Bioprospektering av marina ryggradslösa djur
Linn Rosqvist Helsingfors Universitet Farmaceutiska fakulteten September 2021
Tiedekunta – Fakultet – Faculty Farmaceutiska fakulteten
Koulutusohjelma – Utbildingsprogram – Degree Programme Utbildningsprogrammet för provisorsexamen
Tekijä – Författare – Author Linn Rosqvist
Työn nimi – Arbetets titel – Title
Bioprospektering av marina ryggradslösa djur
Oppiaine/Opintosuunta – Läroämne/Studieinriktning – Subject/Study track Farmaceutisk biologi
Työn laji – Arbetets art – Level Pro Gradu avhandling
Aika – Datum – Month and year September 2021
Sivumäärä – Sidoantal – Number of pages 90
Tiivistelmä – Referat – Abstract
Marina ryggradslösa djur är en god och relativt oupptäckt källa till bioaktiva föreningar. Eftersom dessa bioaktiva sekundära metaboliter produceras av organismerna, är deras struktur inte begränsad av kemisters fantasi och kan därför vara helt unika, vilket kan ge föreningarna unika verkningsmekanismer. Detta gör bioaktiva sekundära metaboliter isolerade ur marina ryggradslösa djur attraktiva för läkemedelsupptäckt. Det finns dock även utmaningar med bioprospektering av marina ryggradslösa djur. Bland annat är tillgången på material begränsad och miljön samt biodiversiteten måste beaktas vid insamling av organismer.
Syftet med denna avhandling var att utföra de första stegen i bioprospekteringsprocessen av marina naturprodukter;
extraktion, fraktionisering, bioaktivitetstestning och identifiering av bioaktiva metaboliter. De analyserade proven kom från svampdjuret Caulophacus arcticus och hade samlats in från tre olika platser. Målet var inte enbart att identifiera en eller flera bioaktiva metaboliter, vilka eventuellt kunde analyseras vidare, utan också att jämföra bioaktiviteten hos fraktioner med ursprung i olika insamlingsplatser.
Fraktioniseringen utfördes med hjälp av flashfraktionisering, vilken resulterade i åtta fraktioner av varje extrakt.
Dessa fraktioner testades för anticancer-, antibakteriella- samt biofilmshämmande egenskaper. Fraktionernas bioaktivitet analyserades med hjälp av cellviabilitetsanalyser (MTS analyser) på fyra olika cellinjer, antibakteriell växtinhiberingsanalys på fem olika bakteriestammar och biofilmshämmande analys på biofilm av S. epidermidis. De fraktioner som uppvisat aktivitet, fraktionen före och efter dessa samt motsvarande fraktioner i de två andra proven analyserades med UHPLC-HR-MS, för att identifiera eventuellt bioaktiva föreningar samt bestämma dessa föreningars elementärsammansättning. Ur vilka fraktioner en eller flera eventuellt bioaktiva målföreningar intressanta för vidareanalys i första hand skulle identifieras prioriterades på basen av bioaktivitetsanalyserna.
En förening, vilken identifierades som eventuellt bioaktiv med eventuellt tidigare icke-identifierad
elementärsammansättning, utsågs till målförening för vidare analys. På basen av resultaten kunde det också konstateras att proven insamlade från olika platser både uppvisade en liknande och en varierande bioaktivitet. Om samma föreningar orsakade bioaktivitet i samma fraktioner av olika prover bör dock undersökas närmare innan slutsatser kan dras.
Även om det finns utmaningar med bioprospektering av marina ryggradslösa djur, lönar det sig fortsättningsvis att undersöka dessa för att hitta nya bioaktiva föreningar. Det finns ett skriande behova av nya läkemedel speciellt för behandling av cancer och bakterieinfektioner, varför undersökningar som denna är relevanta också ur ett större perspektiv. Fortsatta analyser kommer möjligtvis att utföras på den i denna avhandling identifierade målföreningen, för att avgöra om den var ansvarig för bioaktiviteten och om det lönar sig att vidareutveckla den.
Avainsanat – Nyckelord – Keywords
Marina ryggradslösa djur, bioprospektering, bioaktivitetsanalys, identifiering av bioaktiva föreningar Ohjaaja tai ohjaajat – Handledare – Supervisor or supervisors
Päivi Tammela, Jeanette Hammer Andersen, Espen Hansen, Kine Ø Hansen Säilytyspaikka – Förvaringställe – Where deposited
ethesis.helsinki.fi
Muita tietoja – Övriga uppgifter – Additional information
Tiedekunta – Fakultet – Faculty Faculty of Pharmacy
Koulutusohjelma – Utbildingsprogram – Degree Programme Master’s Programme in Pharmacy
Tekijä – Författare – Author Linn Rosqvist
Työn nimi – Arbetets titel – Title Bioprospecting of marine invertebrates
Oppiaine/Opintosuunta – Läroämne/Studieinriktning – Subject/Study track Pharmaceutical biology
Työn laji – Arbetets art – Level Master Thesis
Aika – Datum – Month and year September 2021
Sivumäärä – Sidoantal – Number of pages 90
Tiivistelmä – Referat – Abstract
Marine invertebrates are a good and relatively unexplored source of bioactive compounds. These bioactive secondary metabolites can have unique structures and mechanisms of actions, since they are produced by organisms, which means their structures are not limited by the fantasy of chemists. Therefore, bioactive secondary metabolites isolated from marine invertebrates are attractive for drug development. Still, there are challenges regarding bioprospecting marine invertebrates. For example, the amount of material is limited and the environment as well as the biodiversity has to be taken into account when gathering the organisms.
The aim of this thesis was to perform the first steps of bioprospecting marine invertebrates; extraction, fractionisation, analysis of bioactivity and identification of bioactive metabolites. The samples used in the experiment, gathered from three different locations, were of the sponge Caulophacus arcticus. The goal was not only to identify one or more bioactive metabolites for eventual further analysis, but also to compare the bioactivity of the samples gathered from different locations.
The fractionisation was performed using flash fractionisation, which resulted in eight fractions of each extract. These fractions were tested for anticancer, antibacterial and biofilm inhibiting properties. The bioactivity of the fractions was analysed by performing cell viability assays (MTS assays) on four cell lines, antibacterial growth inhibition assays on five strains of bacteria and biofilm inhibition assays on biofilm of S. epidermidis. The active fractions, the fraction right before and after them and the corresponding fractions of the two other samples were further analysed using UHPLC-HR-MS, in order to identify eventually bioactive compounds and determine the elementary composition of these compounds. The most interesting fractions, from which one or more bioactive compounds were to be identified first, were prioritised based on the bioactivity assays.
One compound, which was identified as potentially bioactive with a potentially novel elementary composition, was chosen as a target compound for further analysis. Based on the results, it was also possible to draw the conclusion that there were variations as well as similarities in the bioactivity of samples gathered from different locations. Still, further research is needed to determine if the bioactivity of the same fractions from different samples was caused by the same compounds or not.
Even if there are challenges regarding bioprospecting of marine invertebrates, it is still useful to keep studying them in order to find new, bioactive compounds. There is a huge need of new drugs, especially for treating cancer and bacterial infections. Therefore, experiments such as this are relevant also in a bigger perspective. The target compound identified in the experimental part of this thesis might be further analysed in order to determine whether it is bioactive and whether it is profitable to develop it further.
Avainsanat – Nyckelord – Keywords
Marine invertebrates, bioprospecting, bioactivity assays, identification of bioactive compounds Ohjaaja tai ohjaajat – Handledare – Supervisor or supervisors
Päivi Tammela, Jeanette Hammer Andersen, Espen Hansen, Kine Ø Hansen Säilytyspaikka – Förvaringställe – Where deposited
ethesis.helsinki.fi
Muita tietoja – Övriga uppgifter – Additional information
Förkortningar
A2058 = humant melanom cellinje APCI = kemisk jonisering under atmosfäriskt tryck
APPI = fotojonisering under atmosfäriskt tryck
AQOS reagent = Aqueous One Solution Reagent
BHI = Brain Heart Infusion
CMNPD = Comprehensive Marine Natural Products Database
COSY =
homoatomkärnskorrelationsspektroskopi DMEM = Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DMSO = dimetylsulfoxid
EMA = European Medicines Agency ESI = elektrosprayjonisering
FC = flashkromatografi FDA = U.S. Food and Drug Administration
HMBC =
Heteroatomkärnsmultipelbondkorrelation HPLC = högprestandavätskekromatografi ID = identifikation
IR = infraröd spektroskopi LC = vätskekromatografi m/z = massa-till-laddning
MCF-7 = humant bröstadenocarcinom cellinje
MEM Eagle = Minimum Essential Medium Eagle
MH = Mueller-Hinton
MRC5 = lungfibroblast cellinje MS = masspektrometri
MS/MS = tandem masspektrometri MSn = flerstegsmasspektrometri MTS = 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-5-(3- karboxymetoxylfenyl)-2-(4-sulfofenyl)- 2H-tetrazolium
MV-4-11 = makrofag, bifenotypisk B myelomocytisk leukemi cellinje NMR = Nuclear Magnetic Resonance, atomkärnmagnetresonans
NOESY = atomkärns-Overhauser- effektsspektroskopi
PBS = Phosphate Buffered Saline PDA = Photodiode-Array Detection QtoF = quadrupole time of flight RPMI-1641 = Roswell Park Memorial Institute-1641 medium
TSB = Tryptic soy broth UHPLC-HR-MS =
ultrahögprestandavätskekromatografi - högresultionsmasspektrometri
UV = ultraviolett
INNEHÅLLSFÖRTECKNING
1 INLEDNING...
2 MARINA NATURPRODUKTER...
3 MARINA RYGGRADSLÖSA DJUR...
3.1 Blötdjur (Mollusca)...
3.2 Kräftdjur (Crustacea)...
3.3 Manteldjur (Urochordata)...
3.4 Mossdjur (Bryozoa)...
3.5 Nässeldjur (Cnidaria)...
3.6 Ringmaskar (Annelida)...
3.7 Svampdjur (Porifera)...
3.8 Tagghudingar (Echinodermata)...
4 MÅLBASERAD OCH FENOTYPISK LÄKEMEDELSUPPTÄCKT...
5 BIOPROSPEKTERING...
6 KROMATOGRAFISKA, SPEKTROMETISKA OCH -SKOPISKA...
ANALYSMETODER...
6.1 Flashkromatografi (FC)...
6.2 Högprestanda vätskekromatografi (HPLC)...
6.3 Masspektrometri (MS)...
6.3.1 Elektrosprayjonisering (ESI)...
6.4 Atomkärnsmagnetresonans (NMR) spektrometri...
7 MATERIAL OCH METODER...
7.1 Insamling av organismer...
7.2 Förberedning av prover inför extraktion...
7.3 Vattenbaserad extraktion...
7.4 Organisk extraktion...
7.5 Förberedning av prover inför flashfraktionisering...
7.6 Tillverkning av kolonner inför flashfraktionisering...
7.7 Flashfraktionisering...
8 BIOAKTIVITETSTESTNING...
8.1 Cellviabilitet...
8.2 Antibakteriell växtinhiberingsanalys...
8.3 Analys av biofilmshämning...
8.4 UHPLC-HR-MS-analys...
s 1 s 2 s 8 s 9 s 10 s 11 s 12 s 13 s 14 s 16 s 18 s 19 s 21
s 27 s 28 s 29 s 30 s 32 s 34 s 36 s 36 s 37 s 38 s 39 s 40 s 42 s 42 s 45 s 45 s 47 s 49 s 51
9 RESULTAT...
9.1 Vattenbaserad och organisk extraktion...
9.2 Flashfraktionisering...
9.3 Cellviabilitet...
9.4 Antibakteriell växtinhiberingsanalys...
9.5 Analys av biofilmshämning...
9.6 UHPLC-HR-MS-analys...
10 DISKUSSION...
11 SLUTSATSER...
12 KÄLLFÖRTECKNING...
s 53 s 53 s 54 s 56 s 63 s 68 s 70 s 74 s 79 s 81
1 1 INLEDNING
Människor har i tusentals år använt sig av naturprodukter för att bota sjukdomar (Ji et. al.
2009). Cirka 1000 från växter härledda substanser, av vilka vissa ännu används, har hittats nedskrivna på mesopotamiska lerplattor från år 2600 före Kristus (Newman et. al. 2000).
Dokumentation över användning av naturprodukter i Egypten år cirka 1500 före Kristus samt i Kina år cirka 1100 före Kristus har också hittats. Naturprodukter användes också i antikens Grekland. Även om naturprodukter har använts under långa tider, minskade utnyttjandet av dem för läkemedelsframställning under 2000-talet medan utnyttjandet av syntetiskt framställda föreningar ökade, eftersom läkemedelsupptäckt från naturprodukter är mer tidskrävande och ekonomiskt belastande (Beutler 2009; Brahmachari 2015). Intresset för naturprodukter verkar dock vara på återkommande (Ji et. al. 2009). Dessutom var 67.9 % av alla läkemedel som godkändes mellan 1.1.1981 och 30.9.2019 på något sätt relaterade till naturprodukter (Newman och Cragg 2020). Om de inte var biologiska makromolekyler eller oförändrade naturprodukter, så var farmakoforen en naturprodukt eller produkten en avbild eller ett derivat av en naturprodukt. Bevisligen har naturprodukter varit, och är fortsättningsvis, en essentiell del av läkemedelsupptäckt. De flesta läkemedel av naturursprung har härletts från landlevande organismer, men det fanns också över 30 000 kända föreningar av marint ursprung år 2016, varav de flesta hade isolerats ur ryggradslösa djur (Lindequist 2016). Alltsedan 2008 upptäcks också mer än 1000 föreningar av marint ursprung per år. Marina organismer är speciellt intressanta för läkemedelsupptäckt eftersom de uppvisar en större biodiversitet än landlevande organismer (Jha och Zi-rong 2004).
Marina ryggradslösa djur producerar dessutom ofta bioaktiva sekundära metaboliter, vilka har unika biologiska profiler och har evolverats för att effektivt interagera med sina biologiska mål (Montaser och Luesch 2011; Altmann 2017). Den stora marina mångfalden samt deras sekundära metaboliter gör marina ryggradslösa djur till en potentiellt rik källa för nya bioaktiva molekyler. Marina ryggradslösa djur i polarområdena är en hittills relativt lite undersökt källa, vilket tyder på att det finns stor potential att hitta nya bioaktiva föreningar ur dessa (Soldatou och Baker 2017). Med tanke på att fyra av femton läkemedel av marint
2 naturursprung, vilka har godkänts av läkemedelsauktoriteter, har sitt ursprung i svampdjur samt att bioaktiva föreningar som isolerats ur svampdjur har uppvisat en mängd olika slags bioaktiviteter, verkar svampdjur vara en god källa till potentiellt användbara bioaktiva föreningar (Sipkema et. al. 2004, Marinepharmacology 2021). I denna avhandling behandlas marina naturprodukter, några av de största marina ryggradslösa djurstammarna, bioprospektering och några av de vanligaste kromatografiska, spektrometriska och -skopiska teknikerna som kan användas för att analysera marina naturprodukter. Dessutom beskrivs framställning och fraktionisering av extrakt av svampdjuret Caulophacus arcticus, undersökning av fraktionerna för bioaktivitet samt identifiering av bioaktiva metaboliter med hjälp av ultrahögprestandavätskekromatografi - högresultionsmasspektrometri (UHPLC- HR-MS).
2 MARINA NATURPRODUKTER
Naturprodukter har, som tidigare nämnts, under långa tider haft en central roll i läkemedelsutveckling- och upptäckt. Den första naturprodukten som isolerades i ren form var morfin, från opium år 1805 (Altmann 2017). Även om de flesta naturprodukter har sitt ursprung i växter, svampar eller mikroorganismer, har antalet naturprodukter som isolerats från marina organismer ökat stadigt. År 2016 fanns cirka 30 000 kända föreningar av marint ursprung (Lindequist 2016). Ändå var det först på sent 1960-tal som seriösa försök att utnyttja potentialen hos marina organismer som källa för bioaktiva metaboliter för läkemedelsutveckling inleddes (Proksch et. al. 2002). Därför finns troligtvis många oupptäcka bioaktiva metaboliter hos marina organismer, vilket gör dem intressanta med tanke på upptäckten av nya läkemedel.
Vidare finns det en stor biodiversitet bland marina organismer och den marina miljön hör till en av de rikaste biosfärerna på jorden (Lindequist 2016). Av de 36 djurstammar som finns hittas 34 i marina levnadsmiljöer (Verdes och Holford 2018). Den stora mångfalden bland
3 marina levnadsmiljöer, vilka inkluderar ekosystem med extrema förhållanden i fråga om tryck, temperatur, ljus och näring, har fått marina organismer att anpassa sig på anmärkningsvärda sätt (Lindequist 2016; Verdes och Holford 2018). Marina ryggradslösa djur utgör cirka 60 % av alla marina djur och de flesta föreningar av marint ursprung har isolerats från dem (Lindequist 2016). Marina organismer har troligtvis en större molekylär mångfald i jämförelse med de landlevande djuren, eftersom de har en längre evolutionär historia (Belarbi et. al. 2003). Föreningar isolerade från marina organismer uppvisar också signifikant bioaktivitet i en större utsträckning i jämförelse med dem som isolerats från landlevande organismer (Montaser och Luesch 2011). En bakomliggande orsak till detta kunde eventuellt vara den större molekylära mångfalden och den långa evolutionen hos de sekundära metaboliterna som produceras av många marina organismer. Dessa faktorer motiverar ytterligare utnyttjandet av marina organismer och deras sekundära metaboliter för upptäckt och utveckling av nya läkemedel.
Som en följd av anpassning till den marina miljön producerar många marina organismer sekundära metaboliter (Lindequist 2016). Dessa föreningar används av organismerna bland annat för intra- och interspecifik signalering, för att avskräcka predatorer, hämma tävlande grannorganismer, motverka bakterie- och svampinvasioner, paralysera byten och som skydd mot UV-strålning (Haefner 2003; Lindequist 2016). Eftersom många marina ryggradslösa djur är orörliga eller begränsat rörliga och har mjuka kroppar, saknar de fysiska försvarsmöjligheter, varför det är mycket sannolikt att de producerar sekundära metaboliter (Faulkner 2000; Benkendorff 2010). Många av de sekundära metaboliterna produceras ändå av eller i samarbete med enkelcellade organismer, t.ex. bakterier, inte av själva organismen (Altmann 2017). Till exempel har det visat sig att dolastatiner, till vilka bland annat den cytotoxiska föreningen dolastatin 10 hör, produceras av cyanobakterier av släktet Symploca och inte av mollusken D.auricularia, varifrån föreningen ursprungligen isolerades (Luesch et al. 2001). Även om det visar sig att en sekundär metabolit inte produceras av organismen varifrån den ursprungligen isolerats, minskar det inte på nyttan att ha hittat en ny potentiellt aktiv läkemedelsmolekyl, varför undersökning av marina organismer fortsättningsvis lönar sig.
4 De sekundära metaboliternas unika biologiska egenskaper gör utnyttjandet av dem för läkemedelsupptäckt attraktivt (Altmann 2017). Dessutom har naturprodukter, inkluderande sekundära metaboliter, utvecklats under evolutionens gång för att effektivt växelverka med sina biologiska mål, eller receptorer, vilket har gett dem egenskaper önskvärda för läkemedelsmolekyler (Beutler 2009; Montaser och Luesch 2011). Ett stort antal naturprodukter har också visats växelverka med specifika receptorer hos däggdjur (Beutler 2009). Detta motiverar ytterligare användandet av naturprodukter för läkemedelsupptäckt.
Förutom att marina sekundära metaboliter kan ha nya kemiska egenskaper, har vissa av dem också nya verkningsmekanismer (Montaser och Luesch 2011). Ett exempel på detta är det smärthämmande läkemedlet ziconotide (Prialt), som verkar genom att blockera neuronala kalciumkanaler (Miljanich 2004). Naturprodukters strukturer är inte heller begränsade av kemisters fantasi, så som syntetiska produkters strukturer är (Beutler 2009). Det är därför möjligt att hitta helt nya molekylskelett med nya slags funktioner. Lipinskis regel gäller inte heller för naturprodukter. Eftersom naturprodukter varken begränsas av Lipinskis regel eller kemisters fantasi samt eftersom de har utvecklats för att interagera med biologiska receptorer, kunde det tänkas mer sannolikt att hitta föreningar som är aktiva in vivo från dem i jämförelse med från syntetiska föreningar.
Det finns även utmaningar med läkemedelsutveckling på basen av marina föreningar. Bland annat innehåller föreningarna lite syre, eftersom syrehalten i haven är låg, vilket ökar på deras hydrofobicitet, vilket om hydrofobiciteten blir för hög kan vara ett hinder för fortsatt utveckling i läkemedelsutvecklingspipelinen (Kong et. al. 2010). Utöver det måste ett extrakt som uppvisat bioaktivitet fraktioneras, de aktiva föreningarna isoleras och bioanalyser genomföras vid reningsprocessens varje steg, vilket gör bearbetningen av biologiska extrakt och föreningar tidskrävande (Beutler 2009). Dessutom kan föreningarna vara instabila och svåra att separera och bioanalyserna kan vara opålitliga, vilket ytterligare förlänger bearbetningsprocessen. Andra utmaningar med läkemedelsupptäckt utifrån naturprodukter är att de lättaste föreningarna redan har identifierats, att det kan vara svårt att syntetisera naturprodukter och att det kan vara svårt att samla in mer eller tillräckligt med material för prekliniska studier, eftersom det inte finns ändlöst mycket material. Som kan ses i Figur 1
5 består den typiska kemiska upptäckts- och utvecklingsprocessen av naturprodukter av flera steg, där varje steg kräver mer material. Dessa utmaningar gör läkemedelsutveckling av naturprodukter mer komplex i jämförelse med screening av syntetiskt framställda föreningar.
Dessutom finns flera möjliga hinder för vidareutveckling av en potentiellt aktiv förening.
Figur 1. Den typiska kemiska upptäckt- och utvecklingsprocessen av naturprodukter (Koehn och Carter 2005). För att få en biologiskt aktiv förening extraheras naturprodukten från källan, varefter den koncentreras, fraktioneras och renas. För att undvika analys av redan kända föreningar identifieras dessa i extraktet. Föreningens preliminära struktur-aktivitets förhållande (SAR) bestäms och reningsprocessen utökas då föreningens biologiska aktivitetsprofil uppfyller selektivitets- och potenskriterierna. Då det bekräftats att den biologiska responsen kan förändras med hjälp av syntetisk modifiering, optimeras ledningsmolekylen vidare med hjälp av traditionell medicinsk kemi. I varje steg av processen behövs mer av föreningen, vilket är en utmaning speciellt i fråga om marina naturprodukter.
Vid insamling av marina ryggradslösa djur måste valet av insamlingsplats övervägas noga, så att antalet olika arter som insamlas maximeras utan att insamlingsområdet skadas (Leal et. al. 2012). Om det inte är möjligt att odla organismerna varifrån intressanta föreningar har identifierats, måste tillräckligt med material kunna samlas in från havet, för att det ska vara
6 möjligt att analysera dem vidare (Lindequist 2016). Detta utgör en kritisk punkt, och ofta också en flaskhals, i fråga om läkemedelsutveckling från marina organismer, eftersom det kan vara utmanande att samla in tillräckligt av dem utan att skada den marina miljön. I vissa fall går det ändå att kringgå detta problem. Bland annat kan vissa föreningar syntetiseras, till exempel eribulin mesylate (Lindequist 2016). Vissa marina ryggradslösa arter och stammar, till exempel B. neritina och E. Turbinata, kan också odlas så att kraven för kommersiell läkemedelstillförsel uppfylls (Mendola 2003). De flesta marina ryggradslösa djur kan dock inte odlas (Lindequist 2016). Dessutom kan inte mikroorganismer, som i många fall visat sig vara den egentliga källan till föreningar som isolerats från marina ryggradslösa djur, odlas enskilt i rena kulturer, eftersom de lever i symbios med de marina ryggradslösa djuren.
År 2017 hade nio stycken läkemedel med ursprung i marina naturprodukter godkänts av FDA, varav tre har sitt ursprung i ω3 polyomättade fettsyror (Altmann 2017). De första läkemedlen som härletts från det marina är cytarabine (Ara-C) och vidarabine (Ara-A) (Mayer et. al. 2010). Ara-C är en syntetisk pyrimidin nukleosid, som godkändes av FDA 1969 för behandling av cancer och Ara-A är en syntetisk purin nukleosid med antivirala egenskaper, som godkändes av FDA 1976. Båda har utvecklats från ämnen isolerade från svampdjuret Cryptotethia crypta (Bergmann och Feeney 1951; Bergmann och Burke 1955).
Cytarabine (DepoCyte) godkändes av EMA 2001, men dess marknadstillstånd är inte längre i kraft (EMA 2019). Däremot används cytarabine fortfarande i kombination med daunorubicin (Vyxeos liposomal) för att behandla cancer i Europa (EMA 2020a). Vyexeos liposomal godkändes av EMA år 2018. Ett annat exempel på ett läkemedel med marint ursprung är ziconotide (Prialt), en syntetisk peptid utvecklad från gift isolerat från kägelsnäckan Conus magus, vilket godkändes av FDA 2004 och EMA 2005 för behandling av allvarlig kronisk smärta (FDA 2004; Miljanich 2004; EMA 2020b).
I början av 2021 fanns det tio olika läkemedel av marint ursprung med indikationen cancerbehandling (Marinepharmacology 2021). Alla är ursprungligen isolerade eller härledda från marina ryggradslösa djur eller från dem isolerade föreningar, och de flesta av dem, förutom cytarabine, fick marknadstillstånd på 2010-talet (Tabell 1). Det fanns inga godkända antibakteriella läkemedel med ursprung i det marina.
7 Tabell 1. Läkemedel av marint ursprung med indikationen cancerbehandling i början av 2021.
Läkemedel Marknads- tillstånd år
Indikation Består av/
isolerats från
Källor Cytarabine
(Ara-C, Cytosar-U®)
1969 (FDA) 2001 (EMA)
Akut (icke)- lymfotisk, myelocytisk och meningeal leukemi
Svampdjuret Cryptotethia crypta
Bergmann och Feeney 1951; Mayer et. al. 2010; EMA 2019; Dyshlovoy och Honecker 2020;
Hospira 2020 Trabectedin
(Yondelis®)
2015 (FDA) 2007 (EMA)
Mjukvävnadssarkom, återfall av äggstocks- cancer
Manteldjuret
Ecteinascidia turbinata
Dyshlovoy och Honecker 2020; EMA 2020c; FDA 2020;
NCI 2020a Eribulin
mesylate (Halaven®)
2010 (FDA) 2011 (EMA)
Lokalt framskriden eller metastatisk bröstcancer
Syntetisk analog av halichondrin B, isolerat från marina svampdjuren Halichondria okadai, Lyssodendoryx n.sp.1.
Lindequist 2016;
Dyshlovoy och Honecker 2020
Brentuximab vedotin (Adcetris®)
2011 (FDA) 2012 (EMA)
Hogkins lymfom, systemisk anaplastisk storcells-lymfom
Auristatin, syntetisk analog av dolastatin 10, produceras av
cyanobakterier av släktet Symploca, ursprungligen isolerat ur mollusken D.auricularia, plus tumörspecifik antikropp
Luesch et. al. 2001;
FDA 2011; Lindequist 2016; Dyshlovoy och Honecker 2020; EMA 2020d
Plitidepsin (Aplidin®)
2018, endast i Australien
Leukemi, lymfom, multipelt myelom
Depsipeptid isolerad från sjöpungar
Dyshlovoy och Honecker 2020 Polazumab
vedotin (PolivyTM)
2019 (FDA) 2020 (EMA)
Kronisk lymfocytisk leukemi, B-cell lymfom, icke- Hodgkins lymfom
Aurastatin E, ett derivat av aurastatin, plus monoklonal antikropp
FDA 2019; Dyshlovoy och Honecker 2020;
EMA 2020e; NCI 2020b
Panobinostat (Farydak®️)
2015 (FDA) 2015 (EMA)
Multipelt myelom Syntetisk analog av Psammaplin A som isolerats från svampdjuret Psammaplinaplysilla
Marinepharmacology 2021; Wang & Miao 2013, EMA 2021b Enfortumab
Vedotin (PADCEVTM)
2019 (FDA)
Metastatisk uroterial cancer
Monometyl aurastatin E, ett derivat av aurastatin, plus monoklonal antikropp
Marinepharmacology 2021; Hanna 2020 Lurbinectedin
(ZepzelcaTM) 2020 (FDA) 2019 (EMA)
Metastatisk småcellslungcancer
Ecteinascidia turbinata Marinepharmacology 2021; Baena 2021;
EMA 2021a Belantamab
Mafodotin (BlenrepTM)
2020 (FDA) 2020 (EMA)
Återfall av eller resistant multiple myelom
Momometylaurastatin F, ett derivat av aurastatin, plus monoklonal antikropp
Marinepharmacology 2021; Markham 2020;
Doronina et. al. 2006
8 I början av 2021 var 24 läkemedelskandidater av marint ursprung i olika skeden av kliniska prövningar, varav majoriteten var cancerläkemedel (Marinepharmacology 2021). Fem av läkemedelskandidaterna genomgick studier i fas tre, varav tre som cancerläkemedel. Trots alla fördelar med naturprodukter har upptäckten av nya sådana minskat på grund av att det är tids- och kostnadskrävande (Zhang et. al. 2015).
De flesta läkemedelsmolekylskandidater med marint ursprung har isolerats från tropiska eller subtropiska ryggradslösa djur (Proksch et. al. 2002). Läkemedelsmolekylskandidater isoleras också från marina arter som lever i arktiska miljöer. Bland annat har sex nya breitfussiner, varav två visade sig inhibera flera cancercellinjer selektivt, isolerats från den arktiska marina hydrozoanen Thuiaria breitfussi, och tre nya samt två tidigare isolerade securaminanaloger, varav tre visade sig inhibera fyra cellinjers livskraft, isolerats från det organiska extraktet av det arktiska mossdjuret S.securifrons (Hansen et. al. 2017; Hansen et. al. 2019). Ett tredje exempel är ianthelline, ett bromotyrosinderivat, som har isolerats från det arktiska marina svampdjuret Stryphnus fortis och som visat sig vara aktiv mot sju olika grampositiva- och negativa slag av bakterier (Hanssen et. al. 2014). Det kan därmed konstateras att också de arktiska marina miljöerna erbjuder flera möjligheter till upptäckt av bioaktiva föreningar.
3 MARINA RYGGRADSLÖSA DJUR
Marina ryggradslösa djur är som tidigare nämnts en rik källa till för läkemedelsupptäckt intressanta föreningar. Det finns över 100 000 ryggradslösa vattenlevande djurarter, vilka kan indelas i över 30 olika stammar, varav åtta behandlas här, eftersom de antingen hör till de mer artrikare stammarna, har undersökts mer eller utnyttjas till en större grad av människan (Thorpe et. al. 2000; Josefson et. al. 2013; WoRMS 2020). Eftersom marina organismer har genomgått evolution under en längre tid än landlevande, är det troligt att de har en större molekylär mångfald (Belarbi et. al. 2003). Med tanke på de marina arternas
9 mångfald, att de ofta producerar sekundära metaboliter och att de flesta bioaktiva föreningar isolerats från dem, är marina ryggradslösa djur extra intressanta för läkemedelsutveckling.
3.1 Blötdjur (Mollusca)
Blötdjur har genom tiderna använts som bland annat mat, färgämnen och läkemedel (Benkendorff 2010). De utgör den näst största djurstammen på jorden, eftersom ungefär 7 % av alla djur hör till stammen blötdjur. Blötdjurens inre organ finns mellan en muskulös krypande fot på buksidan och ett kalkhaltigt skal på ryggsidan (Moore och Overhill 2006).
Alla blötdjur har ändå inte ett skal. Foten kan användas för förflyttning. Alla blötdjur förutom de tvåskaliga har en rivtunga, vilken de använder för att skaffa föda. Blötdjurens respiration sker med hjälp av gälar, och syret förs runt i kroppen med hjälp av blodcirkulationen.
Blötdjurens skal består av två eller flera lager av kalciumkarbonat, men dess form passar inte kroppen helt och det omformas inte då djuret växer (Moore och Overhill 2006). Skalet kan stöda kroppen men är inte en del av dess struktur. Skalet har olika funktioner för olika blötdjur: det kan utnyttjas som muskelfäste eller skydd, vid nedgrävning eller för understöd av blötdjurets bärighet. Ledsnäckor och kägelsnäckor är exempel på blötdjur (Figur 2).
Figur 2. Ledsnäckor och kägelsnäckan Conus textile (Ling 2005, Rae 2011). Ledsnäckor, till vänster, och kägelsnäckor, till höger, hör till stammen blötdjur.
10 Eftersom alla blötdjur har mjuka kroppar är de utsatta för predatorer och patogener (Benkendorff 2010). Också de skalförsedda blötdjuren är utsatta, eftersom de måste öppna skalet för att kunna äta eller röra på sig och dessutom filtrerar stora mängder vatten innehållande mikroorganismer. Blötdjur kan leva i en mängd olika livsmiljöer, i allt från höga alpina områden till djupa havsöppningar. De kan också leva på många olika sätt; som predatorer, köttätare, herbivorer, samlare, detritivorer, filtrerare eller foto- och kemoautotrofer. Blötdjur är inte enbart mindre djur med begränsad rörlighet, bland annat bläckfiskar är också blötdjur (Moore och Overhill 2006).
Bland annat kägelsnäckorna, som är det största släktet av marina ryggradslösa djur, är också blötdjur (Bingham et. al. 2010). Kägelsnäckorna använder sig av toxiner, vilka består av en blandning av peptider, för att förlama sina byten. Dessa toxiner, som har spänningsstyrda kalciumkanaler som mål, har försett forskningen med nya föreningar. Åtminstone en av dem har utvecklats till det smärthämmande läkemedlet Prialt, som är det första läkemedlet som utvecklats från kägelsnäckor.
Det finns många andra exempel på bioaktiva föreningar som har isolerats från blötdjur. Bland annat har det hittats polypropionater, vilka har associerats med cytotoxisk aktivitet och antineoplastisk aktivitet, från ett antal lungsnäckor (Riguera 1997). Bursatellanin-P, en förening som uppvisat anti-HIV aktivitet, har isolerats från sjöharen Bursatella leachiis (Rajaganapathi et. al. 2002).
3.2 Kräftdjur (Crustacea)
Kräftdjur är en grupp med stor mångfald, av vilka det finns cirka 50 ordningar, och de är också många till antalet (Moore och Overhill 2006). Till kräftdjur hör bland annat krabbor, humrar, kräftor och räkor. De kan se ut till exempel som i Figur 3. Kräftdjur är till största delen marina. De har två antenner och deras lemmar är ofta tvådelade. Marina kräftdjurs respiration sker över hela kroppsytan eller med hjälp av gälar. Kräftdjur skaffar sin föda på
11 många olika sätt, de kan bland annat vara detritivorer, predatorer, algätare, filtrerare eller parasiter på de yttre delarna av fiskars gälar (Cartes och Sardà 1989; Vannini et. al. 1989;
Manjulatha och Babu 1991; Guerra-García och de Figueroa 2009; Moore och Overhill 2006).
Figur 3. En räka och en hoppkräfta (CremboC 2016, Biosciences Imaging Group 2020).
Räkor, till vänster, och hoppkräftor, till höger, hör till stammen kräftdjur.
Kitin, en förening som finns i cellväggen hos svampar, insekter och jäst samt i kräftdjurs exoskelett, är mest lättillgänglig från marina kräftdjurs skal (Kurita 2005; Jeon et. al. 2007).
Kitosan fås genom att deacytelera kitin i närvaro av en bas (Jeon et. al. 2007). Kitin och kitosan och olika modifikationer av dem används inom flera olika områden, bland annat bioteknologi, läkemedel och genterapi (Prashanth och Tharanathan 2007). Kitin och kitosan kan eventuellt ha bland annat anticancer, antibakteriella, antifungala eller antikoagulanta egenskaper. Kitosan har också visat sig ha en sänkande effekt på kolesterolvärden.
3.3 Manteldjur (Urochordata)
Manteldjur hör till stammen Chordata. Sjöpungar, som hör till manteldjuren, är orörliga filtrerare och vanliga i grunt havsvatten (Moore och Overhill 2006). De har inget huvud och deras nervsystem är lågt utvecklat. Deras respiration sker med hjälp av gälar. Sjöpungarna bildar ofta stjärnformade kolonier, som är klart färgade och täckta av gel. Ett exempel på hur sjöpungar kan se ut syns i Figur 4. En annan klass av manteldjur är salper, som existerar i
12 flytande, genomskinliga kolonier. De kan skapa en vattenström genom att dra samman musklerna i sina kroppsväggar, vilken de utnyttjar för förflyttning och införskaffning av föda genom filtrering och syreupptag. Två andra klasser av manteldjur är appendikularier, som flyter omkring i plankton omgivna av gel och lever på små födopartiklar, och sorberacea, vilka är köttätande djupvattenorganismer.
Figur 4. Sjöpungen Pycnoclavella taureanensis och salper (Dapaan 2005, Parent 2010).
Sjöpungar, till vänster, och salper, till höger, hör till stammen manteldjur.
Förutom de två cancerläkemedlen plitidepsin och trabectadin, har även en hel del andra intressanta bioaktiva föreningar isolerats från sjöpungar, till exempel de cytotoxiska föreningarna bistratamin M och N, som har isolerats från Lissoclinum bistratum, samt eusynstyelamid B som har isolerats från Didemnum candidum (Liberio et. al. 2015; Urda et.
al. 2017; Watters 2018; Dyshlovoy och Honecker 2019).
3.4 Mossdjur (Bryozoa)
Mossdjur är orörliga kolonier av miniatyrdjur (Moore och Overhill 2006). Varje individ, eller zooid, i kolonin bor i en skild liten “låda” av ytterhud, vart de snabbt kan dra sig tillbaka.
Mossdjur har en lopofor som kan sträckas ut för att samla in föda. Lopoforen är en cirkulär eller hästskoformad vikning av djurets kropp, vilken omger djurets mun och har tentakler täckta av cilier. Cilierna på tentaklerna drar till sig vatten innehållande födopartiklar.
Mossdjur kan ha många olika former, de kan växa som platta ark på sjögräs eller likt träd
13 eller buskar rakt upp från underlag bestående av till exempel stenar eller skal (Moore och Overhill 2006; Josefson et. al. 2013). De kan till exempel se ut som i Figur 5. Ofta är uppgifter som födointag, försvar och utsöndring av avfallsprodukter uppdelade mellan zooiderna i en mossdjurskoloni (Moore och Overhill 2006). Mossdjurens metabolism kan vara väldigt varierande; allt mellan den snabbaste till den långsammaste i världen. Den mest kända klassen av föreningar som härstammar från marina mossdjur är bryostatiner, som är lovande anticancerläkemedelskandidater (Figuerola och Avila 2019).
Figur 5. Mossdjur (Southwood 2013, Southwood 2017). Mossdjur är orörliga kolonier av miniatyrdjur (Moore och Overhill 2006).
3.5 Nässeldjur (Cnidaria)
Till nässeldjur hör anemoner, koraller, maneter och hydroider (Moore och Overhill 2006).
De kan vara orörliga polyper eller fritt flytande maneter. Till exempel nässeldjuret Paramuricea clavata består av polyper (Figur 6). Alla nässeldjur är vattenlevande och de flesta är marina. De har en enkel struktur och kan vara allt från några millimeter till flera hundra meter långa. Nässeldjur har stickceller (cnidae eller nematocyster), vilka de använder för att fånga föda, försvara sig eller attackera rivaliserande kolonier. Nematocysterna aktiveras av en kombination av kemisk och mekanisk stimuli och vissa av dem innehåller paralyserande toxiner. Nässeldjur är köttätande predatorer. Nässeldjur saknar huvud, organ, hjärna, centralt nervsystem och skilda muskler. De har bara en öppning som fungerar både som mun och anus, vilken ofta omges av tentakler, på vilka stickcellerna är koncentrerade.
14 Eftersom de är radiellt symmetriska kan nässeldjur kan fånga föda från alla håll. De har en stor regeneringsförmåga, endast en liten bit vävnad kan bilda ett helt nytt polyp. Det finns också polyper, korallpolyper, som lever i symbios med gröna alger. Algerna lever inuti korallernas celler och förser dem med en del av sin föda samtidigt som de understöder upptag av nitrater och fosfater. Algernas fotosyntes underlättar också bildningen av kalkavlagringar, vilket är vad korallreven är uppbyggda av.
Figur 6. Paramuricea clavata (till vänster) och en röd anemon (till höger) (Altenburg 1996, Aubourg 2016). Paramuricea clavata, som består av polyper, och röda anemoner är nässeldjur.
Föreningar med antiinflammatorisk, antibakteriell, antiviral och antiparasitisk aktivitet har isolerats från nässeldjur. Bland annat har tre potentiellt antiinflammatoriska föreningar, sarcocrassocolide M-O, isolerats från Sarcophyton Crassocaule (Lin et. al. 2012). Dessutom har fem stycken potentiellt antibakteriella pseudopterosiner, PsY, PsQ, PsS, seco-PsK och PsG isolerats från Pseudopterogorgia elisabethae (Correa et. al. 2011). Ytterligare ett par föreningar är gemmacolide V och Y, vilka har isolerats från Dichotella gemmacea och har visat sig inhibera cancercellinjerna A549 och MG63 in vitro (Li et. al. 2012).
3.6 Ringmaskar (Annelida)
De flesta ringmaskar lever i havet under stenar eller på havsbotten (Moore och Overhill 2006). De är segmenterade och har ett hydrostatiskt skelett. Segmenten är ofta åtskilda. Tack
15 vare dessa egenskaper kan de röra sig snabbt och effektivt med hjälp av muskelsammandragningar. Ringmaskarnas yttre hudlager täcks av kitinborst.
Ringmaskarnas nervsystem har en grupp huvudkroppar av nervceller, vilken kan ses som en hjärna. De använder gälar för syreupptagning.
De flesta marina ringmaskar är havsborstmaskar (Josefson et. al. 2013). Ringmaskar kan till exempel se ut som i Figur 7. Övriga slag av ringmaskar är fåborstmaskar och iglar (Moore och Overhill 2006). Det finns många olika slag av havsborstmaskar medan de andra två klasserna är mer likartade. Havsborstmaskar kryper eller simmar fritt i havet och är ofta färggranna, aktiva predatorer med bitkäkar. De flesta arter är köttätande, men det finns också sådana som är växtätande eller detrivoriska.
Figur 7. En havsborstmask och Spirobranchus giganteus (Guttuso 2010, McCuller 2016).
Både Spirobranchus giganteus, till höger, och havsborstmasken, till vänster, hör till stammen ringmaskar.
Också från havsborstmaskar har intressanta föreningar isolerats. Ett exempel är en trombolytisk serinproteas, som har isolerats från havsborstmasken Diopatra sugokai (Kim et. al. 2018). Extrakt av havsborstmasken Perinereis cultrifera har också uppvisat antibakteriella egenskaper (Elayaraja et. al. 2010).
16 3.7 Svampdjur (Porifera)
Svampdjur är de mest primitiva flercelliga djuren (Belarbi et. al. 2003). De har funnits i 700- 800 miljoner år. Alla svampdjur är vattenlevande och de flesta finns i marina miljöer (Moore och Overhill 2006). Svampdjur växer i regel långsamt, men tillväxthastigheten beror på art, årstid och levnadsförhållanden (Belarbi et. al. 2003). En del arter växer inte till maximal storlek utan koloniserar i stället nya områden och förökar sig snabbt, medan andra förökar sig och växer långsamt, men till enorm storlek (Moore och Overhill 2006). I denna avhandling undersöks fraktioner av extrakt av svampdjuret Caulophacus arcticus, som är ett av de vanligaste glassvampdjuren i Norska havet (Buhl-Mortensen et. al. 2019).
Svampdjur är täckta av hål och saknar exakt kroppsform, symmetri, nerver och muskler (Moore och Overhill 2006). Deras celler, vars differentiering är helt reversibel, är inte samordnade och ett helt svampdjur kan regenereras från några få celler. I svampdjurens mitt finns en gel, som stöder djurets kroppsform, och de flesta svampdjur har också piggar med samma funktion, som dessutom hindrar dem från att röra sig. Svampdjur som lever vid kusten och i grunt vatten är ofta gula, orangea, röda, gröna eller violetta. Ett exempel på ett gult och ett orange svampdjur, samt på Caulophacus arcticus, kan ses i Figur 8.
Figur 8. Polymastia boletiformis, Tethya californiana och Caulophacus arcticus (Ueda 2008, Picton 2016). Polymastia boletiformis (till vänster) och Tethya californiana (i mitten) är exempel på färgglada svampdjur. Längst till höger syns Caulophacus arcticus, vilket är svampdjuret vars extrakt undersöks i denna avhandling (MAREANO/Havsforskningsinstituttet 2009)
17 Svampdjur är filtrerare, vilket innebär att vatten dras in genom små porer i deras yttre kroppsvägg och utsöndras genom större öppningar (Belarbi et. al. 2003). Svampdjuren absorberar föda och syre från vattnet som flödar igenom dem (Belarbi et. al. 2003; Moore och Overhill 2006). Vissa arter är också köttätande och fångar då små kräftdjur med hjälp av uppskjutande krokformade piggar (Moore och Overhill 2006). Många tropiska svampdjur hyser även fotosyntetiska endosymbioter, vilka kräver ljus för att överleva (Belarbi et. al.
2003). Dessa svampdjur behöver mindre organisk föda.
I naturen kan svampdjur leva i över 1500 år (Belarbi et. al. 2003). Svampdjur har en anmärkningsvärd kemisk mångfald och de, samt deras symbioter, producerar ett stort antal unika metaboliter, vilka är av intresse för läkemedelsutveckling (Belarbi et. al. 2003;
Sipkema et. al. 2004). Bland annat har ovanliga nukleosider, bioaktiva terpener, steroler, cykliska peptider, alkaloider, fettsyror, peroxider och aminosyraderivat isolerats från dem (Sipkema et. al. 2004). Svampdjur producerar också en hel del biotoxiner för att skrämma bort predatorer och för att tävla om levnadsmiljöer med andra orörliga ryggradslösa djur (Moore och Overhill 2006). De bioaktiva föreningar som isolerats ur svampdjur har uppvisat bland annat antiinflammatoriska, anticancer, immunhämmande, neurohämmande, antivirala, antimalariska och antibiotiska egenskaper (Sipkema et. al. 2004). Förutom den redan nämnda antibakteriella föreningen ianthelline, har till exempel också fyra merosesquiterpener isolerats från det marina svampdjuret Dactylopongia elegans, vilka uppvisade måttliga antibakteriella egenskaper och dessutom potential till anticanceregenskaper (Hanssen et. al.
2014; Balansa et. al. 2019).
Kommersiell produktion av metaboliter isolerade från svampdjur skulle dock kräva så stora mängder biomassa att det inte på ett hållbart sätt går att skörda tillräckligt med svampdjur för ändamålet, varför andra sätt att producera metaboliter, till exempel odling av svampdjur, i så fall skulle krävas (Belarbi et. al. 2003). Som tidigare nämnts har till exempel cancerläkemedlet eribulin mesylate, som från början isolerades från svampdjuren Halichondria okadai och Lyssodendoryx n.sp.1., framställts syntetiskt (Lindequist 2016).
Det går att odla svampdjur i havsbaserade odlingar, men det finns många okända faktorer i fråga om odlandet, vilket gör det till en utmaning (Belarbi et. al. 2003).
18 3.8 Tagghudingar (Echinodermata)
Tagghudingar är radiellt symmetriska och saknar huvudända, men de flesta kan bilda en tillfällig hjärna för koordinering av rörelse (Moore och Overhill 2006). Till tagghudingar hör bland annat sjöstjärnor, sjögurkor, sjöborrar och ormstjärnor. Tagghudingar har tubformade fötter som skjuter ut från deras överhud. Tubfötterna kan fungera som sensoriska tentakler, användas för respiration, insamling av föda samt rörelse. Tagghudingarnas bindvävnad kan snabbt och reversibelt ändra sin stelhet.
De flesta tagghudingar rör sig långsamt längs med havsbotten, där de samlar in föda via en mun på undersidan (Moore och Overhill 2006). Tagghudingar kan vara samlare, predatorer eller suspensionsätare och tack vare sin radiella symmetri kan de samla mat från alla håll.
Hos de tagghudingar som har armar kan vilken arm som helst bli den ledande armen.
De flesta sjöborrar är växtätande och rör sig långsamt. De är runda eller äggformade och skaffar föda genom att skrapa sjögräs från stenar. Sjögurkorna är långsamma bilateralt symmetriska djur, vilka oftast är depositätare. Exempel på hur en sjögurka, sjöstjärnor och sjöborrar ser ut kan ses i Figur 9.
Figur 9. En sjögurka, sjöstjärnor och sjöborrar (Jllm06 2012, Flower Garden Banks 2014).
Sjögurkor, till vänster, sjöstjärnor och sjöborrar, till höger, är tagghudingar.
19 Flera intressanta föreningar har isolerats från tagghudingar. Till exempel uppvisade sex av åtta triterpenglykosider, vilka isolerades ur sjögurkan Holothuria edulis, hög eller moderat cytotoxicitet (Hoang et. al. 2020). Ett annat exempel är det obearbetade extraktet av sjöstjärnan Acanthaster planci, vilket uppvisade cytotoxiska och apoptosinducerande effekter på den mänskliga bröstcancercellinjen MCF-7 (Mutee et. al. 2012).
4 MÅLBASERAD OCH FENOTYPISK LÄKEMEDELSUPPTÄCKT
Målbaserad läkemedelsupptäckt ersatte till stor del fenotypisk läkemedelsupptäckt för cirka 25 år sedan, eftersom screeningskapaciteten av potentiella läkemedelsmolekyler då kunde ökas (Sams-Dodd 2005). Vid målbaserad läkemedelsupptäckt söks aktiva föreningar genom screening av kemiska bibliotek för förändringar i specifika proteinaktiviteter och vid fenotypisk läkemedelsupptäckt söks önskade fenotyper med hjälp av cell- eller organismbaserade analyser (Eggert 2013). Kemiskt bibliotek avser en samling föreningar som kan utvärderas i en screening (Cordell 2000). I denna avhandling användes en fenotypisk metod, eftersom bioaktivitet söktes med hjälp av cell- och bakterieanalyser.
Vid användandet av fenotypisk läkemedelsupptäckt ses organismen som en svart låda, varför ingen förståelse för sjukdomens bakomliggande orsak eller biologi eller föreningens verksamhetsmekanism krävs (Sams-Dodd 2005). Analyserna utvecklas på basen av vetskap om sjukdomen, kliniskt effektiva läkemedel eller grundläggande biologisk vetskap. Även om det är viktigt att det finns en väldefinierad fenotyp som bas för en screen, är det också viktigt att lämna rum för lyckoträffsupptäckter (Eggert 2013). Inom fenotypisk läkemedelsupptäckt identifieras och definieras först fenotypen som ska studeras, sedan designas och optimeras en analysmetod, varefter det bestäms var screenen ska genomföras. Efter den inledande screeningen väljs de mest intressanta träffmolekylerna (engelska: ”hits”), det vill säga aktiva föreningarna med fastställd struktur, vilka är potentiellt nya och tillgängliga (Cordell 2000).
Samtidigt ignoreras falska positiva träffar (Eggert 2013). Träffmolekylernas kemiska
20 identitet och renhet och huruvida de har en meningsfull dos-respons effekt bekräftas också.
Därefter genomförs flera sekundära analyser där fenotypens specificitet bekräftas och hur träffmolekylen förändrar fenotypen av intresse utreds. Vilken träffmolekyl som väljs för fortsatta undersökningar påverkas också av hur stor chansen är att bestämma dess mål.
Fördelar med fenotypisk läkemedelsupptäckt är att det enda som krävs är en relevant modell med förutspåbar giltighet av sjukdomen, medan ingen förståelse för den molekylära verksamhetsmekanismen behövs (Sams-Dodd 2005). Dessutom kan föreningar som visat aktivitet i fenotypiska analyser effektivare ge upphov till terapeutisk verkan på en viss sjukdom jämfört med sådana som uppvisat aktivitet i målbaserade analyser, eftersom fenotypiska analyser inte är lika artificiella som målbaserade (Swinney och Anthony 2011).
Nackdelar med fenotypisk läkemedelsupptäckt är att inget tydligt förhållande mellan verksamhetsmekanism och biologisk effekt hittas, att det kan vara svårt att effektivt optimera föreningens molekylära egenskaper och att analysernas screeningskapacitet är mindre än målbaserade analysers (Sams-Dodd 2005; Swinney och Anthony 2011).
Vid målbaserad läkemedelsupptäckt är målet att utveckla läkemedel som påverkar endast en gen eller molekylmekanism, för att selektivt kunna behandla den bakomliggande orsaken till sjukdom och samtidigt undvika bieffekter (Sams-Dodd 2005). Organismen ses som en serie av gener och stigar. Målbaserad läkemedelsupptäckt sker i fem steg: identifiering av målet, validering av målet, utveckling av analysmetoder, identifiering av en ledtrådsförening och optimering av ledtrådsföreningen. Med en ledtrådsförening (engelska: ”lead”) avses en förening med väldefinierad renhet, genuint struktur-aktivitetsförhållande för analys av dess mål, väldefinierad minimumstruktur för aktivitet, selektiv aktivitet och potens (Cordell 2000). Vid identifiering av målet identifieras det exakta målet och den specifika patientpopulationen (Sams-Dodd 2005). Vid validering av målet bestäms målets terapeutiska värde hos den specificerade patientpopulationen. Vid utveckling av analysmetoder uttrycks målet i ett analyssystem där screening med hög genomströmning används. Vid ledtrådsidentifikation screenas föreningsbibliotek för att identifiera för målet selektiva föreningar. Vid ledtrådsoptimering optimeras ledtrådsföreningarnas affinitet och selektivitet till målet.
21 Fördelar med målbaserad läkemedelsupptäckt är metodens höga screeningskapacitet samt att det går att formulera enkla, tydliga krav på läkemedlet, vilket möjliggör rationell läkemedelsdesign (Sams-Dodd 2005). Det är också möjligt att använda molekylär- och kemisk vetenskap för att undersöka specifika molekylära hypoteser samt att använda både småmolekylära screeningstrategier och biologiskt baserade tekniker (Swinney och Anthony 2011). Nackdelar är att läkemedel bara kan optimeras mot ett litet antal mål samtidigt och att lösningen på en specifik molekylhypotes inte alltid är relevant för sjukdomsutvecklingen eller ger ett tillräckligt bra terapeutiskt index (Sams-Dodd 2005; Swinney och Anthony 2011). Liksom inom fenotypisk läkemedelsupptäckt krävs också en giltig modell av sjukdomen för att möjliggöra principbevisningsundersökningar (Sams-Dodd 2005).
5 BIOPROSPEKTERING
Bioprospektering innebär insamling och screening av biologiskt material för kommersiella ändamål (Synnes 2007). För en översikt av de olika stegen i bioprospektering se Figur 10. I fråga om läkemedel sker insamlingen av biologiskt material ofta i två steg; det primära steget då små prover tas från ett stort antal arter och det sekundära skedet då större prover tas, vilket sker efter screeningen efter en träff- eller ledtrådsmolekyl (Hunt och Vincent 2006). Efter insamlandet extraheras organismernas vävnader, varefter lösningsmedlet som använts under extraktionen avlägsnas (Beutler 2009). Sedan identifieras de aktiva föreningarna i de extrakt som uppvisat intressant bioaktivitet, varefter föreningarna renas och separeras innan deras struktur klargörs. För att säkerställa föreningarnas bioaktivitet upprepas bioaktivitetsanalyserna av de aktiva föreningarna.
22 Figur 10. Översikt av bioprospekteringsstegen (inspiration till figuren hämtad från Bhatia och Chugh 2015). Bioprospektering inleds med insamling av prover, varefter de aktiva föreningarna identifieras, isoleras och renas. Därefter karakteriseras de aktiva föreningarnas struktur. Efter produktion av de aktiva föreningarna testas deras bioaktivitet ytterligare, varefter den bekräftas. Kommersialisering sker då produktutveckling- och testning slutförts.
Eftersom det finns så många olika användningsområden för läkemedel med ursprung i det marina, bland annat mot bakterier, cancer, svampar, HIV och malaria, och eftersom viljan att hitta nya läkemedel kvarstår, skapas ett tryck på den marina miljön (Synnes 2007). Också
23 tidigare icke-nåbara ekosystem, som hydrotermala öppningar, är nuförtiden utsatta för forskningsaktivitet och bioprospektering. Det finns ändå molekylärbiologiska tekniker som möjliggör hållbar bioprospektering, till exempel genomiska bibliotek, dit genetiskt material med ursprung i marina organismer kan sparas, samt olika sätt att skydda specifika miljöer.
Obligatoriska insamlingsprotokoll och miljöpåverkansbedömningar har införts i ett försök att skydda den marina miljön (Hunt och Vincent 2006). Bland annat ingår det i Norges nationella strategi från 2009, vilken är i kraft i 10-15 år, att regeringen ska garantera hållbara extraktions- och undersökningsmetoder (Norwegian Ministeries 2009). I del 13 av Förenta Nationernas konvention över havslagar ingår det också att länder är skyldiga att skydda och bevara den marina miljön, samt förhindra, minska och kontrollera förorening av den (Förenta Nationerna 2020). Också i Australien har det år 2000 utförts en förfrågan för att reglera insamling av biologiskt material, där krav på att insamlingen inte får påverka arter eller populationer negativt ingår (Voumard 2000). En viktig internationell överenskommelse mellan 196 länder för skydd av biodiversitet är ”The Convention on Biological Diversity”
(CBD 2020). Målet med överenskommelsen är att stoppa förlusten av biodiversitet genom effektiva och akuta åtgärder (Secretariat of CBD 2020). I den senaste strategiska planen för år 2011-2020 ingår bland annat målen att uppnå ett minskat tryck på biodiversiteten, återskapa ekosystem och använda biologiska resurser hållbart. Det är ändå svårt att fastställa effekten som insamling av biologiskt material har på miljön, eftersom information om insamlingsområde, lokal förekomst av organismer och populationers livshistoria inte rapporteras (Hunt och Vincent 2006). Detta är oroväckande, eftersom det ger de insamlande företagen en möjlighet att tänja på gränserna. Ett annat sätt att minska på trycket på miljön är genom utveckling av alternativa tillgångsstrategier till intressanta föreningar, till exempel syntes och odling då det är möjligt (Hunt och Vincent 2006).
Vid screening av material utvärderas de insamlade proverna med hjälp av olika analyser, ofta receptor-, enzym- eller cellbaserade sådana (Cordell 2000). Med hjälp av dataanalys av resultaten urskiljs proverna som uppvisat bioaktivitet, vilka därför undersöks vidare. Efter den primära screeningen fås enbart potentiellt intressanta träffmolekyler. Det är därför viktigt att det är möjligt att samla in tillräckligt med material, eller på annat sätt få tag på tillräckligt
24 av träffmolekylerna, för att kunna genomföra fortsatta biologiska och kemiska undersökningar. Eftersom det ibland inte är möjligt att återskapa den observerade biologiska aktiviteten då en organism samlas in på nytt, är det viktigt att redan från början samla in tillräckligt med material. Det kan dock hända att det inte går att samla in tillräckligt med material för att undersöka en förenings struktur-aktivitetsförhållanden, öka dess potens eller modifiera den kemiskt. Det är dessutom ovanligt att en isolerad naturprodukt i sig själv är biologiskt aktiv, varför den ofta måste modifieras. Dessa faktorer är som tidigare nämnts en stor utmaning vid läkemedelsutveckling på basen av marina organismer.
För att åtskilja cytotoxiska föreningar, som kan maskera andra föreningars aktivitet i en cellbaserad analys, koncentrera föreningar som det finns en mindre mängd av så att de kan testas i en högre effektiv koncentration och för att sålla ut och bortse från väldigt polära eller lipofila föreningar i ett extrakt utförs prefraktionisering (Beutler 2009). Med andra ord så isoleras rena föreningar varefter de delvis karakteriseras, innan de undersöks i bioanalyser.
Efter att organismer har samlats in, måste deras vävnader extraheras för att separera de små molekylerna från biopolymererna (proteiner, cellulosa, kitin och nukleinsyror) (Beutler 2009). För att göra extraktionen snabbare kan torr vävnad malas eller frysas, eventuellt också lyofiliseras. Att frysa vävnader är dock dyrt och i många fall besvärligt. Eftersom valet av lösningsmedel och extraktionsförhållanden beror på molekylerna som ska extraheras och de små molekylerna som ska extraheras kan vara väldigt olika, finns det väldigt få extraktionsstandardtekniker. Den höga salt- och vattenhalten i marina ryggradslösa djurs vävnad medför dessutom särskilda utmaningar. I sektion 7.2. Förberedning av prover inför extraktion, 7.3. Vattenbaserad extraktion och 7.4. Organisk extraktion beskrivs extraktionsmetoderna som användes i denna avhandling.
Efter extraktionen måste lösningsmedlet avlägsnas, för att det extraherade materialets vikt ska kunna fastställas och för att undvika reaktioner som kan förändra beståndsdelarna i lösningen (Beutler 2009). För att göra detta lyofiliseras vätskelösningar, medan organiska lösningsmedel avdunstas med hjälp av en rotavapor. De sista spåren av lösningsmedel kan avlägsnas under högt vakuum.
25 Det är vanligt att förvara molekylbibliotek i dimetylsulfoxid (DMSO), varför det är viktigt att beakta att alla bioanalyser med hjälp av vilka extrakten undersöks har en gränstolerans för DMSO (Beutler 2009). För cellbaserade analyser är toleransgränsen ofta 0,5-1 % av analysvolymen och för biokemiska analyser 5-10 %. I analyserna som användes i denna avhandling var toleransgränsen 0,25 %.
När ett extrakt, eller som i denna avhandling en fraktion, bekräftats uppvisa intressant aktivitet i en bioanalys, måste de aktiva föreningarna identifieras, vilket kan göras med hjälp av en upprepad process av separation och bioanalys; bioanalysguidad separation eller fraktionisering (Beutler 2009). De allmänna stegen i bioanalysguidad separation kan ses i Figur 11. Extraktet uppdelas först i flera fraktioner, varefter ursprungsextraktet samt fraktionerna undersöks (Beutler 2009). I denna avhandling undersöktes enbart fraktionerna, inte ursprungsextraktet. Det önskade resultatet är att en eller flera av fraktionerna uppvisar betydande bioaktivitet. Om ingen av fraktionerna uppvisar aktivitet eller om alla eller de flesta uppvisar låg aktivitet, är separationsmetoden olämplig. Detta kan bero på att föreningarna är instabila eller på att de bundits irreversibelt till kromatografiämnet.
Figur 11. Bioanalysguidad fraktionisering (Koehn och Carter 2005). För att rena en förening krävs ofta flera cykler av fraktionisering. HP20; en adsorberare i fast form, HPLC; hög prestanda vätskekromatografi, IR; infraröd spektroskopi, LC/MS;
vätskekromatografi/masspektrometri, NMR; atomkärnmagnetresonans, UV; ultraviolett.
26 Oftast behövs det fler än ett separationssteg för att rena de aktiva föreningarna (Beutler 2009). Det lönar sig att börja med separering med större partikelstorlek och undvika högprestanda vätskekromatografi (HPLC) som första separationsmetod, eftersom råextrakt kan hopa sig på HPLC kolumnerna. Efter polaritetsseparering kan metoder som flashkromatografi eller gelpermeationskromatografi användas. Som sista steg i reningsprocessen lönar det sig att använda HPLC. För att säkerställa att partiklar och övrigt material som inte elueras skadar HPLC-kolumnen kan provet filtreras innan det injiceras i HPLC instrumentet. Lösningsmedelsförhållandena ska väljas så att alla beståndsdelar i extraktet elueras.
Nästa steg är att klargöra strukturen hos de renade aktiva föreningarna, vilket ofta sker med hjälp av atomkärnsmagnetresonans (NMR) spektroskopi, specifikt med tvådimensionella experiment, till exempel COSY eller NOESY, vilka möjliggör bestämningen av alla väte- och kolatomers bindningar i molekylen (Beutler 2009). Masspektrometri (MS) används också ofta för att med hjälp av exakta massmätningar identifiera föreningens molekylformel.
Med hjälp av dessa två tekniker kan en okänd molekyls struktur ofta bestämmas helt.
Strukturbestämningen blir svårare ju fler atomer molekylen innehåller, eftersom antalet möjliga strukturer då stiger exponentiellt. Övriga tekniker för strukturbestämning, vilka kan vara nödvändiga vid specialtillfällen, kan vara baserade på till exempel ultraviolett eller infraröd strålning eller optisk rotation.
För att identifiera redan tidigare karakteriserade småmolekyler och därigenom undvika resursinvestering i bestämning av strukturen av redan kända molekyler, används olika metoder, varav de effektivaste ofta kombinerar biologi och kemi (Beutler 2009). Detta kallas dereplikation (Corley och Durley 1994). Dereplikation är centralt i fråga om naturprodukter eftersom det finns över 150 000 kända småmolekyler som redan karakteriserats (Beutler 2009). Målet är att kända föreningar ska identifieras före hela NMR datasamlingar har fåtts och analyserats, eller innan en ren aktiv substans har isolerats. För att utföra kemisk dereplikation kan till exempel tekniker som HPLC-MS, HPLC-UV eller HPLC-NMR användas. Dessa ger dock upphov till stora datasamlingar, vilka kan vara utmanande att analysera. Ett annat sätt att genomföra dereplikation är att försöka hitta motsvarande mönster
