Reologi på gelberedningar

(1)

TVE 16 020 maj

Examensarbete 15 hp Maj 2016

Reologi på gelberedningar

Viktoria Andersson, Katrin Berezniak Ida Björs, Anna Eriksson

Markus Hall, Victor Håkanson

(2)

Teknisk- naturvetenskaplig fakultet UTH-enheten

Besöksadress:

Ångströmlaboratoriet Lägerhyddsvägen 1 Hus 4, Plan 0

Postadress:

Box 536 751 21 Uppsala

Telefon:

018 – 471 30 03

Telefax:

018 – 471 30 00

Hemsida:

http://www.teknat.uu.se/student

Abstract

Rheology on gel compositions

Viktoria Andersson, Katrin Berezniak, Ida Björs, Anna Eriksson, Markus Hall, Victor Håkanson

The softness of a gel made of crosslinked HA (HA = hyaluronic acid) depends on three factors. One is the amount of free hyaluronic acid in the gel. Another is the density of the crosslinked network, which is the molecular entanglements in the gel.

The third is the total concentration of HA.

In this project a rheometer is used to measure the rheological properties by running the following tests: time sweep, frequency sweep and amplitude sweep. From the obtained data, parameters related to viscous properties (G’’) and elastic properties (G’) of the gels were observed. 27 different compositions of gels with three different concentrations (35 mg HA/g, 25 mg HA/g, 15 mg HA/g), three different gel contents (100%, 90%, 80%) and three different densities of crosslinked network (A, B, C) were analyzed. To draw further conclusions an analysis of extrusion force was performed as well.

The results from the frequency sweeps show that the loss tangent for a gel increased as the total concentration of HA was reduced and that the loss tangent for a gel increased as the gel content was decreased. This indicates that the gels become more viscous when either the concentration of HA or the gel content was decreased. An increase in concentration of HA results in an increase of G' and an increase of gel content also results in an increase of G'. The results from the amplitude sweeps show that xG' (xG' = storage modulus at the crossover point between G' and G'') increases as either the concentration of HA or the gel content is increased. For xStrain (xStrain

= deformation of the gel at the crossover point) and xStress (xStress = the stress applied to the gel at the crossover point) no clear trend can be seen regarding the gel content. But an increase in concentration of HA results in an increase of both xStrain and xStress. The results from the analysis of extrusion force show that an increase in total concentration HA increases the force.

Keywords: amplitude sweep, complex modulus, crosslink, elasticity, extrusion force, frequency sweep, gel content, hyaluronic acid, loss modulus, loss tangent, viscosity, rheology, rheometer, storage modulus.

(3)

Sammanfattning

Konsistensen på en gel bestående av tvärbunden hyaluronsyra beror av tre faktorer: total koncentration hyaluronsyra, gelningsgrad och tvärbindningsdensitet. För att utföra detta projekt erhölls tre olika geler med olika tvärbindningsdensitet. Dessa geler späddes dels med lösning av fri, icke tvärbunden, HA från 100 % gelningsgrad till 90 % och 80 %. De olika gelningsgraderna späddes också med natriumkloridlösning från den totala koncentrationen HA, 35 mg HA/g gel, till 25 mg/g och 15 mg/g. Projekts huvudfråga är att kartlägga gelens reologiska egenkaper då både total koncentration HA och gelningsgrad varieras. För att kunna kartlägga detta har en reometer brukats där följande tre tester körts: tidssvep, frekvenssvep och amplitudsvep. Från erhållen data har sedan två parametrar som representerar gelkompositionernas viskösa egenskaper (G”) och elastiska egenskaper (G’) observerats. Även mätning av extruderingskraft har genomförts för att dra vidare paralleller och slutsatser mellan extruderingskraften och de reoligiska egenskaperna.

Ur resultaten ses att förlusttangenten tenderar att sjunka när gelningsgraden ökar, d.v.s. gelerna blir då mer viskösa och mindre elastiska. Förlusttangenten sjunker även vid ökande total koncentration HA vilket betyder att G’ ökar mer än G” i vardera punkt som gör att förlusttangenten minskar. Det gick även att avläsa att de viskösa egenskaperna i gelen ökar då total koncentration hyaluronsyra minskar samt att de viskösa egenskaperna i gelerna minskar vid en sjunkande gelningsgrad.

Mellan gelningsgrad 90-100 % och total koncentration HA 25-35 mg HA/g har analyserna som gjorts i detta projekt gett följande slutsatser. Konsistensen på gel A och C är mer påverkade av gelningsgraden än total koncentration HA. För gel B kan ingen dominerande parameter utläsas.

Nyckelord: amplitudsvep, elasticitet, extruderingskraft, frekvenssvep, förlustmodul, förlusttangent, gelningsgrad, hyaluronsyra, komplex modul, lagringsmodul, reologi, reometer, tvärbindning, viskositet.

(4)

Innehåll

1 Ordlista 6

2 Introduktion 7

2.1 Bakgrund . . . . 7

2.1.1 Galderma Nordic AB. . . . 7

2.1.2 Hyaluronsyra som fillerbehandling . . . . 8

2.1.3 Gelens sammansättning med avseende på extrudering . . . . 9

2.2 Syfte och frågeställningar . . . . 9

2.3 Projektorganisation och riskanalys . . . . 9

2.4 Avgränsningar. . . . 10

3 Teori 11 3.1 Hyaluronsyra . . . . 11

3.2 Reometri . . . . 12

3.3 Extrudering . . . . 15

4 Material och metod 15 4.1 Material . . . . 15

4.2 Tillredning av gelberedningar . . . . 15

4.2.1 Nya tillredningar . . . . 16

4.3 Utförande av reologiska mätningar . . . . 17

4.3.1 Inställningar . . . . 17

4.4 Utförande vid mätning av extruderingskraft . . . . 17

4.4.1 Inställningar . . . . 18

5 Avläsning av grafer över rådata 18 5.1 Tidssvep . . . . 19

5.2 Frekvenssvep . . . . 19

5.3 Amplitudsvep . . . . 19

5.4 Extruderingskraft. . . . 19

6 Resultat 20 6.1 Reologiska mätningar . . . . 20

6.1.1 Sammantällning av frekvenssvep . . . . 20

6.1.2 Sammanställning av amplitudsvep . . . . 21

7 Diskussion 22 7.1 Reometri . . . . 22

7.1.1 Frekvenssvep . . . . 22

7.1.2 Amplitudsvep. . . . 23

7.2 Felkällor reometri . . . . 24

7.4 Felkällor extruderingskraft . . . . 25

7.5 Bättringsförslag. . . . 26

8 Slutsats 26 9 Förslag på vidare forksning 26 10 Källförteckning 27 10.1 Tryckta källor . . . . 27

(5)

A Appendix 29 A.1 Frekvenssvep . . . . 29 A.2 Amplitudsvep . . . . 30 A.3 Extruderingskraft. . . . 31

(6)

1 Ordlista

AS - amplitudsvep analys i reometern där deformationen av provet ökas, d.v.s. geometrin svänger med större rörelser.

Autoklavering - sterilisering genom upphettning under tryck.

BDDE - tvärbindare.

Elasticitet - ett mått på ett materials förmåga att deformeras och sedan återgå till sin ursprungliga form.

Extruderingskraft - den kraft som krävs för att trycka ut gelen genom en kanyl.

Fri HA - korta, ej tvärbundna hyaluronsyrekedjor.

FS - frekvenssvep, analys i reometern där frekvensen av geometrins oscillering ökas d.v.s. geometrin svänger snabbare.

G’ - lagringsmodul, mått på elasticitet.

G” - förlustmodul, mått på viskocitet.

Gap - tjockleken på det prov som analyseras i en reometer, d.v.s. avståndet mellan geometrin och peltierplattan.

GelC (%) - gelningsgrad, andel gelbunden hyaluronsyra i den totala mängden.

Geometri - den övre oscillerande plattan i reometern.

HA - hyaluronsyra eller hyaluronan är en glukosaminoglykan.¹ Peltierplatta - bottenplattan i reometern.

Reologi - läran om materiens deformations- och flytegenskaper.

Reometer - utrustning för att utföra reologiska mätningar.

tan δ - förlusttangent, kvoten mellan G” och G’ som beskriver graden av elasticitet samt viskositet.

Total HA - gelbunden hyaluronsyra + fri hyaluronsyra.

TS - tidssvep, analys i reometern där G’ och G” undersöks med avseende på tiden.

Tvärbindning - polymerkedjor som binds till sig själva eller till andra polymerkedjor.

Viskoelastisk - material med viskösa och elastiska egenskaper.

Viskositet - ett mått på en vätskas inre friktion, betecknar hur trögflytande vätskan är.

xG’ - punkten där G’ och G” antar samma värde, alltså där materialet övergår till att vara mer visköst än elastiskt, G’ och G” avläses från amplitudsvep.

xStrain - betecknar deformationen för skärningspunkten där lagringsmodulen och förlustmodulen antar samma värde, avläses från amplitudsvep.

xStress -beskriver hur stor spänning som krävs för att deformera gelen tills dess att xStrain nås, avläses från amplitudsvep.

xG* - är den komplexa modulen i skärningspunkten mellan G’ och G”, avläses från amplitudsvep.

1Fraser JR, Laurent TC, Laurent UB. "Hyaluronan: its nature, distribution, functions and turnover"

(7)

2 Introduktion

I denna rapport behandlas metod för tillredning av gelberedningar innehållande hyaluronsyra och analys av dessa. De analyseras med avseende på dess reologiska egenskaper för att ge en bild över hur gelen beror av olika parameterar. Extrudering kommer genomföras för att se samband mellan extruderingskraften och gelens reologiska egenskaper.

HA: hyaluronsyra

Fri HA: fria kortare HA-kedjor Gelningsgrad: andel tvärbunden HA

2.1 Bakgrund

Studien görs på uppdrag av Galderma Nordic AB. Under denna rubrik kommer en bakgrund om både företaget och gelkompositionernas applikationer beskrivas.

2.1.1 Galderma Nordic AB

Galderma Nordic AB är ett läkemedelsföretag med sitt huvudkontor lokaliserat i Uppsala. Företaget är ett dotterbolag till Galderma International som idag är ett världsledande företag inom dermatologi.

2 Galderma Nordic AB var ursprungligen Q-Med AB som hade patent på teknologin inom produktio- nen av stabiliserad icke-animalisk hyaluronsyra, även kallad NASHA. Under 2011 blev Q-Med uppköpt av Galderma International och Uppsalas anläggning ansvarar idag för forskning, utveckling, innovation, produktion och marknadsföring av företagets estetiska och korrigerande produkter.³Företaget är specia- liserat inom medicinsk hudvård och tillverkar även produkter mot bland annat ackne, pigmentsjukdomar och icke-melanom hudcancer.⁴

Vid estetisk behandling använder Galderma geler som injiceras olika djupt i huden beroende på efter- strävad effekt. Metoden kallas för fillerbehandling och har blivit mycket eftertraktad då den helt eller delvis kan ersätta kirurgiska ingrepp. Idag finns många fillers på marknaden, vad som utmärker Galder- mas produkter är att de består av en gel baserad på hyaluronsyra som är en naturligt förekommande produkt. Hyaluronsyra benämns vidare som HA. För att behandlingen ska vara behaglig för patienten innehåller gelerna vanligen även den smärtlindrande substansen lidokain.⁵

2http://www.firstreserve.se/lediga-jobb/galderma-nordic-ab-soker-logistic-planner-med-helhetsansvar/

3http://www.galderma.se/Om-Galderma/Galderma-Nordic-AB/Historia-om-Uppsala-anlaggningen

4http://www.galderma.se/Behandlingsomraden/For-allmanheten

5http://www.mynewsdesk.com/se/galderma/pressreleases/galderma-lanserar-nya-restylane-injektionssprutor-1163977

(8)

2.1.2 Hyaluronsyra som fillerbehandling

Den naturliga mängden HA i huden minskar med åldern. Detta leder till minskad spänst och fuktighet vilket i sin tur ökar bildningen av rynkor. I de första fillerbehandlingarna på 1980-talet användes kollagenfillers vilket idag nästan helt har konkurrerats ut av HA-fillers på grund av dess många fördelar.

Exempelvis har kollagenfillers en varaktighet på ca 2-4 månader medan HA-fillers har en varaktighet på 6-12 månader. HA har samma fysikaliska egenskaper oavsett vävnad och kräver heller inga hudtest före användning. Studier visar även att HA-baserade fillerbehandlingar är lika säkra som kollagenfillers men har färre överkänslighetsreaktioner.⁶

För att utveckla fler användbara dermatologiska produkter med HA är det viktigt att förstå hur gelernas egenskaper påverkas av olika parametrar. Detta område är inte fullständningt utforskat,⁷därför kommer tre HA-gelberedningar med olika täta nätverk att undersökas med avseende på parametrarna:

• Total koncentration HA

• Gelningsgrad, GelC (%) (andel gelbunden hyaluronsyra i den totala mängden gel)

• Tvärbindningsdensitet (beskriver tätheten på gelnätverket, d.v.s. hur mycket tvärbindningar som finns i gelen)

För att trender skulle kunna avläsas om hur ovanstående faktorer inverkar på gelens konsistens genom- fördes reologiska mätningar i en reometer.

Anledningen till att denna information är intressant grundar sig bland annat i att Galderma idag ste- riliserar sin HA-gel genom autoklavering, vilket innebär att gelen hettas upp i en autoklav. Vid auto- klaveringen klipps delar av den tvärbundna HA:n bort så att det uppkommer fria fragment av syran i lösningen. De fria kedjorna agerar sedan smörjmedel i gelen.⁸ Fragmenten, de korta HA-kedjorna, som omtalas i texten kallas vidare för fri HA i denna rapport.

Att studera hur gelen påverkas av koncentrationen fri HA skulle kunna ge Galderma nya möjligheter inom gelernas tillredningsätt. Resultaten kan även ge bättre kunskap om hur HA beter sig under olika omständigheter. Detta kan både vara en fördel ekonomisk och för att få en bättre kännedom om gelens egenskaper.

I dagsläget används gelerna vanligen med koncentrationen 20 mg HA/g gel medan tvärbindningsdensitet och gelningsgrad är varierande, se Ordlista sida 4.⁹ För att utföra detta projekt valde Galderma ut tre olika geler med olika täta nätverk som tilldelades projektgruppen. Dessa geler späddes dels med fri HA från 100% gelningsgrad till 90% och 80%. De olika gelningsgraderna späddes också med natriumklorid- lösning från den totala koncentrationen HA, 35mg HA/g gel, till 25mg/g och 15mg/g. Dessa riktmärken tilldelades till projektgruppen av Galderma eftersom de förmodades ge mest intressant information.

6Allemann, Inja Bogda och Baumann, Leslie. "Hyaluronic acid gel (Juvéderm^TM) preparations in the treatment of facial wrinkles and folds".

7Företagspresentation Galderma 2016-04-06

(9)

2.1.3 Gelens sammansättning med avseende på extrudering

Gelen injiceras som ett dermatologiskt fyllningsmedel in i huden. Då gelen pressas ut genom kanylen uppstår ett tryck som är en funktion av flera olika faktorer. Kraften får inte vara för stor för läkarens ergonomi. Om kraften är för stor ökar även risken för att sprutan går sönder vid injektionen. För att undvika onödiga risker vid ingreppen samtidigt som behandlarens preferenser uppfylls är det viktigt att kartlägga hur olika gelers sammansättning påverkar extruderingskraften, d.v.s. kraften som krävs för att pressa gelen genom en kanyl.

I detta projekt kommer måtten på kanylen hållas konstanta i den utsträckning det är möjligt, vilket gör att kraften endast beror på de olika gelkompositionernas sammansättning. Eftersom kraften kommer bero på gelens egenskaper kommer paralleller att kunna dras till reologimätningarna för att eventuellt kunna avläsa några trender.

2.2 Syfte och frågeställningar

Det huvudsakliga syftet med projektet var att kartlägga de reologiska egenskaperna för en gel av tvärbun- den hyaluronsyra. De reologiska egenskaperna beror av följande faktorer: total andel HA, gelningsgrad och tvärbindningsdensitet. Gelkompositionernas egenskaper beror av varje enskild faktor vilket har konstate- rats genom tidigare analysstudier hos Galderma. Analyser har däremot inte utförts på hur egenskaperna förändras då dessa faktorer varieras samtidigt. Målet i detta projektarbete har därför varit att se hur mycket varje enskild faktor bidrar till gelernas egenskaper då parametrarna varieras samtidigt.

Den frågeställning som projektarbetet ska besvara lyder: “Hur beror gelens elastiska och viskösa egenskaper på smörjningseffekten av fri hyaluronsyra samt total koncentration hyaluronsyra?”

2.3 Projektorganisation och riskanalys

För att genomföra detta projekt definierades tio delmål som i stort innebar litteraturstudier, laborativt arbete samt analys av erhållna mätvärden. Projektgruppen delades därför upp i tre grupper där ansvaret fördelades inom varje område. Uppdelningen skulle dra fördel av gruppens storlek och skapa effektivitet.

En aspekt som inte var väntad i denna uppdelning var att fler timmar än planerat skulle läggas på det laborativa arbetet. För att lösa detta flyttades därför hela gruppen till att sköta de reologiska mätningarna gemensamt. Alla fick samtidigt ansvar över sammanställningen av data och att göra litteraturstudier under sin icke laborativa tid. Eftersom denna åtgärd gjordes redan efter att en försökslabb var genomförd minimerades problemet, det gjorde dock att tidsplanen blev något förskjuten inför analysarbetet.

Reometern som användes var av märket TA Instruments AR 2000. En reologimätning tog omkring 50 minuter, inklusive 5-10 minuter rengöring av reometern samt applicering av nytt prov. Totalt genom- fördes 68 körningar i reometern. Medräknat att planera laborationer samt att skriva och genomföra alla tillredningsmetoder och laborativa metoder har en stor del av detta projekt tillägnats åt laborativt arbete. Metoden för det laborativa arbetet innefattar då, förutom själva mätningarna, att blanda proven efter två dagar för att sedan placera gelerna i 1 ml sprutor och centrifugera dessa innan analyser.

Varje laborationstillfälle inkluderade även förberedelser i reometern där kalibrering och inställningar genomfördes. Under mätningens gång plottades rådata samt förbereddes prov inför senare körningar.

Varje laborationstillfälle för reometerkörningarna tilldelades två personer.

För det laborativa arbetet för extruderingen lades omkring 10 timmar eftersom alla utom ett prov kunde genomföras under samma dag. Övrig tid som lades på extruering var att beskriva metoden för dessa mätningar samt att sammanställa datan som erhölls. För att hitta medelvärdet för de olika gelernas krafter delades arbetet upp inom hela gruppen för att sedan sammanställas till en graf per gel, vilket visas under 6.2 Extruderingskraft.

(10)

Annat som påverkade projektets fortlöpning var att tillgången till reometerutrustniningen var begränsad.

Eftersom projektets tekniska konsult Jan Bohlin hade den enda inloggningen till reometern, samt att han behövdes om eventuella tekniska problem uppstod var det inte möjligt att köra lika många test under det intervall som var planerat. Det var heller inte möjligt att boka reometern flera dagar i sträck då det fanns andra som behövde reometern till sitt förfogande. I projektets tidiga stadium var föreställningen att alla prover skulle köras så nära inpå varandra så att gelerna skulle hinna diffundera ungefär lika mycket. Detta var inte möjligt att verkställa till följd av ovanstående orsak och betraktas därför som en möjlig felkälla i resultaten.

En risk var att startmaterialet kunde ta slut innan användbar mätdata för alla gelkompositioner erhållits.

För att undvika eventuella problem sparades gel till en buffert. Nya prov kunde därför tillredas för alla prov med avvikande mätvärden.

För att arbetet skulle fungera planerades en veckovis avstämning inom gruppen. Dessa möten hölls oftare än bestämt eftersom kommunikationen i helgrupp var ett viktigt redskap för att hålla ordning på bland annat rådatan. Dessa möten gav även uppdaterings- och sammanställningsmöjlighet och var även viktig för att arbetet dagligen skulle kunna delas upp. För att undvika missförstånd hölls både möten och mailkontakt med Galderma för att reda ut frågor som uppstod. Med dessa förutsättningar drevs projektet framåt smidigt.

Genom att tidigt bestämma hur märkning av programfiler och geltyper skulle utföras minimerades risken för feltolkning av data och information. Metoden för hur gelerna skulle tillredas, hur reometerinställning- arna skulle ställas in samt hur diagrammen skulle avläsas bestämdes i samarbete med Galderma (se 4 Material och metod). Trots detta uppstod ihopblandning av prov i analysprogrammet under projektets gång. Dessa kunde dock lätt åtgärdas eftersom både en tabell över de reologiska mätningarna och datum över när proven blivit analyserade fanns tillgängligt. I denna fanns originaldata från mätningarna.

Vid extruderingslaborationen fanns en risk att sprutan skulle gå sönder om den kördes ned till botten.

Under körningarna i dragprovaren sattes därför en marginal på minst 5 mm för att detta inte skulle ske.

Vad som däremot uppstod var att plastfästet till kanylen gick sönder vid ett fåtal körningar och att gel läckte ut. Dessa prov kunde därför inte analyseras. Det medförde att samma kanyl inte kunde användas till alla test.

2.4 Avgränsningar

Projektets provbudget var begränsad då en viss mängd gel erhållits av Galderma. Gelernas mängd var A: 190g, B: 201g, C: 130g.

Tre reologiska analyser utfördes på proverna, tidsåtgången per reologisk körning blev då 50 minuter.

Dessa var tidssvep, frekvenssvep och amplitudsvep. Två replikat av varje prov analyserades. Undantag skedde då avvikande mätvärden uppkom och beslut togs om att göra fler analyser.

Eventuell utökning av tabellen för reologimätningarna valdes att avfärdas då extruderingskraften ansågs mer intressant för Galderma.

(11)

3 Teori

Under denna rubrik presenteras egenskaperna hos hyaluronsyra samt ges en teoretisk genomgång av reometri och extrudering.

Geometri: den övre plattan i reometern Pelteriplatta: den undre plattan i reometern Gelningsgrad: GelC (%): andel tvärbunden HA

3.1 Hyaluronsyra

HA är en polysackarid som finns naturligt i många levande organismer, se Figur 1. Den syntetiseras i cellens plasmamembran och agerar bland annat smörjmedel i kroppens leder. HA skiljer sig från andra glykosaminoglykaner i de aspekter att den saknar peptid i sin primära struktur och har en mycket högre molekylvikt.¹⁰

Figur 1: Strukturen av HA¹¹

Polysackariden har unika reologiska och viskoelastiska egenskaper och är känd för att bidra till läkandet av sår.¹² HA bryts ned av enzymer som kallas hyaluronidas, av dessa finns det flera olika typer i män- niskokroppen¹³ och det finns även bakterier som innehåller hyaluronidas.¹⁴ Eftersom hyaluronidas kan tillföras antingen ifrån människokroppen eller via bakterier är HA:n känslig för kontaminering. Om gelen kontamineras är risken stor att gelen börjar brytas ned.¹⁵

10Fraser JR, Laurent TC, Laurent UB (1997). "Hyaluronan: its nature, distribution, functions and turnover"

11Bildkälla: http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/glycobiology/glycosaminoglycans-and- proteoglycans.html

12Chen WY, Abatangelo G. Functions of hyaluronan in wound repair".

13Stern, Robert. Hyaluronan catabolism: a new metabolic pathway.

14Hynes, Wayne L och Walton, Sheryl Lynne. Hyaluronidases of Gram-positive bacteria.

(12)

Figur 2: Strukturen av BDDE¹⁶

HA kan bilda en gel genom att polymerkedjorna tvärbinds till varandra, i detta fall med tvärbindaren 1,4- butandioldiglycidyleter (förkortas BDDE) som binder samman hydroxylgrupper, se Figur 2. Tvärbind- ning innebär att polymerkedjor binds till sig själva eller till andra polymerkedjor, se Figur3. Nackdelen med BDDE är att giftiga grupper kan kvarstå efter tvärbindningen.¹⁷

Figur 3: Illustration av tvärbindning (röd) mellan polymerkedjor (svart) ¹⁸

En gel av HA kan absorbera mycket vatten.¹⁹ Konsistensen på gelen kan regleras med tvärbindnings- graden och likaså kan den tvärbundna gelen göras lösare med fri HA som mjukgörare. Konsistensen är också beroende av total koncentration HA.

I och med hyaluronsyrans högviskösa natur är transport genom gelen begränsad till diffusion. HA, som består av polymerkedjor, kan därför tänkas behöva längre tid att diffundera genom gelen jämfört med vatten och salter.²⁰

3.2 Reometri

När en reologisk mätning utförs med en reometer appliceras materialet som skall undersökas på en bottenplatta (peltierplatta), sedan trycks materialet ihop av en annan platta (geometrin) till bestämd tjocklek, ett “gap”, se Figur4. Geometrin oscillerar sedan och reometern mäter kraften som krävs för att deformera materialet vid en viss vinkel. För denna mätning användes en plan geometri i detta projekt.

21

16Bildkälla: Författarnas egen bearbetning; Håkanson, Victor. 2016.

17Junseok Yeom, Suk Ho Bhang, Byung-Soo Kim, Moo Seok Seo, Eui Jin Hwang, Il Hwan Cho, Jung Kyu Park och Sei Kwang Hahn. "Effect of Cross-Linking Reagents for Hyaluronic Acid Hydrogel Dermal Fillers on Tissue Augmentation and Regeneration"

18Bildkälla: Författarnas egen bearbetning; Berezniak, Katrin. 2016.

19Allemann, Inja Bogda och Baumann, Leslie. "Hyaluronic acid gel (Juvéderm^TM) preparations in the treatment of facial wrinkles and folds"

21HEMA SUNDARAM, BOB VOIGTS, KENNETH BEER, MELISSA MELAND, "Comparison of the Rheological Properties of Viscosity and Elasticity in Two Categories of Soft Tissue Fillers: Calcium Hydroxylapatite and Hyaluronic Acid"

(13)

Figur 4: Schematisk bild av reometriuppställningen

22

Vid reologiska mätningar i en reometer undersöks hur de två variablerna G’ och G” varierar med avseende på bl.a. oscilleringens frekvens och amplitud. G’ kallas lagringsmodul och beskriver de elastiska egenskaperna i ett material.²³ G” kallas förlustmodul och beskriver de viskösa egenskaperna.²⁴ De elastiska egenskaperna gör så att spänningarna inom materialet ligger i fas och följer den pålagda spänningen från reometern. Medan de viskösa egenskaperna gör så att spänningarna inom materialet ligger 90^o ur fas, d.v.s. dessa spänningar är fördröjda gentemot den pålagda spänningen. Material med viskoelastiska egenskaper har då båda dessa delar och deras egenskaper kan då beskrivas med den komplexa modulen, G*, och dess samband med G’ och G” visas i Figur5och ekv1. De geler som används i detta projekt är viskoelastiska. Kvoten mellan G” och G’ är tan δ, förlusttangenten, som beskriver graden av elasticitet samt viskositet, se ekv2.

Figur 5: Illustration av hur G’, G”, δ och G* förhåller sig till varandra

25

G^∗2= G⁰²+ G⁰⁰² (1)

22Bildkälla: Författarnas egen bearbetning; Berezniak, Katrin. 2016.

23M. Mensitieri, L. Ambrosio, L. Nicolais, D. Bellini, M. O’Regan, "Viscoelastic properties modulation of a novel au- tocrosslinked hyaluronic acid polymer", Journal of Materials Science: Materials in Medicine, D.Bellini, M Oregan, Italy, vol 7, 1996, p. 695-698.

24M.J. Ramazani-Harandi, M.J. Zohuriaan-Mehr, A.A. Yousefi, A. Ershad-Langroudi, K. Kabiri, Rheological determina- tion of the swollen gel strength of superabsorbent polymer hydrogels"

25Bildkälla: Författarnas egen bearbetning; Hall, Markus. 2016.

(14)

γ beskriver deformationen och γ0 beskriver amplituden. Sambandet mellan dessa och vinkelfrekvensen, ω, samt hur de beror av tiden t kan avläsas i ekv.3. Vidare kan man beskriva egenskaperna hos gelen som den spänning σ som uppstår i materialet under mätningen. Se ekv.4 där σ0cosδ cos(ωt) beskriver den elastiskt lagrade spänningen och σ₀sinδ sin(ωt) beskriver den spänning som går förlorad pga att materialet har viskösa egenskaper.²⁶

tanδ = G⁰⁰

G⁰ (2)

γ = γ0cos ∗ ωt (3)

σ = σ0cos(ωt + δ) = σ0∗ cosδ ∗ cos(ωt) + σ0∗ sinδ ∗ sin(ωt²) (4)

För att säkerställa att gelen hinner relaxera efter att den applicerats och pressats ihop mellan geometrin och peltierplattan utförs en mätning i form av en konstant oscillation över en bestämd tid, så kallat tidssvep. Detta ger en tidpunkt då relaxationen är godtagbar, d.v.s då lagringsmodulen och förlustmodulen är kontstant med avseende på tiden.

För att undersöka hur lagringsmodulen, förlustmodulen och förlusttangenten beror på frekvensen som geometrin oscillerar med, samt för att även erhålla specifika värden på dessa för de olika proverna utfördes ett frekvenssvep för varje prov.²⁷

Materialet analyseras med ett amplitudsvep. Det innebär att amplituden ökar och då fås uppgifter om xStrain, xStress och xG’. xStrain betecknar deformationen för skärningspunkten där lagringsmodulen och förlustmodulen antar samma värde. Detta beskriver hur stor deformation gelen klarar innan den blir mer viskös än elastisk. xStress beskriver hur stor spänning som krävs för att deformera gelen tills dess att xStrain nås. xG’ är lagringsmodulen i skärningspunkten och eftersom de två modulerna är lika i denna punkt beskriver även den förlustmodulen.²⁸

Med hjälp av analysprogram kunde xG’ och xStrain avläsas ur datan från amplitudsvepet. xStress behövde däremot beräknas, vilket gjordes med ekv 5. Där xG* betecknar den komplexa modulen i skärningspunkten och beskrivs för detta projekt i ekv6.

xG^∗= xStress

xStrain (5)

Då G’ och G” är lika i skärningspunkten så blir xG* följande:

xG^∗=p

xG⁰²+ xG⁰²=√

2 ∗ xG⁰ (6)

26http://projekt.sik.se/rheology/Kompendium/default.htm

28Informationsmöte Galderma 2016-04-14

(15)

3.3 Extrudering

Extruderingskraften för gelen är den kraft som krävs för att trycka ut gelen genom en kanyl. För att erhålla denna utförs extruderingsförsök där en spruta, med kanyl, innehållande gel trycks ihop av en dragprovare så att gelen pressas ut genom kanylen. Vid dessa försök användes en given extruderings- hastighet, en konstant hastighet med vilken sprutan trycktes ihop av maskinen. Längden som sprutan trycktes ihop kallas extruderingslängd. Om sprutorna med gel innehåller luftbubblor kan detta orsaka fluktuationer i kraften som mättes upp när luften passerar genom kanylen.²⁹

4 Material och metod

Detta avsnitt redogör för vilken utrustning och material som har användes under detta projekt. Här beskrivs även hur gelerna tillräddes samt hur reometern och dragprovaren ställdes in och användes.

4.1 Material

Utrustning

Reometer(TA Instruments AR 2000), analysvåg, bägare, 1 ml sprutor (BD glasspruta), Kanyl till 1 ml sprutan(zz 27G (gauge), fabrikat zz), 20 ml plastspruta, spatel, vialer (15 ml), dragprovare.

Kemikalier

Hyaluronsyralösning (HA) 35 mg/ml

Tre gelberedningar, dessa tre geler har olika täta nätverk av HA (koncentration: 35 mg/ml, gelningsgrad:

100%)

NaCl-lösning 0,9 wt%

4.2 Tillredning av gelberedningar

De reologiska mätningarna kördes med ett “gap” på 1 mm, d.v.s. att tjockleken på provet mellan geometrin och peltierplattan var 1 mm. Geometrin hade en diameter på 39,7 mm. Mängden prov som rymdes mellan geometrin och peltierplattan beräknades då vara 1,2 ml och för att säkerställa att provet täckte den beräknade volymen användes 2 ml prov till varje körning. Överflödigt prov skrapades försiktigt bort med spatel. Således beräknades totalt 6 ml prov åtgå: 4 ml till reometern och 2 ml till extruderingskraft.

För att ha en buffert tillreddes totalt 10 ml per prov.

Vid tillredningen av proverna vägdes gelerna, hyaluronsyralösning samt saltlösning upp i separata bä- gare för varje prov. Mängderna noterades samtidigt (se Tabell 1, 2, 3 samt 4) för respektive gel, A, B och C. Lösningarna blandades noggrant och försiktigt med en spatel i ca 5 minuter. Viktigt var att gelen inte krossades mellan spateln och bägarväggen eller blandades för kraftigt då polymerkedjorna och tvärbindningarna mellan dem kunde brista.

Två dagar efter tillredningen blandades gellösningarna genom att proverna trycktes fram och tillbaka mellan två 20 ml sprutor, 10 gånger per prov. Lösningarna fick sedan vila i kylen minst en vecka för att öka diffusionen av HA och saltlösning in i gelen. Exakt hur lång tid som behövdes för diffusionen var ej känd, men en vecka antogs vara tillräckligt. Gelerna med 100% gelningsgrad behövde inte lika mycket tid för diffusion och kunde därför analyseras i reometern redan två dagar efter blandning. Övriga prov fick stå i kylen under ett intervall av 1-3 veckor.

Varje prov fördelades därefter från 20 ml sprutor till sprutor med volymen 1 ml. Detta gjordes på grund av att koncentrationen vatten kan vara högre i de första sprutorna eftersom ett tryck bildas när gelen pressas

29E.B Montufar, Y.Maazouz, M.A.Ginebra. Relevance of the setting reaction to the injectability of tricalcium phospha- te pastes, 2012-12-03. Acta Biomaterialia. https://www.deepdyve.com/lp/elsevier/relevance-of-the-setting-reaction-to-the- injectability-of-tricalcium-Jy4l9TC0kP (Hämtad 2016-05-04)

(16)

ut. Detta tryck gör att vattnet tränger ut först, alltså inte jämnt med gelen. Vattenkoncentrationen minskar sedan med varje spruta. För att hålla de olika mätningarna konsekventa användes spruta 3, 4, 5 och 6 vid reometerkörningar. Prov 3 och 4 användes vid första körningen och prov 5 och 6 användes vid andra körningen. Spruta 7 och 8 användes vid extruderingsförsöken. Varje 1 ml spruta centrifugerades i 3 minuter med 3000 varv per minut för att minimera luftbubblor i provet.

Tabell 1: Uppmätta mängder av gel A, hyaluronsyralösning (D) och saltlösning (E) för respektive prover.

Med koncentration syftas den totala koncentrationen hyaluronsyra (HA) i gelberedningarna. Gelnings- grad syftar till den andel HA som är tvärbunden.

Konc\Gelningsgrad 100 % 90 % 80 %

35 mg HA/g 9,93 g A 9,02 g A; 1,03 g D 8,06 g A; 1,90 g D

25 mg HA/g 7,13 g A; 2,88 g E 6,44 g A; 0,71 g D; 2,89 g E 5,73 g A; 1,47 g D; 2,96 g E 15 mg HA/g 4,29 g A; 5,71 g E 3,86 g A; 0,43 g D; 5,71 g E 3,44 g A; 0,86 g D; 5,73 g E

Tabell 2: Uppmätta mängder av gel B, hyaluronsyralösning (D) och saltlösning (E) för respektive prover.

35 mg HA/g 10,51 g B 9,05 g B; 1,05 g D 8,01 g B; 1,97 g D

25 mg HA/g 7,17 g B; 2,87 g E 6,44 g B; 0,73 g D; 2,86 g E 5,68 g B; 1,46 g D; 2,85 g E 15 mg HA/g 4,31 g B; 5,90 g E 3,87 g B; 0,44 g D; 5,73 g E 3,42 g B; 0,87 g D; 5,73 g E

Tabell 3: Uppmätta mängder av gel C, hyaluronsyralösning (D) och saltlösning (E) för respektive prover.

35 mg HA/g 10,05 g C 9,05 g C; 0,95 g D 8,01 g C; 2,02 g D

25 mg HA/g 7,15 g C; 2,99 g E 6,46 g C; 0,75 g D; 2,86 g E 5,74 g C; 1,47 g D; 2,89 g E 15 mg HA/g 4,29 g C; 5,71 g E 3,86 g C; 0,49 g D; 5,71 g E 3,45 g C; 0,85 g D; 5,72 g E

4.2.1 Nya tillredningar

Efter att de tillredda kompositionerna analyserats i reometern och dragprovaren så fanns vissa mät- värden som var avvikande. Dessa tillreddes då på nytt för att göra ännu en omgång analyser med. De blandades på samma sätt och fick vila för diffusion som tidigare, se 4.2 Tillredning av gelberedningar.

De kompositioner som blandades om visas i Tabell4,5och 6.

Tabell 4: Uppmätta mängder av gel A, hyaluronsyralösning (D) och saltlösning (E) för respektive prover.

35 mg HA/g - - -

25 mg HA/g 7,13 g A; 2,89 g E 6,44 g A; 0,71 g D; 2,90 g E -

15 mg HA/g 4,29 g A; 5,71 g E - -

Tabell 5: Uppmätta mängder av gel B, hyaluronsyralösning (D) och saltlösning (E) för respektive prover.

35 mg HA/g - - -

(17)

Tabell 6: Uppmätta mängder av gel C, hyaluronsyralösning (D) och saltlösning (E) för respektive prover.

35 mg HA/g - - -

25 mg HA/g 7,15 g C; 2,86 g E - -

15 mg HA/g 4,30 g A; 5,71 g E 3,86 g C; 0,44 g D; 5,71 g E -

4.3 Utförande av reologiska mätningar

För varje komposition analyserades två replikat. Totalt kördes 54 ordinarie körningar och 14 omkörningar i reometern som alla genomgick testen: amplitudsvep (TS), frekvenssvep (FS) och amplitudsvep (AS).

Vid körningarna fästes en fuktad tygremsa på insidan av en kupol och vatten placerades i en fördjupning på geometrin. Således bildade kupolen och geometrin ett vattenlås vilket skapade en skyddad atmosfär som motverkade att vatten avdunstade från gellösningarna.

Mellan varje körning rengjordes reometern med en våt pappersduk. De kvarvarnade gelpartiklarna togs bort med destillerat vatten och papper av samma slag. Vatten i geometrin fylldes på vid behov.

4.3.1 Inställningar

Här visas inställningarna som har använts i reometern vid de reologiska mätnignarna, alla analyser genomfördes vid 25C.

TS: tid 15 min, frekvens 0,1 Hz, deformation 0,5 %. 1 punkt/minut.

FS: frekvensintervall 0,01 Hz till 10 Hz, deformation 0,5 %. 3 punkter per dekad.

AS: deformationsintervall 0,1 % till 10000%, frekvens 0,1 Hz. 9 punkter per dekad.

4.4 Utförande vid mätning av extruderingskraft

I dragprovaren analyserades två replikat av samtliga gelberedningar där spruta 7 och 8 användes (se 3.2 Tillredning av gelberedningar). Totalt genomfördes 56 mätningar varav två stycken var omkörningar.

För att utföra mätningen placerades en 1 ml spruta i en 10 ml spruta. 10 ml sprutan fästes i en ställning som placerades i dragprovaren. Kraften mättes i Newton. Se Figur6.

Figur 6: Schematisk bild över uppställningen i dragprovaren ³⁰

30Bildkälla: Berezniak, Katrin. 2016.

(18)

Under mätningarna av extruderingskraften planerades en och samma kanyl att användas för alla test, då kanylerna inte är helt identiska. Men under mätningen av ett fåtal prover deformerades kanylen så att den behövde bytas ut. Detta skedde för följande prov:

• Gel B, koncentration 35 mg HA/g och gelningsgrad 100 %

• Gel B, koncentration 25 mg HA/g och gelningsgrad 100 %

• Gel C, koncentration 35 mg HA/g och gelningsgrad 100 %.

Gällande det tredje provet i listan ovan gick kanylen sönder mellan körningen av de två replikaten, inte under en körning.

4.4.1 Inställningar

Extruderingshastigheten sattes till 10 mm per minut med en extruderingslängd på ca 25 mm (10 mm/min i 150 sekunder) beroende på mängden gel i varje spruta. För att hålla en marginal under körningen uppmättes ett avstånd på ca 5 mm till botten inför varje experiment. Om gelhöjden i sprutan underskred 30 mm korrigerades extruderingslängden efter behov. Mätningarna utfördes vid rumstemperatur men den faktiska temperaturen på gelerna varierade troligtvis mellan 8-18 grader eftersom gelerna stod kylda före mätning.

5 Avläsning av grafer över rådata

Graferna som är presenterade i detta stycke är exempel på hur en reologisk mätning kan se ut. Vid slutlig analys kommer de olika graferna vara sammanställda med flera analysers medelvärde för varierande total koncentration HA och gelningsgrad.

TS: tidssvep FS: frekvenssvep AS: amplitudsvep

G’: lagringsmodul (elastiska egenskaper) G”: förlustmodul (viskösa egenskaper) xStrain: deformationsgaden där G’=G”

xStress: spänningen i materialer där G’=G”

(19)

5.1 Tidssvep

När gelen appliceras och trycks ihop av geometrin bildas spänningar i gelen. För att kontrollera att gelen stabiliserats innan mätning startades tidssvep som fortskred i 15 minuter, då geometrin oscillerade konstant. Efter dessa 15 minuter uppskattades spänningarna från appliceringen ha försvunnit och gelen antogs ha relaxerat. Graferna för dessa körningar visas inte i resultatavsnittet eftersom de inte ger relevant information till analysen. Se Figur7.

5.2 Frekvenssvep

Under frekvenssvepet ökade frekvensen av geometrins oscillering. Ur frekvensintervallet avlästes G’ och G” vid 0,1 Hz. Ur denna data beräknades förlusttangenten som beskriver förhållandet mellan G’ och G”

vid den valda frekvensen. Se Figur8.

5.3 Amplitudsvep

Under amplitudsvepet ökade geometrins vinkelfrekvens, d.v.s. att geometrins svängningar blev längre.

Detta kördes för att hitta flytgränsen (crossover point) för gelen. Denna punkt beskriver materialets övergång från att vara mer elastisk än visköst till att bli mer visköst än elastiskt. Ur denna analys kunde två variabler avläsas: xStrain och xG’. xStrain beskriver deformationen i materialet och avlästes direkt ur diagrammet med hjälp av reometerns analysprogram. xG’ är lagringsmodulen i skärningspunkten och avläses i skärningspunkten vid körningen. Genom dessa beräknades xStress genom ekv 5. Denna parameter beskriver spänningen i materialet.

Från amplitudsvep erhålls två y-axlar, en för G’ och G” samt en för δ medan x-axeln anger deformationen.

Se Figur9.

5.4 Extruderingskraft

Kraften som krävs för att trycka ut gelen genom en kanyl beskrivs som en graf enligt Figur10. En sådan graf representerar ett prov.

Figur 10: Extrudering. Tid (s) mot kraft (N)

Ur graferna som erhålls från extruderingsförsöken avlästes extruderingskraftens medelvärde när en relativt konstant kraft uppnåtts. Dessa medelvärden sammanfattades sedan till ett sammanställningsdiagram för varje geltyp.

(20)

6 Resultat

I detta avsnitt visas sammanställningsdiagram över frekvenssvep, amplitudsvep och extruderingskraft för gelerna A, B och C. Diagrammen skapades utifrån medelvärden beräknade från rådatan över alla analyser. Diagrammen namngavs efter respektive gels ursprungsmärkning: Geltyp A, B eller C. Serierna representerar de olika total koncenterationerna av HA (35, 25 och 15 mg HA/g gel). På x-axeln kommer gelningsgraden, GelC (%) vara plottad. Y-axeln kommer att variera utifrån vilken parameter som ska undersökas. För tabellvärden till respektive diagram se Appendix.

6.1 Reologiska mätningar

Figur11till 25är sammanställningsdiagram där x-axeln är gelningsgraden och y-axeln varierar mellan de parametrar som är av intresse.

6.1.1 Sammantällning av frekvenssvep

Följande sammanställningsdiagram redovisar värden från frekvenssvep. Två diagram per gel presenteras med respektive y-axel för G’ och förlusttangent samt med gelningsgraden på x-axeln.

Figur 11: Gel A, Gelningsgrad (%) mot G’ (Pa)

Figur 12: Gel B, Gelningsgrad (%) mot G’ (Pa)

Figur 13: Gel C, Gelningsgrad (%) mot G’ (Pa)

Figur 14: Gel A, Gelningsgrad (%) mot förlusttangent

Figur 15: Gel B, Gelningsgrad (%) mot förlusttangent

Figur 16: Gel C, Gelningsgrad (%) mot förlusttangent

(21)

6.1.2 Sammanställning av amplitudsvep

Den andra sammanställningen redovisar värden från flytgränsen tagna ifrån amplitudsvep. Tre diagram per gel presenteras med respektive y-axel för xG’, xStress och xStrain.

Figur 17: Gel A. Gelningsgrad (%) mot xG’ (Pa)

Figur 18: Gel B. Gelningsgrad (%) mot xG’ (Pa)

Figur 19: Gel C. Gelningsgrad (%) mot xG’ (Pa)

Figur 20: Gel A. Gelningsgrad (%) mot xStrain (Pa)

Figur 21: Gel B, Gelningsgrad (%) mot xStrain (Pa)

Figur 22: Gel C. Gelningsgrad (%) mot xStrain (Pa)

Figur 23: Gel A. Gelningsgrad (%) mot xStress (Pa)

Figur 24: Gel B. Gelningsgrad (%) mot xStress (Pa)

Figur 25: Gel C. Gelningsgrad (%) mot xStress (Pa)

(22)

Figur26till28är sammanställningsdiagram där x-axeln är gelningsgraden och y-axeln visar kraften (N)

Figur 26: Gel A. Gelningsgrad (%) mot kraft (N)

Figur 27: Gel B. Gelningsgrad (%) mot kraft (N)

Figur 28: Gel C. Gelningsgrad (%) mot kraft (N)

7 Diskussion

Nedan diskuteras resultat från de reologiska analyserna och från analys av extruderingskraften. Dessa ger en bild av hur gelen beter sig då den totala koncentrationen HA och koncentrationen fri HA varieras.

7.1 Reometri

Diskussionen för de reologiska mätningarna är uppdelad i två underruriker: frekvenssvep och amplitudsvep. Här diskuteras bland annat vad som går att avläsas i graferna över de sammanställda värdena, se 6.1 Reologiska mätningar, Figur 11-25.

7.1.1 Frekvenssvep

Värdena i dessa diagram avlästes vid 0,1 Hz. Vad som kan sägas för de tre gelerna är att G’ sjunker med minskande total koncentration HA. För alla geler tenderar även förlusttangenten att sjunka när gelningsgraden ökar, d.v.s. gelerna blir då mindre viskösa och mer elastiska för alla prover. Förlusttangenten sjunker även vid ökande total koncentration HA. Det betyder att G’ ökar mer än vad G” gör i vardera punkt, vilket gör att förlusttangenten minskar.

Vid jämförelse av gel A och C ses en större förändring när man går från koncentration 15 mg HA/g till 25 mg HA/g än när man går från 25 mg HA/g till 35 mg HA/g. Vid lägre koncentrationer för dessa geler tenderar G’ att påverkas mer av förändringar i total koncentration HA än vid högre koncentrationer. För gel B verkar G’ öka linjärt med avseende på koncentrationen.

Mellan 80 och 90 % och koncentration 15-25-35 mg HA/g (med undantag för gel A 15-25 mg HA/g) sker en någorlunda linjär ökning för alla geler.

Enligt Figur 11 ses att G’ ökar med en faktor på 1,4 när gelningsgraden ökas från 90 % till 100 % för gel A, detta gäller både koncentration 35 mg HA/g och 25 mg HA/g. När den totala koncentrationen HA ändras från 25 mg HA/g till 35 mg HA/g vid konstant gelningsgrad ökar G’ med faktorn 1,1 för både gelningsgrad 90 % och 100 %. Detta innebär att gelningsgraden har en större inverkan på G’ än vad koncentrationen har när gelningsgraden varierar från 90 % till 100 % och koncentrationen varierar

(23)

Vidare ses i Figur 12 att G’ för gel B ökar med en faktor på 1,3 mellan gelningsgraden 90 och 100 % för koncentration 35 mg HA/g och med en faktor 1,5 för koncentration 25 mg HA/g i samma gelnings- gradsintervall. När gelningsgraden hålls konstant och koncentrationen ändras från 25 mg HA/g till 35 mg HA/g ökar G’ med faktor 1,5 då gelningsgraden är 90 % och med en faktor 1,3 då gelningsgraden är 100 %. Således innebär detta att varken gelningsgraden eller koncentrationen har en avgörande inverkan på G’ när gelningsgraden varierar från 90 % till 100 % och koncentrationen varierar från 25 mg HA/g till 35 mg HA/g.

Eftersom de reologiska mätvärdena i frekvenssvepen för de två replikaten för B.35.80 skiljer sig mycket från varandra anses värdena för detta prov vara osäkra. Det är därför svårt att avläsa en trend för gel B. Det är väntat att G’ sjunker med gelningsgraden för detta prov. Detta påverkar också resultatet för amplitudsvepet.

I Figur 13 kan man se att G’ för gel C ökar med en faktor 1,7 mellan gelningsgrad 90 och 100 % för koncentrationen 35 mg HA/g och med en faktor 2.2 för koncentration 25 mg HA/g i samma gelspann.

När koncentrationen ändras från 25 mg HA/g till 35 mg HA/g vid konstant gelningsgrad ökar G’ med faktor 1,2 för gelningsgrad 100 % och en faktor på 1,6 för gelningsgrad 90 %.

Med detta kan man konstatera att gelningsgraden har en större inverkan på G’ än koncentrationen när gelningsgraden varierar från 90 till 100 % och koncentrationen varierar från 25 till 35 mg HA/g.

Det som kan sägas om de erhållna värdena är att de elastiska egenskaperna i gelen minskar med minskande koncentration då gelningsgraden är 100 %. Då den totala koncentrationen ökar från 15 till 35 mg HA/g gel ses att gelningsgraden 100 % påverkas mycket mer än gelningsgraderna 80 till 90 % för alla geltyper.

Vidare kan man se att faktorn G’ följer en relativt linjär ökning när gelningsgraden går från 80 till 90 och sedan till 100 %. Övergången mellan 90 och 100 % i gelningsgrad är mer påverkad av denna ökning i G’.

Enligt vår data sker en större förändring i materialet mellan gelningsgraderna 90 och 100 % än mellan koncentrationerna 25 och 35 mg HA/g för gel A och C. För gel B är förändringen mellan gelningsgraderna 90 och 100 % ungefär lika stor som förändringen mellan totala koncentrationerna 25 och 35 mg HA/g.

Det hade varit intressant att analysera intervallet mellan gelningsgraden 90 och 100 % då detta möjligen hade gett mer information om materialets egenskaper. Vid projektets start var det tänkt att en sådan trend skulle upptäckas innan halvtidsredovisningen så att kartläggningen kunde utökas i det intressanta området. Detta var inte möjligt på grund av både tidsbrist och brist på material eftersom nya lösningar tillreddes för omkörningar.

7.1.2 Amplitudsvep

I detta stycke diskuteras hur de tre parametrarna: xG’, xStrain och xStress påverkas vid ökande gelningsgrad och varierande koncentration.

xG’: står för den punkt där G’ och G” skär varandra och är således ett mått på när materialet övergår till att vara mer visköst än elastiskt. I diagrammen där gelningsgraden är plottad mot xG’ kan man urskilja att med ökande total koncentration HA ökar xG’ för samtliga lösningar. Ökande gelningsgrad ger en relativt linjär ökning av xG’. Se Figur 17-19.

xStrain: alla geler följer trenden att xStrain ökar med total koncentrationen HA. När man tittar på koncentration 35 mg HA/g för gel A, B och C så ser man att gel A har ett minimum, gel B ökar med ökande gelningsgrad och gel C har ett maximum.

Vid koncentrationen 25 mg HA/g följer gel A, gel B och gel C samma trend som koncentrationen på 35 mg HA/g för respektive gel. Däremot blir trenden annorlunda för koncentration 15 mg HA/g då xStrain ökar med ökande gelningsgrad för alla geltyper. Se Figur 20-22.

(24)

xStress: alla grafer i xStress följer samma trender som xStrain för alla geler eftersom dessa värden är beräknade med xStrain= xStress/xG*. Se Figur 23-25.

7.2 Felkällor reometri

Det finns ett antal felkällor som kan ha påverkat resultaten i olika utsträckning. En felkälla kan vara att proverna blivit kontaminerade under projektets gång, vilket skulle lett till att gelerna brutits ned.

Eftersom de felaktiga värdena var väldigt höga har troligtvis inte något prov blivit kontaminerat. Denna slutsats kan dras eftersom kontamination borde lett till låga, felaktiga mätvärden. Kontaminationsrisken minimerades genom att arbetsplats och utrustning hölls så ren som möjligt samt genom att använda plasthandskar vid hantering av prover.

En utmaning projektet ställdes inför var att få tiden att gå ihop, vilket beskrivs närmare i 2.3 Projekt- organisation och riskanalys. Eftersom tillgången till reometern var begränsad kunde inte alla reometer- körningar utföras i följd vilket resulterade i att vissa prover diffunderade under en längre tid än andra, se 4.2 Tillredning av gelberedningar. Detta har uppskattningsvis inte medfört någon större variation i hur väl de olika gelerna har diffunderat. Allt bör ha diffunderat fullständigt även vid den tidpunkt då de första proverna kördes i reometern. Dock har ingen exakt anvisning över hur lång tid som krävs för att fri HA helt ska diffunderat in fastställts och det är således svårt att avgöra vad en rimlig tid för diffusionen är.

För att fastställa den egentliga diffusionstiden skulle en grundligare undersökning behöva utföras och bestämmas specifikt för varje provberedning, vilket det varken fanns provbudget eller tid för i detta projekt.

En annan felkälla som kan ha påverkat resultatet är att geometrins vallgrav fylldes för högt under vissa reometrikörningar. Konsekvensen av detta skulle vara att vatten skvätte ut under körningen vilket kan ha absorberats in i provet och skulle då ändra gelens konsistens. Eftersom körningarna genomfördes med en kupol över provet upptäcktes det utspridda vattnet först efter att körningen avslutats och kupolen lyftes bort. Detta bör dock inte ha påverkat resultatet avsevärt eftersom alla körningar utfördes med amplitudsvep som sista test, se 4.3 Utförande av reologiska mätningar, och det är under detta test som vattnet bör ha skvätt över vallgravens kanter på grund av allt större svängningar på geometrin.

För att uppnå tillförlitliga värden måste geometrin kunna rotera helt kontaktfritt. Vetskapen om detta blev aktuellt efter att hälften av mätningarna var gjorda, då det upptäcktes att kupolen möjligen hade kontakt med geometrin under vissa reometerkörningar. Således måste detta betraktas som en möjlig felkälla. Men majoriteten av de prov där detta tros ha inträffat har blandats om och körts på nytt i reometern med extra tanke på att låta geometrin oscillera kontaktfritt.

Sammanställningsdiagrammen är baserade på medelvärden framtagna från extruderingskraftsgrafer, se 5.2.2 Extruderingskraft. Det väntade utseendet på graferna för extruderingen var att kraften skulle öka och att en jämn platå sedan skulle uppnås. I verkligheten fluktuerade kraften under mätningens gång vilket gav ett kraftintervall snarare än en specifik kraft. På kraftintervallet beräknades ett medelvärde över kraften för varje prov.

Från samtliga extruderingsdiagram, se Figur 26, 27 och 28 , avläses att ingen större förändring sker i kraften för någon av geltyperna mellan gelningsgrad 80 och 90 %. Mellan gelningsgrad 90 och 100 % ses dock en större ökning i kraften för alla geltyper.

När man tittar närmare på hur kraften påverkas då koncentrationen går från 15-35 mg HA/g visar sig gelningsgraden på 100 % vara mer avgörande. Denna är alltså mer koncentrationsberoende än gelningsgrad

(25)

Generellt ses att alla kompositioner innehållande total koncentration 15 mg HA/g ligger lägst i extruderingskraft, därefter följer koncentrationen 25 mg HA/g och störst extruderingskraft krävs för koncentrationen 35 mg HA/g. Graferna visar således att med ökande halt HA krävs en större kraft och man ser även att graferna blir brantare. Dock finns det en avvikande punkt som strider mot dessa antaganden och det är punkt A.25.100. Anledningen till avvikelsen är troligtvis att denna lösning blandades fel då lösningen även gav felaktiva värden på reologimätningarna. Denna mätning kördes därför med en ny blandning för de reologiska mätvärdena, för extruderingskraften fanns däremot inga sprutor kvar att använda och därför diskuteras detta istället som en felkälla. Uppskattningsvis borde denna punkt följa trenden enligt gel B och C för lösningarna med gelningsgrad 100 %.

Två av proverna anses ha gett ofullständiga resultat i extruderingskraft då kanylen gick sönder under körningarna. Dessa var:

Gel B, koncentration 35 mg HA/g och gelningsgrad 100 % Gel B, koncentration 25 mg HA/g och gelningsgrad 100 %

Kanylen tvingades bytas ut ytterligare en gång, det var mellan de två körningarna för gel C med koncentration 35 mg HA/g och gelningsgrad 100 %. Detta har inte påverkat resultatet mer än att en ny kanyl började användas, se 7.4 Felkällor extruderingskraft.

Figur 29: Extruderingskraften för prov B:35:100

I Figur 29 kan utläsas att kraften för gel B med total koncentration 35 mg HA/g och gelningsgrad 100

% ökar ojämnt. Detta beror på att sprutan gick sönder och mätningen fick avbrytas. Det medför att det inte är möjligt att uppskatta extruderingskraften eftersom sprutan kan ha brustit innan maximal kraft uppnåtts, således representerar punkterna i grafen inte en trolig trend.

7.4 Felkällor extruderingskraft

En felkälla kan ha uppkommit då 1 ml sprutorna fylldes med något varierande mängd prov. Detta medförde att vissa provberedningar hade de två sista sprutorna i serien till extruderingsmätningar. Som nämnt i 4.2. Tillredningar av gelberedningar kan dessa då haft en lägre andel vatten vilket kan ha påverkat provet så att en högre extruderingskraft än den verkliga uppmätts.

Ytterligare en felkälla kan ha uppkommit då tre kanyler gick sönder under extruderingskörningarna och därmed behövde bytas. Eftersom kanylerna troligtvis inte hade exakt samma diameter och inte var exakt identiska kan även detta ha medfört en viss skillnad i resultat.

Centrifugering av sprutorna var en viktig del av förberedelserna inför extruderingsmätningarna, se 4.4 Utförande vid mätning av extruderingskraft. Detta gjordes för att minimera mängden luftbubblor i gelen eftersom dessa kan ha stor inverkan på resultaten. Det var inte möjligt att få bort alla luftbubblor vilket innebar att sprutorna inte var helt homogena med gel vid mätningarna vilket resulterar i en felkälla.

När mätningarna gjordes i dragprovaren är en annan felkälla att temperaturen på proverna varierade för