Kombuchans mikrobiologi. The Microbiology of Kombucha

(1)

Kombuchans mikrobiologi

Hur olika tillredningssätt påverkar kombucha.

The Microbiology of Kombucha

How different preparation methods affect kombucha.

Författare: Emil Gallegos Wallgren, Emil Nylind

Vårterminen 2021

Examensarbete kandidatkurs 15 hp

Huvudområde: Måltidskunskap och värdskap

Kulinarisk kock och måltidskreatör, Sommelier och måltidskreatör Restaurang- och hotellhögskolan, Örebro universitet.

Handledare: Wilhelm Tham, Professor, Örebro Universitet Examinator: Åsa Öström, Professor, Örebro Universitet

(2)

Kursnamn: Måltidskunskap och värdskap, Examensarbete, kandidatkurs Titel: Kombuchans mikrobiologi

Författare: Gallegos Wallgren, E., Nylind, E.

Handledare: Wilhelm Tham Examinator: Åsa Öström

Sammanfattning

Kombucha har lång historia och drycken har ökat i popularitet hos konsumenter, både att köpa och att tillreda hemma. De verksamma ättiksyrabakterier och jästsvampar fermenterar kombucha och det hävdas att drycken besitter probiotisk effekt samt antioxidativa- och antimikrobiella egenskaper. Samtidigt finns det hälsorisker och möjlighet för patogena bakterier att kontaminera kombucha. Syftet med studien var att undersöka hur mängden startvätska i relation till fermentationstiden påverkar den mikrobiella tillväxten i kombucha.

En mikrobiologisk kvantitativ metod har använts för att undersöka fyra kombuchor med 2 %, 5 %, 10 % och 25 % startvätska. Deras mikrobiologi och pH-värde analyserades vid dag 1, 7, 14 och 21 i fermentationen. Resultatet visade en ökning av mikrobiell aktivitet från dag 1 till dag 21. Högst mikrobiell aktivitet mättes på prov S25 med 25 % startvätska efter 7 dagars fermentation. pH-värdet var olika för kombuchorna dag ett men minskade för samtliga kombuchor på olika sätt och dag 21 var det likvärdigt för alla prover. Studien bekräftar att kombucha med olika mängd startvätska har varierande mikrobiell aktivitet. pH-värdet minskar när kombucha fermenteras och minskar snabbare för kombucha med lägre mängd startvätska. Patogena bakterier var begränsat i samtliga prover och ej tillräckligt många för att orsaka insjuknande.

Nyckelord

kombuchabryggning, startvätska, fermentationstid, pH

2

(3)

3

Abstract

Kombucha has a long history, and the drink has gained increased popularity among

consumers, both to buy and to prepare at home. In kombucha, acetic acid bacteria and yeasts ferment the kombucha. It is claimed that the drink holds a probiotic effect together with antimicrobial and antioxidant properties. However, there are also health risks and the possibility that pathogenic bacteria occur in kombucha. The purpose of this study was to analyze how the amount of starter fluid, along with how long the kombucha ferments, affects its microbial growth. The applied method was a quantitative microbiological analysis of the microbiology, fermentation and composition of four kombuchas and how they developed over time. The four kombuchas were inoculated with 2 %, 5 %, 10 % or 25 % of starter fluid. The results showed an increase in the total amount of microorganisms after 21 days of

fermentation. The greatest quantity of microorganism was recorded after seven days of fermentation, in the kombucha containing 25 % starter fluid. On day one, the pH value of each sample was different. By day 21, the pH value had equalised amongst all samples due to the varying rate of pH reduction. The study confirms that kombuchas with different amounts of starter fluids have different microbial activity. The pH value is lowered when kombucha ferments, and decreases faster for kombuchas with a lower percentage of starter fluids. There was limited amount of pathogenic bacteria in all samples and not enough to cause illness.

Keywords:

kombuchabrewing, starter fluid, fermentation time, pH

(4)

4

Förord

Författarna Emil Gallegos Wallgren och Emil Nylind vill uttrycka sitt erkännande för den eminenta handledningen av Wilhelm Tham i såväl laboratoriet som med skrivandet. Ditt brinnande engagemang, intresse, tålamod och ditt upplivande sinne har skänkt oss mycket solsken. Vi vill också tacka Marie-Louise Danielsson-Tham för ditt stöd och tips. Tack även till Nicholas Rosenstock för inspirationen du givit oss, ditt engagemang för kombucha och rådgivning som hjälpte oss komma långa vägar. Till sist vill vi tacka vår seminariegrupp för alla givande samtal, diskussioner och tankar som vi delat under studiens genomförande.

Allt gott!

The booch bros

(5)

5

Innehållsförteckning

Ordlista ... 7

Inledning ... 8

Bakgrund ... 8

Kombuchans ursprung ... 8

Kombucha idag ... 9

Tillredningsprocess ... 9

Fermentation ... 10

Probiotika ... 11

Antioxidanter... 11

Mikrobiell aktivitet i kombucha ... 12

Patogena bakterier och hälsofaror ... 13

Syfte och frågeställningar ... 14

Kunskapsbidrag och ämnesrelevans ... 14

Metod och material ... 16

Metodval ... 16

Litteratursökning ... 16

Urval ... 17

Material ... 17

Mikrobiologisk analys ... 18

Spädning ... 18

Djupspridning och ytspridning ... 19

Bakterieavläsning ... 19

Renstryk ... 20

Gramfärgning ... 21

Genomförande ... 21

Tillredning av te och inokulering av kombucha ... 21

Provtagningstillfälle 1 ... 23

(6)

6

Dataanalys ... 25

Etiska beaktanden ... 25

Resultat... 26

Provtagningstillfälle 1 ... 26

Diskussion ... 31

Resultatdiskussion ... 31

Totalt antal mikroorganismer ... 31

MRSA ... 32

Kombuchans pH-värde ... 34

Patogener ... 35

Hälsofaktorer ... 36

Metod- och materialdiskussion... 36

Slutsatser ... 39

Praktisk användning och vidare forskning ... 39

Referenslista ... 41

(7)

7

Ordlista

Agar: Ett vegetabiliskt gelbildande ämne som blandas med näringssubstrat att de tillsammans stelnar i petriskålar.

Agarplatta: En petriskål med näringssubstrat blandat med agar.

Anaerob: Organism eller process som inte kräver syre för tillväxt.

Anaerob klocka: Behållare som kan bevara en syrefri miljö.

Arter: Inom ett släkte finns olika arter av bakterier och jästsvampar.

Brygd: En dryck som tillreds av olika ingredienser.

Differentiell färgning: Färgning av celler för att skilja dem åt när de analyseras i ett mikroskop.

DN:as-test: DN:as-test utförs för att särskilja stafylokocker. Ett positivt test innebär mer potenta bakterier och negativt test mindre potenta bakterier.

Fakultativ anaerob: Organismer som kan växa både i aeroba och anaeroba miljöer.

Fria radikaler: Ett ämne som bildas naturligt i kroppen från syret vi andas. För mycket fria radikaler bryter ner cellväggar och angriper fettämnen i kroppen. Detta har betydelse för utveckling av hjärt- och kärlsjukdomar och cancer.

Goda mikroorganismer: Mikroorganismer som lever i symbios med människan.

Grupp: Flera släkten bildar en grupp, till exempel ättiksyrabakterier.

Kombucha: Kombucha i sin helhet. En fermenterad dryck med ursprung från Asien.

Kombuchavätska: Endast vätskan i kombucha, innefattar ej den mikrobiella cellulosan.

Konfirmering: Bekräftande av bakterieart eller grupp av bakterier med biokemiska tester och/eller mikroskopering.

Mikrobiell cellulosa: Organiskt membran som består av jästsvampar och bakterier.

Synonyma namn för kombuchans mikrobiella cellulosa är: SCOBY (Symbiotic culture of bacteria and yeast), te-svamp, kombuchasvamp.

Släkte: Ett släkte består av olika arter av bakterier eller jästsvampar.

Stam: En art består av olika stammar som kan ha olika förmågor och egenskaper.

Startvätska: Opastöriserad kombuchavätska med lågt pH-värde från en tidigare bryggning.

Tillsätts vid tillredningen av kombucha för att sänka pH-värdet och bidra med verksamma jästsvampar och bakterier.

Tevätska: Vätska av varmt vatten som socker lösts upp i och te urlakats i.

(8)

8

Inledning

Kombucha är en fermenterad dryck som har sitt ursprung i Asien. Det är en lätt söt, lätt syrlig och uppfriskande dryck som idag konsumeras över hela världen. Drycken säljs både i

livsmedelsbutiker och restauranger som ett alkoholfritt alternativ. Det finns även en trend att brygga kombucha själv hemma. För tillfället är kombucha både hyllad som den ultimata hälsodrycken men också fördömd som det opålitliga medicinska teet (Jayabalan, Malbasa, Loncar, Vitas & Sathishkumar, 2014, s. 538). I studier beskrivs kombucha som en dryck med terapeutiska egenskaper: antimikrobiella, antioxidanta, anticarcinogena, antidiabetiska samt påstås bota magsår och motverka högt kolesterolvärde (Sreeramulu, Zhu & Knol, 2000, s.

2589). Kombucha har även visat sig ha en positiv påverkan på immunförsvaret och leverns avgiftande förmåga. Vid tillredningen finns det risk för att kombuchan angrips av patogena bakterier och det har rapporterats sjukdomsfall efter konsumtion av kombucha (British Columbia Centre for Disease Control, BCCDC, 2020). Med hänvisning till den splittrade diskursen om kombucha och det nyuppfunna intresse den väckt finns det ett behov att undersöka drycken vidare. Studiens mål är att undersöka hur kombuchans mikrobiologi, fermentation och komposition påverkas av olika tillredningssätt. Därför analyserades fyra kombuchor med olika mängd startvätska för att se hur deras mikrobiella aktivitet och pH- värde förändrades över tid.

Bakgrund

I bakgrunden ges en förklaring till kombuchans ursprung, utbredning och dess

fermentationsprocess. Sedan presenteras dryckens hälsoaspekter och vad det finns för risker med kombucha.

Kombuchans ursprung

Den fermenterade dryckens historia har spårats tillbaka till de östra delarna av Asien år 220 f.Kr. där den användes för sina terapeutiska egenskaper (Sreeramulu et al., 2000, s. 2589).

Under Tsin-Dynastin i Manchuriet, en region belägen i nordöstra Kina, var kombucha känd för sina avgiftande och energigivande krafter (Jayabalan et al., 2014, s. 538). Drycken har haft olika namn genom tiden: Tea Fungus, Kargasok Tea, Manchurian Mushroom och Haipao.

(9)

9

Namnet kombucha härstammar från en doktor vid namn Kombu som tog teet till Japan och botade kejsarens matsmältningsbesvär varpå kombucha fick sitt namn efter Kombus te (Jayabalan et al., 2014, s. 538).

Kombucha har traditionellt tillverkats på grönt eller svart te (Sreeramulu et al., 2000, s. 2589).

Drycken blev populär på grund av möjligheten att enkelt variera smak (Jayabalan et al., 2014). Däremot menar Sreeramulu et al. (2000, s. 2589) att kombuchans popularitet ökade på grund av dels dess förmånliga hälsoeffekter på människan, dels genom dess enkla

bryggningsmetoder. När den kinesiska handelsvägen Sidenvägen utvidgades introducerades kombuchan i Ryssland och senare i Östeuropa (Jayabalan et al., 2014, s. 538). Under andra världskriget introducerade Tyskland drycken till resterande delarna av Europa och världen (Sreeramulu et al., 2000 s. 2589). Efter andra världskriget blev te och socker eftersökta livsmedelsprodukter, vilket medförde en brist på råvarorna till tillredningen av kombucha.

Bristen resulterade i en minskad konsumtion. Efter att schweiziska forskare utförde en studie under 1960-talet som visade att konsumtionen av kombucha var lika nyttigt som yoghurt började kombuchans popularitet öka igen (Jayabalan et al., 2014, s. 538).

Kombucha idag

Kommersiellt tillverkad kombucha säljs idag i livsmedelsbutiker världen över i flera olika smaker (Jayabalan et al., 2014, s. 539). Det går även att köpa mikrobiella cellulosor och startvätska online för att brygga kombucha i hemmet. Tumble (u.å.) menar att kombucha och andra låghaltiga alkoholdrycker fått en större plats på krogen i Sverige och ingår numera oftare i svenska restaurangers dryckespaket. I New York har kombucha ökat i popularitet på grund av sitt hälsosamma rykte och restauranger tillverkar själva eller köper in färdiggjorda kombuchor (Nation's Restaurant News, 2017). Michelinrestaurangen Noma i Köpenhamn tillreder kombucha i sitt restaurangkök. De olika sorters kombucha som Noma tillverkar används som komplement till viner samt som ingrediens i maträtter (Redzepi & Zilber, 2018, s. 110).

Tillredningsprocess

Det finns olika recept för att brygga kombucha. Traditionellt bryggs ett te som sedan blandas med socker där blandningen fungerar som ett substrat för fermentationen med bakterier och jästsvampar (Jayabalan et al., 2014, s. 538). Tevätskan hälls över i ett glaskärl och inokuleras

(10)

10

sedan med startvätska. Genom att tillsätta startvätskan sänks pH-värdet och därmed minskar möjligheten för tillväxt av patogena bakterier (Jayabalan et al., 2014, s. 539). Mängden te, socker, startvätska samt tesort och fermentationstid kan variera beroende på recept eller region kombuchan bryggs i (Jayabalan et al., 2014, s. 538). Därefter tillsätts en mikrobiell cellulosa i glaskärlet. Enligt Jayabalan et al. (2014, s. 539) är den optimala temperaturen för fermentationen 18–26 °C. Under fermentationen kommer kombuchan att börja utsöndra doft samt tillverka gasbubblor av kolsyran som produceras under fermentationen (Jayabalan et al., 2014, s. 539). Beroende på smak och arom avbryts fermentationen när kombuchan anses ha de önskade egenskaperna. Generellt brukar kombucha fermentera i 7–14 dagar (Battikh, Chaieb, Bakhrouf & Ammar, 2013 s. 231).

Fermentation

I kombucha lever olika bakterier och jästsvampar i symbios, samexistens (Redzepi & Zilber, 2018, s. 112). Det är ett ömsesidigt förhållande där båda parter gynnas av varandra. Bakterier och jästsvampar är både verksamma i kombuchavätskan och den mikrobiella cellulosan (Redzepi & Zilber, 2018, s. 113). När startvätskan och den mikrobiella cellulosan

introduceras till tevätskan påbörjar jästsvamparna en fermentation. Jästsvamparna konsumerar socker för att få energi och omvandlar det till etanol samt producerar koldioxid som en

biprodukt av fermentationen (McGee, 2004, s. 773). Mängden alkoholprocent varierar beroende på hur långt fermentationen pågår (Ihsani, Hernahadini & Fauzi, 2021).

Alkoholhalten går sällan över cirka 0,55 % varpå den minskar långsamt (Chen & Liu, 2000, s.

837). Ättiksyrabakterierna i den mikrobiella cellulosan fermenterar etanolen genom att oxidera den till ättiksyra med hjälp av syret från sin omgivning (Redzepi & Zilber, 2018, s.

112). Fermentationen orsakad av jästsvampar och ättiksyrabakterier sänker kombuchans pH- värde (Júnior, Batista, Rodrigues, Filho & Lima, 2009, s. 74).

Kombucha genomgår en oavbruten jäsning vilket innebär att jästsvamparna fortsätter att fermentera socker till etanol, som ättiksyrabakterierna omvandlar till ättiksyra, ända tills sockret tar slut (Redzepi & Zilber, 2018, s. 112). Kombuchans fermentation skiljer sig från vinägerjäsning där jästen kan dö efter att den producerat den mängd alkohol bryggaren eftertraktar varpå vinägern får en del restsötma kvar. Däremot påminner den bakteriella fermentationen i kombucha om vinägerfermentationen genom att de tre ingredienserna etanol, syre och ättiksyrebakterier skapar drycken (McGee, 2004, s. 773). Ättiksyrebakterierna

(11)

11

Acetobacter och Gluconobacter är några av de få bakteriesläkterna som kan använda etanol som energikälla (McGee, 2004, s. 773).

Probiotika

Probiotika utgörs av mikroorganismer vilka kan påverka människors hälsa positivt när de äts eller dricks i tillräcklig mängd. I en rapport från FAO/WHO (2001, s. 18) framkommer indikationer för att mat eller dryck med probiotika påverkar människors hälsa positivt men att det behövs mer forskning för att fastställa vad probiotika har för påverkan. Enligt

Livsmedelsverket (2020) kan probiotiska mikroorganismer ha hälsofrämjande effekt genom att påverka människors tarmflora. De vanligaste probiotika är mjölksyrabakterier vars egenskaper ska stärka immunförsvar och tarmflora (Bogdan, Justine, Filofteia, Petruta,

Gabriela, Roxana & Florentina, 2018, s. 2). Bogdan et al. (2018, s. 6) menar att kombucha har probiotiskt potential efter att ha isolerat mjölksyrabakterier från kombucha, bakterier som hade förmåga att överleva i en människans tarmar. Kombucha skulle därför kunna användas för att utvinna probiotika att tillsättas i mat med specifika hälsovärden (Bogdan et al., 2018, s.

6). När kombuchans direkta påverkan på människans tarmflora analyserades påvisades dock ingen effekt (Bergström, 2018, s. 28). Testdeltagare konsumerade kombucha i tre veckor men det antogs att kombuchan hade för lågt innehåll av levande mikroorganismer för att ha

probiotisk effekt.

Antioxidanter

Antioxidanter förhindrar att fria radikaler bildas och skadar människans kropp. Grönt te innehåller bioaktiva ämnen som kan fungera som antioxidanter (Livsmedelsverket, 2021).

Jayabalan, Subathradevi, Marimuthu, Sathishkumar och Swaminathan (2007) menar att te innehåller beståndsdelar med goda antioxidanter och kombucha som tillreds med te får även goda antioxidativa egenskaper. När kombucha fermenteras ändras teets strukturella

komponenter vilket kan förbättra dess förmåga att rensa bort olika fria radikaler (Jayabalan et al., 2007, s. 233). Förmågan beror på vad för typ av te som används och hur länge

fermentationen pågår. Neutralisering av fria radikaler ökade vid en längre fermentation (Jayabalan et al., 2007, s. 233). Däremot är det inte rekommenderat att förlänga

fermentationen eftersom kombuchan till slut får ett så lågt pH-värde att drycken kan vara hälsovådlig att förtära (BCCDC, 2020, s. 7).

(12)

12

Mikrobiell aktivitet i kombucha

Kombucha är en symbiotisk kultur som består av ättiksyrabakterier (Acetobacter och Gluconacetobacter) och jästsvampar (Saccharomyces, Brettanomyces, Candida sp. eller Pichia Membranifaciens) (Battikh et al., 2013; Marsh, Sullivan, Hill, Ross och Cotter, 2014).

När fermentationen på fem olika mikrobiella cellulosor jämfördes över tid konstaterades det att den bakteriella diversiteten var störst i kombuchan efter tre dagars fermentation (Marsh et al., 2014, s. 173). Mångfalden var dock ännu större bland jästsvamparna i kombuchan.

Gluconacetobacter var det mest aktiva bakteriesläktet i kombucha men det påvisades även små mängder av Acetobacter (Marsh et al., 2014, s. 174). Sreeramulu et al. (2000, s. 2593) menar att det inte går att se skillnad på Gluconobacter och Acetobacter när dessa studeras på agarplattor, därför redovisas dessa hellre tillsammans som gruppen ättiksyrabakterier.

Mjölksyrabakterier har påvisats både i den mikrobiella cellulosan och i kombuchavätskan (Marsh et al., 2014, s. 174). I kombuchavätskan ökade mjölksyrabakterier i mängd under fermentationens gång.

Av de jästsvampar som kan växa under vätska, är de fermentativa och syraproducerande vanligast, däremot har det inte fastställts vilka jästarter som är universellt specifika för kombucha (Teoh, Heard & Cox, 2004, s. 124). Teoh et al. (2004) redogör för hur olika jästarter och sammansättningar av arter har förekommit i kombucha och att de skiljer sig åt när de undersökt olika mikrobiella cellulosor. Teoh et al. (2004) jämförde fyra australiensiska mikrobiella cellulosor vilka alla uppvisade en variation i ekologi. Mängden jästsvampar som hittades i kombuchavätskan matchar antalet jästsvampar som hittades i den mikrobiella cellulosan vilket kan tyda på att cellulosan är en avgörande faktor för kompositionen av jästsvampar (Teoh et al., 2004, s. 125; Marsh et al., 2014, s. 176). Hur antalet jästsvampar växer skiljde sig åt i kombuchavätskan och i den mikrobiella cellulosan (Teoh et al., 2004, s.

125). I kombuchavätskan ökade mängden jästsvampar under det första åtta till tio dagarna och minskade sedan på grund av lågt pH-värde och brist på näringsämnen. (Teoh et al., 2004, s.

125). För den mikrobiella cellulosan däremot var mängden jästsvampar konstant under fermentationen.

Marsh et al. (2014, s. 177) menar att den mikrobiella populationen från den mikrobiella cellulosan har en stark inverkan på kombuchan. Det i kombination med kombuchas låga pH-

(13)

13

värde och etanolinnehåll begränsar eventuell kontaminering med oönskade bakterier, även när kombucha bryggs i ett vanligt kök. Kombucha har även uppvisat antimikrobiella egenskaper mot patogena bakterier: E. coli, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria

monocytogenes och Bacillus cereus (Borkani, Doudi & Rezaytmand, 2016, s. 1746; Júnior et al., 2009, s. 77). Enligt Battikh et al. (2013, s. 231) har bakteriers resistens mot

antimikrobiella läkemedel blivit ett växande världsproblem. Kombuchas verksamma

mikroorganismer kan i framtiden bli ett alternativ för de nuvarande syntetiska antimikrobiella läkemedlen (Battikh et al., 2013, s. 231).

Patogena mikroorganismer och hälsofaror

Konsumtion av kombucha kan innebära hälsorisker, speciellt för människor med bristande immunförsvar (Kole, Jones, Christensen & Gladstein, 2009, s. 207). Det har rapporterats fall där människor upplevt illamående och yrsel efter att ha konsumerat kombucha. Kole et al.

(2009) redovisar ett allvarligare fall där en ung hiv-positiv man insjuknade i feber och fick andningsbesvär efter att ha druckit en liter kombucha. Tidigare har även två fall av akut acidos, mjölksyreöverskott i blodet, misstänks vara orsakad av kombuchakonsumtion (CDC, 1995). Vid ett av fallen fick patienten senare hjärtstopp och omkom.

Patogena mikroorganismer kan kontaminera kombucha i samband med tillredning av brygden (BCCDC, 2020, s. 2). Kombuchans pH-värde underskrider ofta 4,0 vilket innebär en

ogynnsam miljö för patogena bakterier men dessa kan också kontaminera kombuchan innan denna miljö uppnåtts. Food and Drug Administration har uttryckt oro för att mögelsvamparna Aspergillus och Candida sp. kan förorena kombucha (Kole et al., 2009, s. 206). Båda

mögelsvamparna kan ge allvarliga sjukdomsbesvär hos människor med nedsatt immunförsvar (Folkhälsomyndigheten, 2016; Folkhälsomyndigheten, 2013). För att undvika kontaminering under tillredning bör rena och desinfekterade redskap användas, inklusive kärl som

kombuchan fermenteras i och duken man använder för att täcka kärlet under bryggning (BCCDC, 2020, s. 5). På grund av den syrliga miljön som uppnås i kombucha är vissa kärl olämpliga för förvaring. Phan, Estell, Duggin, Beer, Smith och Ferson (1998, s. 644) kopplade två fall av blyförgiftning till att patienterna druckit kombucha som förvarats i keramikkärl med blybaserad glasyr. Den sura vätskan gjorde att bly frigjordes från glasyren i keramikkärlen och förorenade kombuchan.

(14)

14

Det är viktigt att miljön kombuchan bryggs och fermenteras i är ren och hygienisk för att det varma teet ska kylas ner till rumstemperatur innan det inokuleras med mikrobiell cellulosa och startvätska. En överproduktion av ättiksyra kan vara skadligt, därför bör fermentationen inte gå för långt. För att säkerställa en miljö i kombuchan som är ogynnsam för patogena bakterier bör fermentationen heller inte vara för kort (BCCDC, 2020, s. 7). Kombuchans pH- värde bör inte vara lägre än 2.5 och inte högre än 4.2 när fermentationen är klar.

Kombucha har ökat i popularitet och drycken har en enkel tillredningsprocess som gör den tillgänglig för privatpersoner eller restauranger att brygga. Samtidigt som det rapporterats hälsofrämjande egenskaper hos kombucha finns det också risker vid tillredningen. Därför är det aktuellt att undersöka hur tillredningsmetoden påverkar kombucha och om det är något i tillredningen som bör beaktas.

Syfte och frågeställningar

Syftet är att undersöka hur mängden startvätska i relation till fermentationstiden påverkar den mikrobiella tillväxten i kombucha.

• Hur skiljer sig den mikrobiella aktiviteten i kombucha med 2 %, 5 %, 10 % och 25 % startvätska efter 0, 7, 14 och 21 dagars fermentationstid?

• Hur förändras pH-värdet i kombucha med 2 %, 5 %, 10 % och 25 % efter 0, 7, 14 och 21 dagars fermentation?

• Hur ser tillväxten av patogena bakterier ut i kombucha med 2 %, 5 %, 10 % och 25 % startvätska efter 0, 7, 14, och 21 dagars fermentation?

Kunskapsbidrag och ämnesrelevans

I och med kombuchans ökade popularitet avser denna studie att öka förståelsen för en dryck som kan förhöja måltidsupplevelsen. Studien undersöker mikrobiologin i drycken kombucha.

(15)

15

Även om kombuchans sensoriska egenskaper inte undersöks kan en laborativ studie vara första steget för att utreda hur olika tillredningssätt skiljer sig. De metoder som används för tillredning i studien ska efterlikna de som används i hemmet. Den information studien hittar kan förmedlas till samhället för att förebygga sjukdom orsakade av mikroorganismer vid tillredning av kombucha i hemmiljö.

Vi som skrivit denna studie är en kockstudent och en sommelierstudent på Restaurang- och hotellhögskolan (RHS) i Grythyttan. Utbildningen på RHS utgår till stor del från The Five Aspect Meal Model (FAMM). Det är en modell som tar fem aspekter i beaktande för att skapa en helhet av måltiden i restaurang (Gustafsson, Öström, Johansson & Mossberg, 2006, s. 84).

De fem aspekterna i FAMM är rummet, mötet, produkten, styrsystemet och atmosfären.

Denna studie fokuserar på tillverkningen av kombucha och jämför hur olika faktorer i tillredningen påverkar drycken. Därför kommer studien behandla FAMM-aspekten

”produkten”. Gustafsson et al. (2006, s. 88) belyser vikten för en kock att ha kunskapen om kemin bakom produkten och dess olika stadier för att skapa en bra produkt. Sommelieren använder sin praktiska och teoretiska kunskap om dryck för att bland annat skapa

dryckeskombinationer till mat. Med en större förståelse för tillredning och faktorer som påverkar kombuchans uppbyggnad kan denna information användas för att skapa en bra produkt eller mat- och dryckeskombination. Studien innehåller även livsmedelshygieniska aspekter vid tillredning av kombucha. Dessa kan kopplas till FAMM-aspekterna ”produkten”,

”atmosfären” och ”styrsystemet”. Om produkten som skapas inte är lämplig att dricka har tillverkaren misslyckats med att skapa en bra produkt. Gustafsson et al. (2006, s. 90) menar att helhetsupplevelsen av en måltid skapar aspekten ”atmosfären”. Ifall en gäst insjuknar på grund av livsmedelsförstörande eller sjukdomsframkallande bakterier kopplat till en produkt kan det påverka måltidsupplevelsen. ”Styrsystemet” innefattar regler hur livsmedel behandlas och lagar för hygien (Gustafsson et al., 2006, s. 89). Följs inte dessa kan en del av

”styrsystemet” misslyckas.

(16)

16

Metod och material

I metodavsnittet ges en beskrivning av hur den laborativa undersökningen har gått tillväga och vad för material som har använts. Under rubriken genomförandet beskrivs hur te och

kombucha har tillretts och hur fyra prover för analysering namngavs till S2, S5, S10 och S25.

Metodval

I denna studie har en teoretisk metod och en praktisk metod använts. Den teoretiska innefattade en litteratursökning och i den praktiska utfördes en mikrobiologisk analys av kombuchor. Den mikrobiologiska analysen gav ett resultat i form av siffror vilket innebar att den har ett kvantitativt förhållningssätt. En kvantitativ metod syftar till att mäta värden i siffror till skillnad från kvalitativa metoder som tolkas i ord (Bryman, 2018). För att uppnå studiens syfte analyserades fyra kombuchor på dess mikrobiologiska aktivitet. För att säkerställa att samtliga kombuchorna var tjänliga utfördes en grundläggande

livsmedelsmikrobiologisk undersökning av patogena bakterier.

Analysen av kombuchorna genomfördes vid fyra olika tillfällen. Dessa benämns som Provtagningstillfälle 1, 2, 3 och 4. Provtagningarna genomfördes på kombuchor med fyra olika mängd startvätska och utfördes första gången efter tillredning och sedan med sju dagars mellanrum i tre veckor. Detta upplägg föreföll naturligt med arbete i laboratoriet och ansågs vara rimligt för ett tidsbegränsat examensarbete. Analysen utfördes med laborativa medel i livsmedelslaboratoriet K1131 på RHS och den mikrobiologiska aktiviteten uppskattades genom att olika synliga bakteriers kolonier räknades.

Litteratursökning

En litteratursökning utfördes för att skapa en bild av det aktuella kunskapsläget. De

vetenskapliga artiklar som använts i studien har blivit refereegranskade. Litteraturen söktes i databaser med hjälp av sökord som utformats från studiens syfte samt med vägledning av handledare. De databaser som använts var Web of Science, Scopus, Primo och Wiley online library. Sökord hjälpte att avgränsa sökningen och få fram relevant material (Bryman, 2018, s. 154). För att öka antalet sökträffar har engelska sökord använts. Sökorden har företrädesvis varit: probiotic, bacterial cellulose, patogen, bacteria, ecology, fermentation, restaurant och health. Utifrån artiklar som lästs har andra artiklar återfunnits i författarnas referenshantering.

(17)

17

Utöver vetenskapliga artiklar har även böcker, information från företag, myndigheter och organisationer använts för att skapa en förståelse för kombuchas tillredning och användning.

De har återfunnits via sökmotorn Google och Restaurang- och hotellhögskolans bibliotek i Grythyttan. Under studiens gång har litteratur tillkommit och tagits bort. Innehållets relevans har diskuterats och analyserats utifrån syftet för att säkerställa att litteraturen var givande för studien. När studien skrevs var litteraturen om kombucha något begränsad, därför valdes det att inte göra avgränsningar utifrån vilket år litteraturen skrevs. En avgränsning var mot sensoriska studier eftersom sensoriska egenskaper inte undersöktes.

Urval

Införskaffande av material såsom te, socker och mikrobiell cellulosa har skett via

bekvämlighetsurval. Det innebar att vi skaffade det material som var tillgängligt för tillfället (Bryman, 2018, s. 243). De mikrobiella cellulosorna var tillverkade i samma land och beställdes via internet från ett livsmedelsmärke vi arbetat med tidigare. Det lades ingen värdering i att arbeta med det specifika livsmedelsmärket förutom att vi visste att de skulle ge en fungerande fermentation. Eftersom studien hade en begränsad tid ansågs det viktigt att omgående starta en pålitlig fermentation.

Valet av procenthalter på startvätska diskuterades fram tillsammans med handledare och med hjälp från Nicholas Rosenstock, doktor i mikrobiologi och grundare till ett kombuchaföretag i Sverige. De olika procenthalter innefattade både 10 % som liknar en vanlig mängd vid

tillredning och 2 %, 5 % och 25 % vilka avviker från standard.

Material

Vid studerandet av mikroorganismer och dess funktion i ett laboratorium behövs speciell utrustning och olika hjälpmedel (Danielsson-Tham, u.å.).

Maskiner och material som användes under laborationerna:

– Petriskålar med färdiggjutna agar: Blodagar (blod), Slanetz agar (SLANETZ), Baird Parker (BP), Bacillus cereus Rapid Agar (BAC), Agar Listeria enligt Ottaviani och Agosti (ALOA), Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC), de Man, Rogosa och Sharpe agar (MRSA).

(18)

18

– Tomma petriskålar med flytande agar: Plate Count Agar (PCA), Violettrött-Galla-Glukos Agar (VRGG 37 °C & VRGG 44 °C), Tryptos Sulphit Cycloserin Agar (TSC).

– Spädningsrör, pipetter, peleusboll, pipettkast, rackla, sax, pincett, stomacherpåse, spädningsvätska, platinös, anaerobklocka.

– Lab-blender Stomacher® 400.

– Inkubator Termaks™ T 1056 U.

– Provrörsskak Vortex-Genie™ 2 K-550-GE.

– Provrörsskak Vortex-Genie™ 1 K-550-GE.

– pH mätare SevenEasy™ Mettler Toledo S20.

Mikrobiologisk analys

Spädning

Vid räknandet av antalet bakterier och jästsvampar i ett provmaterial används spädning som en metod för att underlätta räknandet (Madigan, Bender, Buckley, Sattley & Stahl, 2018 s.

186). I denna studie utfördes spädning genom att blanda fysiologisk koksaltlösning med det ursprungliga provet. Madigan et al. (2018 s. 186) menar att koksaltlösning kan ge ett mer precist resultat, till skillnad från att blanda med vatten. Faktorn för spädningen motsvarar spädningsgraden (Tabell 1). Spädning 1 sker genom att blanda 1 ml provmaterial med 9 ml spädningsvätska och innebär spädning 1:10. Spädning 2 1:100, Spädning 3 1:1000, Spädning 4 1: 10 000 och Spädning 5 1:100 000.

Tabell 1. Spädningsmetoden

Spädning + Spädningsvätska Spädning

Spädning 1 1 ml kombucha + 9 ml spädningsvätska 1: 10

Spädning 2 1 ml Spädning 1 + 9 ml spädningsvätska 1: 100

Spädning 3 1 ml Spädning 2 + 9 ml spädningsvätska 1: 1000

Spädning 4 1 ml Spädning 3 + 9 ml spädningsvätska 1: 10 000

Spädning 5 1 ml Spädning 4 + 9 ml spädningsvätska 1: 100 000

(19)

19

Djupspridning och ytspridning

I studien användes djupspridning och ytspridning när provmaterial inokulerades. För att beräkna bakterier i ett prov är dessa två metoder de vanligaste tillvägagångssätten (Madigan et al., 2018, s. 185). För djupspridningsmetoden applicerades 1 ml provmaterial till en

steriliserad petriskål, följt av tillförseln av ett flytande agarmedium med temperatur på cirka 50 °C. Provmaterialet blandades med agarmediumet genom cirkulär-liknande rörelser i form av en åtta på en plan yta. För ytspridningsmetoden applicerades 0,1 ml provmaterial till en färdiggjuten agar i petriskål som sedan racklas med en desinfekterad rackla och fördelas jämt över ytan. Den högre spädningen racklades först för att sedan använda samma rackla för samma prov med en lägre spädning (Tabell 1) tills alla plattor var racklade. Agarplattorna inkuberas sedan upp och ner förvarade i plastpåsar vid olika temperaturer och tider beroende på agarmedium.

Bakterieavläsning

För att räkna bakteriekolonier på en agarplatta bör en spädning utföras på provmaterialet (Madigan et al., 2018 s. 185). När djupspridning och ytspridning tillämpas är det viktigt att bakteriekolonierna inte är för många eller för få. Enligt Danielsson-Tham (u.å.) bör det vara mellan 30 och 300 bakteriekolonier på varje agarplatta för att statistiskt vara det mest valida provet att räkna. Inkubationstemperaturen och inkubationstiden varierar beroende på vilken bakterie som undersöks (Tabell 2) (Madigan et al., 2018 s. 178). I och på ytan kan man efter 1–3 dygn upptäcka prickar (Danielsson-Tham, u.å.), där varje prick utgör en bakteriekoloni.

Varje koloni kommer ursprungligen från en enda bakteriecell som förökat sig i eller på agaren (Madigan et al., 2018 s. 184). Varje bakteriekoloni består av 1 miljon till 1000 miljoner bakterier (Danielsson-Tham, u.å.). Efter inkubationen räknades varje koloni beroende på lämplig spädningsgrad. Sedan multiplicerades antalet med tiopotenser med lika många gånger som spädningen skett (Tabell 1). Antal bakterier redovisas sedan i logaritmisk form (log.) (Danielsson-Tham, u.å.).

(20)

20

Tabell 2. Substrat som använts för att undersöka en viss bakterie med vilken spridning samt inkubationstid.

Substrat Bakterie Ytspridning/Djupspridning Inkubation

Plate Count Agar (PCA) Totalantal bakterier Djupspridning 3 dygn, 30 °C

Violettröd Galla-agar (VRGG)

Enterobacteriaceae 37

°C och 44 °C

Djupspridning 2 dygn, 37 °C

eller 44 °C

Baird Parker-agar (BP) Stafylokocker Ytspridning 2 dygn, 37 °C

Slanetz & Bartley agar (SLANETZ)

Enterokocker Ytspridning 2 dygn, 44 °C

Bacara-agar (BAC) Bacillus cereus Ytspridning 2 dygn, 30 °C

Tryptose Sulfite Cycloserine- agar (TSC)

Clostridium perfringens Djupspridning 2 dygn, 37 °C i anaerob klocka

Agar Listeria Ottaviani &

Agosti (ALOA)

Listeria monocytogenes Ytspridning 2 dygn, 37 °C

Blodagar (blod) Flera aeroba

mikroorganismer

Ytspridning 2 dygn, 37 °C

De Man, Rogosa & Sharpe agar (MRSA)

Lactobacillus Ytspridning 2 dygn, 30 °C

Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC)

Mögelsvamp och jästsvamp

Ytspridning 3–7 dygn, 22–25

°C

Renstryk

För att säkerställa en mikroorganisms egenskaper måste den befinna sig i renkultur, en kultur där det endast finns en sorts bakterie (Carlson & Linder, 2008 s. 22). Vid förekomst av olika bakteriekolonier, till form, färg och storlek, eller vid överväxt av jästsvampar tillämpas renstryk. Denna metod syftar till att isolera en representativ bakteriekoloni med en steril platinös från ett redan odlat och inkuberat agarmedium som är av intresse att undersöka vidare. För att erhålla en renkultur stryks eller inokuleras den isolerade bakteriekolonin på ett nytt agarmedium (Figur 1) (Carlson & Linder, 2008 s. 23). Efter inkubation studeras plattan vidare.

(21)

21

Figur 1. De två renstryckningsmetoderna.

Gramfärgning

Gramfärgning är en metod som används för att undersöka den enskilda mikroorganismens form och för att ta reda på om mikroorganismen är Gramnegativ (G-) eller Grampositiv (G+) (Madigan et al., 2018 s. 50). Differentiell färgning är den färgningsprocess som används när man gramfärgar (Madigan et al., 2018 s. 50). Differentiell färgning kan skilja på

mikroorganismer eller strukturer och cellulära komponenter i en mikroorganism (Madigan et al., 2018 s. 50). Vid gramfärgning förs mikroorganismen till ett objektglas och smetas ut med en droppe vatten. Objektglaset passeras sedan upprepande gånger över en gasbrännare för att långsamt torka ut provet med mikroorganismen. Färgämnen tillsätts i olika ordning (Madigan et al., 2018). Först appliceras Kristallviolett i en minut för att färga alla celler lila. Sedan tillsätts Lugol i en minut för att bibehålla grampositiva bakterier lila. Sedan avfärgas

eventuella Gramnegativa bakterier med aceton-sprit vilket gör dem färglösa. Momentet följs av vattenavsköljning. Sist tillsätts Safranin i 15–20 sekunder för att färga G- rosa (Madigan et al., 2018 s. 50). Momentet följs av ytterligare en vattenavsköljning. Objektglaset torkas sedan försiktigt av med en pappershandduk.

Genomförande

Tillredning av te och inokulering av kombucha

Tillredningen av kombucha genomfördes enligt Jayabalan et al. (2014) med vissa

modifieringar. Tillredningen skedde i ett restaurangkök med utrustning som vanligen finns i

(22)

22

ett hushåll. Vid all tillredning användes desinfekterad utrustning. Glaskärlen desinfekterades genom att ångas i 100℃ i minst tio minuter. Silar och mindre verktyg kokades i vatten. De mikrobiella cellulosorna förvarades enligt instruktion av tillverkaren med startvätska i originalförpackning i kylskåp inför tillredning. När en mikrobiell cellulosa hanterades användes plasthandskar.

De införskaffade mikrobiella cellulosor hade inte tillräckligt med startvätska för studien. För att få tillräckligt med startvätska bryggdes 1200 ml kombucha en vecka innan de fyra

proverna bryggdes. Mikrobiella cellulosan och dess startvätska togs ut ur kylskåp och ur förpackning cirka två timmar innan de skulle tillsättas till brygden. 60 gram (5 % socker) löses i 1080 ml kokande vatten. När vattnet svalnat till 95℃ tillsattes sex gram svart te, Assam Chardwar Golden Tippy, som fick dra i 10 minuter. Sedan silades tevätskan och fick svalna till rumstemperatur i ett sterilt 1500 ml cylinderformat glaskärl. Den mikrobiella cellulosan med 120 ml startvätska tillsattes när tevätskan svalnat. Kärlet täcktes med en steril dubbelvikt pappershandduk som fästes med gummisnodd. Fermentationen skedde vid cirka 22℃.

Inför tillsatsen öppnades fyra originalförpackningar med mikrobiell cellulosa och startvätska, tillsammans blandades de med den tidigare förberedda startvätskan i en desinfekterad

plastskål. Vid förberedning noterades det att de mikrobiella cellulosorna var i olika storlekar.

För att förbereda tevätskan kokades 9000 gram vatten upp i kastrull och 1000 gram socker blandades i vattnet. Kastrullen togs bort från spishällen och när temperaturen sjunkit till 95℃

tillsattes 50 gram Assam Chardwar Golden Tippy som fick dra i 13 minuter. Sedan silades tebladen bort och tevätskan fick svalna till cirka 55℃. För att särskilja proverna namngavs fyra olika 3300 ml glaskärl. Glaskärlen namngavs med ett ”S” för startvätska och sedan en siffra för att markera den procentuella mängd startvätska provet skulle innehålla: S2, S5, S10 och S25. Därefter fylldes glaskärlen med tevätskan, denna fick svalna ytterligare till

rumstemperatur varpå den procentuella mängden startvätska tillsattes. S2 fylldes med 2450 gram tevätska plus 50 gram (2 %) startvätska, S5 med 2375 gram tevätska och 125 gram (5

%) startvätska, S10 med 2250 gram tevätska plus 250 gram (10 %) startvätska, S25 med 1875 gram tevätska plus 675 gram (25 %) startvätska. Slutligen lades cirka 100 gram mikrobiell cellulosa i vardera glaskärl och täcktes med en steril pappershandduk. Kombuchorna

fermenterades i ett avstängt kylskåp med cirka 22℃ med dörren på glänt för att släppa in luft.

(23)

23

När kombuchorna skulle analyseras fördes cirka 50 ml kombuchavätska med desinfekterad slev från varje glaskärl till fyra förmärkta sterila glasflaskor.

Provtagningstillfälle 1

Vid första provtagning analyserades den mikrobiella cellulosa som bryggt startvätskan till de fyra proverna och kombuchavätskorna från S2, S5, S10 och S25. Den mikrobiella cellulosan som bryggt startvätskan analyserades för att säkerställa dess tjänlighet. För att späda den mikrobiella cellulosan klipptes 10 gram av och blandades med 90 gram koksaltlösning i en stomacherpåse. Påsen lades i en stomacher för att krossa den mikrobiella cellulosan. Sedan gjordes två spädningar till enligt spädningsschema (Tabell 1). Vätskorna överfördes med sterila glaspipetter för volymen 1 ml och peleusbollar till petriskålar; denna hantering var genomgående för samtliga provtagningstillfällen. Ytspridning och djupspridning utfördes enligt Tabell 2. Spädningar som användes varierade beroende på hur mycket mikrobiell aktivitet som förväntades. Detta upprepades för alla provtagningstillfällen. Som mest utfördes fem spädningar. pH-värdet uppmättes med pH-mätare; denna pH-mätare användes vid

samtliga provtagningstillfällen. Elektroden stoppades i provburken och sköljdes med ultrarent vatten mellan pH-mätning av proverna.

Odling på MRSA och DRBC vid första provtagningstillfället genomfördes två dagar senare.

Detta innebar att pH-elektroden hade nuddat provet i provburkarna. Vid odling på MRSA och DRBC skedde misstaget att samma rackla användes för alla fyra prover, detta kan ha påverkat resultatet. Efter analysen upptäcktes det att anaerobklockan för TSC inte var lufttät under inkubationen.

Vid andra provtagningen testades kombuchavätskorna efter sju dagars fermentation. Fem spädningar utfördes. Samtliga agarmedia användes utom VRGG 44 °C. Efter att agarplattorna inkuberats i respektive temperatur uppmättes pH-värdet. Avläsning skedde två dagar efter inkubering för samtliga agarmedia förutom PCA som avlästes först tre dagar efter inkubering.

För att säkerställa att anaerobklockan som användes för att inkubera TSC-agarplattorna i fungerade inokulerades en blod-platta med Clostridium perfringens. Om blod-plattan gav tillväxt innebar det att miljön i klockan var anaerob. På resterande provtagningstillfällen vid anaerob inkubering upprepas detta för konfirmering av anaerob miljö.

(24)

24

Vid avläsning av TSC-agaren användes mikroskåp för att räkna kolonier. En fjärdedels cm² delades i fem och räknades för att få en uppskattning av antalet bakterier. När ¼ cm² räknats mulitplicerades antalet med 4, sedan multiplicerades det med petriskålens yta. När kolonier på MRSA beräknades skiljdes små och stora kolonier. För att särskilja mikroberna, benämndes små kolonierna som ”x” och det stora benämndes som ”y”.

Efter 14 dagars fermentation genomfördes tredje provtagningen. Fem spädningar gjordes. De fyra olika kombuchavätskorna analyserades på likadana media som vid provtagningstillfälle 2. På grund av brist på petriskålar i standardstorlek användes petriskålar i halv storlek för MRSA. Blod och MRSA inkuberades både aerobt och i en anaerobklocka. Kombuchornas pH-värde mättes. Två dagar efter inkubation undersöktes all agarmedia utom PCA som undersöktes tre dagar efter inkubation.

Från blodagaren genomfördes sedan renstryk och för MRSA genomfördes renstryk samt gramfärgning. Från blodagaren utfördes renstryk av en anaerob och en aerob koloni. Från MRSA analyserades en större koloni och en mindre koloni från den anaeroba respektive den aeroba odlingen.

Efter 21 dagars fermentation genomfördes fjärde och sista provtagningen. Återigen utfördes fem spädningar. De fyra kombuchavätskorna analyserades på likadana media som vid provtagningstillfälle 2 och 3. MRSA inkuberades aerobt och anaerobt, denna gång användes petriskålar i ordinarie storlek. Slutligen uppmätes pH-värdet på respektive prov.

Tre renstryk utfördes och ytterligare inkubering genomfördes efter analys. Kolonier från VRGG 37 °C ströks på blodagar och inkuberades i 44 °C för konfirmering. Kolonier från DRBC-agar från prov S25 ströks på ny DRBC-agar. Ytterligare särskildes stora kolonier från MRSA och renströks på DRBC för att jämföra de kolonierna. För att säkerställa att blodagar- plattorna var sterila inkuberades de i 37 °C i två dygn. De pappershanddukar som täckte för kombuchornas glaskärl undersöktes genom att de trycktes mot färdiggjuten VRGG-agar och inkuberades i 37 °C. På S10 gjordes ett DN:as-test som antogs var presumtiv för patogena

(25)

25

stafylokocker. Samtliga kolonier renströks på DN:as-agar och framkallades efter ett dygn med 1 ml saltsyra. En av tio kolonier gav en klar zon runt stryket, d.v.s. den var DN:as-positiv, d.v.s. mer potent än de andra.

Dataanalys

Det substrat som används i agarplattan visar vid tillväxt i och på agarn vilken mikroorganism som kan förekomma i provet (Tabell 2). När bakterieavläsning av provet skett anges resultatet i logaritmisk form. Att presentera med hjälp av logaritmer är fördelaktigt när stora antal siffror presenteras och om de ska presenteras i diagram (Danielsson-Tham, u.å.). Antalet mikroorganismer uttrycks i antal per gram prov (Danielsson-Tham, u.å.). Detta innebär att prov där ytspridning utförts multipliceras antalet relevanta kolonier först med tio eftersom 0.1 ml sprids på agarmedium (0.1ml≈ 0.1 gram). För att omvandla antalet bakterier per ml prov till en logaritm används en logaritmtabell eller miniräknare. För de plattor där ingen synlig bakteriekoloni påvisats anges antalet i form av log <1.0 eller <2.0 beroende på spädningsgrad.

Dessa värden anger metodernas känslighet.

När en logaritmtabell används avrundas antalet bakteriekolonier till två siffrors noggrannhet.

Är den tredje siffran från vänster högre än fyra avrundas den andra siffran från vänster uppåt.

Logaritmen beräknas på hur många siffror talet innehåller. Ett tiotal får logaritmen 1, ett hundratal får logaritmen 2, tusental får logaritmen 3 och så vidare. För att beräkna decimalen jämförs talet antal bakterier med logaritmtabellen, det som är närmast avrundas till två siffrors noggrannhet. Som exempel får ett bakterieantal på 54 000 bakterier heltalet 4. Decimalen blir enligt logaritmtabell 7324, varpå det avrundas till 7. Exemplet ger då log 4,7 bakterier per gram.

Etiska beaktanden

De grundläggande uppförandekraven har beaktats under hela forskningsperioden för att uppnå god forskningsed och för att producera forskning av hög kvalitet. Detta innebär att studien är sanningsenlig, medvetet granskad och öppet redovisad (Vetenskapsrådet, 2017, s. 8).

Eftersom studien inte innefattar några mänskliga studier eller några personuppgifter

inkluderades den inte i lagen (SFS 2003:460) om etikprövning av forskning. De företag som mikrobiell cellulosa, te och socker har köpts ifrån har inte tillfrågats att delta i studien. Därför

(26)

26

har de gjorts anonyma för att undvika eventuella etiska dilemman enligt samtyckeskraven (Vetenskapsrådet, 2017, s. 31).

Studien har inte några kommersiella bindningar eller intressen. I början av projektet var vi i kontakt med Nicholas Rosenstock som gav tips och råd om tillredningen av kombuchan samt rekommenderade vad för andel procentuell startvätska som skulle analyseras. Detta samarbete var endast i form av stöd, Nicholas har inte bistått med något material eller ekonomiskt stöd till studien och studien har inte skrivits för att främja hans intressen. Nicholas gav sitt godkännande att nämnas i studien.

Resultat

Resultatet i från varje provtagningstillfälle presenteras under respektive rubrik. Fokus för samtliga provtagningar var att undersöka den totala mikrobiella aktiviteten och pH-värdet.

Resultaten visar det totala antalet bakterier som förekommer i kombucha samt vissa specifika arter och grupper av bakterier, såväl patogena som tjänliga.

Provtagningstillfälle 1

Vid Provtagningstillfälle 1 utfördes provtagning på den mikrobiella cellulosan, S2, S5, S10 och S25 från sin startpunkt i bryggningsprocessen (dag 0). I Tabell 3 redovisas resultatet från de bakteriemedia som testats. pH-värdet i mikrobiella cellulosan uppmättes till 3,1 (Tabell 3).

Till proverna uppmättes: S2 pH 4,6; S5 pH 4,2; S10 pH 3,9 och S25 pH 3,5 (Tabell 3). På PCA-agaren räknades det totala antalet bakterier. Resterande media visade ingen tillväxt och redovisas som <1,0 eller 2,0 (log). TSC-agarn visade tillväxt. Men eftersom den anaeroba klockan inte var lufttät gick det inte att säkerställa närvaron av Clostridium perfringens.

Därför uteslöts samtliga resultatet från TSC-agarn från provtagningstillfället 1.

(27)

27

Tabell 3. pH-värde och förekomst av mikroorganismer som redovisas i log från Provtagningstillfälle 1.

Substrat/pH Mikroorganism S2 S5 S10 S25 Mikrobiell

cellulosa

pH-värde – 4,6 4,2 3,9 3,5 3,1

PCA-agar Totalantal bakterier 4,8 4,6 4,99 5,4 6,2 VRGG-agar 37 °C Enterobacteriaceae <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 VRGG-agar 44 °C Enterobacteriaceae <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0

BP-agar Stafylokocker <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 SLANETZ-agar Enterokocker <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 BAC-agar Bacillus cereus <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 <2,0

TSC-agar Clostridium perfringens – – – – – ALOA Listeria monocytogenes <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 BLOD-agar Övrigt <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 <2,0

MRSA Lactobacillus – – – – –

DRBC-agar Mögel- och jästsvamp <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 <2,0

Provtagningstillfälle 2

Vid Provtagningstillfälle 2 utfördes provtagning på S2, S5, S10 och S25 efter 7 dagars fermentation. pH-värdet i de olika proverna efter 7 dagar uppmättes till: S2 pH 3,5; S5 pH 3,6; S10 pH 3,3 och S25 pH 3,2 (Tabell 4).

Resultatet från koloniräkningen på PCA visar den mikrobiella utvecklingen av proverna S2, S5, S10 och S25 från dag 0 till dag 7 (Tabell 4). TSC-agarn som användes för att isolera C.

perfringens kolonier uppvisade växt av bakterier. Men med hjälp av handledare kunde det konstateras att de inte var typiska för C. perfringens. Dessa kolonier har därför inte tagits med i resultatet. På MRSA identifierades två typer av kolonier, de mindre benämndes ”x” och de större ”y”. Under avläsningen av blod-agaren påvisades även där bakterietillväxt. Men efter att ha inkuberat oympade blod-agarplattor och påvisat bakterietillväxt konstaterades det att alla resultat på detta agarmedium ej gick att lita på p.g.a. att blodplattorna sannolikt

kontaminerats under tillverkning.

(28)

28

Substrat/pH Mikroorganism S2 S5 S10 S25

pH-värde – 3,5 3,6 3,3 3,2

PCA-agar Totalantal bakterier 5,7 5,99 5,3 7,2

VRGG-agar 37 °C Enterobacteriaceae <1,0 <1,0 <1,0 <1,0

VRGG-agar 44 °C Enterobacteriaceae - - - -

BP-agar Stafylokocker <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 SLANETZ-agar Enterokocker <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 BAC-agar Bacillus cereus <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 TSC-agar Clostridium perfringens <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 ALOA-agar Listeria monocytogenes <2,0 <2,0 <2,0 <2,0

BLOD-agar Övrigt – – – –

MRSA Lactobacillus

x=små y=stora

x=5,9 y=5,5

x=5,6 y=4,5

x=5,7 y=5,3

x= <4,0 y=5,3 DRBC-agar Mögel- och jästsvamp <2,0 <2,0 <2,0 <2,0

Provtagningstillfälle 3

Vid Provtagningstillfälle 3 utfördes provtagning på S2, S5, S10 och S25 efter 14 dagars fermentation. pH-värdet i de olika prover efter 14 dagar uppmättes till: S2 pH 2,9; S5 pH 3,0;

S10 pH 2,9 och S25 pH 2,9 (Tabell 5).

Resultatet från koloniräkningen av PCA-agarn redovisar den mikrobiella utvecklingen av prover S2, S5, S10 och S25 från dag 7 till dag 14 (Tabell 5). Vid Provtagningstillfälle 3 visade VRGG-agar tillväxt på 37 °C. Plattorna sparades till nästkommande

provtagningstillfälle för att jämföra om proverna visade växt även då. MRSA gav även vid detta provtagningstillfälle resultat på två olika typer av mikroorganismer, både aerobt och anaerobt. På MRSA (aerob) och MRSA (anaerob) utfördes renstryk och inkuberades i 2 dagar för att sedan utföra gramfärgning. Vid observation under mikroskop kunde x konfirmeras vara

(29)

29

Lactobacillus och y jästsvampar (Tabell 5). På blod-agar S10 genomfördes renstryk och växt påvisades efter 2 dagar.

pH-värde – 2,9 3,0 2,9 2,9

PCA-agar Totalantal bakterier 4,8 6,0 6,3 6,2

VRGG-agar 37 °C Enterobacteriaceae 2,3 <1,0 4,7 2,99

VRGG-agar 44 °C Enterobacteriaceae – – – –

BP-agar Stafylokocker <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 SLANETZ-agar Enterokocker <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 BAC-agar Bacillus cereus <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 TSC-agar Clostridium perfringens <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 ALOA-agar Listeria monocytogenes <2,0 <2,0 <2,0 <2,0

x=små y=stora

x=5,7 y=5,2

x=5,7 y=3,8

x=5,3 y=4,99

x=5,9

MRSA (anaerob) Lactobacillus x=små Y=stora

x=5,6 y=4,8

x=5,9 y=4,8

x=5,8 y=5,1

x=5,99 y=4,7

DRBC-agar Mögel- och jästsvamp <2,0 <2,0 <2,0 <2,0

Provtagningstillfälle 4

På Provtagningstillfälle 4 utfördes provtagning på S2, S5, S10 och S25 efter 21 dagars fermentation. pH-värdet i de olika proverna efter 21 dagar uppmättes till: S2 pH 2,6; S5 pH 2,7; S10 pH 2,7 och S25 pH 2,7 (Tabell 6).

Resultatet från koloniräkningen av PCA-agarn redovisar den mikrobiella utvecklingen av prover S2, S5, S10 och S25 från dag 14 till dag 21 (Tabell 6). Vid denna provtagning visade VRGG åter resultat på 37 °C. Renstryk utfördes och inkuberades på 44 °C.

Enterobacteriaceae-kolonier från VRGG 37 °C visade ingen växt i 44 °C. VRGG-plattorna på vilka pappershanddukarna tryckts mot visade heller ingen växt. Men med hjälp av handledare

(30)

30

kunde det konstateras att växten av Enterobacteriaceae inte var tillräcklig mängd för att orsaka insjuknande. Den anaeroba och aeroba MRSA gav även vid detta provtagningstillfälle resultat på två olika typer av mikroorganismer (Tabell 6). Renstryk utfördes på en stor koloni från MRSA S25 på 20 °C och 30 °C. Resultatet konfirmerade att det var samma typ av jästsvamp som växte på DRBC som på MRSA. Vid denna provtagning visade S10 växt på BP-agaren av typiska BP-positiva stafylokocker. Efter DN:as-test så visade resultatet att S10 innehöll 10 presumtiva Staphylococcus aureus per ml kombuchavätska.

Tabell 6. pH-värde och förekomst av mikroorganismer redovisas i log från Provtagningstillfälle 4.

pH-värde – 2,6 2,7 2,7 2,7

PCA-agar Totalantal bakterier 5,8 5,6 5,8 6,9

VRGG-agar 37 °C Enterobacteriaceae 2,4 1,97 3,9 1,4

VRGG-agar 44 °C Enterobacteriaceae – – – –

BP-agar Stafylokocker <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 SLANETZ-agar Enterokocker <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 BAC-agar Bacillus cereus <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 TSC-agar Clostridium perfringens <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 ALOA-agar Listeria monocytogenes <2,0 <2,0 <2,0 <2,0

x=små y=stora

x=4,95 y=3,95

x=5,7 y=3,6

x=5,1 x=5,1

y=4,3

MRSA (anaerob) Lactobacillus x=små y=stora

x=5,1 y=4,1

x=5,2 x=5,3 x=4,9

y=4,5

DRBC-agar Mögel- och jästsvamp <2,0 <2,0 <2,0 <2,0

(31)

31

Diskussion

I detta kapitel diskuteras först resultaten från den laborativa studien med den bakomliggande litteraturstudien. Sedan diskuteras studiens styrkor och svagheter med metoden och

tillvägagångssätt.

Resultatdiskussion

Totalt antal mikroorganismer

Resultatet från PCA-plattorna visar att totalantalet mikroorganismer ökade från dag 1 till dag 21 (Figur 2). Proverna S2, S5 och S10 hade ett mer likartat resultat efter 21 dagar medan S25 hade fler antal mikroorganismer. Från dag ett hade S25 mer totalantal mikroorganismer, resultatet kan ge indikationen att ju fler mikroorganismer som är verksamma i kombuchan från början av fermentationen desto fler kommer finnas i slutet av fermentationen. Däremot visar resultatet en ojämn tillväxt i totalantal hos S25. Tillväxten var som högst efter 7–13 dagars fermentation varpå den sjönk och fick ett lägre totalantal än vad S10 hade efter 14 dagars fermentation. Liknande tillväxt påvisas hos S2, den ökade efter en veckas fermentation varpå den sjönk efter 14 dagars fermentation. S10 hade den procentuella mängd startvätska, 10 % som rekommenderas vid tillredning av kombucha (Redzepi & Zilber, 2018, s. 117). 10

% använder Jayabalan et al. (2007, s. 228), Marsh et al. (2014, s. 172) och Teoh et al. (2004, s. 121) när de tillreder kombucha. S5 hade den procentuella mängd startvätska som var närmast S10 och de båda proverna hade en tillväxtkurva som liknade varandra. Dessa två provers mikrobiella tillväxt var jämnare. S2 och S25 var de prover med mest och minst startvätska och deras procentuella mängd skiljde sig från S10 med 10 % startvätska som ofta föreslås vid tillredning av kombucha. Proverna S2 och S25 hade mest ojämn tillväxt av mikroorganismer, men de hade också en liknande och parallell tillväxt. Hade alla prover vuxit proportionellt hade det gett en tydligare indikation på startvätskans påverkan på mängden mikroorganismer. Däremot kan det indikera att för en jämn och pålitlig tillväxt av

mikroorganismer i kombucha bör en procentuell mängd startvätska vara ca 5–10 %.

(32)

32

Figur 2. Mängden tillväxt av totala antalet mikroorganismer på PCA över tid.

MRSA

Resultatet efter provtagningstillfälle 3 visar att bakterierna på MRSA växte både aerobt och i anaerob (Tabell 5). Således var de bakterier som detekterades fakultativt aeroba. Efter renstrykning, gramfärgning och analys av MRSA-mikroberna under mikroskop indikerade resultatet att Lactobacillus och jästsvampar är närvarande i kombucha. Detta stämmer överens med vad Marsh et al. (2014) och Teoh et al. (2004) visade när de kartlade kombuchas

mikrobiella ekologi. Vid jämförelse av PCA (Figur 2) och MRSA (Figur 3), kan man se att MRSA ligger generellt ett heltal i logaritmiskt form under PCA. Detta indikerar att de jästsvamparna som är närvarande i kombucha var en tiondel av den totala mikrobiella floran.

Enligt Livsmedelsverket (u.å.) är mjölksyrabakterier en vanlig probiotika; äter eller dricker man tillräckliga mängder av de probiotiska mikroorganismerna kan de förbättra hälsan. Detta styrker påståendet från Sreeramulu et al. (2000, s. 2589) att kombucha är en hälsofrämjande dryck. Om det var tillräckligt mängd mikroorganismer för att ha probiotisk effekt kunde vi inte fastställa.

En kontinuerlig minskning av antalet stora kolonier hos S2, S5 och S10 på MRSA visades (Figur 3). De stora kolonierna (y) på MRSA konfirmerades som jästsvampar. Enligt Carlson och Linder (2008, s. 111) kan bakterier producera ämnen som hindrar andra organismers tillväxt. Detta kan antyda varför andelen jästsvampar minskade. Ytterligare menar Marsh et

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Dag 1 Dag 7 Dag 14 Dag 21

Antal kolonier (log)

PCA över tid

S2 S5 S10 S25