Technická univerzita v Liberci Fakulta textilní
ANALÝZA A TESTOVÁNÍ HEDVÁBÍ ZAVÍJEČŮ A PAVOUKŮ JAKO SCAFFOLDŮ PRO TKÁŇOVÉ
INŽENÝRSTVÍ
Bakalářská práce
Liberec 2014 Firyt Lukáš
ANALÝZA A TESTOVÁNÍ HEDVÁBÍ ZAVÍJEČŮ A PAVOUKŮ JAKO SCAFFOLDŮ PRO TKÁŇOVÉ
INŽENÝRSTVÍ
Bakalářská práce
Studijní program: B3107 – Textil
Studijní obor: 3107R011 – Textilní materiály a zkušebnictví Autor práce: Lukáš Firyt
Vedoucí práce: Doc. Eva Košťáková, Ph.D.
Konzultant práce: RNDr. Milan Řezáč, Ph.D.
Ing. Věra Jenčová, Ph.D.
ANALYSIS AND TESTING OF MOTHS AND SPIDERS SILK AS SCAFFOLDS FOR TISSUE
ENGINEERING
Bachelor thesis
Study programme: B3107 – Textil
Study branch: 3107R011 – Textile materials and metrology Author: Lukáš Firyt
Supervisor: Doc. Eva Košťáková, Ph.D.
Consultant: RNDr. Milan Řezáč, Ph.D.
Ing. Věra Jenčová, Ph.D.
Téma: Analýza a testování hedvábí zavíječů a pavouků jako scaffoldů pro tkáňové inženýrství.
Theme: Analysis and testing of moths and spiders silk as scaffolds for tissue engineering.
ANOTACE:
Bakalářská práce je zaměřena na problematiku vlákenných materiálů produkovaných larvami zavíječů a pavouky a testování možnosti jejich potencionálního využití v tkáňovém inženýrství.
V této práci je studována struktura několika vzorků hedvábí produkovaného různými druhy pavouků a zavíječů v larválním stadiu. Sledovány jsou zejména průměry vláken. Navržena a testována je možná sterilizace a provedeny jsou úvodní testy in vitro.
ANNOTATION:
The bachelor thesis is focused on the issue of fibrous materials produced by moth larvae and spiders and testing the possibilities of their potential use in engineering tissue. In this work we studied the structure of several samples of silk produced by various species of spiders and moth in the larval stage. Fiber diameters are mainly monitored. The possible sterilization was designed and tested and initial tests in vitro are carried out.
Prohlášení
Byl jsem seznámen s tím, že na mou bakalářskou práci se plně vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., o právu autorském, zejména § 60 – školní dílo.
Beru na vědomí, že Technická univerzita v Liberci (TUL) nezasahuje do mých autorských práv užitím mé bakalářské práce pro vnitřní potřebu TUL.
Užiji-li bakalářskou práci nebo poskytnu-li licenci k jejímu využití, jsem si vědom povinnosti informovat o této skutečnosti TUL; v tomto případě má TUL právo ode mne požadovat úhradu nákladů, které vynaložila na vytvoření díla, až do jejich skutečné výše.
Bakalářskou práci jsem vypracoval samostatně s použitím uvedené literatury a na základě konzultací s vedoucím diplomové práce a konzultantem.
Součastně čestně prohlašuji, že tištěná verze se shoduje s elektronickou verzí, vloženou do IS STAG.
Datum:
Podpis:
Poděkování
Chtěl bych touto cestou poděkovat své vedoucí bakalářské práce Doc. Evě Košťákové, Ph.D. za její podporu a mnoho cenných rad při vedení bakalářské práce. Také bych chtěl
poděkovat RNDr. Milanu Řezáči, Ph.D. za jeho čas, který mi věnoval při konzultaci a za věnování vzorků, bez kterých bychom se neobešli.
Další díky bych chtěl věnovat Ing. Věře Jenčové, Ph.D. za umožnění testování vzorků v tkáňově laboratoři a za pomoc s jejich testováním.
Obsah práce
1.Úvod ………... 1
2.Teoretická část ………...……. 2
2.1 Pavouci ………...….. 2
2.2 Bourec morušový ………...….. 10
2.3 Zavíječi ……….………... 13
2.4 Měřící zařízení ………... 15
2.5 Hedvábí pavouků a larev motýlů v medicíně ………... 16
3. Praktická část ………...…… 17
3.1 Měření průměrů vláken ………...…... 17
3.2 Biologické testování ………... 26
3.3 Zhodnocení výsledků ………...…..… 33
4.Závěr ………... 36
5.Seznam použité literatury ………..….….. 37
6.Seznam obrázků ………...……... 40
7.Seznam tabulek ………...…….. 43
1
1. Úvod
Člověk již dosáhl v medicínské sféře nejednoho velkého úspěchu. Ale všechny nové pokroky jsou limitované znalostmi člověka. Proto je potřeba prohlubovat své znalosti v daných oborech medicíny. Tyto znalosti nepřicházejí zadarmo. Je zapotřebí mnoha testů, zkoumání nových materiálů a cest. Některé testy a cesty nás zavedou do slepých uliček, kde se zdá, že vše co jsme učinili bylo zbytečné. Thomas Alva Edison při hledání vhodného žhavicího se vlákna pro svojí žárovku vyzkoušel nespočet možností, jak ho vyrobit a i přes všechny jeho počáteční neúspěchy si užíváme do dnes plodu jeho úspěchu.[1] Proto by se nikdy neměli nechat odradit od hledáním nových materiálů pro medicínské účely jako je například nových typů scaffoldů pro tkáňové inženýrství.
Scaffold slouží jako dočasná opěrná struktura podporující adhezi buněk. Taková struktura může být použita pro tvorbu například umělé chrupavky, umělé kosti, kožních implantátů a jiných tkání. Pro tyto struktury se hledají materiály jak umělé vyráběné člověkem, tak i přírodní. Jedním z hlavních požadavků na scaffoldy – nosiče buněk je vysoká porozita a propojenost pórů při dostatečně velkém specifickém povrchu a dostatečných mechanických vlastnostech. Tyto požadavky velmi dobře splňují vlákenné materiály. Mezi přírodní vlákenné materiály patří i hedvábí produkované pavouky či larvami zavíječů. Některé druhy těchto vláken, zejména pavoučích, již byly testovány pro využití v tkáňovém inženýrství, avšak není to tradičně používaný plně popsaný scaffold. Tyto materiály je nutné náročně testovat v tkáňových laboratořích, kde se nasazují na tyto vlákenné scaffoldy různorodé druhy buněk a tím odhalují možnost jejich použití právě v tkáňovém inženýrství. Tato bakalářská práce je úvodní prací propojující entomologii a tkáňové inženýrství na Fakultě textilní Technické univerzity v Liberci (FT TUL). Po konzultaci s entomologem bylo vybráno několik druhů pavoučích vlákenných materiálů a vlákenných materiálů produkovaných larvami zavíječů. Tyto byly následně podrobeny jednoduché strukturní analýze zaměřené zejména na hodnocení průměrů jednotlivých vláken. Následně byl navržen postup a byly provedeny úvodní in vitro testy. Pro tyto úvodní testy byly použity myší embryonální fibroblasty.
Cílem této bakalářské práce bylo prokázat, zda jsou vybrané typy pavoučích vláken a vláken zavíječů vhodné pro následné hlubší studium v oblasti tkáňového inženýrství na FT TUL, a také nastavit a vyzkoušet celý úvodní postup in vitro testování včetně přípravy vzorků, sterilizace a vlastní in vitro testování.
2
2.Teoretická část
Teoretická část je zaměřená na seznámení se základní anatomií pavouků a s jejich mechanismem snování vláken. Následně je představeno základní složení pavoučích vláken s vybranými druhy pavouků, jejíž vlákenný materiál je testován v experimentální části. Vedle pavouků je pozornost věnována také zástupcům motýlů produkujících vlákna jako je Bourec morušový, Zavíječ paprikový a Zavíječ moučný. Součastně budou představeny jednotlivé vývojové fáze, produkované hedvábí, jejich rozlišovací znaky a návyky.
2.1 Pavouci
Pavouci jsou důmyslní lovci, kteří využívají svojí schopnost chytit kořist do předem připravených snovaných sítí, které dokážou umístit na nejrůznorodější místa. Jejich kořistí je často drobný hmyz. Pavouci žijí na všech kontinentech mimo Antarktidu.
V současnosti je známo přes 40 tisíc jejich druhů. Pavouci patří mezi členovce. Jejich charakteristickým znakem je osm nohou a chelicery, česky klepítka. Tyto chelicery se skládají z bazálního článku a zahnutého drápku. Slouží mimo jiné k zachycení kořisti a injikování jedu. Také je možné je rozpoznat dle anatomického rozdělení těla na dvě části. Hlavohruď (cephalothorax), kde je především umístěná jejich nervová soustava a zadeček (abdomen), který je s hlavohrudí spojen malou válcovitou stopkou. Na konci zadečku jsou umístěny výrůstky, tzv. snovací bradavky.
3
Díky snovacím žlázám dokážou spřádat proteinová vlákna s mimořádnými vlastnostmi.
Tyto vlastnosti využívají k stavění sítí, vytváření kokonů, chycení kořisti nebo jako jištění proti pádu. Tato více účelovost je umožněna rozmanitostí fyzikálních a mechanických vlastností, které jsou přizpůsobeny konkrétním funkcím.[2] Například u vlákna produkovaného velkými ampulovitými žlázami, které slouží jako jistící lano, byla u některých druhů pavouků naměřena maximální síla vlákna až 1.7 GPa, což jesíla potřebná k přetrhnutí vlákna. Pro porovnání u ocele dosahuje maximální síla 1,5 GPa a Kevlaru 3,6 GPa. U Kevlaru se dosahuje vyšší maximální síly, avšak tato vlákna jsou křehčí a snadněji se lámou oproti pavoučím vláknům, které před prasknutím pohltí více energie.[5] A to poskytuje pavoukovi dokonalé jištění. Pavouci snovají svá vlákna pomocí malých výrůstků v podobě trysek připomínajících trny nebo silnější chloupky, které jsou umístěné na konci snovacích bradavek.[3] Tyto výrůstky se nazývají spigody.
Obr.1.1 Základní morfologie Araneomorphae[21][22][23]
4
Obr. 2.1 Spigody na konci snovacích bradavek[3]
Je známo sedm základních druhů snovacích žláz. Počet snovacích žláz je dán způsobem života pavouka nebo jeho metodou lovu, jelikož pavouci, kteří svoji kořist pronásledují, nepotřebují některé typy vláken, které naopak využívají pavouci, kteří svoji kořist chytají do předem vytvořených sítí. Také počet žláz bývá rozdílný u samců a samiček pavouků vzhledem k tomu, že dospělí samci většinou již neloví kořist a nevytvářejí pro vajíčka kokon. Snovací žlázy jsou umístěny v zadečku (abdomen) a vyúsťují na snovacích bradavkách. Jak lze vidět na obrázku níže, každý typ snovací žlázy má jiný tvar a jiné umístění vyústění.[2]
5
Vlastnosti vláken pavouků závisí na chemickém složení proteinu, ze kterého jsou vyrobeny. Složení proteinu je zakódované v DNA každého pavouka, proto složení vláken se liší dle druhu pavouka. Proteiny jsou vysokomolekulové biopolymerní
Obr. 3.1 Snovací žlázy Nephila clavipes [4]; (1) velká ampulovitá žláza – její produkty slouží jako kostra pavučiny nebo jako jištění; (2) malá ampulovitá žláza
– slouží k výrobě pomocné spirály; (3) flageliformní žláza – slouží k výrobě osových vláken lapací spirály; (4) agregátní žláza – slouží k nanášení lepivé hmoty na lapací spirálu; (5) cylindrická žláza – slouží k výrobě silných vláken pro stěny kokonů; (6) aciniformní žláza – slouží k výrobě vláken obalujících kořist či k výrobě síťky pro samčí spermie, nebo pro jemná vlákna kokonů; (7) piriformní žláza – slouží k výrobě příchytných terčíků pro pavoučí vlákna nebo jako součást
nosných a signálních vláken.
6
přírodní látky složené z aminokyselin. Aminokyseliny jsou v chemii popsány jako molekuly, které obsahují karboxylovou (-COOH) a aminovou (-NH2) funkční skupinu.
Ačkoliv existuje velké množství aminokyselin budou zde uvedeny pouze některé z nich, viz Tab. 1.1 nejčastěji se vyskytující v proteinu pavoučího vlákna.[5]
Tab. 1.1 Přehled některých aminokyselin jako základních stavebních jednotek vybraných pavoučích vláken[5]
Název: Alanin Označení: Ala,A
- nepolární, neesenciální α-aminokyselin
- na α uhlík je navázána metylová skupina - nejjednodušší s α- aminokyselin
Název: Kyselina glutamová Označení: Glu, E
- kódovaná glukogenní neesenciální aminokyselina - dvě karboxylové skupiny v molekule
-kyselá aminokyselina
Název: Glycin Označení: Gly, G
- aminokyselina s nepolárním postranním řetězcem
-inhibiční neuropřenašeč v Centrální nervové soustavě
Název: Isoleucin Označení: Ile, I
- hydrofobní aminokyselina (aminokyseliny s hydrofobním postranním řetězcem)
- esenciální aminokyseliny
7
Název: Leucin Označení: Leu, L
- hydrofobní aminokyselina - esenciální aminokyselina
Název: Glutamin Označení: Gln, Q
- neesenciální biogenní aminokyselina
Název: Arginin Označení: Arg, R
- biogenní aminokyselina s bazickou guanidinovou skupinou
- semiesenciální aminokyseliny (senciální v době růstu)
Název: Serin Označení: Ser, S
- glukoplastická aminokyselina - polární → hydrofilní
Název: Valin Označení: Val, V
- esenciální α-aminokyselina s nepolárním postranním
řetězcem
Název: Tyrosin Označení: Tyr, Y
-neesenciální aminokyselina - polární aminokyselina
8
Obr. 4.1 Protein velké ampulovité žlázy Nephila clavipes[5]
Jako příklad zápisu aminokyselin v proteinu je zde uvedeno jistící vlákno pavouka Nephila clavipes. Všechny aminokyseliny jsou v zápisu zapsány jako jedno písmenové zkratky.
Jak je možné vidět z Obr. 4.1 největší zastoupení má Alanin a Glycin. Díky těmto dvěma aminokyselinám vlákno získává svojí vysokou pevnost a houževnatost.[5]
Vybrané druhy pavouků byly zvoleny v závislosti na jejich metodě vytváření síti a vlákenné struktuře pavučin. Tito pavouci předou na rozdíl od ostatních, prostorné hustě tkané nepravidelné horizontální kobercovité pavučiny volně přecházející v obývací rourku, které vytváří při chůzi dvoučlennými velmi dlouhými snovacími bradavkami drženými nad rovinou zadečku.[26] Tyto pavoučí vlákenné struktury svojí strukturou připomínají netkané vlákenné textilie používané v biomedicíně. Vybraní pavouci jsou z řádu Araneae a mezi čeleď Dipluridae patří pavouci Euagrus Obr. 5.1, který pochází z jihu spojených států, ale vyskytuje se i v oblastech Kostariky, Jižní Afriky, Tchaj-wanu a Linothele megatheloides Obr. 5.2, který pochází z oblasti Peru, Kolumbie a dorůstá velikostí až 5 cm. Macrothele gigas Obr. 5.3 již patří mezi čeleď Hexathelidae, který pochází z oblasti Japonska a dorůstá velikostí také 5 cm.Acanthogonatus pissiiObr. 5.4 je z čeledi Nemesiidae, jedná se o menšího pavouka pocházejícího z Čile, kde žije ve vyšších nadmořských výškách. Tegenaria ferruginea Obr. 5.5 patří do čeledi
9
Agelenidae, dorůstá velikostí až 11 mm. Vyskytuje v Evropě a na Azorských ostrovech.[15]
Obr. 5.5 Tegenaria ferruginea[16]
Obr. 5.4 Acanthogonatus pissii[20]
Obr. 5.3 Macrothele gigas[19]
Obr. 5.1 Euagrus[17] Obr. 5.2 Linothele megatheloides[18]
10
Obr. 6.1 Bourec morušový[9]
2.2 Bourec morušový
Bourec morušový je tvor také známý pod latinským názvem Bombyx mori. Jedná se o nočního
motýla z čeledi Bombycidae. Ve volné přírodě se již nevyskytuje, žije pouze v kultuře.
Převážně je chován k výrobě hedvábí, i když v některých kulturách jsou kukly nebo housenky bource morušového pojídány. Dospělý motýl má rozpětí křídel přibližně 5 centimetrů, bílé ochmýřené tělo a neumí létat. Samice jsou dvakrát až třikrát větší než samci a jsou podobně zbarveny. Dospělí jedinci mají redukováno ústní ústrojí a nemohou přijímat potravu. Housenky bource
morušového se převážně živí listy moruše nebo jeho náhražkou - práškem ze sušeného morušového listí společně s agarem, vitaminy, minerály atd.[8][7]
11
Dále je popsán vývoj bource morušového. Samička bource morušového klade 300 až 500 vajíček, ta jsou po nakladení žlutá a později tmavnou při přecházení do dalšího stádia.[8]Vývoj housenek trvá přibližně 35 dnů a má pět vývojových stadií, tzv. instary, z nichž každé je zakončeno svlékáním. Za tuto dobu housenka vyroste na 25 - 30ti násobek své délky a hmotnost zvýší sedm až devět tisíckrát. Plně vyvinutá, dorostlá housenka se začne kuklit. Z párových slinných žláz vylučuje tekutinu, která na vzduchu tuhne, čímž vzniká tenké hedvábné vlákno. Jím se opřádá tak dlouho, až vytvoří pevný pružný zámotek - kokon. Ten je svrchu ještě opředen jemnými vlákénky, tzv.
bourovinou. Kokony se liší barvou a velikostí, rozdíly jsou však také v rychlosti množení, sbírají se 8-10 dní po zakuklení a suší se vzduchem při 80 - 85 °C, tím se usmrtí kukla uvnitř - nesmí se vylíhnout motýl, znehodnotil by kokon. Kokony se pak máčejí v teplé vodě, kde se rozpustí bílkoviny slepující zámotek a uvolněné hedvábné vlákno, které se pak navíjí a dále zpracovává.[10] Celková délka hedvábného vlákna z jednoho kokonu je až 2000 metrů. K výrobě 1 kilogramu hedvábí je potřeba asi 2 - 3 tisíce kusů kokonů.[7] Hedvábí housenek bource morušového je jako u pavouků tvořeno z proteinů, ale na rozdíl od pavouků má bource morušový pouze jeden pár snovacích žláz. Z nich se uvolňují proteiny Sericin a Fibroin.
Obr.7.1 Koloběh života bource morušového[7]
12
Obr. 8.1 Příčný řez hedvábí[14]
Bourec produkuje současně dvě fibroinová vlákna, přibližně trojúhelníkového tvaru, která jsou vzájemně spojena Sericinem. Fibroin je nerozpustný protein, který tvoří střed hedvábí a skládá se z antiparalelních vrstev beta - skládaných listů. Hlavní strukturou fibroinu je stále se opakující sekvence amino kyselin (Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala)n. V největším množství je zastoupen Glycin a o něco menším zastoupením je Alanin. Díky těmto amino kyselinám a jejich silným vodíkovým můstkům získává fibroin vysokou pevnost v tahu, tuhost a houževnatost. Vnější plášť hedvábí tvoří protein Sericin, který zde zastupuje vlastnosti pojiva a spojuje fibroinová vlákna. Chemické složení Sericinu je C30H40N10O16. Sericin se často odstraňuje, aby se získalo, tzv. pravé hedvábí.[10]
13
2.3 Zavíječi
V této kapitole budou představeny dva druhy zavíječů, zavíječ moučný a zavíječ paprikový. Zavíječi jsou druhy motýlů převážně je můžeme znát z domácností jako potravní škůdce, vyskytující se ve spížích, sklepích nebo podobných skladech s potravinami. Zavíječ moučný (Ephestia kuehniella) je motýl z čeledi zavíječovití (Pyralidae). Dospělý jedinec dorůstá velkosti 10 - 14 mm a rozpětí křídel má 20 - 25 mm. Přední křídla jsou olovnatě šedá, zadní křídla jsou bělavá, bez nápadné kresby.
Housenka je běložlutá, 15 - 20 mm dlouhá. Hlavu má červenohnědou a hruď má zbarvenou do hněda. Živí se převážně moukou, otruby a ovesnými vločkami. Samice naklade během svého života 600 - 700 vajíček. Vývoj jedné generace trvá při teplotách kolem 18 °C kolem 95 dní. Plně dorostlé larvy často opouští potravní zdroj a produkují zámotky, ve kterých se kuklí. Lepivé pavučiny larev způsobují nalepení mouky do hroznů, provazců a vytvářejí chuchvalce a hrudky až o váze několika kilogramů, které jsou útočištěm dalších škůdců.[11]
Obr. 9.1 Zavíječ moučný[24]
14
Zavíječ paprikový (Plodia interpunctella) je motýl z čeledi zavíječovití (Pyralidae).
Dospělý jedinec dorůstá 7 - 9 mm s rozpětím křídel 13 - 20 mm. Přední křídla jsou výrazně dvoubarevná, na konci jsou tmavě hnědočervená až bronzová, zatím co u těla jsou žluto šedá. V klidu zavíječ paprikový nechává svá křídla střechovitě složena.Vývoj od vajíčka po dospělce trvá kolem 30 dnů. Čerstvě vylíhlé housenky mají žlutou barvu, před kuklením jsou dlouhé až 13 mm. Tyto housenky se živí potravinářskými surovinami (chleba, těstoviny, rýže). Ostatní stádia jsou již neškodná. Samička klade 200 - 250 vajíček. Plně dorostlé larvy často opouštějí potravní zdroj a produkují zámotky, ve kterých se kuklí. Dospělí jedinci jsou převážně aktivní v noci.[11]
Obr. 9.2 Zavíječ paprikový[25]
15
2.4 Měřící zařízení
K potřebné vizualizaci vzorků během zkoumání a testování nových nebo člověku interesantních objektů vždy v laboratořích sloužila zařízení se schopností přiblížit daný objekt k potřebám pozorovatele. Ať už se jednalo o pouhé zvětšovací sklo nebo modernější světelný mikroskop. V průběhu času tyto metody byly nedostačující k potřebám pozorovatele, který zatoužil spatřit objekt svého zájmu v jiném světle, něž jej znal a potřeboval. Tato potřeba dala vzniknout moderním měřícím a vizualizačním zařízením. Mezi tyto zařízení, potřebné k pozorování struktur a k vizualizaci změn růstu buněk, slouží elektronový mikroskop, u kterého stejně jako u světelného mikroskopu je elektronový mikroskop, optický přístroj, který dovoluje zvětšení měřených objektů.
Avšak u elektronového mikroskopu jsou fotony nahrazeny elektrony a skleněné čočky za elektromagnetické čočky, které jsou v podstatě cívky, vytvářející vhodně tvarované magnetické pole.[12] Co se týče rozlišovacích schopností elektronových mikroskopů jsou úměrná vlnové délce elektronů. Jelikož elektrony mají kratší vlnovou délku než viditelné světlo, se dosahuje mnohem vyšší rozlišovací schopnosti a tím i vyšší efektivního zvětšení. Rastrovací elektronový mikroskop (SEM), nebo také řádkovací elektronový mikroskop, je elektronový mikroskop, který se využívá k zobrazování pohyblivého svazku elektronů, přičemž na každé místo je zaměřen úzký paprsek elektronů.[12] Díky interakci dopadajících elektronů na charakteristický povrch materiálu vzorku se mění úroveň signálu. Z těchto signálu se pak sestavuje výsledný obraz elektronů. Fluorescenční mikroskop je světelný mikroskop uzpůsobený k detekci a pozorování fluoreskujících látek ve vzorku. Cílem Fluorescenčního mikroskopu je vytvořit dostatečně silné záření a tím excitovat vzorek, který se následně snímá na fluorescenci.[13] Z toho vyplývá, že Fluorescenční mikroskop snímá světlo přímo ve vzorku. V biologii se Fluorescenční mikroskop využívá k snímaní buněk, které byly nějakým způsobem vystaveny molekulám schopnými fluoreskovat. Základní obraz z fluorescenčního mikroskopu je tvořen oblastmi fluorescenčního signálů a černého pozadí.
16
2.5 Hedvábí pavouku a larev motýlu v medicíně
V období posledních deseti let se tkáňové inženýrství stalo oborem zahrnujícím medicínu, biologii a inženýrství. V tomto oboru vědci využívají různé nástroje k výrobě vlákenných biologických konstrukcí, jež by měly napodobovat fyziologické prostředí, včetně fyzikálních a topografických vlastností, nativních tkání.[27] Jedno z nejstarších známých přírodních vláken produkované larválním stadiem bource morušového je hedvábí, které je původem z Číny. Vzhledem k tomu, že se jedná o dlouhé vlákno, používá se jako chirurgický šicí materiál. Jeho výhodou je nezánětlivá reakce a absorpce vlákna po zahojení rány. Využití nachází i jako biodegradabilní mikrotrubice pro opravu cév a jako tvarová vložka pro rekonstrukci kostí, chrupavek a zubů.
Hedvábné vlákno může být očištěno za účelem odstranění imunogenních komponentů (zejména Sericinu) a může být i implantováno jako tkáň podporující protetické součásti kvůli jeho imunitně neutrálním vlastnostem. Mezi další osvědčené aplikace patří opravy kýly, rekonstrukce tkáňových stěn a podpora orgánů jako smyčky močového měchýře, scaffoldy pro tkáňové inženýrství a jako řízené systémy dodávající či uvolňující léčiva.
Hlavním požadavkem na biomateriály je jejich biokompatibilita a hedvábí díky svým mechanickým vlastnostem je vhodný jako biopolymer pro lékařské aplikace. Vlastnost propouštět kyslík dělá vlákenné hedvábí ideálním materiálem pro aplikace na měkkých tkáních a i přes jeho vyšší lepicí schopnost ke tkáňovým buňkám je stále biologicky odbouratelný. Hedvábné vlákno nevykazuje žádnou toxicitu pro živé tělo během degradace, protože se skládá z totožných aminokyselin vyskytujících se u lidí.[29] Jako příklad pavoučího hedvábí byl vybrán pavouk Nephiliaclavipes, který již byl mnohokrát popsán v odporných publikacích. Na rozdíl od bource morušového, výše popsané pavoučí hedvábí doposud nenaznačuje přítomnost proteinu Sericinu. Pavoučí hedvábí je jedinečná skupina vláknitých bílkovin s neobvykle vysokou mechanickou pevností ve vláknu. Buněčná kultura na hedvábí na bázi biomateriálů má za následek vytvoření různorodých tkání, včetně kostí, chrupavek, vazů, a to jak in vitro, tak in vivo. Za pomoci molekulární biologie se vytváří syntetické pavoučí hedvábí i přesto, že větší množství stále nejsou k dispozici. Takto geneticky vytvořené pavoučí hedvábí složené z proteinů, je zformováno do filmů, které mohou být dále chemicky modifikovány.
Pavoučí hedvábí je jedinečné svoji strukturou a dá se zpracovat mnoha způsoby. Navíc je biokompatibilní, snadno se sterilizuje a lze jej použít v četných biomateriálních morfologiích. V neposlední řadě genetické inženýrství nabízí různé metody k získaní
17
většího počtu variací vlákenného hedvábí. Tyto vlastnosti dělají z pavoučího hedvábí vhodný biomateriál pro mnoho klinických funkcí.[29]
3. Praktická část
Praktickou část lze rozdělit do dvou částí. V první části byly naměřeny průměry vláken pavouků a zavíječů v programu Lucie G. Snímky vlákenné struktury pro měření byly pořízeny na Rastrovacím elektronovém mikroskopu od firmy Tescan s označením Vega3 SB EasyProbe. S naměřenými hodnotami se provedly nutné statistické výpočty.
V druhé části na vybraných vzorcích byl proveden test růstu buněk na vlákenných strukturách zavíječe paprikového, moučného a pavouka Macrothele gigas. Pro test byly použity 3T3 - Swiss albino, myší embryonální fibroblasty, které byly před nasazením pasážovány cca pětkrát a bylo nasazeno pro každý vzorek 1∙105 buněk, které následně byly kultivovány v inkubátoru při 37°C / 5% CO2. Výměna media cca 15 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) probíhala dvakrát do týdne.
3.1 Měření průměrů vláken
Vzorky vlákenných struktur pavouků Euagrus, Macrothele gigas, Acanthogonatus pissii, Linothele megatheloides, Tegenaria ferruginea a Zavíječů paprikového a moučného, byly nasnímány na rastrovacím elektronovém mikroskopu od firmy Tescan s označením Vega3 SB EasyProbe. Ze získaných snímků ze SEM získáváme informace o podobě vlákenné struktury a průměru vláken měřených v programu Lucie G. Kde od každé vlákenné struktury bylo naměřeno 120 hodnot průměru vlákna. K těmto naměřeným průměrům byly získány statistické hodnoty jako minimální průměr vláken (Minimum), maximální průměr vláken (Maximum), střední aritmetická hodnota průměru vláken (Stř.Hodnota) a směrodatná odchylka průměru vláken (Směr.Odchylka), které byly vloženy do přehledných tabulek. Při měření průměru vláken pavouka Euagrus se zjistilo, že produkuje vlákna o průměru 102 až 972 nm, avšak největší četnosti dosahuje v rozmezí 100 až 400 nm a jeho vlákna jsou v struktuře náhodně uspořádána. Strukturu lze vidět na snímcích Obr. 10.1 ze SEM zvětšený 1000x a Obr. 10.2 ze SEM zvětšený 5000x. Největší četnosti dosahují vlákna o malém průměru a s rostoucím průměrem klesá jejich četnost.
18
Tab. 2.1 Naměřené hodnoty průměru z vlákenné struktury pavouka Eagrus Stř.Hodnota Směr.Odchylka Minimum Maximum
Délka [nm] 291 173 102 972
Obr. 10.3 Grafy naměřených průměru vláken pavouka Eagrus Obr. 10.1 snímek ze SEM vlákenné
struktury pavouka Euagrus zvětšený 1000x
Obr. 10.2 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Euagrus zvětšený
5000x
19
Obr. 11.1 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Acantohonatus pissi
zvětšený 1000x
Obr. 11.2 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Acantohonatus pissi
zvětšený 5000x
Obr. 11.3 Grafy naměřených průměru vláken pavouka Acantohonatus pissi
U pavouka Acantohonatus pissi byly naměřeny vlákna o průměru 102 až 465 nm, největší četnost však dosahuje v rozmezí 100 až 400 nma jeho vlákna jsou v struktuře náhodně uspořádána. Strukturu Acantohonatus pissi lze pozorovat na snímku Obr. 11.1 ze SEM, který je zvětšený 1000x a na snímku Obr. 11.2 ze SEM, který je zvětšený 5000x. Největší četnosti zaujímají vlákna o malém průměru a s rostoucím průměrem klesá jejich četnost.
Tab. 2.2Naměřené hodnoty průměru z vlákenné struktury pavouka Acantohonatus pissi Stř.Hodnota Směr.Odchylka Minimum Maximum
Délka [nm] 202 69 102 465
20
Obr. 12.1 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Macrothele gigas
zvětšený 1000x
Obr. 12.2 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Macrothele gigas
zvětšený 5000x
Obr. 12.3 Grafy naměřených průměru vláken pavouka Macrothele
Při měření průměru vláken pavouka Macrothele gigas se zjistilo, že produkuje vlákna o průměru 192 až 3214 nm. Největší četnosti však dosahuje v rozmezí 200 až 800 nm a vysoké četnosti dosahuje i v rozmezí 1100 až 1300 nm. Tyto vlákna jsou náhodně uspořádány v struktuře vytvořené tímto pavoukem. Strukturu Macrothele gigas lze pozorovat na snímku Obr. 12.1 ze SEM, který je zvětšený 1000x a na snímku Obr. 12.2 ze SEM, který je zvětšeny 5000x.
Tab. 2.3Naměřené hodnoty průměru z vlákenné struktury pavouka Macrothele gigas Stř.Hodnota Směr.Odchylka Minimum Maximum
Délka [nm] 856 527 192 3214
21
Obr. 13.2 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Linothele megatheloides zvětšený 5000x Obr. 13.1 snímek ze SEM vlákenné
struktury pavouka Linothele megatheloides zvětšený 1000x
U pavouka Linothele megatheloides byly naměřeny vlákna o průměru 136 až 1885 nm.
Největší četnosti však dosahuje v rozmezí 400 až 600 nma jeho vlákna jsou v struktuře náhodně uspořádána. Strukturu Linothele megatheloides lze pozorovat na snímku Obr.
13.1 ze SEM, který je zvětšený 1000x a na snímku Obr. 13.2 ze SEM, který je zvětšený 5000x. Největší četnosti dosahují vlákna o malém průměru a s rostoucím průměrem klesá jejich četnost.
Tab. 2.4Naměřené hodnoty průměru z vlákenné struktury pavouka Linothele megatheloides
Stř.Hodnota Směr.Odchylka Minimum Maximum
Délka [nm] 509 233 136 1885
22
Při měření průměru vláken pavouka Tegenaria ferruginea se zjistilo, že produkuje vlákna o průměru 130 až 1158 nm. Největší četnosti však dosahuje v rozmezí 100 až 500 nm. Tyto vlákna jsou náhodně uspořádány v struktuře vytvořenou pavoukem.
Strukturu Tegenaria ferruginea lze pozorovat na snímku Obr. 14.1 ze SEM, který je zvětšený 1000x a na snímku Obr. 14.2 ze SEM, který je zvětšený 10000x. Největší četnosti zaujímají vlákna o malém průměru a s rostoucím průměrem klesá jejich četnost
Tab. 2.5Naměřené hodnoty průměru z vlákenné struktury pavouka Tegenaria ferruginea
Stř.Hodnota Směr.Odchylka Minimum Maximum
Délka [nm] 357 168 130 1158
Obr. 13.3 Grafy naměřených průměru vláken pavouka Linothele megatheloides
23
Obr. 14.1 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Tegenaria ferruginea
zvětšený 1000x
Obr. 14.2 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Tegenaria ferruginea
zvětšený 10000x
Obr. 14.3 Grafy naměřených průměru vláken pavouka Tegenaria ferruginea ferruginea
U zavíječe paprikového byly naměřeny vlákna o průměru 245 až 1679 nm. Největší četnosti však dosahuje v rozmezí 400 až 800 nm. Tyto vlákna jsou náhodně uspořádány v struktuře vytvořenou zavíječem. Strukturu zavíječe paprikového lze pozorovat na snímku Obr. 15.1 ze SEM, který je zvětšený 1000x a na snímku Obr. 15.2 ze SEM, který je zvětšený 5000x. Největší četnosti dosahují vlákna o malém průměru a s rostoucím průměrem klesá jejich četnost.
24
Obr. 15.1 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječ paprikový zvětšený
1000x
Obr. 15.2 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječ paprikový zvětšený
5000x
Obr. 15.3 Grafy naměřených průměru vláken Zavíječe paprikového Tab. 2.6Naměřené hodnoty průměru z vlákenné struktury zavíječ paprikový
Stř.Hodnota Směr.Odchylka Minimum Maximum
Délka [nm] 738 328 245 1679
25
Obr. 16.1 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječe moučného zvětšený
1000x
Obr. 16.2 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječe moučného zvětšený
2000x
Obr. 16.3 Grafy naměřených průměru vláken Zavíječe moučného
Při měření průměru vláken Zavíječ moučného se zjistilo, že produkuje vlákna o průměru 538 až 4193 nm. Největší četnosti však dosahuje v rozmezí 800 až 1700 nm.
Tyto vlákna jsou náhodně uspořádány v struktuře vytvořenou zavíječem. Strukturu zavíječe moučného lze pozorovat na snímku Obr. 16.1 ze SEM, který je zvětšeny 1000x a na snímku Obr. 16.2 ze SEM, který je zvětšený 2000x. Největší četnosti zaujímají vlákna o malém průměru a s rostoucím průměrem klesá jejich četnos.
Tab. 2.7Naměřené hodnoty průměru z vlákenné struktury Zavíječ moučný Stř.Hodnota Směr.Odchylka Minimum Maximum
Délka [nm] 1465 613 538 4193
26
Obr. 17.1 Vypínací kroužek pro vypnutí vlákenného vzorku Vypínací vrchní kroužek
Vzorek
Vypínací spodní kroužek
3.2 Biologické testování
Testy s buňkami byly provedeny na vzorcích zavíječe paprikového, zavíječe moučného a pavouka Macrothele gigas. Z důvodů malého množství vzorků byly testy omezeny pouze na otestování růstu buněk, a to třetí, sedmý a čtrnáctý den po nasazení buněk.
Vzorky byly vypnuté na vypínacích kroužcích a sterilizovaly s pomocí 70% ethanolu po 30 minut v kultivačních destičkách pro tkáňové kultury. Poté byly čtyřikrát opláchnuty roztokem phosphatebufferedsaline pH 7.4. Byla ozkoušena i metoda sterilizace UV zářením, ale tato metoda poskytuje pouze povrchovou sterilizaci, a vzhledem ke konstrukci vypínacích kroužků a pozici vypnutého vzorku by tato metoda nezaručila sterilizaci nepovrchových oblastí vzorku. Z tohoto důvodu byla upřednostněna sterilizace pomocí 70% ethanolu. Biologické testování spočívalo pouze ve vizualizaci růstu buněk na vlákenných strukturách na Fluorescenčním mikroskopu a SEM. Pro test byly použity 3T3 - Swiss albino myší embryonální
fibroblasty, které byly před nasazením pasážovány cca pětkrát a bylo nasazeno pro každý vzorek 1∙105 buněk, které následně byly kultivovány v inkubátoru při 37°C / 5%
CO2. Výměna media cca 15 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)
27
probíhala dvakrát do týdne. Vzorky pro fluorescenční mikroskopii se připravovaly pomocí fixace buněk na vzorcích vlákenných stuktur, která byla provedena MetOH po 10 minut při teplotě 4°C. Poté se zafixované vzorky třikrát opláchly v PBS. Jako fluorescenční barvivo byl použit roztok propidium jodidu (PI) s poměrem (50 µl PI v 10 ml PBS). Barvení proběhlo s cca 1 ml roztoku PI po 10 minut při pokojové teplotě a v temnu. Po obarvení se vzorky opláchly čtyřikrát v PBS a uložily se do temna.
K přípravě vzorku pro SEM se provedla roztokem 2,5% glutaraldehydu v PBS při teplotě 4°C po 10 minut. Pro odvodnění se použila vzestupná etanolová řada, a to při užití 60% - 70% - 80% - 90% - 96% - 100% EtOH po dobu 10 minut pro každou koncentraci. Vzorky minimálně po dobu jedné noci se vysoušejí při pokojové teplotě.
Následně je možné vzorky preparovat a umístit pomocí oboustranné lepící pásky na terčíky sloužící jako podpora pro pozlacení,
bezpečné přenášení a upnutí do rastrovacího elektronového mikroskopu. Vzorek se upravil tak, aby ho bylo možné nasnímat z obou stran jak z vrchní tak i ze spodní strany.
Snímek Obr. 19.1 z fluorescenční mikroskopie Zavíječe paprikového dokumentuje nárůst fibroblastů po třech dnech po nasazení na vlákennou strukturu. Zvýšení růstu
Obr. 18.1 Příprava vzorku na terčík
28
Obr. 19.2 Fluorescenční mikroskopie buněk po čtrnáctý dnech od nasazení na
vlákennou strukturu Zavíječe paprikového
Obr. 19.1 Fluorescenční mikroskopie buněk po třech dnech od nasazení na
vlákennou strukturu Zavíječe paprikového
buněk můžeme pozorovat na snímku Obr. 19.2 fluorescenčního mikroskopu ze čtrnáctého dne od nasazení oproti snímku Obr. 19.1 z fluorescenčního mikroskopu ze třetího dne od nasazení.
Snímek Obr. 20.1 ze SEM je 1000x zvětšením vlákenné struktury Zavíječe paprikového ze třetího dne od nasazení a dokumentuje nárůst fibroblastů, které prorostly vlákennou strukturou a vytvořily na ní řadu tenkých celistvých vrstev. V porovnání se snímkem Obr 20.2 ze SEM je 1000x zvětšením vlákenné struktury Zavíječe paprikového ze čtrnáctého dne od nasazení fibroblastů snímek dokumentuje nárůst fibroblástu po celé ploše scaffoldu.
29
Obr. 20.1 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječe paprikového zvětšený 1000x po třech dnech od nasazení buněk
Obr. 20.2 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječe paprikového zvětšený
1000x po čtrnácti dnech od nasazení buněk
Snímek Obr. 21.1 ze SEM je 1000x zvětšením vlákenné struktury Zavíječe paprikového dokumentuje negativní kontrolu vlákenné struktury po třech dnech při stejných podmínkách jako při nasazení fibroblastů po třech dnech, jak lze vidět na Obr. 20.1, avšak bez nasazení myších fibroblástů. Totožně tomu snímek Obr. 21.2 ze SEM 1000x zvětšením vlákenné struktury Zavíječe paprikového dokumentuje negativní kontrolu vlákenné struktury po čtrnácti dnech. Na snímcích Obr. 21.1 a Obr. 21.1 nebyly vypozorovány žádná poškození ve vlákenné struktuře, která by byla jiného typu než mechanického, utrženého při manipulaci se vzorkem.
30
Obr. 22.2 Fluorescenční mikroskopie buněk po třech dnech od nasazení na vlákennou strukturu Zavíječe moučného Obr. 22.1 Fluorescenční mikroskopie
buněk po třech dnech od nasazení na vlákennou strukturu Zavíječe moučného
Obr. 21.2 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječe paprikového zvětšený
1000x po čtrnácti dnech negativní kontroly
Obr. 21.1 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječe paprikového zvětšený 1000x po třech dnech negativní kontroly
Snímek Obr. 22.1 ze fluorescenčního mikroskopu Zavíječe moučného dokumentuje nárůst fibroblastů po třech dnech po nasazení na vlákennou strukturu. Na snímku Obr.
22.2 fluorescenčního mikroskopu ze čtrnáctého dne od nasazení nepozorujeme přílišného zvýšení růstu buněk oproti snímku Obr. 22.1 ze fluorescenčního mikroskopu ze třetího dne od nasazení.
31
Obr. 23.2 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječe moučného zvětšený
1000x po čtrnácti dnech od nasazení buněk
Obr. 23.1 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječe moučného zvětšený 1000x po třech dnech od nasazení buněk
Snímek Obr. 23.1 ze SEM je 1000x zvětšením vlákenné struktury Zavíječe moučného ze třetího dne od nasazení dokumentuje nárůst fibroblastů, které prorostly vlákennou strukturou a vytvořily na ní řadu tenkých celistvých vrstev. V porovnání se snímkem Obr 23.1 snímek Obr 23.2 ze SEM 1000x zvětšením vlákenné struktury Zavíječe moučného ze čtrnáctého dne od nasazení fibroblastů dokumentuje nárust fibroblástu po celé ploše scaffoldu.
Snímek Obr. 24.1 ze SEM je 1000x zvětšením vlákenné struktury Zavíječe moučného dokumentuje negativní kontrolu vlákenné struktury po třech dnech při stejných podmínkách jako při nasazení fibroblastů po třech dnech, jak lze vidět na Obr. 23.1, avšak bez nasazení myších fibroblástů. Totožně tomu snímek Obr. 24.2 ze SEM je 1000x zvětšením vlákenné struktury Zavíječe moučného dokumentuje negativní kontrolu vlákenné struktury po čtrnácti dnech. Na snímcích Obr. 24.1 a Obr. 24.1 nebyly vypozorovány žádná poškození ve vlákenné struktuře, která by byla jiného typu než mechanického, utrženého při manipulaci se vzorkem.
32
Obr. 24.2 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječe moučného zvětšený
1000x po čtrnácti dnech negativní kontroly
Obr. 24.1 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječe moučného zvětšený 1000x po třech dnech negativní kontroly
Obr. 25.2 Fluorescenční mikroskopie buněk po čtrnácti dnech od nasazení na
vlákennou strukturu pavouka Macrothele gigas Obr. 25.1 Fluorescenční mikroskopie
buněk po třech dnech od nasazení na vlákennou strukturu pavouka
Macrothele gigas
Snímek Obr. 25.1 ze fluorescenčního mikroskopu pavouka Macrothele gigas dokumentuje nárůst fibroblastů po třech dnech po nasazení na vlákennou strukturu.
Zvýšení růstu buněk můžeme pozorovat na snímku Obr. 25.2 fluorescenčního mikroskopu ze čtrnáctého dne od nasazení oproti snímku Obr. 25.1 ze fluorescenčního mikroskopu ze třetího dne od nasazení.
33
Obr. 26.2 snímek ze SEM vlákenné struktury pavoukaMacrothele gigas zvětšený 1000x po čtrnácti dnech od
nasazení buněk Obr. 26.1snímek ze SEM vlákenné
struktury pavouka Macrothele gigas zvětšený 3000x po třech dnech od
nasazení buněk
Snímek Obr. 26.1 ze SEM je 1000x zvětšením vlákenné struktury Macrothele gigas ze třetího dne od nasazení dokumentuje vlákennou strukturu bez nárůstu embryonálních fibroblastů. Jedná se zřejmě o vzorek který nebyl omylem osazen buňkami. Obr. 25.1 a z důvodu malého množství vzorků nebylo možné pořídit odpovídající snímek, avšak snímek Obr 26.2 ze SEM je 3000x zvětšením vlákenné struktury Macrothele gig ze čtrnáctého dne od nasazení fibroblastů potvrzuje zřejmou kompatibilitu embryonálních fibroblastů. Kde snímek dokumentuje nárůst fibroblástu po celé ploše scaffoldu.
Snímek Obr. 27.1 ze SEM je 1000x zvětšením vlákenné struktury Macrothele gigas dokumentuje negativní kontrolu vlákenné struktury po třech dnech a snímek Obr. 27.2 ze SEM je 3000x zvětšením vlákenné struktury Macrothele gigas dokumentující negativní kontrolu vlákenné struktury po čtrnácti dnech při stejných podmínkách jako při nasazení fibroblastů po čtrnácti dnech Obr. 26.2 , avšak bez nasazení myších fibroblástů.
34
Obr. 27.1 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Macrothele gigas zvětšený 1000x po třech dnech negativní
kontroly
Obr. 27.2 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Macrothele gigas
zvětšený 3000x po čtrnácti dnech negativní kontroly
3.3 Zhodnocení výsledků
Z výsledků měření průměru z vlákenných struktur byl naměřen nejmenší průměr vláken u druhu pavouků Acantohonatus pissi a Euagrus. Kde u druhu Acantohonatus pissi byla naměřena nejnižší hodnota 102 nm a u druhu Eugrus byla naměřena nejnižší hodnota také 102 nm. Avšak u druhu Euagrus se vyskytla vlákna o průměru až 972 nm.
Předpokládá se, že tato vlákna slouží jako podpůrná struktura pro slabší vlákna pro získaní vyšší odolnosti pavučinové struktury. U druhu Acantohonatus pissi dosahují tato vlákna přibližně poloviční velikosti, naměřená velikost byla 465 nm. Druhy Macrothele gigas, Linothele megatheloides a Tegenaria ferruginea již produkují silnější vlákna. Kde u Macrothele gigas jsou naměřena vlákna v rozmezí 192 až 3214 nm. U Linothele megatheloides je to v rozmezí 136 až 1885 nm a u druhu Tegenaria ferruginea tomu je 130 až 1158 nm. A co se týče četností vláken v pavučinové struktuře, jsou si tyto druhy pavouků podobné. Největší četnosti dosahují vlákna o malém průměru a s rostoucím
35
průměrem klesá jejich četnost. Při vizuálním pozorování struktury pavouka druhu Tegenaria ferruginea porovnání s ostatními strukturami zkoumaných druhů pavouků je struktura řidší. Tato odlišnost je dána metodou snování vlákenné struktury u tohoto druhu pavouka. Vlákna zavíječe paprikového dosahují průměru od 245 až do 1679 nm a jejich největší četnost dosahuje intervalu od 400 do 800. V čestnosti jsou vlákna Zavíječe paprikového porovnatelná s vlákny Linothele megatheloides, kde se největší četnost vláken právě nachází v intervalu od 400 do 600. U druhého zkoumaného zavíječe tedy Zavíječe moučného jsou výsledné naměřené průměry velice odlišné od předchozích hodnot, které byly naměřeny. Jeho průměry vláken se pohybují od 538 do 4193 nm, což je značně nad ostatními hodnotami. Tedy vlákenná struktura neobsahuje jemnější vlákna, které se vyskytují u vlákenných struktur pavouků. Na obrázku Obr 28.1 jsou graficky znázorněny namřené průměry vláken s důrazem na minimální, maximální a střední hodnotu průměru vláken.
Obr. 28.1 Grafické znázornění všech naměřených hodnot s důrazem na minimum, maximum a střední hodnot průměru vláken ve vlákenných strukturach
Průměr vláken[nm]
36
Z výsledků biologického testování vlákenných struktur s 3T3 myšími embryonálními fibroblasty je zřejmé, že materiál a vlákenné struktury nejsou pro tyto buňky toxické a buňky na vlákna adherují a následně proliferují. Vlákenné vzorky jsou tedy s fibroblasty biokompatibilní a tedy vhodnými kandidáty na další testování. Nahlédneme-li na strukturu zavíječe s ohledem na naměřené průměry vláken a testování s fibroblasty nejen, že dokazují svou schopnost jako možný scaffold díky své jemné struktuře, kde fibroblasty přerůstají přes vlákna a tvoří celistvou buněčnou strukturu, ale i díky své rozdílné škále průměru vláken mohou docílit jisté variability použití. Také oproti pavoučí struktuře produkované Makrotele gigas se se vzorky lépe manipulovalo.
Makrotele gigas produkuje složitější strukturu než je vidět u zavíječe. Také je schopen vytvořit vlákna s menším průměrem. Avšak jak ukazují snímky z rastrovacího elektronového mikroskopu vrstva vytvořená myšími embryonálními fibroblasty je místy potrhaná. K tomu mohlo dojít mechanickým poškozením při přípravě vzorků na SEM.
37
4.Závěr
Tato bakalářská práce potvrdila náš předpoklad, že získané vlákenné struktury pavouků a zavíječů mají předpoklady stát se kandidátem pro scaffold s uplatněním v tkáňovém inženýrství. Avšak toto lze s určitostí tvrdit pouze o vzorcích pavouka Macrothele gigas, zavíječe paprikového a zavíječe moučného. Jelikož na nich proběhly testy s 3T3 myšími embryonálními fibroblasty přestože ostatní zmiňované druhy pavouků tvoří podobné vlákenné struktury nebylo je možné otestovat kvůli malému množství vzorků.
Z toho důvodu by bylo zapotřebí získání většího množství vzorků a provést biologické testování i těchto vzorků. Co se týče již otestovaných vzorků testy prokázaly biokompatibilitu testovaných materiálů s 3T3 fibroblasty. Proto tyto vzorky můžeme doporučit k dalšímu in vitro testování.
38
5.Seznam použité literatury
[1]Dyer, Frank et al. (1910) Edison, His Life and Inventions, pp. 306-315
[2]SEBASTIAN, P. A.; PETER, K. V. Spiders of India. India : Universities Press, 2009.
614 s.
[3] Marik , Ivan . Aranearium, SNOVACÍ BRADAVKY[online].
Dostupné z : http://aranearium.cz/cz/body.aspx?ven=spinnerets
[4] Marik , Ivan . Aranearium, SNOVACÍ ŽLÁZY[online].
Dostupné z : http://aranearium.cz/cz/body.aspx?int=spinningglands
[5] Olena Tokarevaa, Matthew Jacobsenb, Markus Buehlerc, Joyce Wongb, David L.
Acta Biomaterialia Volume 10, Issue 4, April 2014, Pages 1612-1626
Dostupné z : http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1742706113004121
[6]MURRAY, Robert K. a kolektiv.Harperova Biochemie,Vydavatelství: H & H, 1998,pp.24 - 34
[7] Moodle,turbo.cdv.tul.Textilní zbožíznalství 1, Vlákna[online].
Dostupné z http://turbo.cdv.tul.cz/mod/book/tool/print/index.php?id=863
[8] foxymonk.com.Atlas zvířat, Bourec morušový
Dostupné z : http://www.foxymonk.com/atlas-zvirat/bourec-morusovy/
[9] Dvořák, Josef. Bombyx mori (Linnaeus, 1758) - bourec morušový Dostupné z : http://www.biolib.cz/cz/image/id21882/
[10] Radoňová, Eva. Bakalářská práce, Technická univerzita v Liberci, Přírodní hedvábí (2011).
[11]NOVÁK, Ivo. Motýli. 2. Vyd, Aventinum., (2005).ISBN 80-86858-05-7. pp. 144
39
[12] Suškin, Nikolaj Gavrilovič. Elektronový mikroskop,Praha: Státní nakladatelství technické literatury, 1954.
[13] Ctirad, Hofr. Fluorescenční mikroskopie.
Dostupné z:http://is.muni.cz/el/1431/podzim2007/Bi7230/um/3973768/12 mikroskopie.pdf
[14] Rashad, uzzaman Mithun. Silk and its degumming process.
Dostupné z : http://www.textiletoday.com.bd/magazine/574
[15] Az-europe. Kútnik
Dostupné z : http://az-europe.eu/cz/zvirata/315-kutnik/g
[16] Felix, Kossak. Tegenaria ferruginea [online].
Dostupné z : http://members.aon.at/fkossak/pics/Tegenaria_ferruginea_m4det2-.jpg
[17] Scabies.myfreeforum.org [online].
Dostupné z : http://scabies.myfreeforum.org/archive/south-american-funnel-webs- dipluridae__o_t__t_864.html
[18] Arachnoboards.com. Linothele megatheloides
Dostupné z : http://www.arachnoboards.com/ab/showthread.php?63830-Linothele- megatheloides
[19] Arachnoserver.org. Macrothele giga [online].
Dostupnéz:http://www.arachnoserver.org/images/spiderimages/Macrothele%20gigas%2 0female-BastianRast.jpg
[20] Arachnoboards.com. Acanthogonatus pissii [online].
Dostupné z : http://www.arachnoboards.com/ab/showthread.php?127638- Acanthogonatus-pissii
[21] RADEK, JOHN. Australští křižáci vibrují pavučinou vyvolené, aby je nesežrala
40
Dostupné z : http://www.tyden.cz/rubriky/veda/priroda/australsti-krizaci-vibruji- pavucinou-sve-vyvolene-aby-je-nesezrala_293342.html#.U3SJcoF_sss
[22] Ing.Rimeš,David – archive, Lasiodora parahybana, chelicerae 02
Dostupnéz:http://cs.wikipedia.org/wiki/Chelicery#mediaviewer/Soubor:Lasiodora_para hybana%2C_chelicerae_02.JPG
[23] Svaton.S. spidersnature.webnode.cz [online].
Dostupné z: http://spidersnature.webnode.cz/images/200000071-000a101040- public/pavouk+z+hora.gif
[24] LORINI, I. Manual técnico para o manejo integrado de pragas de grăos de cereais armazenados. [online].
Dostupné z : http://www.pragas.com.br/poscolheita/pragasgraos/tracas/tracas_main.php
[25] Desinsekta. Zavíječ paprikový [online].
Dostupné z : http://www.desinsekta.cz/share/images/skudci/.5/zavijec-paprikovy.jpg
[26] Az-europe. Kútnik [online].
Dostupné z :http://az-europe.eu/cz/zvirata/315-kutnik/g
[27] Ali Tamayol, Akbari, Nasim Annabi, Arghya Paul, Ali Khademhosseini, David Juncker. Biotechnology Advances,Volume 31, Issue 5, September–October 2013, Pages 669–687
Dostupné z : http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0734975012001929
[28] R. Manohar Reddy. Innovative and Multidirectional Applications of Natural Fibre, Silk
[29] Charu Vepari and David L. Kaplan. Silk as a Biomaterial
Dostupné z : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2699289/
41
6.Seznam obrázků
Obr.1.1 Základní morfologie Araneomorphae[21][22][23] ……….…………... 3
Obr. 2.1 Spigody na konci snovacích bradavek[3] ……….……… 4
Obr. 3.1 Snovací žlázy Nephila clavipes[4] ……….……... 5
Obr. 4.1 Protein velké ampulovité žlázy Nephila clavipes[5] ………..……….. 8
Obr. 5.1 Euagrus[17] ……….……….. 9
Obr. 5.2 Linothele megatheloides[18] ……….… 9
Obr. 5.3 Macrothele gigas[19] ……….……… 9
Obr. 5.4 Acanthogonatus pissii[20] ……….……… 9
Obr. 5.5 Tegenaria ferruginea[16] ……….……….. 9
Obr. 6.1 Bourec morušový[9] ………..………..… 10
Obr.7.1 Koloběh života bource morušového[7] ……….……..…. 11
Obr. 8.1 Příčný řez hedvábí[14] ………..….. 12
Obr. 9.1 Zavíječ moučný[24] [25] ……….……… 13
Obr. 9.2 Zavíječ paprikový[26] ………...………..… 13
Obr. 10.1 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Euagrus zvětšený 1000x ...…. 18
Obr. 10.2 snímek SEM vlákenné struktury pavouka Euagrus zvětšený 5000x …….… 18
Obr. 10.3 Grafy naměřených průměru vláken pavouka Eagrus14 ………..…... 18
Obr. 11.1 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Acantohonatus pissi zvětšený 1000x ……….… 19
Obr. 11.2 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Acantohonatus pissi zvětšený 5000x ………...……….. 19
Obr. 11.3 Grafy naměřených průměru vláken pavouka Acantohonatus pissi……..….. 19
Obr. 12.1 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Macrothele gigas zvětšený 1000x …... 20
Obr. 12.2 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Macrothele gigas zvětšený 5000x ...……. 20
Obr. 12.3 Grafy naměřených průměru vláken pavouka Macrothele ……….…… 20
Obr. 13.1 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Linothele megatheloides zvětšený 1000x ………..… 21
42
Obr. 13.2 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Linothele megatheloides
zvětšený 5000x ………..… 21
Obr. 13.3 Grafy naměřených průměru vláken pavouka Linothele megatheloides …... 22
Obr. 14.1 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Tegenaria ferruginea zvětšený 1000x ………...……….. 23
Obr. 14.2 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Tegenaria ferruginea zvětšený 10000x ………...……… 23
Obr. 14.3 Grafy naměřených průměru vláken pavouka Tegenaria ferruginea…..……. 23
Obr. 15.1 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječ paprikový zvětšený 1000x ………….………..…. 24
Obr. 15.2 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječ paprikový zvětšený 5000x ………..……….. 24
Obr. 15.3 Grafy naměřených průměru vláken Zavíječe paprikového ………...……… 24
Obr. 16.1 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječe moučného zvětšený 1000x ………..………..…… 25
Obr. 16.2 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječe moučného zvětšený 2000x ………..….….… 25
Obr. 16.3 Grafy naměřených průměru vláken Zavíječe ………….……….….. 25
Obr. 17.1 Vypínací kroužek pro vypnutí vlákenného vzorku ………...……… 26
Obr. 18.1 Příprava vzorku na terčík ……….…...…….. 27
Obr. 19.1 Fluorescenční mikroskopie buněk po třech dnech od nasazení na vlákennou strukturu Zavíječe paprikového ………..………...……… 28
Obr. 19.2 Fluorescenční mikroskopie buněk po čtrnáctý dnech od nasazení na vlákennou strukturu Zavíječe paprikového ………...…...………… 28
Obr. 20.1 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječe paprikového zvětšený 1000x po třech dnech od nasazení buněk ……….………...……... 29
Obr. 20.2 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječe paprikového zvětšený 1000x po čtrnácti dnech od nasazení buněk ……….………...…..…… 29
Obr. 21.1 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječe paprikového zvětšený 1000x po třech dnech negativní kontroly ……….………...…….. 30
Obr. 21.2 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječe paprikového zvětšený 1000x po čtrnácti dnech negativní kontroly ……….………...…….. 30
Obr. 22.1 Fluorescenční mikroskopie buněk po třech dnech od nasazení na vlákennou strukturu Zavíječe moučného ……….………... 30
43
Obr. 22.2 Fluorescenční mikroskopie buněk po třech dnech od nasazení na vlákennou strukturu Zavíječe moučného ………..………...………... 30 Obr. 23.1 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječe moučného zvětšený 1000x po třech dnech od nasazení buněk ………..……...………. 31 Obr. 23.2 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječe moučného zvětšený 1000x po čtrnácti dnech od nasazení buněk ……….………...…….. 31 Obr. 24.1 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječe paprikového zvětšený 1000x po třech dnech negativní kontroly ……….…………...…….. 32 Obr. 24.2 snímek ze SEM vlákenné struktury Zavíječe moučného zvětšený 1000x po čtrnácti dnech negativní kontroly ……….………...……….. 32 Obr. 25.1 Fluorescenční mikroskopie buněk po třech dnech od nasazení na vlákennou strukturu pavouka Macrothele gigas ………...………...……… 32 Obr. 25.2 Fluorescenční mikroskopie buněk po čtrnácti dnech od nasazení na vlákennou strukturu pavouka Macrothele gigas ……….………. 32 Obr. 26.1 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Macrothele gigas zvětšený 3000x po třech dnech od nasazení buněk ………...….. 33 Obr. 26.2 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Macrothele gigas zvětšený 1000x po čtrnácti dnech od nasazení buněk ………...………...…… 33 Obr. 27.1 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Macrothele gigas zvětšený 1000x po třech dnech negativní kontroly ………...…….. 34 Obr. 27.2 snímek ze SEM vlákenné struktury pavouka Macrothele gigas zvětšený 3000x po čtrnácti dnech negativní kontroly ……….………...…. 34 Obr. 28.1 Grafické znázornění všech naměřených hodnot s důrazem na minimum, maximum a střední hodnot průměru vláken ve vlákenných strukturach …………...… 35
44
7.Seznam tabulek
Tab. 1.1 Přehled některých aminokyselin jako základních stavebních jednotek vybraných pavoučích vláken[5] ………...……….…6 Tab. 2.1 Naměřené hodnoty průměru z vlákenné struktury pavouka Eagrus..…………18 Tab. 2.2 Naměřené hodnoty průměru z vlákenné struktury pavouka Acantohonatus pissi
…...…19 Tab. 2.3 Naměřené hodnoty průměru z vlákenné struktury pavouka Macrothele gigas
…...………..…... 20 Tab. 2.4 Naměřené hodnoty průměru z vlákenné struktury pavouka Linothele megatheloide ………...………... 21 Tab. 2.5 Naměřené hodnoty průměru z vlákenné struktury pavouka Tegenaria ferruginea ………...………...……. 17 Tab. 2.6 Naměřené hodnoty průměru z vlákenné struktury zavíječ paprikový …….… 18 Tab. 2.7 Naměřené hodnoty průměru z vlákenné struktury Zavíječ moučný …...….... 19
