IN VITRO TESTOVÁNÍ BIODEGRADABILNÍCH CÉVNÍCH NÁHRAD S MALÝM PRŮMĚREM

IN VITRO TESTOVÁNÍ BIODEGRADABILNÍCH CÉVNÍCH NÁHRAD S MALÝM PRŮMĚREM

Diplomová práce

Studijní program: N3106 – Textilní inženýrství

Studijní obor: 3106T018 – Netkané a nanovlákenné materiály Autor práce: Bc. Tereza Pavlíková

Vedoucí práce: Mgr. Jana Horáková Konzultant: Ing. Petr Mikeš, PhD.

Prohlášení

Byla jsem seznámena s tím, že na mou diplomovou práci se plně vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., o právu autorském, zejména § 60 – školní dílo.

Beru na vědomí, že Technická univerzita v Liberci (TUL) nezasahuje do mých autorských práv užitím mé diplomové práce pro vnitřní potřebu TUL.

Užiji-li diplomovou práci nebo poskytnu-li licenci k jejímu využití, jsem si vědoma povinnosti informovat o této skutečnosti TUL; v tomto případě má TUL právo ode mne požadovat úhradu nákladů, které vynaložila na vytvoření díla, až do jejich skutečné výše.

Diplomovou práci jsem vypracovala samostatně s použitím uvedené literatury a na základě konzultací s vedoucím mé diplomové práce a konzultantem.

Současně čestně prohlašuji, že tištěná verze práce se shoduje s elektronickou verzí, vloženou do IS STAG.

Datum: 14. 5. 2015

Podpis:

Poděkování

Na tomto místě bych ráda poděkovala především vedoucí mé diplomové práce Mgr. Janě Horákové za velkou ochotu a za poskytnutí svého času, velmi cenných rad a věcných připomínek při vypracování této diplomové práce. Dále bych chtěla poděkovat Ing. Petrovi Mikešovi, PhD. za motivaci k řešení této problematiky a cenné poznatky. Poděkovaní patří též Ing. Patrikovi Novákovi a Ing. Alešovi Šamanovi za spolupráci při výrobě scaffoldů.

Další poděkování patří celé Katedře netkaných textilií a nanovlákenných materiálů na Technické univerzitě v Liberci za poskytnutí zázemí pro provedení všech experimentů. Zvláště pak celému osazenstvu biologické laboratoře za trpělivost a vysvětlení postupů.

Chtěla bych také vyjádřit velký dík své rodině, partnerovi a blízkým přátelům, kteří mi poskytli velkou psychickou podporu po celou dobu mého studia.

Anotace

Tato práce se zabývá in vitro testováním biodegradabilních tkáňových nosičů určených pro maloprůměrové cévní náhrady. Komerční výroba z konvenčních materiálů u cév menších než 6 mm v současnosti selhává z důvodu trombogenního charakteru syntetických materiálů. Pro vyřešení tohoto problému se zdají být slibným kandidátem náhrady vyrobené z biodegradabilních materiálů. V této práci byly jako materiály pro cévní náhrady použity polykaprolakton a kopolymer kyseliny polymléčné a polykaprolaktonu, které byly elektrostaticky zvlákněny. Byly zkoumány jejich morfologické a materiálové vlastnosti. Práce se zaměřila na jejich kultivaci s fibroblasty a s endotelovými buňkami a na statickou a dynamickou inkubaci trombocytů. In vitro testy prokázaly vhodnost těchto materiálů při použití ve vaskulárním tkáňovém inženýrství.

Klíčová slova

cévní náhrady, elektrostatické zvlákňování, tkáňové inženýrství, fibroblasty, endotelové buňky, trombocyty, bioreaktor

Annotation

This work deals with in vitro testing of biodegradable small-diameter vascular grafts. Commercial production of grafts from conventional materials with a diameter smaller than 6 mm currently fails because of thrombogenic nature of synthetic materials. Promising candidate to solve this problem seems to be the replacements made from biodegradable materials. In this work, polycaprolactone and copolymer poly(lactic-co-caprolactone) were used for manufacturing of vascular grafts prepared by electrospinning method. Their morphological and material properties were investigated.

The work was focused on the incubation of the material with fibroblasts and the endothelial cells, static and dynamic incubation with thrombocytes. In vitro assays demonstrated the suitability of these materials form using in vascular tissue engineering.

Key words

vascular grafts, electrospinning, tissue engineering, fibroblasts, endothelial cells, platelets/thrombocytes, bioreactor

- 6 -

Obsah

Seznam obrázků ... - 8 -

Seznam tabulek ... - 10 -

Seznam grafů... - 10 -

Seznam zkratek a symbolů ... - 11 -

Úvod ... - 12 -

1 Teoretická část ... - 14 -

1.1 Cévní soustava člověka ... - 14 -

1.1.1 Stavba stěny cévy ... - 14 -

1.2 Cévní náhrady ... - 16 -

1.2.1 Typy... - 16 -

1.2.2 Výroba ... - 17 -

1.3 Elektrostatické zvlákňování ... - 18 -

1.3.1 Princip ... - 18 -

1.3.2 Zařízení pro elektrostatické zvlákňování ... - 19 -

1.4 Tkáňové inženýrství cévních náhrad ... - 20 -

1.4.1 Scaffoldy ... - 21 -

1.4.2 Materiály pro scaffoldy ... - 22 -

1.4.3 Modifikace cévních náhrad ... - 24 -

1.5 Buněčné kultury ... - 26 -

1.5.1 Fibroblasty ... - 26 -

1.5.2 Endotelové buňky ... - 27 -

1.5.3 Trombocyty ... - 28 -

1.6 In vitro testy ... - 28 -

1.6.1 Test viability buněk (MTT test) ... - 28 -

1.6.2 Fluorescenční mikroskopie... - 29 -

1.6.3 Skenovací elektronová mikroskopie (SEM) ... - 29 -

- 7 -

1.7 Dynamický kultivační systém ... - 29 -

2 Experiment - porovnání PCL a PLC ... - 31 -

2.1 Materiály a metodika ... - 31 -

2.1.1 Použité materiály a jejich příprava ... - 31 -

2.1.2 Charakterizace materiálů ... - 32 -

2.2 Metodika biologického testování ... - 35 -

2.2.1 Příprava vzorků ... - 35 -

2.2.2 Příprava bioreaktoru ... - 35 -

2.2.3 Buněčné kultury a nasazení buněk ... - 36 -

2.2.4 Testování buněčné adheze a proliferace ... - 37 -

2.3 Výsledky charakterizace materiálů ... - 40 -

2.4 Výsledky biologického testování ... - 44 -

2.4.1 3T3 myší fibroblasty ... - 44 -

2.4.2 Endotelové buňky HUVEC ... - 48 -

2.4.3 Trombocyty - statická inkubace ... - 52 -

2.4.4 Trombocyty - dynamická inkubace ... - 56 -

3 Experiment - vliv oxidu dusnatého na endotelizaci ... - 59 -

3.1 Materiály a metodika ... - 59 -

3.1.1 Materiály a jejich příprava ... - 59 -

3.1.2 Příprava vzorků ... - 59 -

3.1.3 Buněčná kultura a nasazení buněk ... - 59 -

3.1.4 Testování buněčné adheze a proliferace ... - 60 -

3.2 Výsledky biologického testování ... - 60 -

Diskuze výsledků ... - 64 -

Závěr ... - 66 -

Použitá literatura ... - 68 -

Zdroje obrázků ... - 74 -

- 8 -

Seznam obrázků

Obrázek 1 - Ilustrativní model cévy [1]. ... - 14 -

Obrázek 2 - Histologický řez cévou [2]. ... - 14 -

Obrázek 3 - Srovnání cévní stěny arterie a vény [3]. ... - 16 -

Obrázek 4 - Schéma elektrostatického zvlákňování metodou Nanospider [4]. ... - 19 -

Obrázek 5 - Schéma elektrostatického zvlákňování cévních náhrad. [5]... - 20 -

Obrázek 6 - Strukturní vzorec PCL [6]. ... - 23 -

Obrázek 7 - Strukturní vzorec PLA [6]. ... - 24 -

Obrázek 8 - Stukturní vzorec PLC [6]. ... - 24 -

Obrázek 9 - Prospěšné vlastnosti NO v cévách [7]. ... - 25 -

Obrázek 10 - Struktura cyclam-NAP-thiolakton komplexu syntetizovaného z cyclamu (1, 4, 8, 11-tetraazacyclotetradekan) a NAP-thiolaktonu [8]. ... - 26 -

Obrázek 11 - Snímek z fluorescenční mikroskopie 3T3 myších fibroblastů obarvených fluoresceinem. ... - 27 -

Obrázek 12 - Snímek z fluorescenční mikroskopie endotelových buněk HUVEC obarvených fluoresceinem. ... - 27 -

Obrázek 13 - Příklad MTT testu [9]. ... - 28 -

Obrázek 14 - Příklad měření kontaktního úhlu pomocí SeeSystemu. ... - 34 -

Obrázek 15 - Model bioreaktoru. ... - 35 -

Obrázek 16 - Fotografie bioreaktoru pro dynamickou inkubaci trombocytů, zobrazení jeho umístění v CO2 inkubátoru. ... - 36 -

Obrázek 17 - SEM snímky, histogramy a průměry vláken PCL a PLC. ... - 40 -

Obrázek 18- Snímky z fluorescenčního mikroskopu jader 3T3 myších fibroblastů obarvených propidium jodidem (1., 3., 7. a 14. den kultivace): a) PCL, b) PLC (měřítko 100 μm). ... - 45 -

Obrázek 19 - Snímky z fluorescenční mikroskopie 3T3 myších fibroblastů obarvených phalloidiniem-FITC (zelená) a DAPI (modrá) (1., 3., 7. a 14. den kultivace): a) PCL, b) PLC (měřítko 100 μm). ... - 46 -

Obrázek 20 - Snímky z fluorescenčního mikroskopu jader 3T3 myších fibroblastů obarvených propidium jodidem po 14 dnech kultivace: a) PCL, b) PLC. ... - 46 -

Obrázek 21 - SEM snímky 3T3 myších fibroblastů (1., 3., 7. a 14. den kultivace): a) PCL, b) PLC (zvětšení 1000x). ... - 48 -

- 9 -

Obrázek 22 - Snímky z fluorescenčního mikroskopu jader endotelových buněk HUVEC obarvených propidium jodidem (1., 3., 7. a 14. den kultivace): a) PCL, b) PLC

(měřítko 100 μm). ... - 50 - Obrázek 23 - Snímky z fluorescenční mikroskopie endotelových buněk HUVEC

obarvených phalloidiniem-FITC (zelená) a DAPI (modrá) (1., 3., 7. a 14. den

kultivace): a) PCL, b) PLC (měřítko 100 μm). ... - 50 - Obrázek 24 - SEM snímky endotelových buněk HUVEC (1., 3., 7. a 14. den kultivace): a)

PCL, b) PLC (zvětšení 1000x). ... - 51 - Obrázek 25 - Snímky z fluorescenční mikroskopie adherovaných trombocytů po:

a) 2 hodinách, b) 4 dnech statické inkubace (měřítko 100 μm). ... - 54 - Obrázek 26 - SEM snímky trombocytů po 2 hodinách statické inkubace na: a) PCL nm, b)

PCL um, c) PLC (zvětšení 3000x). ... - 54 - Obrázek 27 - SEM snímky a) aktivovaných a b) agregovaných trombocytů na

mikrovlákenné vrstvě z PLC po 1 dni inkubace. ... - 55 - Obrázek 28 - Snímek z elektronového mikroskopu jednovrstvé cévní náhrady z PLC...- 56

--

Obrázek 29 - Snímek z elektronového mikroskopu dvouvrstvé cévní náhrady z PCL...- 57 - -

Obrázek 30 - Snímky ze skenovací elektronové mikroskopie trombocytů po 2 hodinách dynamické inkubace: a) PCL nm, b) PLC μm (zvětšení 505x a 5050x). ... - 58 - Obrázek 31 - Snímky z fluorescenčního mikroskopu jader endotelových buněk HUVEC

obarvených propidium jodidem (1., 3., 7. a 14. den kultivace): a) PCL kontrolní, b) PCL+cyclam (měřítko 100 μm). ... - 61 - Obrázek 32 - Snímky z fluorescenční mikroskopie endotelových buněk HUVEC

obarvených phalloidiniem-FITC (zelená) a DAPI (modrá) (1., 3., 7. a 14. den

kultivace): a) PCL kontrolní, b) PCL+ cyclam (měřítko 100 μm). ... - 61 - Obrázek 33 - SEM snímky endotelových buněk HUVEC (1., 3., 7. a 14. den kultivace): a)

PCL kontrolní, b) PCL+cyclam (zvětšení 1000x). ... - 63 -

- 10 -

Seznam tabulek

Tabulka 1- Plošná hmotnost a tloušťka vrstev PCL a PLC. ... - 41 - Tabulka 2- Vyhodnocení krystalinity vzorků... - 44 -

Seznam grafů

Graf 1 - Výsledky měření kontaktního úhlu na vlákenné vrstvě a fólii z PCL a PLC. ... - 41 - Graf 2 - Termická křivka PCL. ... - 42 - Graf 3 - Termická křivka PLC. ... - 43 - Graf 4 - MTT test po 1, 3, 7 a 14 dnech kultivace 3T3 myších fibroblastů na scaffoldech z

PCL a PLC. ... - 45 - Graf 5 - Počet buněk po 1, 3, 7 a 14 dnech kultivace 3T3 myších fibroblastů na scaffoldech

z PCL a PLC. ... - 47 - Graf 6 - MTT test po 1, 3, 7 a 14 dnech kultivace endotelových buněk HUVEC na

scaffoldech z PCL a PLC.. ... - 49 - Graf 7 - Počet buněk po 1, 3, 7 a 14 dnech kultivace endotelových buněk HUVEC

na scaffoldech z PCL a PLC.. ... - 51 - Graf 8- MTT test po 2 hodinách, 1, 4 a 7 dnech statické kultivace trombocytů na

scaffoldech z PCL a PLC. ... - 53 - Graf 9- MTT test po 1, 3, 7 a 14 dnech kultivace endotelových buněk na scaffoldech z PCL a PCL+cyclam.. ... - 60 - Graf 10 - Počet buněk po 1, 3, 7 a 14 dnech kultivace endotelových buněk HUVEC na

scaffoldech z kontrolního PCL a PCL+cyclam.. ... - 62 -

- 11 -

Seznam zkratek a symbolů

3T3-SA Linie 3T3 myších fibroblastů Swiss Albino A_hm Plošná hmotnost [mg/cm²]

BSA Bovinní sérový albumin

DMEM Dulbecco's Modified Eagle's medium – kultivační médium DSC Diferenční kompenzační kalorimetrie

EBM – 2 Endothelial cell basal medium – kultivační médium ECM Extracelulární matrix

FBS Fetální bovinní sérum FITC Fluorescein isothiokyanát

HUVEC Human umbilical vein endothelial cells – lidské endotelové buňky in vitro Testování v laboratorních podmínkách

in vivo Testování prováděné na zvířatech MTT Test buněčné viability

NO Oxid dusnatý P Porozita [%]

PBS Phosphate-buffered saline – fosfátový pufr PCL Polykaprolakton

PI Propidium jodid PLA Kyselina polymléčná

PLC Kopolymer kyseliny polymléčné a polykaprolaktonu PTFE Polytetrafluorethylen

SEM Skenovací elektronová mikroskopie TEBV

Totally engineered blood vessels - Tkáňovým inženýrstvím připravené cévní náhrady

TRS Thrombocyte rich solution – trombocytový roztok V_hm objemová hmotnost [g/cm³]

XRD Rentgenová difrakční analýza

Z Zaplnění [%]

ρ Hustota [g/cm³]

- 12 -

Úvod

V současné době představují kardiovaskulární onemocnění zásadní problém, jelikož v jejich důsledku ročně umírají miliony lidí. Ti se setkávají s problémy, jako je ateroskleróza, hypertenze nebo diabetes, které způsobují často nevratné poškození krevních cév. V důsledku toho dochází k srdečním selháním, mozkovým mrtvicím nebo nekrózám tkání dolních končetin a následným amputacím. Pokud se jedná o takto těžce poškozené cévy, konzervativní způsoby léčby selhávají a je nutno přistoupit k nahrazení cévy, obvykle formou bypassu, čili přemostění poškozeného úseku cévy cévní náhradou. Cévy se nahrazují i z důvodu poranění, které poškodilo cévu natolik, že ji už nelze rekonstruovat.

Vývoj cévních náhrad se datuje již do konce 19. století, kdy Jaboulay a Briau poprvé autotransplantovali tepny psům. V roce 1906 pak Goyanes použil autologní žilní štěp při náhradě úseku podkolenní tepny (arteria poplitea) postižené výdutí. O rok později došlo i k náhradě na podklíčkové tepně. V té době se prováděly pokusy i s tepennými alotransplantáty. Jejich konzervací se zabýval Carrel a Guthrie. Velkým zvratem ve vývoji cévních náhrad byla 2. světová válka, kdy došlo k obrovskému pokroku v této oblasti. Roku 1945 navrhli Blakemore a Lord zřízení cévní banky, která byla založena až o 3 roky později Grossem. V roce 1951 započala úspěšná éra štěpů ze žilních autotransplantátů, které jsou doposud užívány [1].

S přibývajícími roky dochází k prohlubování výzkumu v této problematice.

Medicína si žádá širší spektrum náhrad. Již nestačí jen cévy velkoprůměrové, v současnosti komerčně vyráběné a hojně využívané. Ty mají vnitřní průměr od 7 mm výše. Roste zájem o náhrady maloprůměrové (< 6 mm), jejichž výroba však není tak rozšířená. Při použití konvenčního materiálu používaného pro velkoprůměrové cévy se totiž zvyšuje riziko vzniku krevních sraženin a další problémy popsané níže. Slibnou možností je pak cesta tkáňového inženýrství, které se zabývá výrobou tkáňových nosičů a jejich osazením buňkami.

Tato práce pojednává právě o problematice maloprůměrových cévních náhrad, která je v současnosti velkou výzvou na poli tkáňového inženýrství. V první řadě se zabývá výběrem vhodného materiálu a jeho charakterizací z hlediska různých vlastností důležitých pro cévní náhrady. Vychází z předpokladu, že cévní náhrada musí být

- 13 -

navržena tak, aby byla co nejlepší kopií nativní cévy. Předpokládá se, že náhrada s takovou morfologií by věrně napodobila nativní extracelulární matrix (ECM) a umožnila tak vytvoření náhrady se všemi základními funkcemi. Pro výrobu takového scaffoldu byla zvolena technika elektrostatického zvlákňování, která dokáže vyrobit vlákna v řádu nanometrů, což jsou i rozměry proteinových fibril v ECM. Takový scaffold má velký měrný povrch, což zaručuje více možných míst pro adhezi buněk.

Volba samotného materiálu je též zásadní. Polykaprolakton (PCL) byl vybrán jako modelový polymer kvůli své biokompatibilitě, netoxicitě, vhodných mechanických vlastnostech [2]. Na druhou stranu by mohl zapříčinit špatnou adhezi buněk, vzhledem ke svému hydrofobnímu charakteru. V této souvislosti se jeví jako slibný kandidát kopolymer polykaprolaktonu s kyselinou polymléčnou, který by měl mít lepší uplatnění na poli tkáňového kardiovaskulárního inženýrství vzhledem ke své lepší smáčivosti, biodegradabilitě atd. Jeho testování na buněčnou adhezi studovalo již několik skupin [3, 4]. Velmi dobrý potenciál jeví též modifikace biomateriálů oxidem dusnatým, který, jak je známo z literatury, by měl podporovat proliferaci endotelových buněk a zamezovat trombogenezi [5].

Další oblastí zájmu této práce je samotné biologické testování zvoleného materiálu. To obnáší jeho osazování buňkami a zkoumání buněčné reakce na něj.

Základní testování probíhá s fibroblasty, dále pak s endotelovými buňkami. Jak již bylo popsáno v předešlém odstavci, na buněčnou adhezi a proliferaci by měla mít vliv především smáčivost materiálu, případně přítomnost dalších modifikujících složek jako je oxid dusnatý. Slabě hydrofilní materiály by měly podporovat buněčnou adhezi [6].

Růst endotelových buněk by měl podporovat materiál uvolňující oxid dusnatý.

U inkubace krevních destiček se přepokládalo hlavně to, že buněčnou adhezi a aktivaci bude ovlivňovat morfologie vlákenných vrstev. Scaffoldy obsahující tenká vlákna (průměr < 1μm) by skoro neměly způsobovat koagulaci a neměly by na ně adherovat téměř žádné trombocyty. Na druhou stranu by na scaffoldy s větším průměrem vláken mělo adherovat více trombocytů [7]. Nevýhodou tohoto experimentu se jevily statické podmínky při inkubaci, které nenapodobují přirozené prostředí organismu. Dalším testem proto byla inkubace za dynamických podmínek v bioreaktoru a zkoumání odlišností od inkubace statické.

- 14 -

1 Teoretická část

Pro dosažení optimálních výsledků této práce je nutné znát fyziologii cév a jejich buněk. To je popsáno dále. V následujících podkapitolách bude vysvětlen princip tvorby scaffoldů a jejich osazování buňkami.

1.1 Cévní soustava člověka

Oběhový systém člověka se rozděluje na srdce a krevní cévy. Ty mohou být trojího typu, a to arterie (tepny), vény (žíly) a kapiláry. Tento systém a jeho správná funkčnost je životně důležitá, jelikož se podílí na transportu kyslíku, nutričních látek a hormonů k cílovým tkáním a orgánům. Opačným směrem zajišťuje odvod odpadních metabolitů z organismu.

1.1.1 Stavba stěny cévy

Cévy mají podobnou strukturu, která je jednotlivě přizpůsobena fyziologickým nárokům. Skládají se z vrstev neboli tunik (z latinského slova tunica = plášť), které jsou celkem tři: tunica intima, tunica media a tunica adventitia. Tyto vrstvy zobrazují a popisují následující obrázky.

Obrázek 1 - Ilustrativní model cévy [1]. Obrázek 2 - Histologický řez cévou [2].

- 15 - Tunica intima (interna)

Vnitřní vrstvu, která je ve styku s proudící krví, tvoří 1 vrstva endotelových buněk a subendotelová vrstva. Endotel sestává z buněk, které spočívají na bazální lamině a v rovných úsecích cévy jsou protaženy ve směru toku krve. V místech větvení a ohybů cév mají polygonální tvar a uspořádání je méně pravidelné. Jejich typická velikost se pohybuje mezi 8-12 μm. Endotelové buňky patří mezi dlouhožijící elementy.

Vykazují jen malou mitotickou aktivitu. Endotel má kromě své bariérové funkce i funkci sekreční. Tento dlaždicový epitel vytváří za normálních okolností hladký a nesmáčivý vnitřní povrch cévy, na kterém žádné krevní buňky neulpívají, což zajišťuje absolutně antitrombogenní povrch. Příčinou je uvolnění vazodilatačních a antiagregačních mediátorů. To je nesmírně důležité pro zabránění srážení krevních destiček a jejich shlukování, tedy tvorbě trombů. Dále endotel produkuje růstové faktory a ovlivňuje proliferaci a diferenciaci buněčných struktur v cévní stěně.

Pod endotelem se nachází tenká subendotelová vrstva, kterou utváří řídké kolagenní vazivo. Může zde být i malé množství hladkých svalových buněk. Tato vrstva již nemá nesmáčivé vlastnosti, takže při poškození endotelu se na ni krevní destičky velmi snadno přichytávají [8, 9].

Tunica media

Tunica media tvoří střední vrstvu cév. Jejími hlavními buněčnými elementy jsou hladkosvalové buňky. Ty probíhají cirkulárně nebo v nízkých spirálovitých závitech, mezi kterými se nachází množství kolagenních a elastických vláken a proteoglykanů.

Tento extracelulární materiál produkují hladké svalové buňky. Elastická vlákna vytváří jemné sítě nebo blanky, které jsou perforovány otvory (fenestrace), což umožňuje snadný prostup živin do hlubší vrstvy stěny cévy. Někdy se elastická vlákna soustřeďují na hranicích tunica media a vytvářejí dvě membrány, které oddělují tuto vrstvu od okolních. Tyto membrány nesou název membrana elastica interna a membrana elastica externa. V drobnějších cévách, kapilárách, je tato vrstva zastoupena buňkami zvanými pericyty [9, 10].

Tunica adventitia (externa)

Tato vrstva tvoří vnější vrstvu cévy. Skládá se z kolagenního vaziva s buňkami, jako jsou fibroblasty a adipocyty. Ojediněle se mohou vyskytnout i hladkosvalové

- 16 -

buňky. Převažují zde podélně uspořádaná kolagenní a elastická vlákna, která se síťovitě překřižují a přecházejí do vaziva v nejužším okolí cévy. Důsledkem toho je pružná fixace cévy k okolí. V adventicii je obsažen především kolagen typu I, dále glykosaminoglykany dermatansulfát a v malém množství i heparansulfát [9].

Výživu cévy, s průměrem větším než 1 mm, zajišťuje systém vlastních cév nazývající se vasa vasorum. Tyto cévy probíhají převážně v adventicii a v zevních oblastech médie. Jejich zdrojem je buď arterie, kterou zásobují, nebo tepny sousední.

Cévy drobnější jsou vyživovány cestou difuze z lumen cévy, z krve protékající cévou [9, 10].

Tepny (arterie) a žíly (vény)

Tepny a žíly si jsou stavebně velmi podobné. Rozdíly se najdou v tloušťce jednotlivých vrstev. Při stejném průměru má tepna vždy silnější stěnu. Její netlustší vrstvou je pak tunica media, naproti tomu u žil je to tunica adventitia. Žíly mají navíc větší lumen než tepny [8].

Obrázek 3 - Srovnání cévní stěny arterie a vény [3].

1.2 Cévní náhrady

1.2.1 Typy

Na současném trhu se vyskytují cévní náhrady, které se dají rozdělit na biologické a syntetické. Biologické implantáty, tepna nebo žíla, získané přímo z pacientova těla mají přirozeně nejvíce fyziologických vlastností (allografty). Sem

- 17 -

můžeme začlenit i implantáty ze zemřelých dárců, či zvířecí (xenogenní štěp). Nicméně takto získané náhrady mohou být mnohdy nedostupné nebo nepřijatelné pro transplantaci. Proto se využívají syntetické cévní implantáty. Standardními materiály pro jejich výrobu jsou již přes 50 let polyetylentereftalát (PET, Dacron, Terylen) a rozšířený polytetrafluoretylen (ePTFE, Teflon, Gore-Tex) [1].

Tyto syntetické implantáty fungují dobře jako velkoprůměrové náhrady, tj. náhrady s průměrem větším než 6 mm. Pokud je potřeba maloprůměrových cévních náhrad (< 6 mm) (například v koronárním, infrainguinálním a bércovém řečišti) nastává problém. Cévy s větším průměrem mají vyšší průtok krve a menší odpor než cévy s průměrem malým, kde je nízký průtok krve. Užití takovýchto syntetických náhrad pro maloprůměrové cévy pak přináší problémy. Náhrady selhávají v důsledku tendence k tvorbě krevních sraženin na umělém povrchu (akutní trombózy) a poruchy hojení způsobené nedostatkem funkčního endotelu, následné embolizaci a okluzi, restenózy v důsledku chronické zánětlivé odpovědi, náchylnosti k infekci v roli cizího tělesa v pacientově těle a vznikem intimální hyperplazie (IH). Často pak vyžadují rozsáhlou antikoagulační prevenci, což může vést k dalším komplikacím [1, 11].

K řešení těchto poruch se díky pokrokům v buněčné biologii a ve tkáňovém inženýrství za posledních 30 let zavedl koncept cévní náhrady s buňkami. Tyto takzvané tkáňovým inženýrstvím připravené cévní náhrady (TEBVs, Totally engineered blood vessels) by koncepčně obsahovaly 3 části: oporu (scaffold), adhezní matrix a živé cévní buňky. Měly by také mechanické vlastnosti, které by napodobovaly vlastnosti nativní cévy. Na rozdíl od nativních cév mohou TEBVs poskytovat variabilní průměry v závislosti na typu potřebné náhrady. Tento přístup by také eliminoval značnou morbiditu [3, 12]. Nevýhodou scaffoldů s buňkami je jejich dlouhodobá příprava a předpokládaná remodelace tkáně po implantaci. Proto se tato práce zaměřuje na neosazené scaffoldy, které se implantují do organismu, kde se předpokládá adherence a migrace buněk z okolních tkání [1].

1.2.2 Výroba

Výroba velkoprůměrových cévních náhrad se realizuje prostřednictvím třech dále uvedených postupů.

- 18 - Cévní náhrady tkané

Tkané náhrady se vyrábí v jednoduché vazbě, což přináší problémy s nepatrnou porozitou stěny. Jejich nevýhoda také spočívá v nedostatečném ukotvení vnitřní fibrinové vrstvy. Tyto náhrady jsou málo tažné a ohebné, což vede k problémům při jejich našívání do organismu [13, 14].

Cévní náhrady pletené

Tyto náhrady představují hlavní skupinu a jsou tvořeny úpletem z umělých, převážně polyesterových, vláken. Jejich stěna je porézní, je ale impregnována kolagenem, želatinou či albuminem, takže je průsak krve eliminován. Jsou pružnější než náhrady tkané [13, 14].

Cévní náhrady lité

Lité náhrady představují třetí skupinu velkoprůměrových náhrad. Vznikají extruzí polytetrafluoretylénu. Jsou neporézní a v důsledku nesmáčivosti jejich stěny tolerují i menší průtoky. Mají však vyšší cenu [13].

Těmito způsoby vyrobené náhrady jsou však nevyhovující pro aplikaci jako maloprůměrové cévy. Proto se hledají nové možnosti výroby. Jedním z nich, který se jeví jako slibná alternativa pro zhotovení cévní náhrady, je elektrostatické zvlákňování, které je popsáno dále.

1.3 Elektrostatické zvlákňování

Elektrostatické zvlákňování (electrospinning) je relativně snadná a všestranná metoda pro výrobu vláken s průměry pohybujícími se v oblasti 50 - 5000 nm.

1.3.1 Princip

Podstatou elektrostatického zvlákňování je vytváření vláken z polymerního roztoku či polymerní taveniny vlivem elektrostatické síly. Konvenční zařízení se skládá z kapiláry s polymerním roztokem, dvou elektrod a zdroje stejnosměrného napětí v rozsahu kV. Kapilára je připojena ke zdroji napětí a naproti ní je uzemněný kolektor.

Polymer se z trysky uvolní působením elektrostatické síly a za vypařování rozpouštědla

- 19 -

se dlouží do vláken, která jsou neuspořádaně ukládána na povrchu protilehlého kolektoru. Existují parametry, které určují vlastnosti vláken, jako je koncentrace polymeru a jeho molekulová hmotnost, rozpouštědlo, aditiva, povrchové napětí zvlákňovaného roztoku, použité napětí, rychlost dávkování, vzdálenost mezi zvlákňovací elektrodou a kolektorem, okolní teplota, vlhkost apod. [15, 16, 17, 18].

Tímto způsobem lze zvláknit mnoho přírodních i syntetických materiálů a připravit tak vhodné nosiče buněk pro tkáňové inženýrství. Kontrolou a řízením složení, struktury, průměru vláken, porozity a mechanických vlastností lze připravit cévní náhradu s obdobnou strukturou jako má extracelulární hmota nativní cévy.

Vzhledem k tomu, že tento nosič má pak vysoký měrný povrch, vysokou porozitu s malými velikostmi pórů, poskytuje lepší podmínky pro uchycení buněk než jiné struktury [19].

1.3.2 Zařízení pro elektrostatické zvlákňování Nanospider^TM

Nanospider^TM je zařízení, které využívá bezjehlového principu tvorby vláken z volného povrchu kapaliny. Jako zvlákňující elektroda je zde rotující váleček, který se brodí v roztoku polymeru. Vlivem elektrostatického pole se na jeho povrchu formují vlákna, která se pohybují směrem ke kolektoru, před nímž je natažena netkaná textilie, na kterou se vlákna zachytávají. Tato technologie byla vynalezena p. prof. Oldřichem Jirsákem na Technické univerzitě v Liberci. Licence byla zakoupena firmou Elmarco, která tím začala produkovat stroje pro průmyslovou výrobu nanovláken.

Obrázek 4 - Schéma elektrostatického zvlákňování metodou Nanospider. Váleček (1) brodící se v roztoku polymeru (2) je připojen ke zdroji vysokého napětí. Na povrchu válečku se tvoří Taylorovy kužely a z nich nanovlákna, která dopadají na pohybující se vrstvu netkané textilie

(4), která je umístěna před uzemněným kolektorem (5)[4].

- 20 -

Zařízení pro výrobu cévních náhrad (cévostroj)

Pro přípravu tubulárního scaffoldu se musí použít speciální kolektor válcového tvaru a požadovaného vnitřního průměru. Konstrukce takového zařízení byla navrhnuta na Technické univerzitě v Liberci. Toto zařízení využívá princip jehlového zvlákňování.

Tvoří jej jehla, která je poháněna pneumaticky. Tím je umožněn její lineární posuv tam a zpět. Na jehlu je připojena přívodní hadička polymerního roztoku, který je dávkován z plastové injekční stříkačky o objemu 10 ml pomocí lineární pumpy. Nad jehlou se nachází rotující kolektor z nerezové oceli ve tvaru tyčky o požadovaném průměru (obvykle v rozmezí 1-6 mm dle požadované aplikace), jehož umístěním se dá regulovat vzdálenost od jehly [20]. Tímto postupem pak vznikají tubulární cévní náhrady o délce 20 cm.

Obrázek 5 - Schéma elektrostatického zvlákňování cévních náhrad. Polymerní roztok je dopravován přes injekční pumpu (1), která je připojena ke zdroji vysokého napětí (2), na hrot

stříkačky (3). Vznikají nanovlákna, která jsou zachytávána ve formě vlákenné pavučiny na rotující kolektor v tubulární formě (4) [5].

1.4 Tkáňové inženýrství cévních náhrad

Tkáňové inženýrství lze obecně definovat jako interdisciplinární obor, který uplatňuje principy inženýrství a přírodních věd směrem k vývoji biologických náhrad, které obnoví, zachovají nebo zlepší funkci tkáně nebo celého orgánu.

Proces tkáňového inženýrství zahrnuje několik kroků. Prvním z nich je izolace příslušných buněk a jejich následná kultivace v in vitro podmínkách. V této fázi buňky

- 21 -

musí mít dostatek živin dodávaných v příslušném médiu, které jim umožní růst a proliferaci. Další fází je výroba a příprava vhodného scaffoldu (nosiče), na který se buňky nasadí a nechají se kultivovat. Buňky by měly na nosič adherovat a proliferovat.

Po určité době by se takto vytvořený scaffold mohl implantovat do organismu [21]. To je koncept TEBVs náhrad.

Tento postup je však možné nahradit přímou implantací neosazeného scaffoldu do organismu. Není tak nutná izolace buněk, jejich kultivace a osazení nosiče. Tak je tomu i v případě této práce. Buňky by měly na scaffold adherovat až po jeho implantaci a s postupnou degradací nosiče by si měly vytvořit svou vlastní ECM. Zde je velmi důležitý čas degradace nosiče, který by měl pokrýt čas vzniku nové ECM.

1.4.1 Scaffoldy

Scaffold neboli tkáňový nosič obecně zastupuje funkci extracelulární matrix, která v lidském těle obklopuje buňky. Poskytuje jim mechanickou 3D oporu pro jejich optimální růst.

Tkáňové nosiče můžeme rozdělit do dvou skupin a to na nosiče vlákenné a nevlákenné. Vlákenné nosiče se připravují klasickými textilními technikami jako je pletení, tkaní, dále elektrostatické zvlákňování, o kterém bylo zmíněno výše. Pro nosiče nevlákenné se používají netextilní technologie, např. vymývání částic, vypařování rozpouštědla, fázová separace, zpěňování plynem a další [20].

Tkáňová regenerace na biodegradabilním scaffoldu je závislá na několika faktorech. V prvním případě je důležitá struktura scaffoldu. Velikost pórů musí být dostatečná, aby byla umožněna buněčná migrace a infiltrace do scaffoldu. Porozita musí být vysoká, aby došlo k optimálnímu propojení pórů a buněk. Jako další faktor se uplatňují povrchové vlastnosti nosiče, jako je např. jeho smáčivost. Extrémní hydrofilicita nebo hydrofobicita neumožňuje pevnou buněčnou adhezi a následnou regeneraci tkáně. Tyto vlastnosti mohou být ovlivněny modifikací polymerů, pokrytím povrchu proteiny, antikoagulanty, antibiotiky, úpravou povrchu např. plazmou atd.

V neposlední řadě je velmi důležitý samotný tvar nosiče. Aby mohl dostatečně zastoupit ECM, musí být designově stejný jako původní tkáň. V případě cévní náhrady se tedy jedná o 3D dutý tubulární nosič s různě širokým vnitřním průměrem [22].

- 22 -

Ideální cévní náhrada by pak měla splňovat několik podstatných vlastností. Měla by být mechanicky pevná a současně odolná, netoxická, neměla by způsobovat imunitní reakci a tvoru trombu, měla by být cytokompatibilní, odolná vůči infekci a vůči hemodynamickému stresu, schopná tkáňové integrace a kompletního vhojení, dostupná v různých velikostech dle potřeb pacienta, chirurgicky vhodná ve smyslu poddajnosti a retence stehů a v neposlední řadě i ekonomicky dostupná [1].

1.4.2 Materiály pro scaffoldy

Pro scaffoldy v tkáňovém inženýrství se dnes jako biomateriály široce užívají polymery. Materiály mohou být buď přírodní, nebo syntetické. Mezi přírodní materiály, sloužící k výrobě scaffoldů maloprůměroých cévních náhrad vyrobených elektrospinningem, se řadí proteiny jako je želatina, kolagen, elastin a pavoučí hedvábí.

Při použití některých z nich (kolagen, želatina) však musíme počítat s jejich trombogenicitou a následnou nutností povrchové modifikace (například heparinem).

Syntetické polymery ve srovnání s přírodními jsou snadněji dostupné a levnější [23].

Kromě toho mohou být přesně upraveny podle požadavku rychlosti degradace, biokompatibility, elasticity aj. Nejvíce preferované materiály pro biodegradabilní náhrady jsou polykaprolakton (PCL), kyselina polymléčná (PLA), jejich kopolymer (PLC), dále kyselina polyglykolová (PGA) aj. [24]. Dále budou podrobněji popsány polymerní materiály, které byly použity pro tento výzkum.

Polykaprolakton (polycaprolactone, PCL)

Polykaprolakton je jedním z prvních polymerů, které syntetizovala skupina okolo Carotherse na začátku 30. let 20. století. PCL je hydrofóbní, semikrystalický polyester, jehož krystalinita má tendenci klesat se zvyšující se molekulovou hmotností.

Molekulová hmotnost se pohybuje v rozmezí od 3.000 do 80.000 g/mol. Má nízkou teplotu tání (59-64 °C) a jeho teplota skelného přechodu je -60 °C. Vyznačuje se dobrou rozpustností v chloroformu, dichlormetanu, benzenu, toluenu, cyklohexanonu a 2-nitropropanu. Lze jej typicky připravit cestou katalytické polymerizace s otevřením kruhu (ring-opening polymerization) a to buď ε-kaprolaktonu za použití různých aniontových, kationtových a koordinačních katalyzátorů, nebo pomocí 2-metylen-1-3-dioxepanu [2, 14, 25].

- 23 -

Polykaprolakton je také dnes jedním z nejpoužívanějších syntetických polymerů v kardiovaskulárním tkáňovém inženýrství. Je významný z hlediska jeho mechanických vlastností, dobré biokompatibility s živým organismem, nízké toxicity a nízké ceny.

Jednoduchou cestou, jak zpracovat PCL do podoby porézního scaffoldu, je electrospinning. Avšak uchycení buněk na scaffold je limitováno jeho hydrofobním charakterem. Doba biodegradace v organismu je relativně dlouhá a závisí na jeho výchozí molekulové hmotnosti. Probíhá od iniciální hydrolýzy (0-6 měsíců), přes postupné ubývání hmotnosti (6-12 měs.) a resorpci (nad 12 měs.) až po celkovou metabolizaci (nad 18 měs.). Díky pomalému rozkladu PCL však nedochází k hromadění kyselých metabolitů, které by mohly ovlivnit růst buněk. [17, 26].

Obrázek 6 - Strukturní vzorec PCL [6].

Kyselina polymléčná (poly(lactic) acid, polylactide, PLA)

Kyselina polymléčná byla též vyrobena Carothersem v roce 1932. Patří do skupiny biodegradabilních a biokompatibilních polymerů. Vyrábí se z obnovitelných zdrojů jako cukrová třtina a kukuřičný škrob, kdy je využit proces fermentace. Je to termoplastický alifatický polyester, který vzniká polymerací za otevření kruhu.

Vzhledem k chirální struktuře existuje ve třech isomerických formách a to D(-), L(+) a směsi DL. Její molekulová hmotnost je variabilní. Teplota skelného přechodu leží v rozmezí 60-65 °C a teplota tání mezi 150-160 °C. Aplikační využití je velmi rozmanité v důsledku zajímavých vlastností, jako je průhlednost, nízká hodnota tažnosti (6 %) a vynikající mechanická pevnost.

Pro většinu aplikací v tkáňovém inženýrství je upřednostňován L isomer, protože je přednostně metabolizován v těle. Uplatňuje se jako materiál pro řízení degradace výrobku. Tento polymer v těle hydrolyticky degraduje do formy kyseliny mléčné, která je v těle fyziologicky přítomná. Konečné produkty jsou finálně vylučovány jako voda a oxid uhličitý, a to cestou dýchacího ústrojí nebo močí.

- 24 -

Ve vysoké koncentraci mohou způsobit zvýšené okyselení, což vede k lokálnímu zánětu tkáně [14, 27, 28].

Obrázek 7 - Strukturní vzorec PLA [6].

Kopolymer polykaprolaktonu a kyseliny polymléčné (PLC)

Polykaprolakton a kyselina polymléčná jsou kopolymerizovány za účelem různých aplikací v tkáňovém inženýrství. Mají rozdílné mechanické vlastnosti a rychlosti biodegradace v organismu, proto se změnou jejich poměrů v kopolymeru může nastavovat přibližná doba biologické degradace v organismu a mechanické vlastnosti vyrobené cévní náhrady.

Obrázek 8 - Stukturní vzorec PLC [6].

1.4.3 Modifikace cévních náhrad

Cévní náhrady se dají modifikovat přidáním složky, která uvolňuje oxid dusnatý (NO). Uvolňování NO má zásadní význam v kardiovaskulárním systému. Oxid dusnatý inhibuje adhezi a agregaci krevních destiček, stimuluje proliferaci endotelových buněk a naopak inhibuje nadměrnou proliferaci a migraci hladkosvalových buněk a působí též proti vzniku zánětu. Tyto vlastnosti přispívají k udržení příznivého stavu cév. Využití NO v oblasti cévních náhrad by tedy mohlo přinést výrazné zlepšení jejich vlastností.

- 25 -

Nejčastěji se využívají dvě hlavní skupiny: diazeniumdiolaty a S-nitrosothioly, které byly využity v experimentu této práce [29].

Obrázek 9 - Prospěšné vlastnosti NO v cévách. EC = endotelové buňky; PLT = trombocyty;

VSMC = cévní hladkosvalové buňky; WBC = bílé krvinky [7].

S-nitrosothioly (RSNO) slouží jako donory a transportéry NO v biologických systémech, což umožňuje jeho dlouhodobé uvolňování. Jejich biologická aktivita je ovlivněna prostředím a též faktory, které jsou schopné uvolňovat z nich NO. Jsou to např. teplo, světlo, přítomnost Cu¹⁺, kyseliny citronové atd. Jednou látkou z této supiny je cyclam-NAP-thiolakton komplex, který byl vybrán pro pokusy v této práci. Je schopný uvolňovat NO dlouhodobě. Jeho schéma výroby je znázorněno v následujícím obrázku.

Vazorelaxace

VSMC apoptóza

EC apoptóza

Re-endotelizace

Formování matrix WBC chemotaxe/adheze

PLT agregace/adheze VSMC proliferace/migrace

- 26 -

Obrázek 10 - Struktura cyclam-NAP-thiolakton komplexu syntetizovaného z cyclamu (1, 4, 8, 11-tetraazacyclotetradekan) a NAP-thiolaktonu [8].

1.5 Buněčné kultury

Pro tento experiment byly použity tři typy buněk, které jsou podrobněji popsány v následujících odstavcích.

1.5.1 Fibroblasty

Fibroblasty, štíhlé vřetenovité až hvězdicovité buňky s jádry, tvoří nejběžnější a zároveň nejvýznamnější složku vazivové tkáně. Jejich velikost se pohybuje mezi 10-15 μm. Mají především úlohu v udržení tkáňové homeostázy a celistvosti zdravých tkání. Podílejí se na řízení diferenciace tkání během prenatálního období, ale i postnatálně se uplatňují v řízení fyziologických funkcí a buněčné integrity [30]. To se realizuje díky produkci stavebních složek extracelulární matrix (tropokolagen, proteoglykany, případně elastin). V případě potřeby se mohou měnit na jiné buňky mezenchymu, např. adipocyty, chondrocyty, myocyty atd. [31, 32]. Jejich morfologii lze vidět na Obrázku 11.

- 27 -

Obrázek 11 - Snímek z fluorescenční mikroskopie 3T3 myších fibroblastů obarvených fluoresceinem.

1.5.2 Endotelové buňky

Endotelové buňky tvoří souvislou hladkou vnitřní výstelku cév. Více byly popsány v kap. 1.1.1. Jejich struktura je naznačena na následujícím Obrázku 12.

Obrázek 12 - Snímek z fluorescenční mikroskopie endotelových buněk HUVEC obarvených fluoresceinem.

- 28 - 1.5.3 Trombocyty

Trombocyty neboli krevní destičky jsou bezjaderné krevní elementy diskoidního tvaru o průměru 1,5-3,5 μm a tloušťky 1-1,5 μm. Jejich tvar se však mění podle stupně aktivace. Tato tělíska jsou produkována v kostní dřeni jako fragmenty z megakaryocytů.

Jejich životnost po odběru činí přibližně 8-12 dní. Jejich množství se pohybuje okolo 140-400·10⁹/l. V lidském organismu především hrají významnou roli při hemostáze (zástavě krvácení). Vykazují též fagocytární aktivitu a mají vliv na správnou funkci endotelových buněk [33].

1.6 In vitro testy

Pomocí in vitro testů se zjišťují vlastnosti scaffoldu z hlediska jeho cytotoxicity.

Následujícími metodami lze zkoumat buněčnou viabilitu, adhezi a proliferaci.

1.6.1 Test viability buněk (MTT test)

MTT test je kolorimetrický test, který měří metabolickou aktivitu buněk a je vhodný pro analyzování jejich proliferace, viability a cytotoxicity. Je založen na redukci žluté solubilní tetrazoliové soli MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- difenyltetrazolium bromid) na nerozpustný formazan ve formě fialových krystalků.

Reakce probíhá na mitochondriální membráně vlivem mitochondriální dehydrogenázy živých buněk. Počet živých buněk je tedy indikován redukcí MTT. Formazanové krystalky se následně rozpustí přidáním okyseleného izopropanolu a spektrofotometricky se stanoví hodnota absorbance roztoku [34].

Obrázek 13 - Příklad MTT testu [9].

- 29 - 1.6.2 Fluorescenční mikroskopie

Fluorescenční mikroskopie představuje jeden z velmi cenných nástrojů pro studium buněk. Umožňuje analýzu vzorků pomocí fluorescenčního značení. Dokáže zviditelnit určitou látku či strukturu v buňce. Pro toto zobrazení je třeba fluorescenční barvivo (fluorofor, fluorochrom), které se na danou strukturu v buňce naváže. Toto barvivo má typické emisní a absorpční spektrum. Při jeho ozáření dochází k absorpci fotonu o určité vlnové délce a následné emisi světla o jiné vlnové délce. Struktury, které obsahují fluorescenční barvivo, poté v mikroskopu září v různých barvách na temném pozadí [35].

1.6.3 Skenovací elektronová mikroskopie (SEM)

Skenovací (rastrovací) elektronová mikroskopie též patří k důležitým nástrojům zkoumání buněčné struktury. Využívá elektrickým polem urychlený proud elektronů, který dopadá na povrch vzorku. Vzorek i svazek elektronů musí být v prostředí vakua, aby nedocházelo k interakcím elektronů s atmosférou. Vzorek musí být speciálně upraven (pokoven), aby došlo k odrazu elektronů, které jsou poté snímány detektorem.

Na rozdíl od fluorescenční mikroskopie umožňuje sledování kromě prostorového povrchu buněk i strukturu vlákenného scaffoldu, jednotlivá vlákna, mezivlákenné póry atd. Výsledný obraz je primárně černobílý [36].

1.7 Dynamický kultivační systém

Je známo, že tradiční statická kultivace buněk na scaffoldech neplní všechny požadavky pro optimální regeneraci funkční tkáně. Současným trendem na poli tkáňového inženýrství je proto vývoj takového dynamického kultivačního zařízení, ve kterém by docházelo k napodobení in vivo podmínek v organismu. Pro vaskulární aplikace je to hlavně působení tlaku krve a průtoku. Tyto stimuly působí nejen na uspořádání strukturních elementů a organel uvnitř buněk, ale i na modulaci biochemických signálů v buňkách i mezi nimi. Takovým zařízením je bioreaktor. Jeho hlavní výhodou je to, že v něm mohou být pečlivě monitorovány a řízeny biochemické a biomechanické parametry, které hrají významnou roli v tkáňovém inženýrství. Použití bioreaktorů vede k rozvoji scaffoldů s lepšími mechanickými vlastnostmi

- 30 -

a morfologickými charakteristikami ve srovnání s těmi, které se kultivují staticky [37, 38].

Design bioreaktoru je komplexní otázka, která zahrnuje jak otázky biologické, tak konstrukční. Obecně bioreaktor musí být navržen tak, aby splňoval několik požadavků. Musí zajistit kultivaci za sterilních podmínek, poskytnout buňkám dostatek živin a zajistit látkovou výměnu. Musí být možnost vystavit scaffold mechanickému namáhání jako je komprese a expanze, využít i hydrodynamické síly jako je smykové napětí a tlak, řídit tok média, ať už stabilně nebo dynamicky, a snížit nadměrnou turbulenci v toku média. Materiály, z nichž je bioreaktor vyroben, musí být kompatibilní s buňkami, musí se snadno udržovat a čistit. Bioreaktor by měl mít též optimální velikost, aby byla umožněna kultivace v CO2 inkubátoru [37].

- 31 -

2 Experiment - porovnání PCL a PLC

V prvním experimentu byly nejprve zkoumány materiály z polykaprolaktonu (PCL) a kopolymeru polylaktidu a polykaprolaktonu (PLC). Byl proveden rozbor z hlediska jejich hlavních charakteristik, které jsou důležité pro buněčnou adhezi, jako jsou průměry vláken, plošná hmotnost, porozita, smáčivost, krystalinita a termická analýza. Pro buněčné testování na těchto materiálech byly nejdříve použity 3T3 myší fibroblasty pro obecné hodnocení nového materiálu. Při dalších testech se nasazovaly lidské endotelové buňky HUVEC (Human umbilical vein endotheial cells) s cílem zjistit, zda zkoumané materiály podporují endotelizaci. V neposlední řadě byla řešena i otázka trombogenicity povrchů testovaných materiálů kvůli pomalé endotelizaci povrchu in vivo. Materiály byly inkubovány krevními destičkami z trombocytového roztoku a testovala se míra jejich aktivace.

2.1 Materiály a metodika

2.1.1 Použité materiály a jejich příprava

Pro pokusy s fibroblasty a endotely byly použity biodegradabilní polyestery polykaprolakton (PCL) a kopolymer polylaktidu a polykaprolaktonu ve vzájemném poměru 70:30 (PLC). Polymer PCL (Mm = 45.000, Sigma Aldrich) byl rozpuštěn v systému chloroform/etanol (9:1, v:v). Výsledná koncentrace byla 22 hm.%.

Kopolymer PLC (Purasorb), s výslednou koncentrací 10 hm.%, se rozpustil v rozpouštědlovém systému složeném z chloroformu, etanolu a kyseliny octové (CHEKO) (8:1:1, v:v:v). Tyto polymerní roztoky byly míchány při pokojové teplotě 2 hodiny a poté zvlákněny pomocí Nanospideru^TM 1WS500U do podoby vlákenné vrstvy.

Pro statické testování trombogenicity byla k výše uvedeným materiálům navíc připravena vlákenná vrstva PCL v rozpouštědlovém systému CHEKO (8:1:1, v:v:v) ve výsledné koncentraci 18 hm.%. Zvlákňování bylo provedeno pomocí technologie Nanospider.

K dynamickému testování trombogenicity v bioreaktoru byly použity cévní náhrady zvlákněné na cévostroji z jehly o vnitřním průměru 6 mm. Byly vyrobeny dva

- 32 -

typy: jednovrstvá cévní náhrada z PLC o koncentraci 10 hm.% a dvouvrstvá cévní náhrada z PCL, jejíž vnitřní stěnu tvořil 16 hm.% PCL rozpuštěný v systému CHEKO (8:1:1, v:v:v) a vnější stěnu 18 hm.% PCL rozpuštěný v chloroformu a etanolu (9:1, v:v). Podmínky elektrostatického zvlákňování byly udržovány na těchto optimalizovaných hodnotách: vzdálenost jehly a kolektoru 20 cm, napětí 15 kV, rychlost rotace kolektoru při zvlákňování vnitřní vrstvy byla 3-5.000 rpm po dobu 5 minut, u druhé vrstvy byla rychlost 10.000 rpm po dobu cca 60 minut. Teplota se v laboratoři pohybovala mezi 22-23 °C, relativní vlhkost 50-60 %.

K měření kontaktního úhlu byly připraveny 2 hm.% fólie z PCL a PLC jako materiál pro srovnání s vlákennou strukturou získanou technologií Nanospider.

Polymery byly rozpuštěny v chloroformu.

2.1.2 Charakterizace materiálů Morfologie vláken

Vzorky ze zvlákněných polymerních vrstev (PCL 22 hm.%, PLC 10 hm.%) pomocí zařízení Nanospider byly pozlaceny a pozorovány pomocí skenovacího elektronového mikroskopu (SEM) VEGA3 SB - Easy Probe (Tescan, Česká republika).

Ze získaných snímků se provedlo měření průměrů vláken pomocí obrazové analýzy v programu NIS Elements. Střední průměr vláken se určil ze 100 měření vláken z 5 snímků se zvětšením 5000x.

Plošná hmotnost, tloušťka vrstvy

Ke zjištění plošné hmotnosti a tloušťky vrstvy materiálu se připravilo 10 vzorků od každého materiálu ve velikosti 1x1 cm. Provedlo se měření pomocí digitálních vah a mikrometru.

Porozita

Porozita byla stanovena podle výpočtu pro zaplnění, ve kterém se použila známá hustota materiálu od výrobce, naměřená hodnota tloušťky vrstvy a plošná hmotnost vzorku.

- 33 -

Z průměrné tloušťky obou materiálů t a jejich plošné hmotnosti Ahm byla vypočtena objemová hmotnost Vhm podle Rovnice 1.

(1)

V dalším kroku se počítalo s hodnotou hustoty každého materiálu (ρPCL = 1,145 g/cm³, ρPLC = 1,22 g/cm³), která představovala referenční hodnotu 100%

zaplněného materiálu. Podle ní se poté vypočetla hodnota pro náš vzorek, která vyjadřovala hodnotu zaplnění Z tohoto vzorku, viz Rovnice 2. Pro konečný výpočet porozity P byla odečtena od 100, viz Rovnice 3.

(2)

(3)

Smáčivost, kontaktní úhel

Kontaktní úhel byl měřen pomocí přístroje a softwaru SeeSystem (Surface Energy Evaluation System). Zařízení disponuje CCD kamerou a posuvným stolkem.

Pomocí USB portu je připojeno k počítači. Kontaktní úhel se zjišťoval na mikrovlákenných vrstvách a fóliích z PCL a kopolymeru PLC. Pro měření byl připraven vzorek o velikosti 25 x 75 mm, který se nalepil na podložní sklo opatřené samolepící páskou a umístil se před kameru přístroje. Jako testovací kapalina se použila destilovaná voda a dávkovala se pipetou v objemu 10 μm. Každý materiál byl měřen 3x a z výsledků byla vypočtena střední hodnota a směrodatná odchylka.

- 34 -

Obrázek 14 - Příklad měření kontaktního úhlu pomocí SeeSystemu.

DSC - termická analýza, RTG difrakční analýza (XRD)

Termická analýza byla provedena u testovaných polymerů PCL a PLC pomocí diferenční kompenzační kalorimetrie (DSC). Měření bylo provedeno na Katedře strojírenské technologie Fakulty strojní TUL ve spolupráci s Ing. Lubošem Běhálkem, PhD. Pro měření byl použit originální polymer ve formě granulátu a ve formě elektrostaticky zvlákněné vrstvy. Analýza probíhala v přístroji DSC 1/700 Mettler- Toledo kalibrovaný proti indiu a zinku. Rychlost ohřevu byla 5 °C/min. Teplotní rozsah byl stanoven od -20 °C do 100 °C pro PCL a do 180 °C pro PLC.

Pomocí výsledných termických křivek byly stanoveny charakteristické teploty (tání, krystalizace a skelného přechodu), které se měřily ve dvou teplotních cyklech.

Výsledky 1. ohřevu odráží výchozí stav materiálu, jenž je ovlivněn historií jeho zpracování. Provádí se až do roztavení materiálu, který tím dosáhne rovnovážného stavu. Standardně se proto vyhodnocuje 2. ohřev, který následuje po zchlazení roztaveného materiálu. Tím se odstraní tepelná historie vzorku a z 2. ohřevu se získá údaj pouze o samotném polymeru.

Rentgenová difrakční analýza proběhla ve spolupráci s Ústavem fyziky plazmatu Akademie věd ČR. Pro toto měření byly k dispozici elektrostaticky zvlákněné vzorky PCL a PLC o velikosti 1x1 cm. Samotné měření probíhalo na difraktometru D8 Discover. Vyhodnocení krystalinity proběhlo v programu Diffrac.Eva.

- 35 -

2.2 Metodika biologického testování

2.2.1 Příprava vzorků

Pro přípravu scaffoldů se použily zvlákněné vrstvy PCL a PLC popsané výše, které byly nastříhány do tvaru malých kruhů o průměru 6 mm. Vzorky se následně sterilizovaly v 70 % etanolu po dobu 30 minut a následovalo jejich trojité promytí ve fosfátovém pufru (PBS, Phosphated buffer saline, Lonza).

K dynamickému testování v bioreaktoru se použily cévní náhrady zvlákněné na cévostroji o vnitřním průměru 6 mm, které byly upraveny na požadovanou délku 10 cm.

2.2.2 Příprava bioreaktoru

Bioreaktor pro dynamickou kultivaci byl vyroben ve spolupráci s Ing. Michalem Ackermannem z Katedry mechaniky, pružnosti a pevnosti Fakulty strojní TUL.

Samotný bioreaktor sestával z válce z polymethylmethakrylátu (PMMA), na který byly připojeny trubičky pro přívod a odvod tekutiny. V konstrukci obou konců válce byly duté kolíčky pro uchycení cévních náhrad a pro přesné přivedení roztoku do náhrady simulující průtok krve v cévách v organismu. Bioreaktor byl umístěn do inkubátoru pro zajištění potřebné teploty 37 °C a CO2. Byl připojen na průtokové čerpadlo, jež rychlostí 10 ml/min přivádělo dovnitř trombocytový roztok.

Obrázek 15 - Model bioreaktoru.

- 36 -

Obrázek 16 - a) fotografie bioreaktoru pro dynamickou inkubaci trombocytů, b) zobrazení jeho umístění v CO2 inkubátoru.

2.2.3 Buněčné kultury a nasazení buněk

3T3 myší embryonální fibroblasty (ATCC) byly kultivovány v médiu DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium, Lonza) doplněného o 10% FBS (Fetal Bovinne Serum, Lonza) a 1% směsi antibiotik (penicilin/streptomycin/amfotericin B) (Lonza).

Buňky byly umístěny do inkubátoru se zvlhčenou atmosférou, obsahem 5 % CO2

a teplotou 37 °C. Když se vrstva buněk stávala konfluentní, byly buňky zpasážovány následujícím způsobem: nejprve bylo odsáto médium a buňky se opláchly PBS, dále se přidal trypsin (Lonza) k oddělení buněk od povrchu kultivační lahve. Dokud se buňky neoddělily od povrchu, byla lahev ponechána při 37 °C a stav se průběžně kontroloval pod mikroskopem. Následně bylo přidáno médium, čímž se inaktivovalo působení trypsinu. Buňky se po trypsinizaci centrifugovaly (200 x g) 5 minut při pokojové teplotě a následně byl buněčný pelet resuspendován v novém médiu pro zamezení nechtěného destrukčního vlivu zbytkového trypsinu. Ke zjištění počtu buněk bylo odebráno množství 10 μm do Eppendorfovy zkumavky a k tomu přidáno 10 μm trypanové modři.

Počet a viabilita buněk se po obarvení zjistil v automatickém počítači buněk LUNA^TM (Logos Biosystems). Fibroblasty (19. pasáž) byly nasazeny na scaffoldy umístěné v 96jamkové destičce v hustotě 5·10³ buněk na každou jamku. Médium bylo měněno 3x týdně v průběhu 14denního experimentu.

a) b)

- 37 -

Lidské umbilikální žilní endoteliální buňky (HUVEC, Human umbilical vein endothelial cells, Lonza) se kultivovaly v endoteliálním bazálním médiu (EBM-2, Lonza) doplněném o EGM-2 Single Quots (Lonza) obsahující lidský epidermální růstový faktor (hEGF), hydrokortizon, BBE (Bovine Brain Extract), kyselinu citronovou, FBS (Fetal Bovine Serum) a gentamicin/amfotericin-B (GA). Buňky byly umístěny do inkubátoru, který udržuje vysokou relativní vlhkost s řízenou teplotou (37 °C) a obsahem 5 % CO2. Následný postup pasážování a přípravy buněčné suspenze se shoduje s postupem uvedeným u pokusu s 3T3 myšími fibroblasty. Na scaffoldy umístěné v 96jamkové destičce (předem preinkubované v médiu po dobu 2 hodin pro usnadnění buněčné adheze) se poté nasadily endoteliální buňky (6. pasáž) v hustotě 7,5·10³ na každou jamku. Médium bylo měněno 3x týdně v průběhu 14denního experimentu

Roztok trombocytů (TRS, Thrombocyte Rich Solution) byl získán z periferní krve dárců ve spolupráci s Tranfuzním oddělením Krajské nemocnice v Liberci.

V dodaném vaku bylo 715·10⁶/ml krevních destiček. Do každé jamky se sterilními a opláchnutými scaffoldy bylo napipetováno 200 μl TRS. Toto množství obsahovalo 150·10⁶ trombocytů. Do jamek s negativními kontrolami byl napipetován Composol.

Syntetický skladovací roztok Composol slouží jako náhradní médium pro trombocyty, jelikož je schopný zajistit podobné podmínky jako plazma. Takto připravené vzorky se nechaly inkubovat v inkubátoru při 37 °C a 5 % CO₂. Před analýzou byly vzorky opláchnuty v PBS. První testování statické inkubace trvalo celkově 7 dní a vzorky byly analyzovány po 2 hodinách, 1, 4 a 7 dnech. Takovou kultivační dobu popisuje i Diaz-Gomez a kol. ve svém článku [39]. Při dynamickém testování byly vzorky analyzovány pouze po 2 hodinách, což je dostatečný čas pro adhezi trombocytů dle Millereta a kol. [7].

2.2.4 Testování buněčné adheze a proliferace MTT test

Viabilita buněk adherovaných na scaffoldech byla analyzována pomocí MTT testu po 1, 3, 7 a 14 dnech kultivace. Do nových jamek bylo napipetováno 150 μl média a 50 μl MTT roztoku (Sigma Aldrich) a do každé jamky byl umístěn testovaný vzorek.

Každý testovací den byly analyzovány 4 vzorky z každého materiálu. Vzorky byly

- 38 -

následně inkubovány 4 hodiny při 37 °C v inkubátoru. Vzniklé fialové krystaly formazanu se poté rozpustily pomocí okyseleného isopropanolu a ten byl následně přepipetován do nových jamek. Absorbance byla změřena spektrofotometrem od firmy BioTek typu ELx808 při dvou vlnových délkách (λvzorku 570 nm, λreferenční 690 nm). Data byla přenesena pomocí softwaru Gen5 a vyhodnocena v programu Excel. Průměrná absorbance se vypočetla jako rozdíl absorbance při 570 nm a při referenční vlnové délce 690 nm. Data byla vyjádřena průměrem ± směrodatná odchylka.

K pokusům se scaffoldy byly též nasazeny pozitivní a negativní kontroly.

Pozitivní kontrola není ovlivněna působením scaffoldu, buňky jsou nasazeny do nových jamek bez přítomnosti testovaného materiálu. Na vzorky negativních kontrol naopak nejsou nasazeny buňky, jedná se pouze o scaffold v médiu kultivovaný za stejných podmínek.

Fluorescenční mikroskopie

Pro barvení buněčných jader propidium jodidem byly vzorky po 1, 3, 7 a 14 dnech kultivace promyty dvakrát v PBS a zafixovány pomocí vymraženého metanolu 10 minut. Poté byly opláchnuty v PBS a barveny propidium jodidem (PI ředění 2g/l PBS, Sigma Aldrich) 10 minut ve tmě. Následoval dvojitý oplach v PBS.

K vizualizaci celé buňky a zhodnocení její morfologie se použilo nepřímé imunologické barvení phalloidin-fluorescein isothiokyanát (FITC). Vzorky byly promyty dvakrát v PBS a fixovány v 2,5% glutaraldehydu (Sigma Aldrich) v PBS po dobu 10 minut při 4 °C. Následně byly promyty v PBS a permeabilizovány v roztoku 0,1% Tritonu X-100 (Sigma Aldrich) v PBS + 0,1 % BSA (Bovine serium albumin, Prolabo) 5 minut. Aktinová filamenta buňky byla obarvena pomocí phalloidinu-FITC (Sigma Aldrich, ředění 1:1000) po dobu 30 minut při pokojové teplotě ve tmě.

Po dvojitém promytí v PBS bylo provedeno kontrastní barvení buněčných jader pomocí 2-(4-amidinophenyl)-1H-indol-6-karbocamidinu (DAPI 1 mg/ml, ředění 1:1000, Sigma Aldrich). Barvení DAPI probíhalo 5 minut.

Vzorky s trombocyty byly pro fluorescenční zhodnocení mikroskopem 3x promyty v roztoku 0,1% BSA v PBS a poté se využilo imunofluorescenční barvení pomocí FITC-konjugované protilátky proti integrinu αIIb/β3 (CD 41) (ředění 1:50,

- 39 -

Santa Cruz Biotechnology) v 0,1% BSA v PBS. Vzorky byly v tomto roztoku inkubovány po dobu 30 minut ve tmě a pak byly opět promyty v 0,1% BSA v PBS.

Takto obarvené buňky se pozorovaly pomocí invertovaného fluorescenčního mikroskopu Nikon Eclipse Ti-E.

Počet buněk

Počty buněk na scaffoldech se zjišťovaly v programu NIS Elements pomocí testovací sondy o rozměrech 200 x 200 μm s vylučovacími stranami. Pro každý materiál byly náhodně vybrány z každého testovacího dne 4 snímky se zvětšením 100x, ve kterých bylo provedeno celkem 6 náhodných výběrů. Následně byla vypočtena střední hodnota se směrodatnou odchylkou a přepočet buněk na plochu 1 mm².

Elektronová mikroskopie (SEM)

Pro analýzu rastrovací elektronovou mikroskopií byly po 1, 3, 7 a 14 dnech vzorky omyty 2x v PBS a buňky se zafixovaly v 2,5% glutaraldehydu (Sigma Aldrich) v PBS po dobu 10 minut při 4 °C. Následně byly odvodněny působením vzestupné etanolové řady (60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 96 % a 100 %). Po odstranění vody byly scaffoldy přemístěny na terčík pro SEM, pozlaceny a analyzovány pomocí skenovacího elektronového mikroskopu (SEM) VEGA3 SB - Easy Probe (Tescan, Česká republika) případně SEM Phenom-World (FEI Company, USA).

Statistické zhodnocení

Ke statistické analýze dat byl využit program Statistica. K testování byl vybrán párový Studentův t-test. Analýza probíhala na 95% intervalu spolehlivosti, hladina významnosti p = 0,05.

- 40 -

2.3 Výsledky charakterizace materiálů

Morfologie vláken

Průměry vláken byly vyhodnoceny ze snímků SEM. Výsledky jsou uvedeny v následujícím Obrázek 17, kde jsou znázorněny i vlákenné vrstvy každého materiálu připravené elektrostatickým zvlákňováním technologií Nanospider.

22 hm.% PCL 10 hm.% PLC

øD = 0,96 ± 0,76 µm øD = 1,03 ± 0,71 µm

Obrázek 17 - SEM snímky, histogramy a průměry vláken PCL a PLC.

Ve výsledcích nebyly nalezeny statisticky významné rozdíly mezi materiály (p-hodnota < 0,05) v průměru vláken. Dá se tedy říct, že míra homogenity vláken obou zvlákněných vrstev byla podobná. Vrstvy stejné morfologie je tudíž možné použít k hodnocení vlivu samotného polymeru, nikoli jeho struktury.