TECHNICKÁ UNIVERZITA V LIBERCI
Fakulta mechatroniky, informatiky a mezioborových studií
Studijní program: N3942 – Nanotechnologie Studijní obor: 3942T002 – Nanomateriály
Vývoj a testování scaffoldů pro kolenní chrupavkové implantáty
Development and testing of scaffolds for knee cartilage implants
Diplomová práce
Autor: Bc. Iveta Danilová
Vedoucí: Ing. Eva Košťáková, Ph.D.
Konzultant: Prof. RNDr. David Lukáš, CSc.
V Liberci 14. 5. 2013
3
Prohlášení
Byl(a) jsem seznámen(a) s tím, že na mou diplomovou práci se plně vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., o právu autorském, zejména § 60 – školní dílo.
Beru na vědomí, že Technická univerzita v Liberci (TUL) nezasahuje do mých autorských práv užitím mé diplomové práce pro vnitřní potřebu TUL.
Užiji-li diplomovou práci nebo poskytnu-li licenci k jejímu využití, jsem si vědom povinnosti informovat o této skutečnosti TUL; v tomto případě má TUL právo ode mne požadovat úhradu nákladů, které vynaložila na vytvoření díla, až do jejich skutečné výše.
Diplomovou práci jsem vypracoval(a) samostatně s použitím uvedené literatury a na základě konzultací s vedoucím diplomové práce a konzultantem.
Datum: 14. 5. 2013
Podpis:
4
Poděkování
V první řadě bych chtěla poděkovat vedoucí mé diplomové práce paní Ing. Evě Košťákové, Ph.D. za odborné rady, vedení a cenné připomínky. Také bych chtěla velmi poděkovat Mgr. Evě Filové, Ph.D. která vedla celé mé osobní biologické testování na Oddělení tkáňového inženýrství Ústavu experimentální medicíny AVČR, v.v.i. a panu prof. RNDr. Evženu Amlerovi za umožnění a materiálovou podporu této praxe.
Chtěla bych poděkovat na tomto místě svému konzultantovi prof. RNDr. Davidu Lukášovi, CSc., všem zaměstnancům Katedry netkaných textilií a nanovlákenných materiálů TUL, především Mgr. Janě Horákové a Ing. Denise Zálešákové. Poděkovat bych také chtěla Ing. Janu Grégrovi z Katedry chemie TUL za pomoc při práci na praktické části diplomové práce.
Dále bych chtěla poděkovat všem, kteří se podílí na Centralizovaném rozvojovém projektu č. 12091 s názvem Integrovaný systém vzdělávání v tkáňovém inženýrství, regenerativní medicíně a nanobiotechnologiích na UK, ČVUT a TUL.
V neposlední řadě bych chtěla poděkovat své rodině za finanční a morální podporu, projevenou lásku a porozumění, s kterým se mi má diplomová práce psala snadněji.
5
Abstrakt
Hlavním cílem diplomové práce je navrhnout, optimalizovat výrobu a vyrobit scaffoldy pro použití ve tkáňovém inženýrství chrupavky. Pro výrobu 3D nosičů byla použita metoda vymývání částic. Vymýván byl chlorid sodný a jako porézní materiál byl použit poly(ǫ-kaprolakton). Do polymeru bylo přimícháno různé množství mikročástic chitosanu pro zlepšení mechanických vlastností. U všech vzorků byla analyzována jejich struktura a testována vhodnost vyrobených scaffoldů pro životaschopnost, proliferaci a diferenciaci buněk.
Klíčová slova
Tkáňové inženýrství, kolenní chrupavka, metoda vymývání částic, poly(ǫ- kaprolakton), biologické testování.
Abstract
The main aim of this diploma thesis is to design, optimize production and produce scaffolds for using in tissue engineering of cartilage. The particle leaching method was used to produce 3D scaffolds. Sodium chloride was eluted, and poly(ɛ-caprolactone) was used as a porous material. A different amount of chitosan microparticles was mixed in polymer to improve mechanical properties. All samples were analyzed in their structure, and the suitability of manufactured scaffolds for viability, proliferation and differentiation of cells was tested.
Keywords
Tissue engineering, Cartilage, Particle leaching method, Poly(ɛ-caprolactone), Biological testing.
6
Obsah
Seznam symbolů a zkratek ... 8
Úvod ... 9
1. Tkáňové inženýrství ... 11
2. Kolenní kloub (articulatio genus) ... 12
2.1 Anatomie kolenního kloubu ... 12
2.2 Chrupavka ... 13
2.2.1 Kloubní chrupavka ... 14
2.3 Poranění kolenního kloubu ... 17
2.3.1 Degenerativní onemocnění kolenního kloubu ... 19
2.4 Léčba kolenní chrupavky ... 21
3. Scaffoldy ... 23
3.1 Požadavky na scaffold ... 23
3.2 Materiály pro výrobu scaffoldů ... 24
3.2.1 Poly(ɛ-kaprolakton) (PCL) ... 25
3.2.2 Chitosan ... 27
3.3 Metody výroby scaffoldů ... 28
3.3.1 Vymývání částic ... 28
3.3.2 Elektrostatické zvlákňování ... 32
3.3.3 Odstředivé zvlákňování ... 33
3.3.4 3D tisk ... 34
3.3.5 Zpěňování ... 36
3.3.6 Výroba hydrogelů ... 36
3.3.7 Zvlákňování za mokra ... 37
3.4 Testování vyrobených vzorků ... 40
7
4. Praktická část ... 41
4.1 Použité materiál ... 41
4.2 Výroba porézních scaffoldů metodou vymývání částic ... 43
4.3 Základní analýza vytvořených scaffoldů. ... 45
5. Biologické testování scaffoldů ... 47
5.1 Testování viability buněk ... 48
5.1.1 Test MTS ... 48
5.2 Testování proliferace buněk ... 49
5.2.1 Test BrdU ... 50
5.2.2 Test PicoGreen ... 50
5.3 Testování diferenciace buněk ... 51
5.3.1 Vizualizace jader buněk pomocí konfokální mikroskopie ... 52
5.3.2 Vizualizace kolagenu pomocí Second Harmonic Generation (SHG) ... 58
6. Výsledky ... 61
7. Diskuse ... 65
Závěr ... 67
Seznam bibliografických citací ... 68
Seznam obrázků ... 71
Seznam tabulek ... 73
Seznam příloh ... 74
8
Seznam symbolů a zkratek
3D trojrozměrný
in vitro ve zkumavce
in vivo v živém, zaživa
PCL poly(ɛ-kaprolakton)
PLA kyselina polymléčná
PLGA kopolymer kyseliny polymléčné a kyseliny polyglykolové PGA kyselina polyglykolová
PEO polyethylenoxid
PPO polypropylen oxid
NaOH hydroxid sodný
NaCL chlorid sodný
SEM scanovací elektronový mikroskop DNA deoxyribonukleová kyselina
dsDNA dvouřetězcová DNA
RNA ribonukleová kyselina
mRNA mediátorová (messenger, informační) ribonukleová kyselina PCL_CH poly(ɛ-kaprolakton)_chitosan
9
Úvod
Tkáňové inženýrství je jedno z nejvíce se rozvíjejících odvětví moderní medicíny v dnešní době. Je to odvětví mezioborové, které propojuje biologii, chemii, fyziku, medicínu, ale i inženýrství biomateriálů, nebo počítačové modelování. Cílem je obnovit, zachovat nebo zlepšit biologickou tkáň. V obnově tkáně je používáno různých buněk, technik, metod i materiálů.
Vzhledem k tomu, že na kolenní chrupavku je vyvíjen velký tlak při neustálém zatěžování kolenního kloubu, a zároveň je chrupavka také často postižena degenerativním onemocněním, je právě této oblasti tkáňového inženýrství věnována velká pozornost.
Vyvinout plně funkční implantát kolenní chrupavky je velmi náročné. Proti jiným tkáním je však u kolenní chrupavky výhodou absence nervů a cév.
Celkově je v oboru tkáňového inženýrství nezbytné volit pro výrobu tkáňových implantátů takové materiály, které jsou biokompatibilní, neimunogenní, ve většině případů také biodegradabilní. Zároveň však musí mít dobré mechanické vlastnosti shodné s vlastnostmi nativní chrupavky nebo alespoň jim velmi podobné.
Celý proces využívání scaffoldů pro tkáňové inženýrství kolenní chrupavky je velmi komplikovaný, i přes to, že je tomuto problému věnována celosvětově obrovská pozornost a jsou vkládány velké prostředky, jak do výroby nových scaffoldů, tak do jejich následného testování. Testování každého nového léčebného preparátu je vždy velmi dlouhodobé, nákladné a doprovázené mnoha nezbytnými schvalovacími procesy závislými na legislativě země, kde výzkum probíhá.
Tato diplomová práce se v první části zaměřuje na představení problematiky tkáňového inženýrství kolenní chrupavky s důrazem na anatomii kolenního kloubu, funkce kolenní chrupavky, typy onemocnění a jejich terapeutické možnosti. Rešeršní část se věnuje nejčastějším materiálům používaným v tkáňovém inženýrství a postupům výroby scaffoldů pro kolenní chrupavkové implantáty.
Praktická část je pak věnována představení zvoleného postupu výroby kompozitních scaffoldů tvořených pěnami a pěnami vyztuženými krátkými úseky vláken. Podrobné biologické testování navržených a vytvořených scaffoldů, autorkou provedené na Ústavu experimentální medicíny AVČR, v.v.i., v Praze, jeho výsledky, diskuse nad nimi a další doporučení jsou v poslední částí této práce.
10 Tkáňové inženýrství kolenní chrupavky je velmi široký multidisciplinární obor. Právě odtažitost jednotlivých oborů, které do této problematiky vstupují, může mít negativní vliv na výsledky výzkumu. Snahou bylo tedy projít samostatně celý proces od navržení scaffoldů až po in vitro testování a prohloubit si tak znalosti a zkušenosti z více oborů.
11
1. Tkáňové inženýrství
Tkáňové inženýrství je inovativní obor, který se zabývá vývojem nových biologických preparátů sloužících pro náhradu, regeneraci nebo zlepšení funkce lidských orgánů. Principem tkáňového inženýrství je odběr tkáně, namnožení těchto buněk mimo tělo, a následná implantace nové zdravé tkáně zpět do místa postižení u pacienta. Pro ukotvení a rozmnožování buněk se používají nosiče buněk (dále scaffoldy). Právě na tyto nosiče jsou kladeny velké požadavky. Materiál musí být nejen biokompatibilní, ale musí napomáhat svou strukturou uchycení a rozmnožování buněk. V naprosté většině případů se pro tyto účely volí materiály, které jsou biodegradabilní. Pomocný materiál by měl sloužit pouze do doby, než se buňky rozmnoží na požadovaný počet a vytvoří novou tkáň, poté by se měl rozložit v organismu bez vedlejších účinků. V neposlední řadě by měl mít scaffold takový tvar a strukturu, aby s ním dalo dobře manipulovat. Scaffold by měl být jak materiálovým složením, tak strukturou a vlastnostmi co nejvíce podobný nahrazované tkáni.
Výhodou tkáňového inženýrství je v první řadě zabránění imunologické reakci, protože k vytvoření nové tkáně se většinou využívá autologních buněk, tedy buněk přímo od pacienta. V tomto případě při zpětné implantaci nově rozmnožených buněk je minimalizována imunitní reakce. Druhou možností je zdroj buněk od alogenního dárce, tedy od jiného člověka. V tomto případě již je však nutné potlačit imunologickou reakci. Další předností tkáňového inženýrství je neinvazivnost, protože je ve většině případů nutné odebrat pouze malou část tkáně. Pokud se jedná o zlepšení funkce nebo regeneraci chrupavky, stávající metody jsou právě v tomto případě velmi invazivní.
12
2. Kolenní kloub (articulatio genus)
Vývoj nových kolenních chrupavkových scaffoldů vyžaduje v první řadě podrobné seznámení s anatomií a funkcemi kolenního kloubu. Následující část je tedy právě této problematice podrobně věnována.
Kolenní kloub je největším kloubem v těle. Je to kloub složený, ve kterém artikulují tři kosti: kost stehenní, kost lýtková a čéška. Názvy všech těchto kostí a dalších anatomických pojmů jsou v jazyce českém, latinském i anglickém v Příloze A. V textu budou pro přehlednost používány jen názvy české. V kolenním kloubu probíhá několik pohybů. Pohyby se dají rozdělit na extenzi, flexi a rotaci. Extenzí rozumíme základní postavení kloubu, jako flexe je označováno ohnutí kolena. Rotace se rozděluje na vnitřní rotaci a zevní rotaci.
2.1 Anatomie kolenního kloubu
Kolenní kloub je nejen kloub největší v lidském těle, ale také nejprostornější. Stabilita kloubu je zajišťována mohutným vazivovým aparátem a svaly. Anatomicky je kloub tvořen kondyly kosti stehenní a kloubními ploškami kosti holení, což je znázorněno na Obrázek 1(a).
Dále se ke kolenu řadí druhý, menší kloub, který je mezi čéškou a kostí stehenní. Kolenní kloub tvoří také chrupavčité menisky, vazy, svaly, tuk, synoviální dutina obsahující synoviální tekutinu a kloubní pouzdro. Na Obrázek 1(b) je většina těchto částí [1].
Obrázek 1: Schéma artikulujících kostí kolenního kloubu (a), anatomie kolenního kloubu (b). [2].
a b
13 Protože kolenní kloub zajišťuje jak stabilitu stoje, ale současně i pohyblivost končetiny při chůzi, je zesílen řadou vazů a svalů. Vazy se dělí do dvou základních skupin.
První skupinou jsou vazy postranní. Po stranách kolenního kloubu jsou vnější a vnitřní postranní vazy. Další skupinou vazů obklopujících koleno jsou vazy zkřížené. Jsou to nejmohutnější stabilizátory kloubu a spojují kost stehenní a kost holenní. Svaly kolenního kloubu se také rozdělují do dvou skupin. V tomto případě jsou to svaly přední části a svaly zadní části kolenního kloubu. Mezi svaly, které jsou uloženy v přední straně stehna, řadíme sval čtyřhlavý stehenní a sval krejčovský. Sval čtyřhlavý je nejmohutnější sval v lidském těle a je extenzorem kolenního kloubu [1].
Další kostí, která tvoří kolenní kloub, je jedna z kostí sezamských. Kostí sezamských je v lidském těle více, jsou takto označovány kosti, které vznikají ve svalových úponech a šlachách. Jejich hlavní funkcí je mechanická ochrana té části kloubu, na kterou kost naléhá.
V případě kolenního kloubu se tato sezamská kost nazývá čéška. Čéška slouží nejen ke zpevnění přední plochy kolenního pouzdra, ale také jako kladka, na které dochází ke změně směru tahu čtyřhlavého svalu.
Všechny výše pojmenované části kolenního kloubu jsou uloženy a chráněny kloubním pouzdrem. Součástí kloubního pouzdra je fibrózní a synoviální membrána. Fibrózní membrána má především mechanickou funkci, zajišťující stabilitu a pohyblivost kloubu.
Synoviální membrána produkuje kyselinu hyaluronovou, která je součástí synoviální tekutiny.
Synoviální membránu netvoří jen souvislá vrstva buněk, které se v tomto případě nazývají synovialocyty, ale mezi buňkami prochází také kolagenní vlákna. Synovialocyty mají výraznou fagocytující aktivitu a plní funkci obranného systému kloubu. Další význam mají při tvorbě kolagenních vláken a mezibuněčné hmoty vazivové vrstvy kloubního pouzdra [1].
Synoviální tekutina se vyskytuje na vnitřním povrchu všech kloubů. Hlavní úlohou synoviální tekutiny je dialýza krevní plazmy a výživa bezcévných kloubních chrupavek. Dále udržuje a zvyšuje pružnost chrupavek a snižuje tření kloubních ploch [1]. Při bakteriálních infekcích a zánětlivých revmatických onemocněních klesá její pH. Normální pH je přibližně 7,43 ± 0,2 [3].
2.2 Chrupavka
Chrupavku tvoří buňky nazývané chondrocyty, kolagenní a elastická vlákna a amorfní tuhá mezibuněčná hmota. Existuje několik druhů chrupavek, záleží na jejich složení
14 a umístění v těle. Prvním druhem je chrupavka elastická, která se vyskytuje hlavně ve stěně průdušek, tvoří některé chrupavky hrtanu, je podkladem ušního boltce a části zevního zvukovodu. Pružnost této chrupavky je dána zejména strukturou elastinu, v jehož molekule jsou jen ojediněle příčné vazby. Pokud vystavíme elastickou chrupavku deformaci, snadno se vrací do původního tvaru. Je velmi ohebná a pružná, její pružnost se však ve vyšším věku výrazně ztrácí [1].
Vazivová chrupavka je především chrupavkou meziobratlových destiček. Dále tvoří disky a menisky uvnitř kloubů a spojuje klíční a hrudní kost. Představuje přechod mezi tuhým kolagenním vazivem a hyalinní chrupavkou, protože chondrocytů je zde málo a většinu chrupavky tvoří vláknitá složka.
Třetím typem chrupavky je chrupavka hyalinní, neboli kloubní, které bude věnována následující kapitola.
2.2.1 Kloubní chrupavka
Kloubní chrupavka kryje pohybující se povrchy uvnitř kloubů. V této chrupavce má mezibuněčná hmota pevnou konzistenci, která je příčinou dobré pevnosti a pružnosti.
Pružnost a hladký povrch chrupavky zmírňuje nárazy při dopadu a umožňuje kostem v kloubech hladký klouzavý pohyb. Na Obrázek 2 jsou zeleně znázorněna místa výskytu chrupavky v kolenním kloubu u zdravého člověka.
Obrázek 2: Zeleně znázorněna místa pokrývající plochy kolenního kloubu chrupavkou u zdravého člověka [2].
15 Chrupavka v ideálním případě odolává velmi vysokému kontaktnímu tlaku, který odpovídá až čtyřnásobku tělesné hmotnosti a vydrží dlouhodobé cyklické zatížení. Uvádí se, že během jednoho roku dojde až k milionu cyklů pohybu v kloubu. Hyalinní chrupavka neobsahuje cévy ani nervy, její výživa je zajištěna difúzí ze synoviální tekutiny a ze subchondriálních cév. Pokud se jedná o chrupavku kolenní, je pro ni také charakteristická nízká koncentrace kyslíku a anaerobní metabolismus. S tím souvisí jeden z největších problému týkající se regenerace chrupavky. Díky pomalému metabolismu se každé poškození léčí řadu měsíců [4].
Kolenní chrupavka je tvořena z buněk a mezibuněčné hmoty. Zdravá chrupavka obsahuje jen jeden druh buněk, kterým jsou chondrocyty. Chondrocyty mají oválný tvar, malé jádro a jejich průměr se pohybuje v rozmezí 10 až 30 µm. Jejich metabolická aktivita je minimální, velmi nízká je také proliferace. Je to dáno tím, že vyzrálé buňky se již nedělí.
Chondrocyty se sdružují ve skupinách, které čítají až 8 buněk. Tyto skupiny jsou poté nazývány jako izogenetické [3]. Na Obrázek 3 je histologický snímek skupin 1 až 4 chondrocytů.
Obrázek 3: Skupiny 1-4 chondrocytů v hyalinní chrupavce - histologický obrázek [5].
Funkčně slouží chondrocyty k syntéze a udržování stability vnitřního prostředí extracelulární matrix. Chondrocyty, které jsou uloženy v dutinách matrix, jinak také nazývané lakuny, vytváří mezibuněčnou hmotu. Chondrocyty jsou v těchto lakunách buď po jednom, nebo jsou seskupeny po dvou až osmi buňkách. Chondrocyty tvoří pouze 10 % hmotnosti chrupavky, zbylých 90 % tvoří extracelulární matrix. Matrix je složena z vody, více druhů kolagenu, proteoglykanů, kyseliny hyaluronové a glykoproteinů [6]. Poměrné zastoupení těchto složek dle hmotnosti v kolenní chrupavce je sestupně seřazeno v Tabulka 1.
16
Tabulka 1: Složení extracelulární matrix kolenní chrupavky [6].
Největší objem chrupavky zaujímá voda, ve které je tvořena síť z kolagenu ve formě vláken a fibril. Asi 80 % kolagenu tvoří v kloubní chrupavce kolagen typu II. Z ostatních kolagenů je v této tkáni nejvíce zastoupen kolagen typu I, VI a IX. Kolagen IX je odpovědný především za ukotvení proteoglykanů v síti, kolagen typu VI vytváří matrix obklopující chondrocyty, a tím zabezpečuje jejich mechanickou ochranu. Dalším prvkem vyskytujícím se v kolenní chrupavce jsou proteoglykany. Největším a nejvýznamnějším proteoglykanem ve chrupavce je protein nazývaný agrekan. Na jeho jádro se váže asi 100 řetězců chondroitinsulfátu a 30 řetězců keratansulfátu. Celý agrekan se poté váže na kyselinu hyaluronovou a společně vytváří proteoglykanový aparát (Obrázek 4). Tento aparát je složen z dlouhých molekul kyseliny hyaluronové, na které je nekovalentně navázáno asi 200 proteoglykanů. Vytvořená makromolekula zvyšuje odolnost tkáně proti kompresi a zlepšuje její pružnost. Kyselina hyaluronová je dále obsažena volně v synoviální tekutině.
Zde je její funkcí zlepšovat viskoelasticitu1 a stabilitu vnitřního prostředí [6,7].
Obrázek 4: Proteoglykanový aparát – schéma [7].
1 Viskoelasticita: vlastnost látky, ve které se poměr deformace k napětí s časem mění.
Složení extracelulární matrix Poměrné zastoupení dle % hmotnosti
Voda 65–80 %
Kolagen typu II 10–20 %
Ostatní kolageny (typ VI, IX, X, XI) do 5 %
Proteoglykany do 5 %
Další menší komponenty do 5 %
17 Hyalinní chrupavka se skládá ze 4 základních zón. Tyto zóny nemají ostré ohraničení mezi sebou, ale buňky v jednotlivých zónách se liší tvarem, velikostí a orientací ke kloubnímu povrchu. Každá zóna má rozdílný morfologický vývoj a především jinou metabolickou aktivitu. Zóna, která se nachází nejblíže k povrchu kloubní chrupavky, se nazývá povrchová, hlouběji je zóna přechodná, dále radiální. Poslední se odborně nazývá zóna kalcifikované chrupavky, jinak také mineralizovaná zóna. Všechny výše zmíněné zóny jsou označeny na Obrázek 5 [6].
Obrázek 5: Schéma struktury chrupavky v optickém mikroskopu [6].
2.3 Poranění kolenního kloubu
Poranění kolenního kloubu je stále velkým problémem moderní medicíny. V případě kolena se sice neobjevují výrazně často vrozené vady, ale s rychlejším životním stylem a novými extrémními sporty se objevuje více úrazů. Se stárnutím populace zase souvisí větší procento lidí, které trpí degenerativním onemocněním kolenního kloubu. Regenerativní medicína kolena je v popředí zájmu ortopedů, chirurgů, traumatologů a nově také tkáňových inženýrů. Z těchto důvodů je následující kapitola věnována představení některých onemocnění kolenního kloubu a jejich současným léčebným a terapeutickým možnostem.
18 Jak již bylo výše zmíněno, úrazy kolenního kloubu jsou v současné době velmi častým poraněním. Stále nejvíce poranění přibývá při sportu. V popředí jsou sporty kontaktní, dále lyžování, bojové sporty, atletika, tenis, volejbal nebo basketbal. Další příčinou poranění kolena mohou být úrazy při dopravních nehodách. Nejedná se jen o autonehody, kde často dochází k přímým nárazům kolena do přístrojové desky, ale do této skupiny jsou také řazeny úrazy chodců nebo motocyklistů [8].
Úrazy kolenního kloubu jsou odborníky rozdělovány do dvou hlavních skupin podle místa poranění. Jedná se o úrazy měkkého kolena a tvrdého kolena. Mezi poranění měkkého kolena patří poranění vazů, svalů, šlach, menisků, kloubního pouzdra a podpůrných struktur.
Traumatologie chrupavky patří společně s poraněním kostí mezi poranění tvrdého kolena [8].
K traumatizaci měkkého kolena dochází buď přímým, nebo nepřímým násilím. Do přímého násilí řadíme otevřené rány, kontuze2 a luxace3. U poranění nepřímým mechanismem může dojít k poškození menisků a vazů v rozsahu odpovídajícím míře násilí. Příznakem poranění měkkých částí kolenního kloubu patří hydrops kloubu. Tímto termínem je označován otok vzniklý výronem tělní tekutiny do kloubního pouzdra. Tělní tekutinou je buď synoviální tekutina v důsledku poranění menisků a chrupavky, nebo krev. Krev se objevuje v otoku nejčastěji při poranění vazů a kloubního pouzdra. Z poranění měkkého kolena je nejzávažnější poranění menisků a poranění vazů. Nejčastěji z této skupiny poranění dochází k poranění zkřížených vazů, kdy dojde buď k utržení vazu i s kostním bločkem, nebo k přetržení vazu bez části kosti [8].
Z úrazů tvrdého kolena jsou jako nejzávažnější a nejbolestivější klasifikovány vykloubení kolena a vykloubení a zlomenina čéšky. Luxace kolena vzniká při extrémním násilí. Při luxaci bývají poraněny většinou všechny vazivové struktury, roztrženo kloubní pouzdro a někdy mohou být postiženy i cévy a nervy [8].
Vrozené vady kolenního kloubu se vyskytují velmi zřídka. Pokud již se vrozená vada tohoto kloubu objeví, jedná se nejčastěji o vadu čéšky, nebo vrozenou dislokaci kolena.
2 Kontuze = pohmoždění.
3 Luxace = vykloubení.
19 2.3.1 Degenerativní onemocnění kolenního kloubu
Proti vrozeným vadám se degenerativní onemocnění naopak vyskytují velmi hojně.
Nejčastěji degenerativní onemocnění postihuje právě chrupavku. Odolnost a pevnost chrupavky je dána obsahem proteoglykanů a specifickým uspořádáním kloubních fibril v povrchové a přechodové zóně chrupavky. Kloubní chrupavka je schopna dlouhodobě odolávat vysokým tlakům. Tato schopnost se ale v průběhu života výrazně snižuje.
Nejobvyklejším onemocněním degenerativního typu vlivem věku je osteoartróza.
Osteoartrózou rozumíme degenerativní, zánětlivé onemocnění, které dokáže velice výrazně zhoršit kvalitu života a často vede až k invaliditě. Slovem artróza je označován zánět, nebo otok a osteo znamená kost. Jedná se tedy o zánětlivé onemocnění kosti, kdy v důsledku velké zátěže na kolenní kloub dochází ke ztenčení chrupavky a následnému zbytnění kosti.
Na Obrázek 6 jsou znázorněny příznaky osteoartrózy. Při erodování4 chrupavky a menisků dochází k odhalení kosti a právě styk dvou kostí při tlaku na koleno způsobuje bolest [9].
Obrázek 6: Příznaky osteoartrózy kolenního kloubu [9].
Osteoartróza je nejčastější onemocnění pohybového aparátu, které postihuje asi 10 % dospělé populace a ve věku nad 75 let má klinické projevy více než 60 % populace. Příčinou je zejména degenerace chrupavky, která souvisí s její nedostatečnou obnovou. Za další příčiny je považován věk. Artróza se nejčastěji začíná projevovat u lidí kolem 50. roku života,
4 Erodovaný = postižený erozí, charakterizovaný odřením [10].
20 do 40 let je neobvyklá a v tomto věku se objevuje spíše v důsledku úrazů a operací kolenního kloubu. Častěji trpí osteoartrózou ženy, obézní lidí a lidé, u kterých se objevují dědičné dispozice [6].
Pokud již je artrózou kloub postižen, jedním ze základních projevů je snížení počtu proteoglykanů a následná ztráta elasticity mezibuněčné hmoty. Většinou následuje uvolnění štěpných produktů proteoglykanů do synoviální tekutiny, kde vyvolají zánětlivou odpověď synoviálních membrán. V časném stádiu se objevuje pouze občasná bolest, nebo startovací bolest. Typická je také ranní ztuhlost kloubu, omezení funkce a omezení hybnosti. Přehledně jsou v Tabulka 2 shrnuty změny na chrupavce, ke kterým dochází vlivem věku a při osteoartróze. Vzhledem k tomu, že spolu degenerace chrupavky během stárnutí a osteoartróza blízce souvisí, jsou i patologické změny podobné. Jednotlivé symptomy se postupně objevují v několika etapách poškození chrupavky. Fáze poškození můžeme rozdělit na časnou, intermitentní a pozdní. V časné fázi se objevuje akutní poškození matrix, které doprovází v druhé fázi odpověď chondrocytů na opakované porušení mezibuněčné hmoty.
V intermitentní fázi tedy dochází ke zvýšené syntéze matrix a v defektu většinou vzniká regenerační tkáň. Tato zvýšená aktivita chondrocytů však po nějaké době poklesne a dojde k úbytku kloubní chrupavky. Odhalení příčiny tohoto oslabení odpovědi, které nastává ve třetí fázi, je stále ve stadiu výzkumu [6].
Tabulka 2: Změny kloubní chrupavky způsobené věkem a degenerace chrupavky podmíněná rozvojem osteoartrózy [6].
Chrupavka Změny vlivem věku Změny při osteoartróze
Struktura Stabilní struktura, místy povrchové rozvláknění.
Progresivní povrchové rozvláknění, snížení množství
tkáně, formace fibrózní chrupavky jako reparační tkáně.
Buňky Pokles počtu chondrocytů, snížená reakce na růstové faktory, snížená růstová aktivita.
Počáteční zvýšení syntetické a proliferační aktivity, pokles počtu
chondrocytů, zvýšená aktivita degradačních enzymů.
Mezibuněčná hmota Pokles koncentrace vody, pokles počtu velkých proteoglykanových
agregátů, snížená odolnost povrchové vrstvy proti střižným a
tlakovým silám.
Počáteční vzestup koncentrace vody, porucha organizace sítě
kolagenních makromolekul, progresivní degradace a ztráta proteoglykanů, pokles odolnosti
na zátěž.
21
2.4 Léčba kolenní chrupavky
Současné léčebné metody poškozené chrupavky nejsou vždy vyhovující a některé jsou i velmi invazivní. Cílem terapie je zachovat nebo zlepšit funkci chrupavky. Snahou je tedy vytvořit nebo obnovit chrupavku, aby styčná plocha kloubů byla opět chráněna a neobjevovala se u pacienta bolest ani omezení při pohybu. Rozsah poškození chrupavky musí být před léčbou nejprve správně detekován. K detekci a rozsahu poškození kloubů slouží artroskopie. Artroskopie je vyšetřovací a léčebná metoda, kdy je odborníkem do kloubu zaveden endoskopický nástroj. Na Obrázku č. 9 jsou nakresleny 3 nástroje, které jsou ve většině případů nezbytné pro výkon artroskopie. Jedná se o artroskop obsahující světlo a kameru, která je propojena s obrazovkou. Dále je to kanyla pro odvod kapalin a případné promývání kapalinou. Posledním nezbytným komponentem je artroskopický nástroj, který slouží k drobným chirurgickým zákrokům. Tímto nástrojem se často odebírá tkáň pro biopsii [12].
Obrázek 7: Artroskopie kolene [11].
Terapeutické zákroky, které se volí podle rozsahu poškození chrupavky, charakteru léze, věku pacienta a dalších symptomů, se v současné době dělí na dvě skupiny. Jako první skupinu můžeme označit léčebné techniky vedoucí k náhradě buď pouze excidované léze, nebo celého kloubu. Druhou skupinou jsou techniky, které směřují k restauraci poraněné chrupavky a obnovení kloubní plochy stimulací vlastních reparativních procesů. Pokud je
22 chrupavka poškozena velmi, a dochází k častým výrazným bolestem, nebo se objevuje větší množství osteochondrálních fragmentů, byla hlavně v dřívější době indikována totální endoprotéza. V moderní medicíně není již ale nahrazováno celé koleno, pouze jsou nahrazeny poškozené kloubní plochy a kloubní chrupavka. Pokud je to možné, je odstraněna jen malá část kosti, původní vazy, šlachy a svaly jsou ponechány a zpět upevněny. Protéza je vyrobena z kovového a umělohmotného materiálu s vysokou pevností, odolností a dobrou biokompatibilitou. Na Obrázek 8 je na prvním snímku koleno velmi poškozené osteoartrózou a na druhém koleno po endoprotéze [12].
Obrázek 8: Koleno postižené osteoartrózou před a po endoprotéze [11].
Do skupiny invazivnějších zákroků patří také mozaiková plastika. Jedná se o operativní zákrok, kdy je poškozená chrupavka v nosné části kolena nahrazena částmi chrupavky z nenosné části kolena. Za nenosné části kolena jsou považovány povětšinou strany kolenního kloubu [12].
Dnešní moderní medicína tedy dále hledá nové metody léčby defektů kloubní chrupavky vedoucí k úplné regeneraci původní tkáně se zachováním stejných funkčních vlastností, které měla tkáň před poraněním. Z dlouhodobých studií je prokazatelné, že pro léčbu poškozené chrupavky jsou nejvhodnější autologní chondrocyty. Již bylo výše popsáno, že lze odebrat zdravé chondrocyty a namnožit je na požadované množství. Buňky však nemají dostatečnou mechanickou stabilitu, a proto je nutné buňkám poskytnout nosiče (dále scaffoldy).
23
3. Scaffoldy
Jako scaffoldy jsou označovány tkáňové nosiče buněk. Jedná se o struktury z přírodních nebo syntetických materiálů. Scaffoldy jsou buď dvourozměrné, nebo trojrozměrné, vytváří mechanickou podporu buněk a vhodné prostředí pro navázání, proliferaci a další diferenciaci buněk.
Protože v experimentální části diplomové práce byly vytvořeny scaffoldy z poly(ɛ-kaprolaktonu) a chitosanu metodou vymývání částic, bude v následujících kapitolách těmto materiálům a metodě věnována zvýšená pozornost.
3.1 Požadavky na scaffold
Požadavky na scaffoldy se dají rozdělit do dvou kategorií. Jedná se o biologické vlastnosti a mechanické vlastnosti. Mezi biologické je nezbytné zahrnout zejména biokompatibilitu a netoxicitu. Materiál, ze kterého je vytvořen scaffold by neměl vyvolávat imunitní reakci, nebo jen minimální. V žádném případě by však neměl vyvolávat zánětlivou reakci. Pro tkáňové inženýrství se volí materiály, které jsou biodegradabilní a vstřebatelné.
Rozpad materiálu by měl být časově synchronizován s přibližnou dobou růstu nové tkáně a rozkládat se na menší netoxické látky bez zásahu do funkčnosti okolní tkáně. Povrchové vlastnosti scaffoldů by měly podporovat buněčnou adhezi, diferenciaci i proliferaci, ale zároveň by měly regulovat buněčný růst [13].
Mezi mechanické vlastnosti můžeme zařadit například správnou porozitu scaffoldu.
Porozita materiálu je velmi důležitá. Lepších výsledků se dosahuje s použitím vysoce porézních materiálů s propojenými póry. Propojenost póru napomáhá proliferaci a difúzi živin. Správná velikost pórů je nutná k uchycení buněk a jejich prorůstání dále do scaffoldu.
Podle uplatnění vytvořeného tkáňového implantátu se volí také nároky na mechanickou stabilitu a architekturu scaffoldu. Oba tyto parametry by měly odpovídat živé tkáni v místě, kterou má implantát nahradit. Odpovídat by měl co nejvíce také tvar, velikost, pevnost, pružnost a jiné mechanické vlastnosti [14].
24
3.2 Materiály pro výrobu scaffoldů
Materiály pro výrobu scaffoldů se vždy volí podle předpokládaného využití tkáňového implantátu. Používané materiály mají odlišnou dobu degradace, mechanickou pevnost, odolnost, chemické či fyzikální vlastnosti (například hydrofobnost či hydrofilnost) nebo hodnotu pH. V tkáňovém inženýrství chrupavky se používají přírodní i syntetické materiály.
Velkou předností syntetických materiálů je možnost ovlivnění jejich fyzikálních i chemických vlastností. Naproti tomu výhodou přírodních materiálů jsou dobré biologické vlastnosti.
Materiály jsou více biokompatibilní a většinou lépe rozložitelné.
Ze syntetických materiálů je nezbytné zmínit kyselinu polymléčnou (PLA), kyselinu polyglykolovou (PGA) či jejich kopolymer. K přednostem polymerů a kopolymerů těchto dvou kyselin patří zejména regulovatelnost jejich biologické degradace. Obě kyseliny degradují přes hydrolýzu esterových vazeb a dobu degradace lze ovlivnit velikostí průměru vláken, velikostí pórů nebo krystalinitou polymeru. Nejrychlejší biodegradace nebo-li degradace díky přítomnosti mikroorganismů lze dosáhnout u vysoko porézní kyseliny polyglykolové za 6 až 8 týdnů. Pokud je nutné vytvořit materiál s dlouhou životností ze syntetického materiálu, volí se vláknitý materiál z vysoce krystalické kyseliny polymléčné, kdy je její biodegradace uváděna po 6 až 18 měsících [15].
Velmi často se pro zlepšení vlastností a volitelné doby degradace používají k výrobě scaffoldů kopolymery těchto kyselin v různém poměru. Například kopolymer ze 75 % kyseliny poly(D,L-mléčné) a 25 % kyseliny polyglykolové degraduje po 4 až 5 měsících.
Kopolymer z 50 % a 50 % procent těchto dvou kyselin degraduje již po 1 až 2 měsících [15].
Častěji než vláknité materiály jsou z obou kyselin vyráběny scaffoldy pěnové nebo houbovité. Tyto scaffoldy mají většinou dobré mechanické vlastnosti, ale přetrvávajícím problémem je poměrně špatná adheze buněk na scaffoldy vyrobené z těchto kyselin, špatná biokompatibilita a často vyšší zánětlivost. Při výrobě je dalším problémem rozpustnost kyseliny polyglykolové i v běžných organických rozpouštědlech [15], [16].
Mnohdy se při výrobě syntetických scaffoldů používají také poly(ǫ-kaprolakton) (PCL), polyethylenoxid (PEO) a polypropylen oxid (PPO). Polaxomer z jednoho řetězce hydrofobního PPO a dvou hydrofilních řetězců PEO, známý pod průmyslovým názvem Pluronic, se často používá pro výrobu scaffoldů pro chrupavky tepelnou gelací. Pluronic vykazuje vynikající výsledky při in vivo testech, problémem je ale naopak špatná mechanická odolnost vyrobených gelů [15].
25 3.2.1 Poly(ɛɛɛɛ-kaprolakton) (PCL)
PCL je lineární, biokompatibilní a biodegradabilní polyester, který se vyrábí polymerací za otevření kruhu ɛ-kaprolaktonu. Jeho strukturní vzorec je na Obrázek 9. PCL je hydrofóbní, semikrystalický5 (56 %), alifatický termoplast6 s teplotou skelného přechodu -60 °C a teplotou tání 60 °C [17], [18]. PCL je rozpustný v acetonu, chloroformu, tetrahydrofuranu i ethylacetátu. Degradace PCL je pomalejší než u PGA a PLA, proto může být použit pro výrobu dlouhodobějších materiálů, kde je nutné déle podporovat proliferaci buněk. Biodegradace nastává pomocí mikroorganismů, produkujících enzymy, které následně katalyzují hydrolytické štěpení polyesterových řetězců. Při degradaci dochází ke ztrátě mechanických vlastností po 9 až 12 měsících a k celkovému rozpadu po 24 až 36 měsících [19]. Nevýhodou tohoto jinak velmi hojně využívaného polymeru je jeho nízká teplota tání, proto je často používán společně s jinými polymery, například jako kompozit [20].
Obrázek 9: Strukturní vzorec poly(ɛɛɛɛ-kaprolaktonu) [20].
PCL používá nejen v tkáňovém inženýrství chrupavky a kostí, ale také jako materiál pro výrobu nosičů léčiv, nebo chirurgických nití určených pro tvorbu vnitřních stehů.
Ve formě směsí se škrobem našel rovněž důležité využití v oblasti obalových materiálů [7], [21].
5 Semikrystalický materiál: Míra uspořádanosti se vyjadřuje stupněm krystalinity, což je v procentech vyjádřený relativní podíl krystalických oblastí polymeru vzhledem k celkové hmotě polymeru [18].
6 Alifatický termoplast: Plast s otevřeným přímým nebo rozvětveným uhlíkovým řetězcem, u kterého je změna z plastického do tuhého stavu opakovatelně vratná [18].
.
26 Druhou skupinou jsou polymery přírodní. Mezi polymery na bázi sacharidů využívaných pro výrobu scaffoldů jsou řazeny chitosan, agaróza, kyselina hyaluronová a alginát. Další skupinou jsou polymery na bázi proteinů. Příkladem jsou kolagen a fibrin [15]. V chrupavce se nejvíce vyskytuje kolagen II, z toho je však velmi obtížné vytvořit scaffold. Častěji se tedy pro výrobu scaffoldů v tkáňovém inženýrství používá kolagen I.
Kolagen I je rozpustný v kyselém prostředí, proto se většinou z tohoto kolagenu tvoří hydratované gely. Je prokázáno, že scaffoldy z kolagenu I vykazují dobrou adhezi buněk a produkty vzniklé po degradaci kolagenu jsou pro lidský organismus fyziologické a netoxické. V případě kolagenu se však opět setkáváme s problémem špatné mechanické pevnosti, která je právě při léčbě chrupavky kolenního kloubu tak důležitá [16].
Z polysacharidů vykazuje poměrně dobré výsledky při in vivo i in vitro testování kyselina hyaluronová. Tato kyselina je součástí matrice kloubní chrupavky. Chang a kolektiv [13] ve své práci uvádí dobrou diferenciaci i proliferaci chondrocytů na scaffoldech z kyseliny hyaluronové. Zatím není však vyřešeno síťování této kyseliny. Síťování esterifikací i jinými chemickými metodami vždy zhorší biokompatibilitu materiálu a v mnoha případech vede až k chondrolýze. Pokud by bylo vyřešeno síťování, je kyselina hyaluronová velmi dobrým přírodním materiálem pro aplikace v tkáňovém inženýrství pojiv [15].
Agaróza je modifikovaná forma agaru, který se získává izolací a očistěním některých asijských mořských řas. Z agarózy se nejčastěji tvoří pro využití v tkáňovém inženýrství hydrogely [16]. Agaróza se zahřívá ve vodném roztoku s cílem maximalizovat rozpustnost, poté se tento roztok smíchá se studeným roztokem obsahujícím buňky. Po zchlazení vzniká hydrogel se zapouzdřenými buňkami. Při in vitro testování bylo dosaženo velmi dobrých výsledků jak biologických, tak mechanických. Hydrogely z agarózy měly vyhovující mechanické vlastnosti a vytvořilo se velmi rychle velké množství extracelulární matrix.
Problémem je však biologická degradace scaffoldu. V organismu savců totiž není enzym, který by rozkládal agarózu a k degradaci dochází jen velmi pomalu [15], [16].
27 3.2.2 Chitosan
Obrázek 10: Strukturní vzorec chitosanu [22].
Chitosan je biodegradabilní, biokompatibilní, netoxický polysacharid tvořený molekulami D-glukosaminu a N-acetyl-D-glukosaminu, které jsou spojeny 1,4-β-glykosidickou vazbou ( Obrázek 10). Chitosan se vyrábí deacetylací (odstraněním acetylové skupiny) z chitinu za přítomnosti hydroxidu sodného (NaOH), který napomáhá odstranění proteinů a rozpuštění uhličitanu vápenatého. Chitin je hlavní složkou exoskeletu bezobratlých živočichů (krabů, korýšů), buněčných stěn hub a vyskytuje se i v krovkách hmyzu. Výroba chitosanu z chitinu pomocí deacetylace je na Obrázek 11 [22].
Obrázek 11: Výroba chitosanu deacetylací chitinu [22].
Chitosan patří do skupiny kopolymerů s dobrými adsorpčními vlastnostmi. Je velmi hydrofobní a nerozpustný ve vodě a dalších organických rozpouštědlech. Je rozpustný v chloroformu, hexafluoracetonu, kyselině octové a mravenčí [22]. V roztocích kyselin poté nese pozitivní náboj díky protonizované aminoskupině [23].
Chitosan má velmi dobré biologické vlastnosti pro využití tohoto materiálu v lékařství. Je nejen velmi dobře biologicky odbouratelný, ale také je hemostatický a antikarcinogenní, urychluje vznik osteoblastů při regeneraci kostí, má regenerační účinky
28 také na dásně. Na nervovou soustavu působí jako sedativum, podporuje imunitní systém a podporuje snížení hladiny cholesterolu v krvi. Tyto vlastnosti mohou být ovlivněny stupněm deacetylace při výrobě, povrchovými a jinými úpravami [23].
Chitosan pro svou schopnost dobře vázat jiné látky nachází uplatnění jak v regenerativní medicíně (regenerace chrupavky, kostí, tkáňová lepidla), v estetické kosmetice (léčba popálenin, navázání tuků), ale také například při čistění odpadních vod [24].
3.3 Metody výroby scaffoldů
Metod pro výrobu scaffoldů je velká řada. V každé studii se výrobní proces a jeho podmínky liší či různě kombinují. Metoda výroby zaleží převážně na požadovaných vlastnostech konečného produktu. V případě tkáňového inženýrství chrupavky se většinou nevolí scaffoldy fóliového typu, ale spíše objemnější (3D porézní scaffoldy). Mezi nejčastěji používané metody výroby scaffoldů patří metoda 3D tisku (3D printing či rapid prototyping), metoda elektrostatického zvlákňování (electrospinning), metoda vymývání částic (particle- leaching), často také nazývána metoda vymývání soli (salt-leaching), zpěňování (foaming), odstředivé zvlákňování (centrifugal spinning), zvlákňování za mokra (wet-spinning) a lyofilizace (freeze-drying). U každé metody je v závorce uveden anglický název této metody, některé překlady z anglického do českého jazyka jsou v tomto případě často nepřesné nebo se v jednotlivých odborných literaturách liší. V textu budou dále používány pouze české názvy jednotlivých metod.
3.3.1 Vymývání částic
Tato metoda se také někdy nazývá metoda vymývání soli, protože právě chlorid sodný (dále NaCl) je nejčastějším vymývaným porogenem. Při výrobě scaffoldů pomocí této metody se roztok polymeru a rozpouštědla smísí s porogenem. Za laboratorních podmínek (atmosférického tlaku a teplotě okolo 25 °C) se rozpouštědlo pomalu odpařuje a dochází k tuhnutí celého materiálu. Ke vzniku pórů dojde vymytím polymerního materiálu s porogenem v látce, která porogen rozpouští. Chlorid sodný je používán jako porogen právě proto, že je dobře dostupný a je rozpustný ve vodě.
29 Porézní scaffoldy se touto metodou vyrábí velmi často, protože díky přesné velikosti porogenu (soli, cukru, polymerům rozpustným v jiném rozpouštědle než je polymer použitý pro výrobu scaffoldu) je možná kontrolovatelnost velikosti pórů. Vyrobené materiály mají vysokou porozitu (až 97 % [27]), metoda není náročná na přístrojové vybavení ani zvláštní podmínky.
Khang a kolektiv [25] ve své studii však uvádí, že velikost póru není nikdy přesně shodná s velikostí částic porogenu. Pomocí metody vymývání částic připravili scaffoldy z PLA a PLGA. Hmotnostní koncentrace polymerů byla vždy 20 %, lišila se velikost porogenu (NaCl) od 180 µm až po 355 µm. Tabulka 3 ukazuje, že výsledná velikost pórů byla vždy skoro o polovinu menší než velikost porogenu. Důvodem může být jednak obecně velká složitost měření porozimetrie a velikosti pórů u 3D scaffoldů a dále nedostatečné vymytí porogenu a zmenšení pórů při polymeraci. Ve zmiňované studii byla použita pro měření porozimetrie a velikosti pórů rtuťové porozimetrie [25].
Tabulka 3: Vlastnosti porézních scaffoldů vyrobených metodou vymývání částic [25].
Druh polymeru
Velikost NaCL (µm)
Hmotnostní koncentrace polymeru (hm%)
Objem polymeru na NaCL
(hm%/hm%)
Porozita (%) Medián průměru velikosti pórů (µm)
PLA 180 – 250 20 90 94,1 92,1
PLA 250 – 355 20 90 92,5 109,3
PLGA 180 – 250 20 90 97,3 120,8
PLGA 250 – 355 20 90 96,5 133,7
Výroba PCL scaffoldů metodou vymývání částic se často kombinuje s nějakou další metodou. Účelem je většinou vyztužit materiál, a tím zlepšit mechanické vlastnosti PCL.
Například Cannillo a jeho kolektiv [26] používají při svém výzkumu ke zlepšení vlastností vytvořeného scaffoldu skleněné částice Bioglass 45S5. Snímek výsledného scaffoldu ze scanovacího elektronového mikroskopu (dále SEM) je na Obrázek 12. Vzorky byly testovány biologicky in vitro a cytotoxicky. Výsledky prokázaly vynikající propojenost pórů a dobré biokompatibilní vlastnosti. Cytotoxicita se mírně projevila na základě vzniku kalcitu, který záporně ovlivnil životaschopnost buněk. I přes tento problém Cannillo a jeho kolektiv hodnotí výsledky dobře a věří, že má význam ve vývoji této metody pokračovat [26].
30
Obrázek 12: SEM snímek (150×) scaffoldu vyrobených z PCL/Bioglass 4S5S [26].
Reignier a Huneault [27] modifikovali metodu vymývání částic přidáním polyethylenoxidu, jako biodegradabilního polymeru, který je rozpustný ve stejném rozpouštědle jako NaCl. Kombinací metody melt blending (míchání tavenin) dvou nemísitelných polymerů a vymývání soli dosáhli výroby scaffoldů s dvěma druhy propojených pórů a porozitou 75 až 88 % [27].
V této studii se autoři zaměřili spíše na testování mechanických vlastností vzorků než na testování biologické. Byla studována morfologie, mechanické vlastnosti a porozita při změně koncentrace jednotlivých složek. Na Obrázek 13 je snímek ze scanovacího elektronového mikroskopu scaffoldu z PCL s dvěma druhy propojených pórů. Na Obrázek 14 je výsledek tahové zkoušky testovaných scaffoldů. Jedná se o graf závislosti napětí v tlaku na deformaci pro různě porézní materiály. Velikost porozity je vždy uvedena u dané křivky v závorce [27].
.
31
Obrázek 13: SEM mikrofotografie porézního PCL scaffoldu vytvořeného po selektivní extrakci. Poměr PCL/PEO byl 50/50, obsah vymývané soli byl také 50 %. Vyznačené měřítko odpovídá 500 µm (a), 50 µm
(b) [27].
Obrázek 14: Graf závislosti napětí v tlaku na deformaci pro různě porézní materiály [27].
Vyrobené vzorky byly hodnoceny velmi kladně. Díky krystalům soli vznikly větší póry a díky PEO vznikly menší póry, což způsobilo celkovou propojenost pórů obou druhů a obecně vysokou porozitu. Bylo dokázáno, že změnou složení lze ovlivnit i mechanické vlastnosti. Příkladem může být dynamický modul pružnosti, který se v závislosti na porozitě změnil od 1 MPa (porozita 88 %) až na 5,3 MPa (porozita 75 %) [27].
Tohoto poznatku se dá využít při výrobě scaffoldů, u kterých by se mechanické vlastnosti co nejvíce podobaly mechanickým vlastnostem zdravé lidské chrupavky. V porovnání dynamický modul pružnosti lidské chrupavky je přibližně 0,24 až 0,85 MPa [7].
32 3.3.2 Elektrostatické zvlákňování
Metoda je založena na výrobě jemných vláken z polymerního roztoku nebo taveniny pomocí elektrostatických sil. Roztok polymeru a jeho rozpouštědla je přiveden do elektrostatického pole s napětím desítky kilovoltů. Na základě elektrického potenciálu mezi roztokem polymeru nebo taveniny a kolektorem dochází k tvorbě Taylorových kuželů.
Při překonání povrchového napětí kapičky elektrickými silami dochází k „vystřelení“ vlákna z polymeru, trajektorie je řízena elektrickým polem. Při velmi rychlém pohybu vodivého roztoku mezi elektrodami dochází k odpařování rozpouštědla či tuhnutí taveniny. Výsledkem jsou vrstvy mikrovláken nebo nanovláken většinou chaoticky uložených na kolektoru. Princip je zjednodušeně znázorněn na Obrázek 15 [28].
Obrázek 15: Princip elektrostatického zvlákňování [29].
Metoda nachází široké využitý vzhledem k relativní jednoduchosti zařízení a možnosti práce s velmi malým množstvím kapalin (roztoků či tavenin). Roztok polymeru může být zvlákňován z trysky (injekční stříkačky zakončené kovovou jehlou), z vrcholu kovové tyčky, z kovového válečku brodícího se ve vaničce s roztokem nebo ze struny, na kterou je speciálním dávkovacím zařízením polymerní roztok nanášen postupně. Kolektory mohou být deskové, bodové, rotující válec, síťový buben a podobně. Podle volby zvlákňovacího zařízení a tvaru kolektoru se vrstvy vláken vytváří orientované, nebo chaotické, v požadovaném množství, s požadovanou tloušťkou vrstvy [28].
33 Pomocí metody elektrostatického zvlákňování se snažili Homayoni a kol. [30]
zvlákňovat čistý chitosan, u kterého je problémem jeho velká viskozita. Viskozita byla snižována alkáliemi (NaOH). Alkalické látky totiž hydrolyzují řetězce chitosanu, a tím zmenšují jeho viskozitu. Chitosan byl hydrolyzován 50% NaOH při teplotě 95 ˚C po dobu 0,75 až 48 hodin. Každý vzorek byl poté opláchnut v neionizované vodě, neutralizován v kyselině octové a sušen při teplotě 60 ˚C po dobu 16 hodin. Po 48 hodinách hydrolyzace se viskozita snížila ze 7,49 dl/g na 2,20 dl/g. Vlákna bez kapek se tvořila při koncentraci 5 hm%
(průměr vláken 140 nm). Poměrně dobrých výsledků bylo dosaženo i při pokusu se 7,5 hm%
chitosanu v 70% kyselině octové, jen průměr vláken byl vyšší, okolo 240 nm. SEM snímky zvlákněného hydrolyzovaného chitosanu jsou na Obrázek 16 [30].
Obrázek 16: SEM snímky zvlákňovaného chitosanu hydrolyzovaného 48 hodin: 5 hm% chitosanu v 90%
kyselině octové (a), 7 hm% chitosanu v 80% kyselině octové (b), 7,5 % chitosanu v 70% kyselině octové (c). Zvětšení 15000× (a), 10000× (b, c) [30].
3.3.3 Odstředivé zvlákňování
Základním principem této metody je využití odstředivé síly. Díky této síle je z rotujícího zařízení o určitém počtu otáček za jednotku času (většinou jednotky tisíc otáček za minutu) vypuzován polymerní roztok či tavenina. Na kolektoru nejčastěji umístěném po obvodu zařízení se usazují po odpaření rozpouštědla či tuhnutí taveniny během letu finální vlákna. Na Obrázek 17 je zobrazen nákres hlavní části takového zařízení. Rotační část se skládá ze zásobníku polymeru se dvěma otvory na bočních stranách, který je připojen na hřídel s kontrolovatelnou rychlostí otáčení. Polymer je kontinuálně přiváděn do zásobníku [31].
a b c
34 Proces centrifugálního zvlákňování je závislý na rychlosti rotace přístroje, průměru trysek, rychlosti průtoku roztoku, vzdálenosti kolektoru a vlastnostech roztoku, jako je viskozita, molární hmotnost, koncentrace a povrchové napětí. Pokud není nastavení parametrů optimální, dochází k velkému počtu nechtěných defektům, jako jsou kapky, zrnka, provázky a cákance. Výhodou je však možnost výroby scaffoldů ze dvou materiálů najednou. Tyto materiály se poté nazývají jádro-plášť materiály. Jako jádro je často používaný rozpustný polymer v některém ze základních rozpouštěděl. Po rozpuštění dochází ke vzniku dutých vlákenných scaffoldů.
Obrázek 17: Princip odstředivého zvlákňování [32].
3.3.4 3D tisk
Metoda 3D tisku spočívá v počítačem řízeném nanášení jednoho nebo více materiálů s definovanou vnější i vnitřní strukturou. Obvykle se v přístroji odstředivým způsobem namelou granule polymeru, které se roztaví a poté se vstřikují tryskou o požadovaném průměru na podložku. Tryskou se často také nanáší rozpouštědlo, které díky částečnému rozpuštění polymeru působí jako pojivo. Jednotlivé vrstvy se nanáší kolmo na sebe a vytváří potřebný tvar. Na Obrázek 18 jsou naznačeny nejdůležitější parametry scaffoldů [33].
35
Obrázek 18: Charakteristické rozměry materiálů vyrobených pomocí metody 3D tisku. Jako h je označena výška scaffoldů, l je délka, d1 je výška vlákna, d2 je šířka vlákna a d3 je velikost póru [33].
Na Obrázek 19 je přístroj 3D-Bioplotter od firmy EnvisionTEC, který je určen pro výrobu scaffoldů v tkáňovém inženýrství právě metodou 3D tisku. Tímto přístrojem mohou být vyrobeny scaffoldy z velké škály materiálů, od měkkých hydrogelů, polymerních tavenin, přes keramiku a kovy. 3D-Bioplotter je speciálně navržen pro práci ve sterilním prostředí v laminárním boxu [34].
Obrázek 19: Přístroj 3D-Bioplotter od firmy EnvisionTEC [34].
36 Velkou výhodou této metody je možnost vytvoření scaffoldu s přesnými parametry i celkovými rozměry. Nevýhodou je však špatné prorůstání buněk scaffoldem a nerovnoměrné rozložení buněk 3D strukturou. Tyto špatné vlastnosti jsou většinou zdůvodněny nevyhovující sítí pórů [33].
3.3.5 Zpěňování
Metoda zpěňování, jinak také nazývána foaming, se zabývá výrobou porézních 3D scaffoldů pomocí vzniku pórů – bublin díky rychlé změně tlaku v roztoku polymer a plyn.
Jako pevná látka se používají polymery a kopolymery s vhodnou teplotou tání. Ke zpěňování se jako plyn používá nejčastěji oxid uhličitý, ale dobré výsledky ukazují i pokusy s oxidem dusíku. Za zvýšeného tlaku dochází k rozpuštění plynu v polymeru. Při následném snižování tlaku dochází k šíření plynu pomocí bublin a vzniku porézního, pěnového 3D materiálu [17].
Scaffoldy z PCL byly touto metodou vyrobeny například E. Kiranem [28]. V PCL bylo při tlaku 5,5 až 15 MPa rozpuštěno 1,6 až 13 hm% oxidu uhličitého. Při snížení tlaku docházelo k tvorbě pórů o velikosti 20 až 800 µm [17].
Právě velký rozsah velikosti pórů je nevýhodou této metody. Velikost pórů se dá ovlivnit buď změnou rychlosti snižování tlaku, nebo změnou teploty, za které děj probíhá.
Podle pokusů E. Kirana, který testoval zmiňované scaffoldy vyrobené z PCL při teplotě 10 až 60 °C, se velikost pórů nejprve s teplotou zvyšovala a poté klesala. Změnou teploty se také dá ovlivnit rozpustnost plynu v polymeru, a tedy výsledná porozita materiálu. Porozita těchto materiálů bývá velmi dobrá, většinou se pohybuje okolo 90 až 95 % [17].
3.3.6 Výroba hydrogelů
Jako hydrogely jsou označovány vysoce hydratované polymery. Jsou to gely trvale zesíťované kovalentními vazbami. Připravují se buď síťováním ve vodě rozpustných polymerů, nebo změnou hydrofobního polymeru na hydrofilní polymer [35]. Hydrogely mohou být vyrobeny z nejrůznějších biomateriálů. Z přírodních materiálů se k výrobě hydrogelů nejčastěji používají látky na bázi sacharidů (např. alginát, agaróza, chitosan, kyselina hyaluronová), dále se používají látky na bázi bílkovin (např. fibrin, kolagen typu I a II, hedvábí) [15]. Ze syntetických materiálů se pro výrobu hydrogelů pro tkáňové
37 inženýrství osvědčilo používat poly(hydroxyethyl methakrylát), poly(ethylen glykol) a jeho deriváty nebo poly(vinyl alkohol) [35].
Ragetly [24] ve své práci uvádí, že hydrogely vyrobené z iontově síťovaného chondroitin sulfátu a chitosanu velmi podporovaly chondrogenní činnost a proliferaci proteinů extracelulární matrix. Na Obrázek 20 je graf relativního obsahu mRNA (mediátorová RNA odpovídající expresím genů) v poměru k PGA pro kolagen I, agrekan a kolagen X.
Porovnávány byly vzorky PGA, kolagenu obaleného chitosanem a samotného chitosanu.
Hydrogely se svou strukturou podobají měkkým tkáním, výhodou je také rovnoměrné rozložení buněk v hydrogelu. Nevyřešeným problémem však nadále zůstává špatná mechanická odolnost hydrogelů [7].
.
Obrázek 20: Proliferace měřená pomocí relativního obsahu mRNA kolagenu I, agrekanu a kolagenu X na scaffoldech z PGA, kolagenu obaleného chitosanem a ze samotného chitosanu [24].
3.3.7 Zvlákňování za mokra
Principem této metody je vytlačování roztoku polymeru a jeho rozpouštědla do koagulační lázně, kde dochází k odpařování rozpouštědla a srážení polymeru. Koagulační lázeň tvoří látka, ve které je polymer nerozpustný, ale velmi dobře je mísitelný s rozpouštědlem polymeru. Příkladem látky pro koagulační lázeň je izopropylalkohol nebo metanol. Při koagulaci dochází ke vzniku makroporézních materiálů s nepravidelným tvarem pórů o velikosti 150 až 300 µm [25].
38 Neves a kolektiv [36] ve svém výzkumu vytvořili právě touto metodou 3 druhy scaffoldů z chitosanu a PCL mikrovláken v různých poměrech. Polymerní roztoky ze 100 % chitosanu, dále ze 75 % chitosanu a 25 % PCL a z 50 % chitosanu a PCL byly rozpuštěny v kyselině mravenčí. Zvlákňovány byly z jehly pomocí koagulační lázně metanolu. Poté byly vzorky neutralizovány hydroxidem sodným, řádně vymyty v destilované vodě a sušeny v plastových válcových formách [13].
Testování viability a diferenciace bovinních chondrocytů ukázalo vysokou životaschopnost buněk po celých 21 dnů testu (Obrázek 21). Nejméně tvorby extracelulární matrix bylo zjištěno u scaffoldů ze 100 % chitosanu. Jako nejlepší biokompatibilní materiál byl označen materiál se 75 % chitosanu, protože zde bylo objeveno velké množství glykosaminoglykanu, který je známkou tvorby nové chrupavky. Mechanické vlastnosti však byly nejlepší u scaffoldu vytvořeného z 50 % chitosanu a 50 % PCL [13].
Obrázek 21: SEM snímky chondrocytů 1., 14. a 21. den pokusu na scaffoldech z chitosanu a PCL v diferenciačním médiu. Hustota buněk byla 5×105 buněk/20 µl [13].
39 Porozita a velikost pórů byla u všech vyrobených scaffoldů hodnocena jako velmi dobrá nebo dostačující pro tkáňové inženýrství chrupavky. Analýza byla provedena pomocí mikro CT. Porozita byla u vzorku pouze z chitosanu 75,6 % a velikost pórů průměrně 330,2 µm. V druhého vzorku (75 % chitosanu) byla porozita 64,3 % a střední hodnota velikosti pórů 265,2 µm. Ve vzorku z 50 % chitosanu byla porozita změřena 83,2 % a velikost pórů 384,7 µm. Snímky pořízené pomocí scanovacího elektronového mikroskopu a 3D mikro CT také dokazují dostatečnou propojenost pórů (Obrázek 22). Jedním z výsledků tohoto testu byla domněnka, že obsah PCL mění drsnost povrchu scaffoldu, který ovlivňuje adhezi buněk na materiál [13].
Obrázek 22: SEM snímky scaffoldů ze 100 % chitosanu (a, d), 75 % chitosanu (b, e) a 50 % chitosanu (c, f) po tepelném zpracování při 60 °C na 3 hodiny. 3D mikro CT obrázky scaffoldů ze 100 % chitosanu (g),
75 % chitosanu (h) a 50 % chitosanu (f) [13].
40
3.4 Testování vyrobených vzorků
Testování vyrobených vzorků je velmi důležitým mezikrokem od výroby scaffoldů pro tkáňové inženýrství k uvedení tohoto vzorku na trh. Nejprve se provádí testování základní, které přináší více informací o samotné struktuře vzorku a nejdůležitějších parametrech. Poté se většinou přechází ke krátkodobému a dlouhodobému biologickému testování. Dalším nezbytným krokem je biomechanické testování materiálů, které se provádí většinou bez buněk, a poté s buňkami.
Významnost mechanických vlastností při testování se liší u jednotlivých tkání, které mají být díky scaffoldům regenerovány. Vzhledem k tomu, že na kolenní chrupavky je vyvíjen velký tlak, je důležitá její pružnost, viskoelasticita, homogenita a pevnost. Parametry, které se nejčastěji hodnotí, jsou Youngův modul pružnosti, mez pevnosti v tahu, modul pružnosti ve smyku, tuhost (závislost síly na deformaci) nebo poměrná deformace [7], [37].
Hodnoty těchto parametrů by se měly co nejvíce přibližovat hodnotám kolenní chrupavky člověka. Youngův modul pružnosti se pohybuje u kolenní chrupavky člověka v rozmezí 5 až 25 MPa, mez pevnosti v tahu okolo 15 až 35 MPa a modul pružnosti ve smyku je 0,2 až 2 MPa [7]. I když se pro zjednodušení předpokládá, že chrupavky jsou materiály izoelastické, izotropní a homogenní, je biomechanické testování velmi složité a časově náročné [37]. Po biomechanickém testování je nezbytné přejít k testování in vivo.
Z výše uvedených kroků byly v rámci této práce vyrobené vzorky testovány pouze in vitro. Biomechanické testování je naplánováno a bude vedeno Ústavem experimentální medicíny AVČR, v.v.i.
