Målbaserad läkemedelsupptäckt ersatte till stor del fenotypisk läkemedelsupptäckt för cirka 25 år sedan, eftersom screeningskapaciteten av potentiella läkemedelsmolekyler då kunde ökas (Sams-Dodd 2005). Vid målbaserad läkemedelsupptäckt söks aktiva föreningar genom screening av kemiska bibliotek för förändringar i specifika proteinaktiviteter och vid fenotypisk läkemedelsupptäckt söks önskade fenotyper med hjälp av cell- eller organismbaserade analyser (Eggert 2013). Kemiskt bibliotek avser en samling föreningar som kan utvärderas i en screening (Cordell 2000). I denna avhandling användes en fenotypisk metod, eftersom bioaktivitet söktes med hjälp av cell- och bakterieanalyser.
Vid användandet av fenotypisk läkemedelsupptäckt ses organismen som en svart låda, varför ingen förståelse för sjukdomens bakomliggande orsak eller biologi eller föreningens verksamhetsmekanism krävs (Sams-Dodd 2005). Analyserna utvecklas på basen av vetskap om sjukdomen, kliniskt effektiva läkemedel eller grundläggande biologisk vetskap. Även om det är viktigt att det finns en väldefinierad fenotyp som bas för en screen, är det också viktigt att lämna rum för lyckoträffsupptäckter (Eggert 2013). Inom fenotypisk läkemedelsupptäckt identifieras och definieras först fenotypen som ska studeras, sedan designas och optimeras en analysmetod, varefter det bestäms var screenen ska genomföras. Efter den inledande screeningen väljs de mest intressanta träffmolekylerna (engelska: ”hits”), det vill säga aktiva föreningarna med fastställd struktur, vilka är potentiellt nya och tillgängliga (Cordell 2000).
Samtidigt ignoreras falska positiva träffar (Eggert 2013). Träffmolekylernas kemiska
20 identitet och renhet och huruvida de har en meningsfull dos-respons effekt bekräftas också.
Därefter genomförs flera sekundära analyser där fenotypens specificitet bekräftas och hur träffmolekylen förändrar fenotypen av intresse utreds. Vilken träffmolekyl som väljs för fortsatta undersökningar påverkas också av hur stor chansen är att bestämma dess mål.
Fördelar med fenotypisk läkemedelsupptäckt är att det enda som krävs är en relevant modell med förutspåbar giltighet av sjukdomen, medan ingen förståelse för den molekylära verksamhetsmekanismen behövs (Sams-Dodd 2005). Dessutom kan föreningar som visat aktivitet i fenotypiska analyser effektivare ge upphov till terapeutisk verkan på en viss sjukdom jämfört med sådana som uppvisat aktivitet i målbaserade analyser, eftersom fenotypiska analyser inte är lika artificiella som målbaserade (Swinney och Anthony 2011).
Nackdelar med fenotypisk läkemedelsupptäckt är att inget tydligt förhållande mellan verksamhetsmekanism och biologisk effekt hittas, att det kan vara svårt att effektivt optimera föreningens molekylära egenskaper och att analysernas screeningskapacitet är mindre än målbaserade analysers (Sams-Dodd 2005; Swinney och Anthony 2011).
Vid målbaserad läkemedelsupptäckt är målet att utveckla läkemedel som påverkar endast en gen eller molekylmekanism, för att selektivt kunna behandla den bakomliggande orsaken till sjukdom och samtidigt undvika bieffekter (Sams-Dodd 2005). Organismen ses som en serie av gener och stigar. Målbaserad läkemedelsupptäckt sker i fem steg: identifiering av målet, validering av målet, utveckling av analysmetoder, identifiering av en ledtrådsförening och optimering av ledtrådsföreningen. Med en ledtrådsförening (engelska: ”lead”) avses en förening med väldefinierad renhet, genuint struktur-aktivitetsförhållande för analys av dess mål, väldefinierad minimumstruktur för aktivitet, selektiv aktivitet och potens (Cordell 2000). Vid identifiering av målet identifieras det exakta målet och den specifika patientpopulationen (Sams-Dodd 2005). Vid validering av målet bestäms målets terapeutiska värde hos den specificerade patientpopulationen. Vid utveckling av analysmetoder uttrycks målet i ett analyssystem där screening med hög genomströmning används. Vid ledtrådsidentifikation screenas föreningsbibliotek för att identifiera för målet selektiva föreningar. Vid ledtrådsoptimering optimeras ledtrådsföreningarnas affinitet och selektivitet till målet.
21 Fördelar med målbaserad läkemedelsupptäckt är metodens höga screeningskapacitet samt att det går att formulera enkla, tydliga krav på läkemedlet, vilket möjliggör rationell läkemedelsdesign (Sams-Dodd 2005). Det är också möjligt att använda molekylär- och kemisk vetenskap för att undersöka specifika molekylära hypoteser samt att använda både småmolekylära screeningstrategier och biologiskt baserade tekniker (Swinney och Anthony 2011). Nackdelar är att läkemedel bara kan optimeras mot ett litet antal mål samtidigt och att lösningen på en specifik molekylhypotes inte alltid är relevant för sjukdomsutvecklingen eller ger ett tillräckligt bra terapeutiskt index (Sams-Dodd 2005; Swinney och Anthony 2011). Liksom inom fenotypisk läkemedelsupptäckt krävs också en giltig modell av sjukdomen för att möjliggöra principbevisningsundersökningar (Sams-Dodd 2005).
5 BIOPROSPEKTERING
Bioprospektering innebär insamling och screening av biologiskt material för kommersiella ändamål (Synnes 2007). För en översikt av de olika stegen i bioprospektering se Figur 10. I fråga om läkemedel sker insamlingen av biologiskt material ofta i två steg; det primära steget då små prover tas från ett stort antal arter och det sekundära skedet då större prover tas, vilket sker efter screeningen efter en träff- eller ledtrådsmolekyl (Hunt och Vincent 2006). Efter insamlandet extraheras organismernas vävnader, varefter lösningsmedlet som använts under extraktionen avlägsnas (Beutler 2009). Sedan identifieras de aktiva föreningarna i de extrakt som uppvisat intressant bioaktivitet, varefter föreningarna renas och separeras innan deras struktur klargörs. För att säkerställa föreningarnas bioaktivitet upprepas bioaktivitetsanalyserna av de aktiva föreningarna.
22 Figur 10. Översikt av bioprospekteringsstegen (inspiration till figuren hämtad från Bhatia och Chugh 2015). Bioprospektering inleds med insamling av prover, varefter de aktiva föreningarna identifieras, isoleras och renas. Därefter karakteriseras de aktiva föreningarnas struktur. Efter produktion av de aktiva föreningarna testas deras bioaktivitet ytterligare, varefter den bekräftas. Kommersialisering sker då produktutveckling- och testning slutförts.
Eftersom det finns så många olika användningsområden för läkemedel med ursprung i det marina, bland annat mot bakterier, cancer, svampar, HIV och malaria, och eftersom viljan att hitta nya läkemedel kvarstår, skapas ett tryck på den marina miljön (Synnes 2007). Också
23 tidigare icke-nåbara ekosystem, som hydrotermala öppningar, är nuförtiden utsatta för forskningsaktivitet och bioprospektering. Det finns ändå molekylärbiologiska tekniker som möjliggör hållbar bioprospektering, till exempel genomiska bibliotek, dit genetiskt material med ursprung i marina organismer kan sparas, samt olika sätt att skydda specifika miljöer.
Obligatoriska insamlingsprotokoll och miljöpåverkansbedömningar har införts i ett försök att skydda den marina miljön (Hunt och Vincent 2006). Bland annat ingår det i Norges nationella strategi från 2009, vilken är i kraft i 10-15 år, att regeringen ska garantera hållbara extraktions- och undersökningsmetoder (Norwegian Ministeries 2009). I del 13 av Förenta Nationernas konvention över havslagar ingår det också att länder är skyldiga att skydda och bevara den marina miljön, samt förhindra, minska och kontrollera förorening av den (Förenta Nationerna 2020). Också i Australien har det år 2000 utförts en förfrågan för att reglera insamling av biologiskt material, där krav på att insamlingen inte får påverka arter eller populationer negativt ingår (Voumard 2000). En viktig internationell överenskommelse mellan 196 länder för skydd av biodiversitet är ”The Convention on Biological Diversity”
(CBD 2020). Målet med överenskommelsen är att stoppa förlusten av biodiversitet genom effektiva och akuta åtgärder (Secretariat of CBD 2020). I den senaste strategiska planen för år 2011-2020 ingår bland annat målen att uppnå ett minskat tryck på biodiversiteten, återskapa ekosystem och använda biologiska resurser hållbart. Det är ändå svårt att fastställa effekten som insamling av biologiskt material har på miljön, eftersom information om insamlingsområde, lokal förekomst av organismer och populationers livshistoria inte rapporteras (Hunt och Vincent 2006). Detta är oroväckande, eftersom det ger de insamlande företagen en möjlighet att tänja på gränserna. Ett annat sätt att minska på trycket på miljön är genom utveckling av alternativa tillgångsstrategier till intressanta föreningar, till exempel syntes och odling då det är möjligt (Hunt och Vincent 2006).
Vid screening av material utvärderas de insamlade proverna med hjälp av olika analyser, ofta receptor-, enzym- eller cellbaserade sådana (Cordell 2000). Med hjälp av dataanalys av resultaten urskiljs proverna som uppvisat bioaktivitet, vilka därför undersöks vidare. Efter den primära screeningen fås enbart potentiellt intressanta träffmolekyler. Det är därför viktigt att det är möjligt att samla in tillräckligt med material, eller på annat sätt få tag på tillräckligt
24 av träffmolekylerna, för att kunna genomföra fortsatta biologiska och kemiska undersökningar. Eftersom det ibland inte är möjligt att återskapa den observerade biologiska aktiviteten då en organism samlas in på nytt, är det viktigt att redan från början samla in tillräckligt med material. Det kan dock hända att det inte går att samla in tillräckligt med material för att undersöka en förenings struktur-aktivitetsförhållanden, öka dess potens eller modifiera den kemiskt. Det är dessutom ovanligt att en isolerad naturprodukt i sig själv är biologiskt aktiv, varför den ofta måste modifieras. Dessa faktorer är som tidigare nämnts en stor utmaning vid läkemedelsutveckling på basen av marina organismer.
För att åtskilja cytotoxiska föreningar, som kan maskera andra föreningars aktivitet i en cellbaserad analys, koncentrera föreningar som det finns en mindre mängd av så att de kan testas i en högre effektiv koncentration och för att sålla ut och bortse från väldigt polära eller lipofila föreningar i ett extrakt utförs prefraktionisering (Beutler 2009). Med andra ord så isoleras rena föreningar varefter de delvis karakteriseras, innan de undersöks i bioanalyser.
Efter att organismer har samlats in, måste deras vävnader extraheras för att separera de små molekylerna från biopolymererna (proteiner, cellulosa, kitin och nukleinsyror) (Beutler 2009). För att göra extraktionen snabbare kan torr vävnad malas eller frysas, eventuellt också lyofiliseras. Att frysa vävnader är dock dyrt och i många fall besvärligt. Eftersom valet av lösningsmedel och extraktionsförhållanden beror på molekylerna som ska extraheras och de små molekylerna som ska extraheras kan vara väldigt olika, finns det väldigt få extraktionsstandardtekniker. Den höga salt- och vattenhalten i marina ryggradslösa djurs vävnad medför dessutom särskilda utmaningar. I sektion 7.2. Förberedning av prover inför extraktion, 7.3. Vattenbaserad extraktion och 7.4. Organisk extraktion beskrivs extraktionsmetoderna som användes i denna avhandling.
Efter extraktionen måste lösningsmedlet avlägsnas, för att det extraherade materialets vikt ska kunna fastställas och för att undvika reaktioner som kan förändra beståndsdelarna i lösningen (Beutler 2009). För att göra detta lyofiliseras vätskelösningar, medan organiska lösningsmedel avdunstas med hjälp av en rotavapor. De sista spåren av lösningsmedel kan avlägsnas under högt vakuum.
25 Det är vanligt att förvara molekylbibliotek i dimetylsulfoxid (DMSO), varför det är viktigt att beakta att alla bioanalyser med hjälp av vilka extrakten undersöks har en gränstolerans för DMSO (Beutler 2009). För cellbaserade analyser är toleransgränsen ofta 0,5-1 % av analysvolymen och för biokemiska analyser 5-10 %. I analyserna som användes i denna avhandling var toleransgränsen 0,25 %.
När ett extrakt, eller som i denna avhandling en fraktion, bekräftats uppvisa intressant aktivitet i en bioanalys, måste de aktiva föreningarna identifieras, vilket kan göras med hjälp av en upprepad process av separation och bioanalys; bioanalysguidad separation eller fraktionisering (Beutler 2009). De allmänna stegen i bioanalysguidad separation kan ses i Figur 11. Extraktet uppdelas först i flera fraktioner, varefter ursprungsextraktet samt fraktionerna undersöks (Beutler 2009). I denna avhandling undersöktes enbart fraktionerna, inte ursprungsextraktet. Det önskade resultatet är att en eller flera av fraktionerna uppvisar betydande bioaktivitet. Om ingen av fraktionerna uppvisar aktivitet eller om alla eller de flesta uppvisar låg aktivitet, är separationsmetoden olämplig. Detta kan bero på att föreningarna är instabila eller på att de bundits irreversibelt till kromatografiämnet.
Figur 11. Bioanalysguidad fraktionisering (Koehn och Carter 2005). För att rena en förening krävs ofta flera cykler av fraktionisering. HP20; en adsorberare i fast form, HPLC; hög prestanda vätskekromatografi, IR; infraröd spektroskopi, LC/MS;
vätskekromatografi/masspektrometri, NMR; atomkärnmagnetresonans, UV; ultraviolett.
26 Oftast behövs det fler än ett separationssteg för att rena de aktiva föreningarna (Beutler 2009). Det lönar sig att börja med separering med större partikelstorlek och undvika högprestanda vätskekromatografi (HPLC) som första separationsmetod, eftersom råextrakt kan hopa sig på HPLC kolumnerna. Efter polaritetsseparering kan metoder som flashkromatografi eller gelpermeationskromatografi användas. Som sista steg i reningsprocessen lönar det sig att använda HPLC. För att säkerställa att partiklar och övrigt material som inte elueras skadar HPLC-kolumnen kan provet filtreras innan det injiceras i HPLC instrumentet. Lösningsmedelsförhållandena ska väljas så att alla beståndsdelar i extraktet elueras.
Nästa steg är att klargöra strukturen hos de renade aktiva föreningarna, vilket ofta sker med hjälp av atomkärnsmagnetresonans (NMR) spektroskopi, specifikt med tvådimensionella experiment, till exempel COSY eller NOESY, vilka möjliggör bestämningen av alla väte- och kolatomers bindningar i molekylen (Beutler 2009). Masspektrometri (MS) används också ofta för att med hjälp av exakta massmätningar identifiera föreningens molekylformel.
Med hjälp av dessa två tekniker kan en okänd molekyls struktur ofta bestämmas helt.
Strukturbestämningen blir svårare ju fler atomer molekylen innehåller, eftersom antalet möjliga strukturer då stiger exponentiellt. Övriga tekniker för strukturbestämning, vilka kan vara nödvändiga vid specialtillfällen, kan vara baserade på till exempel ultraviolett eller infraröd strålning eller optisk rotation.
För att identifiera redan tidigare karakteriserade småmolekyler och därigenom undvika resursinvestering i bestämning av strukturen av redan kända molekyler, används olika metoder, varav de effektivaste ofta kombinerar biologi och kemi (Beutler 2009). Detta kallas dereplikation (Corley och Durley 1994). Dereplikation är centralt i fråga om naturprodukter eftersom det finns över 150 000 kända småmolekyler som redan karakteriserats (Beutler 2009). Målet är att kända föreningar ska identifieras före hela NMR datasamlingar har fåtts och analyserats, eller innan en ren aktiv substans har isolerats. För att utföra kemisk dereplikation kan till exempel tekniker som HPLC-MS, HPLC-UV eller HPLC-NMR användas. Dessa ger dock upphov till stora datasamlingar, vilka kan vara utmanande att analysera. Ett annat sätt att genomföra dereplikation är att försöka hitta motsvarande mönster
27 i föreningars kromatografiska diagram som hos redan kända standardföreningar. I denna avhandling användes UPHLC-HR-MS för att identifiera eventuellt bioaktiva metaboliter och bestämma deras elementärsammansättningar.
Det finns också flera klasser av föreningar som inte är önskvärda ledtrådsmolekyler, till exempel tanniner, forbolestrar, saponiner, anjoniska polysackarider och katjoniska polymeriska alkylpyridiner (Beutler 2009). Det är viktigt att vara medveten om dessa, för att inte i onödan undersöka föreningar som uppvisar aktivitet i bioanalyser, men som ändå inte är användbara som ledtrådsmolekyler.
6 KROMATOGRAFISKA, SPEKTROMETRISKA OCH -SKOPISKA
ANALYSMETODER
Det finns ett stort urval av kromatografiska metoder som kan användas till att separera föreningar samt spektrometriska och -skopiska analysmetoder som kan användas för insamling av analytisk information om föreningar. Här beskrivs några av de vanligaste;
HPLC, MS, NMR spektroskopi och flashkromatrografi. Flashkromatografi används för att snabbt förbättra ett provs renhet till en acceptabel nivå, HPLC för att separera föreningar från varandra, MS för att bestämma en förenings struktur och sammansättning och NMR spektroskopi för att se hur atomerna är kopplade till varandra (Stevens Jr. och Hill 2009;
Wolfender 2009; Holzgrabe 2010; Seger et. al. 2013). HPLC i kombination med NMR eller MS eller MS ensamt kan dessutom användas för dereplikation (Wolfender 2009, Beutler 2009). Dessutom behandlas ESI, som är den vanligaste joniseringsmetoden, vilken ofta används som gränssnitt mellan LC och MS (De Vijlder et. al. 2018). I denna avhandling användes, som tidigare nämnts, UHPLC-HR-MS för identifikation av eventuellt bioaktiva föreningar och klargöring av deras elementärsammansättningar. Dessutom användes flashkromatografi för att fraktionisera vatten- och lipidextrakten av Caulophacus arcticus.
28 6.1 Flashkromatografi (FC)
Flashkromatografi (FC) används oftast för att snabbt fraktionera råextrakt eller grovt renade fraktioner, men lika bra resolution eller reproducerbarhet som hos HPLC förväntas inte, utan tekniken används snarast för att snabbt förbättra provens renhet till en acceptabel nivå (Stevens Jr. och Hill 2009; Bucar et. al. 2013). Vid FC används ofta lägre tryck och högre flödeshastighet än vid HPLC, vilket möljiggör separering av milligram upp till hundratals gram material (Vizcarra 2018). Den rörliga fasen spolas genom den stationära fasen i en tätt sluten glaskolumn eller genom färdigt packade patroner med hjälp av kväve eller sammanpressad luft (Bucar et. al. 2013). FC är en typ av vätskekromatografi, vilket innebär att komponenter i den rörliga fasen skiljs åt på basen av deras olika migrationshastigheter då de flödar genom en kolumn fylld med fasta partiklar (Riley 1996, Vizcarra 2018). Vid FC kan en mindre partikelstorlek än vid kromatografi med öppna kolumner användas, vilket ökar på pikarnas resolution (Bucar et. al. 2013). Oftast löses proven upp i en minimal mängd passande lösningsmedel och laddas som våta i kolonnen (Stevens Jr. och Hill 2009). För mycket lösningsmedel kan leda till att banden breddas, vilket leder till att resolutionen minskar. Som lösningsmedel för våtladdning används oftast CH2Cl2 och aceton, men också lösningsmedel med lägre polaritet kan användas. Proven tillsätts så jämnt som möjligt till kolonnens topp. Ett annat alternativ för kolonnladdning är att torka proven på kiselgel.
Beroende på kolonn placeras kiseln i kolonnen på olika sätt. Kiseln har ofta en bestämd partikelstorlek; oftast 40-63 µm (Vizcarra 2018). För en beskrivning av flashfraktioniseringsmetoden som användes i denna avhandling, se sektion 7.5. Förberedning av prover inför flashfraktionisering, 7.6. Tillverkning av kolonner inför flashfraktionisering och 7.7. Flashfraktionisering.
29 6.2 Högprestanda vätskekromatografi (HPLC)
HPLC är en lämplig metod för snabb bearbetning av prover som innehåller ett flertal komponenter, där andelen komponenter av intresse är liten (Sasidharan et. al. 2011). Så är ofta fallet med biologiskt aktiva föreningar. Dessutom är HPLC en robust och mer eller mindre universell separationsteknik, med hjälp av vilken både opolära och polära föreningar kan separeras (Seger et. al. 2013). HPLC används, förutom för profilering av naturprodukter, också för kvantitativa analyser och kvalitetskontroll (Wolfender 2009). HPLC instrument består i allmänhet av en pump för tillförsel av lösningsmedel, en provinförningsmekanism (till exempel en autosampler eller en manuell injektionsventil), en analytisk kolumn, en skyddskolumn, en detektor och en inspelare eller printer (Sasidharan et. al. 2011).
Partikelstorleken i kolumnen är vanligen 2,5-5 µm för HPLC och under 2 µm för UHPLC (Walter och Andrews 2014). HPLC kan som tidigare nämnts kombineras med andra spektrometriska tekniker, till exempel NMR spektroskopi, MS, eller ultraviolett-synlig spektrometri (UV/VIS) (Seger et. al. 2013).
Som tidigare nämnts är principen bakom vätskekromatografi (LC) är att skilja åt komponenter i ett lösningsmedel (rörlig fas) på basen av deras olika migrationshastigheter då de flödar genom en kolumn som fyllts med fasta partiklar (stationär fas) (Riley 1996).
Hur väl ämnena åtskiljs beror därför till största delen på valet av stationär fas och rörlig fas (Sasidharan et. al. 2011). Den rörliga fasen flödar genom eller över den stationära fasen med hjälp av tryckskillnaderna som uppstår i kolumnen (Riley 1996). Eftersom de olika föreningarna i lösningsmedlet binds med olika styrkor till den stationära fasen (med vätebindningar, van der Waal’s krafter, elektrostatiska krafter eller hydrofobiska krafter), rör de sig med olika hastighet genom kolumnen och kan sedan, då de elueras ur kolumnen, detekteras vid olika tidpunkter, eller retentionstider. Föreningarnas retentionstider beror förutom på interaktioner mellan föreningarna och den stationära fasen också på interaktioner mellan de olika lösta föreningarna, mellan föreningarna och den rörliga fasen och på interaktioner mellan den rörliga och den stationära fasen. I kromatogrammet, som fås som resultat av HPLC körningen, har varje förening en karakteriserbar pik under bestämda
30 kromatografiska förhållanden (Sasidharan et. al. 2011). Vid optimering av HPLC körningen är målet att föreningen av intresse ska kunna detekteras som en ren pik, utan överlappningar av andra pikar, och med en rimlig retentionstid. För att optimera separationen väljs olika kombinationer av rörlig fas, stationär fas, flödeshastighet och detektorer samt kolumner med varierande fysiska egenskaper.
Innan HPLC-analysen kan genomföras är det viktigt att råmaterialet helt löses upp i ett passande lösningsmedel (Sasidharan et. al. 2011). Valet av lösningsmedel kan signifikant påverka hur väl isoleringen av naturmaterial lyckas. Eftersom många naturprodukter innehåller betydande nivåer starkt bindande material, som kan försämra analytiska kolumners funktion på lång sikt, lönar det sig att använda en skyddskolumn. Vid användning av en opolär kolumn riskeras bindning av opolära föreningar, medan användning av en polär kolumn riskerar bindning av polära föreningar.
HPLC kan som tidigare nämnts kombineras med olika spektrometriska tekniker, till exempel MS. Då HPLC kombineras med MS fås en utmärkt känslighet och selektivitet vid analys av naturprodukter (Wolfender 2009). HPLC-MS används förutom för dereplikation och profilering av råextrakt också för att specifikt detektera och kvantifiera naturprodukter.
HPLC-MS är en väldigt användbar och mångsidig detektionsmetod. Dessutom kan de flesta joniseringsmetoder under atmosfäriskt tryck, vilka fungerar som gränssnitt mellan HPLC och MS, jonisera de flesta naturprodukter så länge rätt förhållanden används.
6.3 Masspektrometri (MS)
Masspektrometri har ett brett användningsområde, eftersom det går att detektera ett nästan oändligt antal olika molekyler med hjälp av metoden och eftersom den har en hög känslighet och produktionstakt (De Vijlder et. al. 2018). Dessutom krävs en väldigt liten mängd av provet som ska analyseras (Bouslimani et. al. 2014). Dessa fördelaktiga egenskaper gör också att datan som fås ur en MS analys är väldigt omfattande och komplex, varför analyterna av intresse måste urskiljas från datan (De Vijlder et. al. 2018). Eftersom MS är lätt att