7.1 Insamling av organismer
Svampdjur av arten Caulophacus arcticus samlades in av Marbank från tre olika platser under augusti 2020 (Tabell 2). Svampdjuren förvarades i -22 °C i mörker innan de, som senare beskrivet, pulvriserades och extraherades.
37 Tabell 2. Insamlingstidpunkt, -plats, -djup, -metod samt insamlad mängd av svampdjuret Caulophacus arcticus, som undersöktes i denna avhandling.
Art Tidpunkt Koordinater Plats Djup (m) Metod Mängd Prov ID
Material och utrustning som användes för att förbereda proverna inför extraktion kan ses i Tabell 3.
Tabell 3. Material och utrustning som användes för förberedning av proverna inför extraktion.
Material/utrustning Leverantör
Heto PowerDry PL9000 Frystork Thermo Fisher Scientific, MA, USA Heto PowerDry PL6000 Frystork Thermo Fisher Scientific, MA, USA
GM 200 Knivkvarn Retsch GmbH, Tyskland
De på förhand insamlade proverna av Caulophacus arcticus (M21001, M21002 och M21003) vägdes och hackades mekaniskt i mindre bitar. Bitarna lades i eldfasta glasskålar, vilka placerades i frysen innan de frystorkades med hjälp av frystorkarna Heto PowerDry PL9000 och Heto PowerDry PL6000. De frystorkade proverna maldes med hjälp av en knivkvarn (GM 200) och det resulterande pulvret överfördes till tre för de olika proverna separata flaskor, vilka förvarades i frysen (-23 °C).
38 7.3 Vattenbaserad extraktion
Material och utrustning som användes vid vattenbaserad extraktion kan ses i Tabell 4.
Tabell 4. Material och utrustning som användes vid vattenbaserad extraktion.
Material/utrustning Leverantör
Ultrarent vatten Merck KgaA, Tyskland
Multifuge 3 S-R Centrifug Heraeus, Tyskland FreeZone 18 Liter -50 C Console Frystork Labconco, MO, USA
Heto PowerDry PL6000 Frystork Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Det pulvriserade provmaterialet fördelades jämnt i 0,6 l centrifugflaskor. Proven extraherades ett i taget. Ultrarent vatten tillsattes till centrifugflaskorna i förhållandet 10 ml per gram torrt pulver. Suspensionen blandades därefter om och centrifugflaskornas vikt balanserades vid behov med ultrarent vatten, så att vikterna inte skiljde sig från varandra med mer än 5 g, för att inte centrifugens rotor skulle skadas då proverna senare centrifugerades.
Locket till centrifugflaskorna säkrades med en o-ring, varefter suspensionen skakades om för hand innan centrifugflaskorna placerades i kylskåpet (3 °C) i 3 h.
Efter 3 h centrifugerades proverna i 30 min (4600 rpm, 5 °C, acceleration och retardation 5).
Vattenfasen överfördes därefter till en eller flera frystorkningsformar, vilka märktes med provets ID följt av 0-W (till exempel M21001-0-W för prov 1). Nummer 0 står för att provet är uppsamlat från en hel organism och bokstaven W för att det är ett vattenextrakt.
Frystorkningsformen innehållande provet placerades i frysen (-23 °C) över natten.
Ytterligare en extraktion av samma prov utfördes enligt samma princip som tidigare. I den andra extraktionen tillsattes hälften så mycket ultrarent vatten jämfört med vid den första extraktionen och centrifugflaskorna stod i kylskåpet (3 °C) i 30 min i stället för 3 h. Pelletarna som blivit kvar på bottnen av centrifugflaskorna skrapades ur i eldfasta glasformar, vilka märktes med provets ID följt av 0-L (till exempel M21001-0-L för prov 1). Bokstaven L står för lipid. Glasformarna placerades i frysen (-23 °C) över natten.
39 Proverna frystorkades med hjälp av frystorkarna FreeZone 18 Liter -50 C Console och Heto PowerDry PL6000. Proverna måste vara i fryst form innan de frystorkas, eftersom vattnet då avlägsnas på ett skonsammare sätt, vilket bevarar föreningarna i proven. Efter frystorkning överfördes vattenextraktproverna till separata rör och lipidpelletarna till flaskor. Tuberna och flaskorna märktes med provens ID (t.ex. M21001-0-W för vattenextraktet av prov 1 och M21001-0-L för lipidpelleten av prov 1) och förvarades i frysen (-23 °C).
7.4 Organisk extraktion
Material och utrustning som användes vid organisk extraktion kan ses i Tabell 5.
Tabell 5. Material och utrustning som användes vid organisk extraktion.
Material/utrustning Leverantör
Heidolph Labrota Rotavapor Heidolph Instuments GmBH & Co, Tyskland Whatman® filterpapper nr 1
Cat. No. 1001 125
GE Healthcare, Storbritannien
Metanol 20864.320 VWR BDH Chemicals, PA, USA
Metanol 34860-2.5L-M Sigma-Aldrich, MO, USA Diklormetan 34856-2.5L Sigma-Aldrich, MO, USA
För organisk extraktion tillverkades en 1:1 lösning av metanol och diklormetan.
Extraktionslösningen tillsattes till den frystorkade pelleten i förhållandet 10 ml per gram pellet. Blandningen skakades om för att avlägsna eventuella gaser, som kan uppkomma då organiskt material blandas med lösningsmedel, och fick stå i dragskåp i 15 min. Efter 15 min skakades blandningen om igen och placerades i kylskåp (4 °C). Blandningen skakades om ytterligare en gång vid dagens slut och fick stå i kylskåpet (4 °C) till följande dag.
Följande dag skakades blandningen om och filtrerades genom ett Whatman nr. 1 filterpapper under vakuum. Innan provet placerades i filtertratten, fuktades filterpappret med extraktionslösning. Det fasta materialet återfördes till flaskan och extraherades igen med
40 hälften så mycket extraktionsvätska jämfört med vid den första extraktionen. Blandningen fick efter omskakning stå i kylskåpet (4 °C) i 30 min innan den filtrerades på nytt. Filtratet hälldes därefter i en 1 l rundkolv, så att ungefär en tredjedel av kolven fylldes.
Extraktionslösningen avdunstades vid 40 °C under reducerat tryck med hjälp av en rotavapor (Heidolph Labrota Rotavapor). Kolven fylldes på med extraktionslösning med jämna mellanrum. Efter hand, i takt med att extraktionslösningens volym minskade, överfördes lösningen till en 250 ml rundkolv, varefter den överfördes till en 100 ml rundkolv och till sist till en 50 ml rundkolv. Innan lösningen överfördes till 50 ml rundkolven märktes kolven med provets ID (till exempel M21001-0-L för prov 1) och vägdes. Efter att all extraktionslösning avdunstats, vägdes kolven igen och placerades därefter i frysen (-23 °C).
Lipidpelletarna från de tre olika proven extraherades separat.
7.5 Förberedning av prover inför flashfraktionisering
Material och utrustning som användes vid förberedning av prover inför flashfraktionisering kan ses i Tabell 6.
Tabell 6. Material och utrustning som användes vid förberedning av prover inför flashfraktionisering.
Material/utrustning Leverantör
Stuart SB3 Rotator Stuart Equipment, Storbritannien
Heidolph Laborota Rotavapor Heidolph Instruments GmBH & Co, Tyskland Diaion HP-20SS 13615-U Sigma-Aldrich, MO, USA
Hexan 24575.290 VWR BDH Chemicals, PA, USA
90 % metanol Okänd (färdigt blandad)
Vattenextrakten förbereddes för flashfraktionisering genom att först väga upp cirka 5 g vattenextrakt i ett plaströr. De uppvägda mängderna kan ses i Tabell 7. Extraktet löstes upp i 45 ml 90 % metanol och placerades i en rotator (Stuart SB3 Rotator) i 4-5 h. Extrakten
41 centrifugerades sedan (4500 rpm, 18 °C, acceleration och retardation 9) i 20 min, varefter supernatanten hälldes över i en rundkolv. Därefter tillsattes 1,5 g kisel (Diaion HP-20SS) till supernatanten, som sedan avdunstades vid 40 °C under reducerat tryck med hjälp av en rotavapor (Heidolph Labrota Rotavapor).
Tabell 7. Uppvägd mängd vattenextrakt
Prov Rör Mängd (g)
M21001-0-W 1 7,05 M21001-0-W 2 6,11 M21002-0-W 1 6,65 M21002-0-W 2 6,33 M21002-0-W 3 5,7 M21003-0-W 1 6,2 M21003-0-W 2 6,5 M21003-0-W 3 6,16 M21003-0-W 4 5,92
De organiska extrakten av proverna förbereddes för flashfraktionisering genom att först väga upp 1,5 g extrakt i en 100 ml erlenmeyerkolv. Extraktet löstes därefter upp i 60 ml hexan.
Eftersom det fanns mindre än 1,5 g av prov M21001-0-L (1,08 g) löstes provet upp direkt i rundkolven där det förvarats. Det utfördes två skilda extraktioner av prov M21002-0-L, där den andra delen av provet löstes upp direkt i rundkolven av samma orsak (vikt 0,89 g). Det upplösta extraktet hälldes i en separationstratt. Ytterligare 10-15 ml hexan hälldes i erlenmeyerkolven eller rundkolven, som skakades, varefter blandningen hälldes i separationstratten. Detta steg utfördes två gånger. Därefter hälldes 50 ml 90 % metanol i erlenmeyerkolven eller rundkolven, som skakades, innan blandningen hälldes i separationstratten. Separationstratten skakades, och metanolfasen samlades upp i en rundkolv. Ytterligare 50 ml 90 % metanol hälldes därefter i erlenmeyerkolven eller rundkolven, som skakades innan blandningen överfördes till separationstratten och metanolfasen samlades upp i samma rundkolv. Liksom med vattenextrakten tillsattes sedan 1,5 g kisel (Diaion HP-20SS) till rundkolven och lösningsmedlet avdunstades vid 40 °C under reducerat tryck med hjälp av en rotavapor (Heidolph Labrota Rotavapor).
42 7.6 Tillverkning av kolonner inför flashfraktionisering
Material och utrustning som användes tillverkning av kolonner för flashfraktionisering kan ses i Tabell 8.
Tabell 8. Material och utrustning som användes för tillverkning av kolonner för flashfraktionisering.
Material/utrustning Leverantör
Kolonnprocessor VWR International, PA, USA
Biotage® SNAP Cartridge KP-Sil 10 g Biotage, Sverige
Diaion HP-20SS 13615-U Sigma-Aldrich, MO, USA
Ultrarent vatten Merck KgaA, Tyskland
Metanol för flash Okänd (färdigt blandad)
Kolonnerna som skulle användas för flashfraktionisering tillverkades genom att först väga upp 6,5 g kisel (Diaion HP-20SS) i erlenmeyerkolvar, till vilka 75 ml metanol tillsattes. Efter att kolvarna fått stå i 20 min, för att kiseln skulle hinna absorbera metanol, vilket senare underlättar absorption av vatten, avlägsnades metanolen. Kiseln samt den del av metanolen som blivit kvar hälldes i en kolonn (Biotage® SNAP Cartridge KP-Sil 10 g) som fästs i en kolonnprocessor. Erlenmeyerkolven sköljdes ur med ultrarent vatten upprepade gånger tills nästan ingen kisel fanns kvar och kisel/vattenblandningen hälldes i kolonnen i kolonnprocessorn. Kolonnerna förvarades i kylskåpet (4 °C) för att undvika tillväxt av mikrober, ifall en oavsiktlig kontamination skulle ha skett.
7.7 Flashfraktionisering
Material och utrustning som användes vid flashfraktionisering kan ses i Tabell 9.
43 Tabell 9. Material och utrustning som användes vid flashfraktionisering.
Material/utrustning Leverantör
Biotage® HPFC SP4 Flash Purification System Biotage, Sverige Biotage® SNAP Cartridge KP-Sil 10 g Biotage, Sverige
Syncore® Polyvap Büchi, Schweiz
Universal Shaker SM 30 Edmund Bühler GmbH, Tyskland
FreeZone 8L -50 C Labconco Frystork VWR, Norge
Diaion HP-20SS 13615-U Sigma-Aldrich, MO, USA
Metanol 20864.320 VWR BDH Chemicals, PA, USA
Aceton 20067.320 VWR BDH Chemicals, PA, USA
Ultrarent vatten Merch KGaA, Tyskland
Dimetylsulfoxid D4540 Sigma-Aldrich, MO, USA
De förberedda proverna av vattenextrakt och organiskt extrakt flashfraktioniserades med hjälp av ett Biotage® HPFC SP4 Flash Purification System flashfraktioniseringssystem. Den mobila fasen, som användes för flashfraktioniseringen, bestod av en gradient av ultrarent vatten, metanol och aceton, i enlighet med Tabell 10. Flashfraktioniseringen utfördes som en gradientkörning för att separera föreningarna baserat på deras vattenlöslighet och lipofilitet.
Flödeshastigheten var 12 ml/min och varje fraktion samlades in i två min. Innan körningen inleddes balanserades den tidigare förberedda kolonnen med 5:95 (vol:vol) metanol och ultrarent vatten. De på förhand torkade extrakten tillsattes till kolonnen för hand. Eftersom det endast rymdes en begränsad mängd extrakt i kolonnen, utfördes flera körningar av samma prov.
Tabell 10. Gradienten hos den mobila fasen som användes för flashfraktionisering Tid (min) Ultrarent vatten (%) MeOH (%) Aceton (%)
0-6 95 5 0
6-12 75 25 0
12-18 50 50 0
18-24 25 75 0
24-36 0 100 0
36-42 0 50 50
42-54 0 0 100
44 Då proverna körts genom flashfraktioniseringssystemet samlade maskinen upp dem i 27 provrör. Provrören innehöll de åtta olika fraktionerna, i enlighet med Figur 12. Fraktionerna hälldes över i separata polyvaprör, vilka märktes med provets ID och fraktion.
4 8 12 4 4 8
3 7 11 3 3 7
2 6 10 2 6 2 6
1 5 9 1 5 1 5 9
A B C D
Figur 12. Flashfraktioneringssystemets uppsamling av flashfraktioner. Provrör A1-3 innehöll fraktion 1, provrör A4-6 fraktion 2, provrör A7-9 fraktion 3, provrör A10-12 fraktion 4, provrör B1-3 fraktion 5, provrör B4-6 fraktion 6, provrör C1-3 fraktion 7 och de resterande provrören fraktion 8.
Lösningsmedlet avlägsnades från fraktionerna under vakuum med hjälp av en Büchi Syncore polyvapmaskin, varefter fraktionerna löstes upp i dimetylsulfoxid (DMSO). Volymen DMSO beräknades i enlighet med formeln: 𝑡𝑜𝑟𝑟𝑡 𝑟ö𝑟 (𝑚𝑔)−𝑟ö𝑟+𝑓𝑟𝑎𝑘𝑡𝑖𝑜𝑛(𝑚𝑔)
40×100 . Om mängden
DMSO beräknades vara mer än 2 ml, ökades koncentrationen till 80 mg/ml och om den beräknades vara mindre än 200 µl minskades koncentrationen till 20 eller 10 mg/ml. I dessa fall substituerades nummer 40, vilken beskriver en koncentration på 40 mg/ml, i formeln med nummer 80, 20 eller 10. För att lösa upp fraktionerna placerades polyvaprören i en skakningsmaskin (Universal Shaker SM 30) i 1-3 h. De upplösta fraktionerna överfördes till 2 ml cryotuber, vilka förvarades i mörker i frysen (-23 °C).
Fraktionerna överfördes därefter till djupbrunnsplattor, i sådan volym att varje brunn innehöll 1 mg fraktion (12,5 µl av fraktioner med koncentrationen 80 mg/ml, 25 µl av fraktioner med koncentrationen 40 mg/ml och 100 µl av fraktionen med koncentrationen 10 mg/ml). Totalt sex djupbrunnsplattor användes, tre för vattenextrakten och tre för de organiska extrakten, där varje platta innehöll en brunn innehållande varje fraktion.
Djupbrunnsplattorna förvarades i – 80 °C i åtminstone en timme, för att undvika att proverna skulle ”koka” och därmed stänka ut ur plattan vid frystorkning, innan de frystorkades med hjälp av en FreeZone 8L Labconco frystork.
45 8 BIOAKTIVITETSTESTNING
8.1 Cellviabilitet
Material och utrustning som användes vid analys av cellviabilitet kan ses i Tabell 11.
Tabell 11. Material och utrustning som användes vid cellviabilitetsanalys.
Material/utrustning Leverantör
Herasafe biologisk sterilbänk (klass 2) Thermo Fisher Scientific, MA, USA HERACELL VIOS 160i CO2 inkubator Thermo Fisher Scientific, MA, USA Bürker cellräkningskammare VWR International AS, Norge DTX 880 Multimode Detector Beckman Coulter, CA, USA
Heidolph Titramax 1000 Heidolph Instruments GmbH & Co, Tyskland
A2058 (ATCC® CRL-11147TM) LGC Standards, Storbritannien MRC5 (ATCC® CCL-171TM) LGC Standards, Storbritannien MCF-7 (ATCC® HTB-22TM) LGC Standards, Storbritannien MV-4-11 (ATCC® CRL-9591TM) LGC Standards, Storbritannien Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium RPMI-1640 medium R5886-500ML Sigma Aldrich, MO, USA Glutamine stable 200 mM X0551-100 Biowest, Frankrike FBS (Fetal Bovine Serum) S1810-500 Biowest, Frankrike
Gentamycin A2712 Biochrom, Storbritannien
Icke-essentiella aminosyror K0293 Biochrom, Storbritannien
Natriumpyruvat L0473 Biochrom, Storbritannien
NaHCO3 L1713 Biochrom, Storbritannien
DMSO (dimetylsulfoxid) D4540 Sigma Aldrich, MO, USA PBS (Phosphate Buffered Saline)
Trypsin X0930 Biowest, Frankrike
Trypan Blue 0,4 % T8154 Sigma Aldrich, MO, USA
CellTiter 96® Aqueous One Solution Reagent G3581
Promega, WI, USA
46 Allt arbete med celler skedde sterilt i sterilbänk. Alla cellinjer hade odlats på förhand och delades två gånger i veckan så länge de användes. Vid delning trypsinerades cellerna och en del av dem återupplöstes i lämpligt medium (Tabell 12). En del av de återupplösta cellerna överfördes tillsammans med nytt medium till en ny cellkultursflaska, medan resten av cellsuspensionen vid behov kunde användas för analys av cellviabilitet. Inför den första cellviabilitetsanalysen såddes celler av typen A2058 (humant melanom), MRC5 (lungfibroblast, normala celler), MCF-7 (humant bröstadenocarcinom) samt MV-4-11 (bifenotypisk B myelomocytisk leukemi) ut i tre 96-brunnsplattor vardera, totalt 12 plattor.
Cellerna räknades först med hjälp av en Bürker cellräkningskammare under mikroskop, för att ta reda på hur stor volym cellsuspension som skulle tillsättas till brunnarna för att uppnå rätt celltäthet (Tabell 12). Efter utspädning med för cellerna specifikt medium (Tabell 12) tillsattes 100 µl (A2058, MRC5, MCF-7) eller 50 µl (MV-4-11) cellsuspension till varje brunn. Cellerna av typen A2058, MRC5 och MCF-7 inkuberades i 37 °C och 5 % CO2 tills följande dag för att de skulle fästa sig vid brunnarna, medan cellerna av typen MV-4-11 såddes ut samma dag som fraktionerna tillsattes, eftersom de är suspensionsceller.
Tabell 12. Lämplig celltäthet och växtmedium för cellinjerna vars viabilitet analyserades Cellinje Celler/brunn Växtmedium Tillsatser i 500 ml medium
A2058 2000 DMEM 50 ml FBS, 500 µl gentamycin, 5 ml
glutamine stable 200 mM
MRC5 4000 MEM Eagle 50 ml FBS, 500 µl gentamycin, 5 ml glutamine stable 200 mM, 5 ml
MCF-7 2000 icke-essentiella aminosyror, 5 ml
natriumpyruvat, 10 ml NaHCO3
MV-4-11 10 000 RPMI-1641 5 ml glutamine stable 200 mM, 50 ml FBS, 500 µl gentamycin
Innan fraktionerna tillsattes till mikrotiterplattorna löstes de upp i 25 µl DMSO, varefter djupbrunnsplattorna skakades (mha. Heidolph Titramax 1000) i cirka 2 h innan 975 µl ultrarent vatten tillsattes för att uppnå en slutlig koncentration på 1 mg/ml. Plattorna skakades igen innan fraktionerna tillsattes till cellplattorna. För att kontrollera att cellerna växte som de skulle och för att ha ett tal som representerar välmående cellers tillväxt att jämföra med
47 användes en negativ kontroll. För att ha ett tal som representerar döda celler att jämföra med användes en positiv kontroll. Som negativ kontroll användes växtmedium och som positiv kontroll användes växtmedium innehållande 10 % DMSO.
Vid tillsats av fraktioner till mikrotiterplattorna innehållande celler av typen A2058, MRC5 och MCF-7 avlägsnades först det gamla växtmediumet, innan 95 µl nytt växtmedium samt 5 µl fraktion tillsattes. Till MV-4-11 cellerna, av vilka det fanns 50 µl cellsuspension per brunn, tillsattes 45 µl växtmedium samt 5 µl fraktion. Fraktionerna tillsattes i triplikat. Deras testkoncentration var 50 µg/ml. Av den negativa kontrollen tillsattes 100 µl (A2058, MRC5, MCF-7) eller 50 µl (MV-4-11) växtmedium, och av den positiva kontrollen 90 µl (A2058, MRC5, MCF-7) eller 40 µl (MV-4-11) växtmedium och 10 µl DMSO. Cellerna inkuberades därefter i 37 °C och 5 % CO2 i cirka 72 h.
Efter cirka 72 h tillsattes 10 µl Aqueous One Solution Reagent (AQOS) till varje brunn i cellplattorna. Plattorna inkuberades därefter i cirka 1 h i 37 °C och 5 % CO2, MV-4-11 cellerna närmare 4 h. Absorbansen mättes vid 485 nm med hjälp av DTX 880 Multimode Detector. Andelen överlevande celler i procent räknades ut med hjälp av formeln:
% Ö𝑣𝑒𝑟𝑙𝑒𝑣𝑛𝑎𝑑 = (Fraktion−positiv kontroll) 𝑥 100
(Negativ kontroll−positiv kontroll). ”Fraktion”, ”positiv kontroll” och
”Negativ kontroll” ersattes av faktorernas absorbansvärden. En överlevnadsprocent på mindre än 50 % innebär aktivitet, en överlevnadsprocent på 50-60 % ifrågasättningsbar aktivitet och en överlevnadsprocent på över 60 % inaktivitet.
Då resultaten av de inledande cellviabilitetsanalyserna fåtts, testades de fraktioner som uppvisat aktivitet på samma sätt men i koncentrationsserie (50, 25 och 10 µg/ml).
Fraktionerna tillsattes då i duplikat i stället för i triplikat.
8.2 Antibakteriell växtinhiberingsanalys
Material och utrustning som användes vid antibakteriell växtinhiberingsanalys kan ses i Tabell 13.
48 Tabell 13. Material och utrustning som användes vid antibakteriell växtinhiberingsanalys.
Material/utrustning Leverantör
Herasafe biologisk sterilbänk (klass 2) Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Skakande inkubator Heidolph Instruments
GmbH & Co, Tyskland
Victor Multilabel Counter Perkin Elmer, MA, USA
Ultrarent vatten Merck Millipore, Tyskland
Mueller-Hinton (MH) buljong Difco 275730 Okänd
Brain Heart Infusion (BHI) buljong 53286 Sigma Aldrich, MO, USA
Blodagarplattor SUMP mediekök UNN, Norge
Gentamycin A2712 VWR, PA, USA
Bakteriestam Enterococcus faecalis ATCC® 29212 LGC Standards, Storbritannien Bakteriestam Escherichia coli ATCC® 25922 LGC Standards, Storbritannien Bakteriestam Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853 LGC Standards, Storbritannien Bakteriestam Staphylococcus aureus ATCC® 25923 LGC Standards, Storbritannien Bakteriestam Streptococcus agalactiae ATCC® 12386 LGC Standards, Storbritannien
Innan analysen inleddes hade bakterier som förvarats i biofrysen strukits ut på blodagarplattor. Bakterierna hölls på is under hela processen. Blodagarplattorna hade inkuberats över natten i 37 °C, varefter de flyttades till kylskåpet.
Fem olika slags bakterier (E. faecalis, E. coli, S. agalactiae, P. aeruginosa, S. aureus) överfördes från blodagarplattor till 8 ml växtmedium (Tabell 14) i separata sterila erlenmeyerkolvar, varefter bakteriekulturerna inkuberades i separata rör i 37 °C över natten.
Bakteriekulturerna späddes därefter ut till lämplig bakteriedensitet (Tabell 14).
Utspädningen utfördes i tre steg; först överfördes 2 ml bakteriekultur till var sin erlenmeyerkolv innehållande 25 ml växtmedium, varefter bakterierna inkuberades (37 °C, 100 rpm) i 1,5 h (E. faecalis, E. coli, S. agalactiae) eller 2,5 h (P. aeruginosa, S. aureus).
Sedan späddes bakteriesuspensionen först ut 1:100 och därefter 1:10 i lämpligt växtmedium (Tabell 14). Av denna bakteriesuspension pipetterades 50 µl till alla kolumner förutom nummer ett i mikrotiterplattorna och till en eller två rader i kontrollplattan. Kontrollplattan, vilken innehöll gentamycin i koncentrationer från 0,02-16 µg/ml, hade förberetts tidigare.
49 Tabell 14. Lämpligt växtmedium och bakteriedensitet för bakteriestammarna som
analyserades. BHI = Brain Heart Infusion, MH = Mueller-Hinton (MH) broth
Bakteriestam Växtmedium Bakteriedensitet. Colony forming units (CFU)/brunn E. faecalis BHI 0,5 – 3x105 CFU/mL (2500 - 15000 CFU/brunn) E. coli MH 0,5 – 3x105 CFU/mL (2500 - 15000 CFU/brunn) S. agalactiae MH 3 – 7x104 CFU/mL (1500 - 3500 CFU/brunn) P. aeruginosa MH 0,5 – 3x105 CFU/mL (2500 - 15000 CFU/brunn) S. aureus BHI 0,5 – 3x105 CFU/mL (2500 - 15000 CFU/brunn)
Innan fraktionerna tillsattes till mikrotiterplattorna späddes de ut till testkoncentrationens dubbla styrka, det vill säga 200 µg/ml. Fraktionerna tillsattes därefter i duplikat till fem olika mikrotiterplattor. Varje platta innehöll olika bakteriestammar. Av varje fraktion tillsattes 50 µl. För att kontrollera att ingen kontamination av vattnet eller växtmediumet skett, användes en positiv kontroll bestående av ultrarent vatten och växtmedium. För att kontrollera att bakterierna vuxit som de skulle, användes en negativ kontroll, till vilken det tillsattes ultrarent vatten i stället för fraktion. Därför tillsattes 50 µl ultrarent vatten samt 50 µl växtmedium till kolumn ett och 50 µl ultrarent vatten till kolumn 12. Mikrotiterplattorna inkuberades över natten i 37 °C, innan absorbansen avlästes med hjälp av Victor plattläsaren (vid OD600). En absorbans på under 0,05 innebar att den testade fraktionen var aktiv, en absorbans på 0,05-0,09 att den var ifrågasättningsbart aktiv och en absorbans på över 0,09 att den var inaktiv. Absorbansen räknades om till överlevnadsprocent på samma sätt som i cellviabilitetsanalysen. Efter den första antibakteriella växtinhiberingsanalysen testades de fraktioner som uppvisat aktivitet på samma sätt men i koncentrationsserie, i koncentrationerna 100, 50, 25, 10, 5 och 1 µg/ml.
8.3 Analys av biofilmshämning
Material och utrustning som användes vid analys av biofilmshämning kan ses i Tabell 15.
50 Tabell 15. Material och utrustning som användes vid analys av biofilmshämning.
Material/utrustning Leverantör
Herasafe biologisk sterilbänk (klass 2) Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Skakande inkubator Heidolph Instruments GmbH & Co, Tyskland
Ultrarent vatten Merck Millipore, Tyskland
Tryptic soy broth (TSB) 105459 Merck, Tyskland
Blodagarplattor SUMP mediekök UNN, Norge
0.1 % krystallviolett 115940 Merck Millipore, Tyskland
Glukos D9434 Sigma Aldrich, MO, USA
70 % etanol
Staphylococcus epidermidis (RP62A 42-77) ATCC® 35984
Staphylococcus haemolyticus (clinical isolate 8-7A)
Innan analysen inleddes hade bakterier som förvarats i biofrysen strukits ut på blodagarplattor. Bakterierna hölls på is under hela processen. Blodagarplattorna hade inkuberats över natten i 37 °C, varefter de flyttades till kylskåpet.
Fraktionerna som skulle testas späddes ut till testkoncentrationens dubbla styrka, 200 µg/ml, i ultrarent vatten. En skopa bakterier (S. epidermidis) överfördes från blodagarplattan till 5 ml TSB. TSB:n innehållande bakterier inkuberades vid 37 °C under omskakning över natten. Följande dag tillsattes 50 µl av fraktionerna till kolumn 1-9 i triplikat och 50 µl ultrarent vatten till kolumn 10-12 till totalt två mikrotiterplattor.
För utspädning av bakteriekulturer och kontroll tillverkades en blandning av TSB innehållande 1 % glukos i en erlenmeyerkolv. Därefter späddes S. haemolyticus och S.
epidermidis ut 1:100 i glukosberikad TSB. Sedan tillsattes 50 µl utspädd S. epidermidis till kolumn 1-10, 50 µl utspädd S. haemolyticus till kolumn 11 och 50 µl glukosberikat TSB till kolumn 12 i mikrotiterplattan. Kolumn 12 innehöll glukosberikat TSB samt ultrarent vatten, för att kontrollera att ingen kontamination av vatten eller växtmedium skett. Kolumn 11 innehöll en bakteriekontroll bestående av en bakteriestam som inte bildar biofilm (S.
haemolyticus), vilken samtidigt användes för att kontrollera att ingen kontamination av växtmediumet skett samt att det inte fanns något allmänt i växtmediumet som hämmade
51 bildandet av biofilm. Kolumn 10 innehöll den positiva kontrollen, som användes för att kontrollera att biofilm bildades. Mikrotiterplattorna inkuberades vid 37 °C över natten.
Följande dag avlästes först absorbansen för att undvika falska resultat, vilka kan uppstå om fraktionerna dödar alla bakterier i stället för att enbart hämma bildning av biofilm. Sedan hälldes bakteriesuspensionen ut och plattorna bankades mot papper, sköljdes av med vatten och bankades torra innan de inkuberades i 66 °C i 1 h för att fixera biofilmen. Efter fixering tillsattes 70 µl 0,1 % krystallviolett till biofilmerna. Plattorna fick stå i cirka 5 min så att biofilmen skulle hinna färgas, innan krystallviolettlösningen sköljdes av med vatten,
Följande dag avlästes först absorbansen för att undvika falska resultat, vilka kan uppstå om fraktionerna dödar alla bakterier i stället för att enbart hämma bildning av biofilm. Sedan hälldes bakteriesuspensionen ut och plattorna bankades mot papper, sköljdes av med vatten och bankades torra innan de inkuberades i 66 °C i 1 h för att fixera biofilmen. Efter fixering tillsattes 70 µl 0,1 % krystallviolett till biofilmerna. Plattorna fick stå i cirka 5 min så att biofilmen skulle hinna färgas, innan krystallviolettlösningen sköljdes av med vatten,