (35). Är kvoten låg tyder det på
proteinkontaminering, vilket förklaras exempelvis av kemikalierester från nukleinsyraextraktionen.
För att kontrollera DNA kontaminering i ett extraherat RNA-prov, kan traditionell PCR med efterföljande gelelektrofores utnyttjas. Upprenat RNA placeras i termocykeln med mastermix
7
inklusive primers riktade mot en bestämd gen. Eftersom PCR endast amplifierar DNA, indikerar förekomst av band med gelelektrofores närvaro av DNA.
Syfte
Syftet med detta examensarbete var att med hjälp av realtids-PCR mäta genuttryck av SIT1 och SIT2 i diatomen C. affinis, och sedan beräkna det relativa genuttrycket med delta-delta Ct metoden. Genuttrycket mättes efter två timmars inkubering vid fyra olika behandlingar.
1. Monokultur i L1 medium (innehåller alla nödvändiga makroämnen, spårämnen och vitaminer, se bilaga A).
2. Monokultur i L1 medium utan tillsats av kisel.
3. Mixad kultur i L1 medium. Till denna kultur tillsattes även diatomen C. fusiformis.
4. Mixad kultur i L1 medium utan tillsats av kisel.
Material och metod
Medium
L1 medium (se bilaga A) förbereddes enligt protokoll från Guillard & Ryther, 1962 (36).
Artificiellt havsvatten (ASW) förbereddes genom att lösa upp havssaltslösning (Sigma- Aldrich, Saint Louis, USA) till 1 L MilliQ ultrarent vatten. Vattnet filtrerades sedan genom 0,2 µm filter till autoklaverade 1 L plastflaskor (Sigma-Aldrich). Till 1L ASW tillsattes 1 mL NaNO3 (75,0 g/L dH2O), 1 mL NaH2PO4· H2O (5,0 g/L dH2O), 1 mL Na2SiO3 · 9 H2O (30,0 g/L dH2O), 1 mL lösning av spårämnen (se bilaga A) och 0,5 mL vitaminlösning (se bilaga A). Framöver när L1 medium anges, har det alltid beretts enligt ovan om inget annat står angivet och blandning av medium och inokulering av kultur utförs alltid i sterilbänk.
Förberedelse av experiment
Start av kultivering (dag 1)
Till tre autoklaverade 250 mL erlenmeyer flaskor av plast (Sigma-Adrich) tillsattes cirka 100 mL av L1 medium. Två av flaskorna inokulerades med ca 5 mL monokultur av Chaetoceros affinis (köpt från Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP), Scottish Association for Marine Science) och den tredje flaskan inokulerades med ca 5 mL monokultur av
Cylindrotheca fussiformis (köpt från samma leverantör, CCAP). Dubbel uppsättning C. affinis utfördes som säkerhetsåtgärd för att erhålla tillräckligt mängd alger. Algerna inkuberades i 20,5 °C i två dygn, i ca 4000 lx (lumen per kvadratmeter), i en 16/8 h dag/natt cykel.
Framöver gäller alltid 20,5 °C, 4000 lx och 16/8h dag/natt cykel då proverna inkuberas, om inget annat står angivet.
Mätning av OD och fortsatt kultivering (dag 2-3)
Efter två dygn tillsattes ytterligare 100 mL L1 medium till varje kultur. Ytterligare ett dygn efter det (totalt 3 dygn sedan inokulering) mättes optiskt densitet (OD) vid 750 nm med FLUOstar Omega (BMG Labtech, Ortenberg, Tyskland). Syftet med att mäta OD var att kontrollera att cellerna befann sig i exponentiell tillväxtfas. Framöver mättes OD dagligen. De två flaskorna med C. affinis överfördes till en gemensam 1L plastflaska och späddes till 1 L med L1 medium. Även C. fusiformis kulturen överfördes till en 1L plastflaska och späddes till 1 L med L1 medium.
8 Kulturerna blandas (dag 4)
På dag 4 blandades 500 mL av respektive kultur (C. affinis och C. fusiformis) till en gemensam 1L plastflaska för att låta algerna tillväxa ihop under ett dygn (=mixad kultur).
Cellantal (celler per mL) beräknades med Sedgewick-Rafter brunnar (37) och biovolym (µm3 per cell) beräknades enligt föreskrifter från Baltic Marine Environment Protection
Commission (38). Cellantal multiplicerat med biovolym beräknades för respektive kultur.
Värdet, µm3 per mL, var ungefär detsamma för båda arterna och därför tillfördes sedan samma volym av kulturerna (500 mL) till den mixade kulturen. Data för beräkningar ej redovisad.
Experiment
Beredning av medium i experimentflaskor (dag 5)
Inför experimentet, förbereddes 12st 250 mL Erlenmeyer plastflaskor som märktes enligt:
1,2,3 ”Monokultur kontroll”, 4,5,6 ” Monokultur – Si”, 7,8,9 ”Mixad kultur kontroll”, 10,11,12 ” Mixad kultur – Si” (figur 2). Varje behandling bestod av tre biologiska replikat.
Till samtliga flaskor tillsattes 150 mL ASW. Sedan tillsattes näringsämnen för att skapa L1- medium enligt ovan. Volymerna för näringsämnen justerades för att få en korrekt
slutkoncentration av respektive ämne: 150 µL fosfat (5,0 g/L), nitrat (75 g/L), silikat (30g/L) (kisel), spårämnen och 75 µL vitaminlösning (se bilaga A). Till flaskorna märkta med
”Monokultur – Si” eller ”Mixad kultur – Si” tillsattes dock inget kisel.
Figur 2. Uppsättning av experiment. I monokultur ingår endast C. affinis, i mixad kultur är både C. affinis och C.
fusiformis tillsatt. Totalt fyra grupper, där respektive grupp består av ett triplikat. Två av grupperna, monokultur – Si och mixad kultur – Si är inget kisel tillsatt. I övrigt har samtliga flaskor L1 medium (bilaga A).
Filtrering och start av experiment (dag 5)
Femhundra mL av varje kultur filtrerades med ett tryck på 15 kPa, genom 3,0 µm filter (GVS Life Science, Bologna, Italien), kopplade till 1 L plastflaskor specifikt utformade för filtrering (Sigma-Aldrich). Cellerna på filtren resuspenderades i 300 µL ASW, blandades, och 50 µL av respektive kultur inokulerades till respektive flaska med L1 medium eller L1 medium utan kisel (figur 2). Kulturerna inkuberades därefter, vilket utgjorde startpunkten av experimentet.
Provtagning (dag 5)
9
Efter två timmars inkubering utfördes provtagningen, där 50 mL av varje kultur överfördes till respektive falconrör (Fisher Scientific) märkt 1-12B. Falconrör placerades på is och vikten mättes med analysvåg, för jämnviktning vid centrifugering. Proverna centrifugerades med Avanti ™ J-25 (Beckman, Indianapolis, USA) i 10 000 g, 10 min och i 4 °C. Supernatanten hälldes sedan försiktigt av, och pellet fångades upp med pipett och överfördes till 2 mL eppendorfrör för ytterligare centrifugering vid 10 000 g, 5 min, 4 °C. Supernatanten
pipetterades av och rören doppades i flytande kväve, och förvarades i -80 °C fram till RNA- extraktion.
RNA-extraktion
Extraktion med TRIzol och Qiagens DNase-behandling
Metoden baserades på Invitrogens protokoll för TRIzol ™ reagens (39). Under hela protokollet förvarades RNA alltid på is och alla reagens blandades alltid innan tillsättning.
Nedfrysta cell pellets resuspenderades med 1 mL TRIzol reagens (Thermo Fisher Scientific) och överfördes till rör med Lyserings-Matrix-E (MP Biomedicals, Kalifornien, USA). Med FastPrep benchtop homogenizer (MP Biomedicals) utfördes homogenisering och lysering av proverna i fyra omgångar i 30 s med hastighet 6,5 m/s. Mellan omgångarna kyldes proverna i is. Sedan inkuberades proverna i 5 m i rumstemperatur (RT).
Varje prov blandades med 200 µL kloroform (Thermo Fisher Scientific) och efter 2 m inkubering i RT, centrifugerades proverna med Centrifuge 54158 R (Eppendorf, Hamburg, Tyskland) i 15 m vid 4 °C. Under tiden tillsattes 500 µL isopropanol (Sigma-Aldrich) till nya 1,5 mL RNase-fria mikrorör (Invitrogen). Vattenfasen (innehållandes RNA) från
centrifugeringen överfördes till dessa rör med isopropanol och blandades med pipettering.
Efter inkubering i 10 m vid 4 °C, centrifugerades proverna i 10 m vid 12 000 g vid 4 °C där en pellet av RNA formades. Supernatanten hälldes av och till RNA pellets tillsattes 1 mL 75
% etanol (VWR, Radnor, USA). Rören blandades på Vortex-Genie 2 (Scientific Industries, Bohemia, USA) för att få pellet att släppa. När pellet lossnade, centrifugerades provet vid 7500 g, 4 °C, i 5 m. Supernatanten pipetterades av och pellet lät lufttorkas i 5 m. För att lösa upp RNA pellet, tillsattes 87,5 µL uppvärmd RNase fritt vatten (Qiagen). Proverna
vortexades, spinnades ner och placerades på is. Sedan förbereddes DNase 1 (Qiagen) genom att blanda 2,5 µL DNase 1 med 10 µL RDD buffer (Qiagen) per prov. Från mixen tillsattes 12,5 µL till varje prov, därefter inkuberades proverna i 20 m i RT för att låta DNase verka.
Upprening av RNA med RNeasy kit
Reningen av RNA fortsatte med Qiagens RNeasy kit (40). Först förbereddes RLT-buffert (Qiagen) genom att blanda 1 ml RLT buffert med 10 µL β-Mercaptoetanol (Sigma-Aldrich).
Av bufferten, tillsattes 350 µL till varje prov följt av 250 µL 96 % etanol (VWR). Proverna blandades och överfördes (cirka 750 µL) till spinkolumner (Qiagen) placerade i 2 mL uppsamlingsrör (Qiagen). Proverna centrifugerades vid 8000 g i 15 s, RT. Sedan återupprepades centrifugeringen genom att vätskan som centrifugerats ned till
uppsamlingsröret överfördes till spinkolumnen på nytt. I spinkolumnens membran återfanns RNA.
Spinkolumnerna placerades i nya uppsamlingsrör och 700 µL RPE buffert (Qiagen) tillsattes, följt av centrifugering vid 8000 g i 15 s vid 4 °C. Den centrifugerade vätskan i
uppsamlingsröret hälldes av och proverna centrifugerades en omgång till för att få bort eventuella rester från buffert, enligt ovan fast i 1 min. Sen överfördes spinkolonnen till nya 1,5 mL elueringsrör, och 25 µL RNase fritt vatten tillsattes direkt ovanpå kolonnen. Proverna
10
inkuberades i 2 m i RT och centrifugerades därefter i 8000 g i 1 min i RT. Proceduren återupprepades med 25 µL RNase fritt vatten som tillsattes igen på kolonnen och proven centrifugerades. I elueringsröret återfanns RNA i totalvolym på 50 µL. Proverna placerades på is och en andra DNase behandling utfördes direkt.
DNase behandling med AMBION Turbo DNA kit
Nästa DNase-behandling baserades på protokoll för AMBION Turbo DNA kit (Thermo Fisher Scientific) (41). Provvolymerna på 50 µL överfördes till 0,2 mL PCR-rör, och 5 µL 10× TURBO DNase Buffer (Thermo Fisher Scientific) och 1 µL TUBO DNase 1 (Thermo Fisher Scientific) tillsattes till respektive rör. För att låta DNase verka, inkuberades proverna i PCR-instrumentet MJ Mini ™ (BIO-RAD, Herculues, USA) i 37 °C i 30 m. Sedan tillsattes 5 µL DNase-inaktiverings reagens (Thermo Fisher Scientific) och proverna inkuberades i 5 m i RT. Sedan centrifugerades proverna vid 10 000 g i 1,5 m vid 4 °C. Supernatanten
(innehållande RNA) pipetterades försiktigt av till nya 1,5 mL eppendorfrör. En alikvot på 5 µL överfördes till ytterligare en uppsättning 1,5 mL eppendorf rör som användes för
kvalitetskontroll. De övriga proven förvarades i – 80 °C.
TapeStation
RNA-kvalité och koncentration bestämdes med TapeStation (Agilent Technologies,
Waldbronn, Tyskland) enligt systemmanualen (42). RNA provbuffert (Agilent Technologies), 5 µL, blandades med 1 µL RNA Ladder (Agilent Technologies) i 0,2 mL plaströr (Agilent Technoligies). Sedan blandades 5 µL RNA provbuffert med 1 µL av respektive prov i samma typ av rör. Proven skakades med IKA MS3 Vortex (Sigma-Aldrich) i 1 m och centrifugerades med bordscentrifugen Frontier ™ 5000 Series Mini (Ohaus, New Jersey, USA) i 2000 g i 1 m.
Därefter värmdes proverna i 72 °C i 3 m med PCR-instrumentet MJ Mini ™ och kyldes sedan ned på is i 2 m, och centrifugerades slutligen igen i 1 m. Proverna var därmed redo för analys med TapeStation och placerades i instrumentet och med mjukvaran startades analysen.
DNA-kontamineringstest
För att kontrollera om RNA proven var helt fria från DNA-kontamination, utfördes en PCR med primers mot DNA, för att sedan visualisera eventuella band med gelelektrofores.
Blandning av mastermix gjordes i UV-bestrålat dragskåp. Mastermixen bestod av följande reagens per prov: 7 µL MilliQ ultrarent vatten, 10 µL 2× Phusion Mastermix (Fisher Scientific), 1 µL 10 µM forward primer och 1 µL 10 µM reverse primer (primer
slutkoncentration 0,5 µM). Mastermixen förbereddes i autoklaverade 2 mL eppendorfrör (Fisher Scentific) för alla prover (1-12B), samt en negativ kontroll. Två mastermix
förbereddes, ena med primers mot 18S rRNA gene och den andra med primers mot CaSIT1.
Till 0,2 mL PCR rör (Fisher Scientific) tillsattes 19 µL av mastermix och 1 µL templat. Till negativ kontroll tillsattes 1 µL MilliQ ultrarent vatten istället för templat.
Rören placerades i Veriti 96 Well Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City, USA) med följande inställningar (tabell 1): initieringsfas där proverna denaturerades vid 94 °C i 5 m, därefter i 35 cykler av denaturering vid 94 °C i 40 s, hybridisering vid 60 °C i 40 s och amplifiering vid 72 °C i 30 s. Till slut termineringsfasen vid 72 °C i 10 m.
Tabell 1. Temperatur, tid och cykler för faserna i PCR. Överst initieringsfas, i mitten denaturering- hybridisering- och amplifieringsfas och underst termineringsfas.
11
En 1,5 % agarosgel förbereddes genom att blanda 150 mL 1× TAE buffert (Tris-acetate EDTA, Thermo Fisher Scientific) med 2,25 g agaros (Thermo Fisher Scientific) i en 200 mL Erlennmeyer flaska (Thermo Fisher Scientific). Blandningen värmdes i mikrovågsugn i cirka tre minuter. När agaros var fullständigt upplöst, tillsättes 8 µL SYBR Safe (Invitrogen,
Carlsbad, USA) och värmdes återigen i några sekunder. Innehållet överfördes till en behållare med kam isatt där gelen fick stelna under 30 minuter i RT. När gelen stelnat och proverna amplifierats färdigt med PCR, dränktes gelen i TAE-buffert i Maxicell ® Primo ™ EC340 (Thermo Fisher Scientific). Sedan blandades 5 µL PCR-produkt från proverna med 1 µL 6×
Loading Dye (Qiagen, Hilden, Tyskland) och applicerades i brunnarna. I en annan brunn tillsättes 5 µL DNA ladder 100 – 1000 baspar (bp) (Thermo Fisher Scientific). Spänning på 90 V kopplades på i 40 min. När elektroforesen var avslutad, analyserades gelen med UV- bestrålning i Gel Doc 4 (Thermo Fisher Scientific).
Uppkomst av band indikerar DNA kontamination, vilket var fallet med CaSIT1 primer, och därför utfördes en tredje DNase-behandling med AMBION Turbo DNA kit. DNA
kontaminering undersöktes därefter återigen med CaSIT1 primers, och denna gång observerades inga band.
NanoDrop
Ytterligare en analys genomfördes med avseende på RNA-kvalité. Detta efter den tredje DNase-behandlingen (till skillnad från analys med TapeStation som analyserade proverna efter två DNase-behandlingar). Till NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific) tillsattes först 1 µL MilliQ ultrarent vatten som blankvärde. Därefter mättes A260/A280-kvot
(spektrofotometrisk beräkning av mjukvara kopplad till NanoDrop) genom att tillsätta 1 µL RNA-prov åt gången.
Test av primers
För att utvärdera olika primers specificitet mot C. affinis, testades totalt sex olika primerpar med PCR och gelelektrofores. Arbetsgången motsvarade den beskriven under ”DNA- kontamineringstest”. Sex mastermix förbereddes för respektive primerpar och analyserades mot DNA från två diatomer: C. affinis och C. fusiformis (samt MilliQ ultrarent vatten som negativ kontroll). Fyra primerpar designades på Linnéuniversitetet för projektet ”Constraining past variations in the global biogeochemical silica cycle” (finansierat av Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse). CaSIT1 var tagen från Kang et al. 2015 och CaELF från från Kang et al. 2012. Samtliga primers köptes från Eurofins Genomics, Luxembourg, Luxembourg.
Primers som testades:
Chaetoceros SIT 2 version 1
Forward: 5’ ACCAGTCAAATCCAATGAAGAG 3’
Reverse: 5’ CACTCTCCCACATAGTCGTC 3’
12 Produkt längd: 148 bp
Chaetoceros SIT 2 version 2 (CaSIT2-2)
Forward: 5’ GCTCTTCATTGGATTTGACTGG 3’
Reverse: 5’ GACTACATCGACAACTACTTTGCC 3’
Produkt längd: 141 bp Chaetoceros SIT D version 1
Forward: 5’ CTGTGATTGTAACGGCAAC 3’
Reverse: 5’ AGATTCATGTCAATGGGCGG Produkt längd: 162 bp
Chaetoceros SIT D version 2
Forward: 5’ TGCGATGTATTGTTTGAAGGTG 3’
Reverse: 5’ GAGTCCAGTGTTGAAGAATGCC 3’
Produkt längd: 179 bp Chaetoceros SIT 1 (CaSIT1)
Forward: 5’ TCTTTCCCTTGCCGTCCTCTC 3’
Reverse: 5’ GGCGGCTCCTGGTGGTAC 3’
Produkt längd: 100 bp Chaetoceros ELF (CaELF)
Forward: 5’ CACCAAGGACGAGGTTGTTTCC 3’
Reverse: 5’ CTCCTGTACTACAACCATAGCGC 3’
Produkt längd: 103 bp (18S rRNA gen)
Forward: 5’ CGGTAAYTCCAGCTCYV 3’
Reverse: 5’ CCGTCAATTHCTTYAAR 3’
Produkt: 558 bp
18S rRNA gen primern användes endast vid DNA-kontamineringstest. Vidare är det en degenerativ primer, vilket innebär att vissa av dess positioner har möjlighet att baspara med mer än en bas (43). Y basparar med C eller T, Rmed G eller A, H med A, C eller T och V med A, C eller G.
Baserat på resultat från primer test, användes CaSIT2-2, CaSIT1 och CaELF för realtids-PCR analys.
Realtids-PCR
Bestämning av optimal koncentration
Inför analys med realtids-PCR bestämdes först den optimala koncentrationen av RNA, med en tvåfaldig spädningsserie. Först poolades lika mängd RNA (4 µL) från varje experimentgrupp,
13
för att erhålla tillräckligt med templat för testet: 4 µL från prov 1B (monokultur kontroll), 6B (monokultur - Si), 9B (mixad kultur kontroll) och 10B (mixad kultur - Si). De prover som hade högst koncentration RNA (ng/µL) valdes från respektive grupp. Slutkoncentrationen av poolen blev 58,48 ng/µL. Att mäta varje grupp för sig är egentligen det mest önskvärda, men p.g.a. tid- och kostnadsaspekter utfördes poolen som beskriven ovan. Därefter späddes poolen till 20,0 ng/µL genom att tillsätta 30,78 µL RNase-fritt vatten. Från denna startkoncentration, späddes provet till 0,2 ng/µL och därefter gjordes en spädningsserie där koncentrationen halverades för varje spädning, totalt 5 spädningar (se bilaga B för beräkningar).
När spädningarna var färdiga, förbereddes tre mastermix, en för varje primer par. De primers som användes var CaSIT1, CaSIT2-2 och CaELF. Spetsar, 1,5 mL rör och pipetter UV-
bestrålades i 10 m. Mastermixar blandades enligt följande per prov, totalt 18 prov: 10 µL iTaq universal SYBR Green 2X (BIO-RAD), 0,6 µL10 mM forward- & 0,6 µL 10 mM reverse primer, 3,55 µL RNase-fritt vatten och 0,25 µL µL iScript reverse transcriptase (BIO-RAD).
Primer koncentration (forward och reverse) i slutvolymen var 0,3 µM.
Femton µL mastermix tillsattes till varje brunn på en vit 96-brunn q-PCR platta (Thermo Fisher Scientific) enligt figur 3, varje spädning för varje primerpar utgjorde ett triplikat samt en negativ och tre positiva kontroll(er) för varje mastermix. Därefter tillsattes 5 µL RNA- templat till de olika spädningar som beskrevs ovan. Till de positiva kontrollerna tillsattes 5 µL 0,2 ng/µL C. affinis DNA och till de negativa kontrollerna 5 µL RNase-fritt vatten (inget triplikat av negativa kontroller). De efterföljande q-PCR uppläggen har förberetts på ett motsvarande sätt som i figur 3.
Figur 3. Schema för provtillsättning med samtliga seriespädningar (tvåfaldig) och primers, samt positiva- och negativa kontroller.
När mastermix och prover var tillsatta, klistrades en tunn plastfilm (Roche Applied Science, Penzberg, Tyskland) ovanpå som täckte plattan. Därefter centrifugerades plattan som hastigast med Allegra ™ 21 Centrifuge (Beckman), för att spinna ned proverna. Slutligen placerades plattan i LightCycler ® 480 (Roche) instrumentet med program enligt tabell 2, reverse transkription i 10 m, vid 50 °C, därefter följde initieringsfas vid 95 °C i 1 min för att denaturera proverna och aktivera polymeraset. Sedan utfördes 40 cykler av denaturering vid 95 °C i 15 s och hybridisering/amplifieringsfas vid 60 °C i 60 s.
Tabell 2. Vid första cykeln verkar enzymet reverse transkriptas. Sedan följer initieringsfas. Denaturering sker vid 95 °C, hybridisering och amplifiering sker båda vid 60 °C.
14
Den optimala koncentrationen bestämdes till 0,1 ng/µL.
Effektivitetstest
För att undersöka hur effektiva primers är att amplifiera PCR produkt, utfördes en tiofaldig- seriespädning med fem olika koncentrationer av templatet, där Ct-värden användes för att konstruera en kalibreringskurva. Poolen på 20 ng/µL av proverna 1B, 6B, 9B och 10B som förbereddes för bestämning av optimal koncentration för att späda till följande
koncentrationer: 10, 1, 0,1 0,01 och 0,001 ng/µL med RNase-fritt vatten (se bilaga B för beräkningar). Därefter förbereddes samma mastermix som vid bestämning av optimal koncentration, och mastermix och proverna applicerades i brunnar på ett motsvarande sätt (figur 3). Även samma PCR-inställningar användes med LightCycler ® 480 (tabell 2).
Test av primerkoncentration med CaSIT2-2
På grund av primer-dimers som uppstod med CaSIT2-2, som misstänktes störa reaktionen, utfördes ett test med olika primerkoncentrationer i ett försök att eliminera primer-dimers. De koncentrationer som testades var 0,15 µM och 0,075 µM, enligt tidigare beskriven
arbetsgång. Spädningarna utfördes genom att halvera volym tillsatt forward- och reverse primer och tillsätta motsvarande volym RNase-fritt vatten. Primer-dimers eliminerades inte i försöket och CaSIT2-2 blev därför exluderat fråm analys av prov 1-12B.
Analys av prover
För att analysera proverna 1 – 12 B, späddes samtliga prover i två steg: först till 4 ng/µL och därefter till 0,1 ng/µL, som enligt tidigare bestämdes till den optimala koncentrationen. Se bilaga B för detaljerat schema av spädningar. Därefter förbereddes tre mastermix: en för varje gen (CaELF och CaSIT1) och en med CaELF utan enzymet reverse transcriptase, för att testa eventuell DNA-kontaminering. Primerconcentration var 0,3 µM i samtliga fall. Blandning av mastermix och spädningar (15 µL mastermix och 5 µL templat) och analys med LightCycler
® 480 (tabell 2) utfördes därefter på samma sätt som tidigare beskrivet.
Resultat (Ct-värden) från LightCycler ® 480 (mjukvara) överfördes till Microsoft ® Excel, och beräkningar av normaliserat värde av genuttrycket och jämförelser med olika kalibratorer utfördes med (samt övriga beräkningar) med Excel. Beräkningar och rådata för prov 1-12B är presenterade i bilaga D.
Statistisk analys
Ett tvåsidigt ANOVA-test utfördes med SPSS Statistics för att utvärdera effekten av
kiselkoncentration och konkurrens på CaSIT1 genuttryck. Även ett tvåsidigt T-test utfördes för att testa förändring i genuttryck mellan behandlingarna. Se bilaga D för beräkningar.
Resultat
Test av primers med PCR
För att utvärdera om primers hybridiserar specifikt med C. affinis DNA utfördes PCR och gelelektrofores. Totalt sex olika primers analyserades, varav tre var specifika mot och
15
ampliferade C. affinis DNA; CaSIT1 (100 bp), CaELF (103 bp) och CaSIT2-2 (141 bp). Ingen av dessa primers amplifierade DNA från C. fusiformis och valdes därför för vidare analys med q-PCR. Foto av agarosgel med CaSIT1, CaELF och CaSIT2-2 primers har sammanfogats i figur 4.
Figur 4. Gelfoto av agarosgel med PCR-produkt. Resultat från tre primers redovisas. Affi = C. affinis, Fusi = C.
fusiformis, Neg = negativ kontroll, Lad = DNA-stege (100 – 1000 baspar). Diatomer i grönt har testats mot CaSIT1 primer, i rött mot CaELF primer och i blått mot CaSIT2-2 primer.
RNA-kvalité och DNA-kontaminering
Efter RNA-extraktion mättes kvalité och koncentration. Se tabell 3 för redogörelse av
koncentration i ng/µL och RIN-värde från TapeStation, samt kvoten A260/A280 från NanoDrop för samtliga 12 prover. Även RIN medelvärde för respektive grupp är beräknat.
Koncentrationen varierade mellan 20,0 och 78,7 ng/µL, RIN-värde varierade mellan 3,3 och 5,4 och A260/A280 kvot varierade mellan 1,70 och 1,95 med undantag för prov 11B som erhöll 1,56. Notera att RIN beräknades efter två DNase-behandlingar, till skillnad från A260/A280 som beräknades efter tre.
Tabell 3. Redovisning av data från RNA-extraktion. Prover, vilken grupp de tillhör, tid och datum för isolering av DNA, koncentration, RIN-värde och gruppernas medelvärde samt A260/A80 kvot beskrivs.
DNA-kontamination påvisades i de flesta prover efter två DNase-behandlingar (figur 5).
Därför utfördes en tredje DNase-behandling, varefter kontaminering kontrollerades igen. Efter tredje DNase-behandlingen observerades inga band motsvarande amplifiering av DNA med CaSIT1 primer (figur 5). Primer mot 18S rRNA gen påvisade däremot ingen kontaminering (data ej redovisad), vilket troligtvis beror på dess oförmåga att hybridisera till avsedd
16
målsekvens (d.v.s. även med målsekvens närvarande). Frånvaro av primer-dimer i brunn med negativt prov efter tre DNase-behandlingar (figur 5) är misstänksamt, men kan eventuellt förklaras av att ej tillräcklig volym mastermix tillsattes till negativ prov. Cirka 10 µL tillsattes, men skulle egentligen varit 19 µL.
Figur 5. Gelfoto av DNA-kontamineringstest efter två DNase-behandlingar (överst) och tre (underst). CaSIT1 primer användes i båda fallen. Primer-dimers observeras i båda gelerna, men i den övre gelen observeras även band (100 bp) just ovanför primer-dimers vilket indikerar DNA-kontamination. Siffror 1-12 motsvarar prov 1- 12B, N negativt prov och L DNA stege (100-1000 bp).
Bestämning av optimal koncentration
Tvåfaldig spädningsserie utfördes för att bestämma vilken koncentration som var optimal för analys av prover 1-12B med realtids-PCR. Ct-värde inom intervallet 18 och 30 är optimalt, då är templatkoncentration varken för hög eller låg. Två koncentrationer för primer CaELF och CaSIT1 hamnade inom intervallet, 0,2 och 0,1 ng/µL och 0,1 ng/µL valdes för vidare analys.
CaSIT2-2 hade höga Ct-värden vid samtliga spädningar, och positivt utslag vid
negativkontroll tyder på kontaminering eller närvaro av primer-dimers. Från smältanalysen (figur 6A) identifierades två toppar för CaSIT2-2. Den senare toppen (ca 82 °C) motsvarar CaSIT2-2 produkt, medan primer-dimer troligtvis motsvarade den tidigare (ca 75 °C). Från gelelektroforesen (figur 4) identifierades endast en produkt samt primer-dimers, därför motsvarar toppen vid ca 75 °C troligtvis primer-dimer. Det amplifierade materialet i den negativa kontrollen var alltså primer-dimer.
Endast en topp i smältanalysen identifierades för CaELF (ca 79 °C) och CaSIT1 (ca 82 °C) vilket innebär endast en produkt amplifierats med respektive primer (figur 6B).
Se bilaga C för rådata av spädningsserien.
17
Figur 6. Skärmbild på smälttoppar med LightCycler ® 480 efter tvåfaldig spädningsserie. I A visas endast värden från CaSIT2-2 triplikat där två toppar observeras, ena motsvarade primer-dimer (ca 75 °C) och den andra CaSIT2-2 (ca 82 °C). I B observeras också två toppar men som representerar CaELF och CaSIT1. På X-axeln anges temperatur, Y-axeln (negativa) förstaderivatan i fluorescens (465-510 nm) genom temperatur.
Primerkoncentration 0,3 µM.
Test av primerkoncentrationer med CaSIT2-2
Med en primerkoncentration på 0,3 µM uppstod omfattande primer-dimers för CaSIT2-2 (figur 6 och B1), vilket misstänktes störa reaktionen. Därför utfördes ett test med lägre koncentrationer av CaSIT2-2 primer på 0,15 och 0,075 µM. Resultatet blev liknande som vid 0,3 µM, d.v.s. toppar av primer-dimers runt 75 °C och vid ca 82 °C. Toppen vid 82 °C blev dock svagare med ökande spädning. Av denna anledning användes inte CaSIT2-2 vid vidare analys. Rådata och smältanalys finns under bilaga C.
Effektivitetstest
En kalibreringskurva genererades genom en tiofaldig seriespädning för CaSIT1 (figur 7) och CaELF (figur 8). Ct värden tillsammans med kurvans lutning användes för att bestämma effektiviteten för respektive primer. Endast tre punkter (0,1, 0,01 och 0,001 ng/µL) användes för att beräkna kalibreringskurvan, detta på grund av att Ct-värden från de två högsta
spädningar avvek och uteslöts därför från beräkningen.
Effektiviteten beräknades för CaSIT1 och CaELF till 2,25 (125 %) och 1,94 (94,2 %).
Determinationskoefficienten (R2) för CaSIT10 och CaSIT1 beräknades båda till 0,999 med Excel (figur 7 och 8).
18
Figur 7. Standardkurva (tiofaldig seriespädning) med CaSIT1 primer. På Y-axeln anges Ct-värdet, och på X- axeln logaritmerad koncentration av de tre värden som användes (0,001, 0,01 och 0,1 ng/µL). Även lutning (- 2,85) och R2 (0,99) är beräknat. Effektiviteten beräknades med 𝐄 = 𝟏𝟎(−
𝟏 𝐥𝐮𝐭𝐧𝐢𝐧𝐠)
.
Figur 8. Standardkurva (tiofaldig seriespädning) med CaELF primer. På Y-axeln anges Ct-värdet, och på X- axeln logaritmerad koncentration av de tre värden som användes (0,001, 0,01 och 0,1 ng/µL). Även lutning (- 3,47) och R2 (0,99) är beräknat. Effektiviteten beräknades med 𝐄 = 𝟏𝟎(−
𝟏 𝐥𝐮𝐭𝐧𝐢𝐧𝐠)
.
Analys av prover 1-12 B:
Genuttryck av CaSIT1 normaliserades med referensgenen CaELF, och förhållande i genuttryck beräknades med olika kalibratorer. Se bilaga D för rådata och beräkningar.
Resultat av genuttrycksanalys presenteras i figur 9-11. Som en extra kontroll av DNA-
kontaminering, analyserades varje prov utan tillsättning av enzymet reverse transcriptase med realtids-PCR. Positivt resultat indikerar DNA-kontaminering, eftersom RNA inte konverteras till cDNA utan enzymet. Resultatet var negativt för samtliga prov; ingen amplifiering
observerades (tabell 14 i blaga D).
y = -2,845x + 26,033 R² = 0,9987
28 29 30 31 32 33 34 35
-4 -3 -2 -1 0
Cykeltröskelvärde (Ct)
Logaritmerad koncentration (ng/µL)
Standardkurva med CaSIT1 primer
y = -3,47x + 20,897 R² = 0,9987
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
-4 -3 -2 -1 0
Cykeltröskelvärde (Ct)
Logaritmerad koncentration (ng/µL)
Standardkurva med CaELF primer
19
CaSIT1 genuttryck vid kiselbegränsning, konkurrens och kombinerad effekt I figur 9 presenteras genuttrycket av CaSIT1 jämfört mot monokultur kontroll (som
kalibrator). Över lag resulterade -Si begränsning i en signifikant ökning av CaSIT1 genuttryck (ANOVA: p = 0,009, n = 12). Däremot vid konkurrens med annan art, minskade CaSIT1 genuttryck signifikant (ANOVA: p = 0,02, n = 12). Den kombinerade effekten av de två behandlingarna visade ingen signifikant effekt av genuttrycket (ANOVA: p = 0,3, n = 12).
Det kan noteras att standardavvikelsen var högre för mixade kulturer jämfört med
monokulturer (0,35 mixad kultur kontroll, 0,44 mixad kultur -Si, 0,16 monokultur kontroll och 0,05 monokultur -Si)
Figur 9. På Y-axeln anges förändring i genuttryck av CaSIT1 i relation till monokultur kontroll, X-axeln anger respektive grupp. Medelvärde av triplikat redovisas. Felstaplar avspeglar standardavvikelsen. Relativt genuttryck beräknades med ekvationen 𝐑 = 𝟐−∆∆𝐂𝐭.
CaSIT1 genuttryck vid kiselbegränsning
Kiselbegränsning i monokultur resulterade i signifikant ökning i CaSIT1 genuttryck i
förhållande till kontrollen (t-test: p < 0,05), en ökning med cirka 80 % (figur 10). Däremot var det inga statistiska skillnader mellan mixad kultur kontroll och mixad kultur -Si (t-test: p = 0,21; i linje med hög standardavvikelse), även om det fanns en tendens till högre uttryck i mixad kultur -Si.
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 1,80 2,00
Monokultur kontroll Monokultur -Si Mixad kultur kontroll
Mixad kultur -Si
Förängdring i genuttryck av CaSIT1
Grupper
Förändring i genuttryck av CaSIT1 med
monokultur kontroll som kalibrator
20
Figur 10. På Y-axeln anges förändring i genuttryck av CaSIT1. X-axeln anger respektive grupp. Monokultur -Si och mixad kultur -Si är beräknat med respektive kontrollgrupp som kalibrator. Medelvärde av triplikat redovisas.
Felstaplar avspeglar standardavvikelsen. Relativt genuttryck beräknades med ekvationen 𝐑 = 𝟐−∆∆𝐂𝐭.
CaSIT1 genuttryck vid konkurrens med C. fusiformis
I figur 11 presenteras genuttryck av CaSIT1 vid konkurrens mellan C. affinis och C.
fusiformis. I både kontrollgrupp och -Si var det inga statistiska skillnader (t-test: p > 0,12), men en tendens till minskning på cirka 40 % av genuttrycket observerades i de mixade kulturerna.
Figur 11. På Y-axeln anges förändring i genuttryck av CaSIT1, X-axeln anger respektive grupp. Mixade kulturer är beräknade med respektive monokulturgrupp som kalibrator. Medelvärde av triplikat redovisas. Felstaplar avspeglar standardavvikelsen. Relativt genuttryck beräknades med ekvationen 𝐑 = 𝟐−∆∆𝐂𝐭.
Diskussion
Syftet med examensarbetet var att med realtids-PCR mäta genuttryck av CaSIT1 och CaSIT2 i diatomen C. affinis under olika miljöförhållanden. Algen kultiverades i två olika medier, där ena utgjorde kontroll och den andra utan tillsatt kisel. Därutöver, för respektive medium, odlades algen i monokultur samt i mixad kultur tillsammans med ytterligare en diatom, C.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 2,6 2,8
Kontroll − Si
Förändring i genuttryck av CaSIT1
Förändring i genuttryck av CaSIT1 vid kiselbrist
Monokultur Mixad kultur
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
Förändring i genuttryck av CaSIT1
Monokulturer Mixade kulturer
Förändring i genuttryck av CaSIT1 vid konkurrens
− Si Kontroll
21
fusiformis. Relativt genuttryck beräknades med delta delta-Ct metoden. CaELF användes som referensgen för att normalisera genuttrycket.
Primers
För att undersöka vilka primers som specifikt amplifierade C. affinis DNA, utfördes PCR och gel-elektrofores. Eventuell amplifiering av C. fusiformis DNA skulle också innebära att primern inte var användbar vid analys i det mixade samhället. Av de sex primers som
testades, resulterade tre i amplifierad produkt mot enbart C. affinis (figur 4): CaSIT1, CaSIT2- 2 och CaELF. För CaSIT2-2 amplifierades också tydliga primer-dimers, vilket indikerar ej optimal design. I synnerhet är nukleotidsekvensen vid 3’-änden viktig att konstruera så basparning med samma eller motsvarande primer undviks (21).
RNA-kvalité
Ett intakt RNA är avgörande för pålitliga resultat vid mätning av genuttryck (31). TapeStation genererar ett objektivt värde av RNA kvalitén, till skillnad från subjektiva metoder där visuell tolkning av förhållande mellan 18S och 28S rRNA band på gel utförs (31,32). Ett RIN-värde på minst 5 rekommenderas om provet ska analyseras med realtids-PCR (44). Endast tre prover i föreliggande studie erhöll ett RIN på minst 5 (tabell 3), vilket indikerar delvis degraderat RNA i de flesta prover. Proverna analyserades också med NanoDrop för att beräkna A260/A280. Kvot mellan 1,8 – 2,0 bedöms som god kvalité av RNA (45). De flesta prover hamnade inom intervallet (tabell 3). Prov 11B erhöll det lägsta värdet för såväl A260/A280 kvot (1,56) och RIN (3,3). Resultaten från NanoDrop indikerar frånvaro av
kontamination i form av proteiner för de flesta prover, och närvaro av RNA. Kvoten A260/A280
förser dock inte med information gällande RNA integritet, till skillnad från RIN. För att förhindra RNA degradering är det viktigt att rengöra ytor med medel som eliminerar RNaser (exempelvis RNase Zap (46)) och att snabbt efter cellskörd placera cellerna i en
konserverande lösning om TRIzol.
Det är svårt att förutse vilken inverkan DNase-behandlingar har på RNA kvalité. DNase klyver förvisso specifikt DNA (41), men upprepad upptining och nedfrysning påverkar RNA integritet negativt (47) och efterföljande laboratoriearbete ökar risk för exponering av RNaser.
Därför hade det varit önskvärt att analysera proverna med TapeStation även efter den tredje DNase-behandlingen. Möjligtvis behöver protokollet för DNase-behandlingarna modifieras, för att slippa genomföra proceduren upprepande gånger vilket är både tids- och
kostnadskrävande. Ett förslag är att utöka inkuberingstid efter DNase-tillsätts, upp till 2 h i 37
°C istället för 30 m med AMBION Turbo DNA kit (3), vilket ger enzymet mer tid att verka.
Förberedande analyser med realtids-PCR
Den optimala koncentration för analys av prov 1-12B bestämdes genom en tvåfaldig
spädningsserie. En pool beståendes av representativa från samtliga fyra grupper konstruerades och som tidigare nämnt förbereddes poolen av tid- och kostnadsskäl. Två spädningar (0,2 och 0,1 ng/µL) av CaSIT1 hamnade inom Ct-intervallet 18-30, och för CaELF hamnade samtliga värden inom intervallet. Lägsta koncentration (0,1 ng/µL) valdes till realtids-PCR analysen av proverna därför att standardavvikelsen var högre vid 0,2 ng/µL för såväl CaELF som CaSIT1 (figur B6).
