Examinator: Dick Wågsäter
Institutionen för medicinsk cellbiologi.
E-post: Dick.Wagsater@mcb.uu.se
Institutionen för medicinsk cellbiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15 hp
Comparison and optimization of May-Grunwald Giemsa and May-Grunwald Giemsa Quick Stain for morphological assessment of pleural and ascites effusions
Hanna Björnsson
2 Abstract
Introduction: Effusion cytology can be performed for the purpose of diagnosis, treatment, and prognosis of malignant disease. A common analysis of effusion cytology samples is the May Grunwald Giemsa stain.
Aim: The aim of the study was to compare May Grunwald Giemsa stain and May Grunwald Giemsa Quick Stain in order to determine the best quality stain and suggest ways to improve the current staining protocol.
Materials and Methods: The methods used in this study are the routine laboratory’s standard procedures for May-Grunwald Giemsa stain and May-Grunwald Giemsa Quick Stain but with adapted washing steps that investigates the effect of tap water, distilled water, and phosphate buffer on stain quality. Two pleural effusion samples were stained in the initial experiment and two pleural effusions and one ascites sample in the second experiment.
Results and Conclusion:
All samples gave a greater score when stained with May-Grunwald Giemsa Quick Stain compared to traditional May-Grunwald Giemsa stain. For the traditional May-Grunwald Giemsa, the use of any of the three phosphate buffers scores higher than the routine washing where tap water is used. In conclusion, it would be of benefit to further investigate and implement phosphate buffer in traditional staining or proceed with the May-Grunwald Quick Stain for all pleural and ascites effusions.
Keywords: Fine-needle aspiration cytology, MGG, non-gynaecological cytology, rapid on- site evaluation staining, Romanowsky staining
3 Populärvetenskaplig sammanfattning
Finnålsaspirat från vätskeansamlingar i kroppens håligheter kan undersökas cytologiskt vid utredning av misstänkt malign sjukdom för att ställa diagnos och vägleda gällande prognos och behandling av eventuell cancersjukdom. Syftet med denna studie var dels att jämföra den traditionella färgmetoden May-Grünwald Giemsa (MGG) mot sin snabbare motsvarighet May Grunwald Giemsa Quick Stain (MGG QS) och att kunna ge förslag till metodförbättring.
Detta för att kunna avgöra vilken färgmetod som ger bäst kvalité gällande graden av detaljrikedom samt nyanser på de infärgade cellerna. Provmaterialet som användes var kvarvarande material från redan analyserade patientprover av vätska från lungsäcken (pleuravätska) samt vätska från buken (ascites).
Redan etablerade färgningsrutiner användes för MGG och MGG QS bortsett från att
sköljningsmediet och spädningen av färglösning varierades för att undersöka hur kranvatten, destillerat vatten och fosfatbuffertar i olika steg i färgningsprocessen påverkade slutresultatet.
Studien utfördes i två delar där små skillnader undersöktes inledningsvis och större skillnader i en senare del där även fosfatbuffert av olika pH testades.
Resultaten visade att snabbfärgningen MGG QS var bättre än traditionella MGG när preparaten färgades enligt laboratoriets rutiner. MGG med sköljning i kranvatten kunde tydligt särskiljas från övriga metoder, vid användning av fosfatbuffert för MGG såg preparaten bättre ut vilket således minskade skillnaderna gentemot MGG QS. För
snabbfärgningen hade preparaten ungefär samma kvalité oberoende av sköljningsmediet.
Slutsatsen är att färgningsmetoden kan förbättras antingen genom att använda fosfatbuffert till MGG eller att övergå till den snabbare metoden MGG QS.
4 Introduktion
Den internationella incidensen av cancersjukdom har ökat i takt med en åldrande
befolkning[1]. I Sverige beräknas nu var tredje person få en cancerdiagnos någon gång under sin livstid1. Den stigande incidensen av cancer påverkas dock i mindre grad av den ökade medellivslängden än flertalet andra sjukdomar. Detta eftersom cancer generellt upptäcks tidigare i livet än exempelvis hjärt- och kärlsjukdom, även om stora skillnader i debutålder förekommer mellan olika cancerformer[2].
Dessa skillnader mellan cancerformer resulterar även i könsskillnader eftersom de vanligaste cancerformerna hos respektive kön, prostatacancer hos män och bröstcancer hos kvinnor, generellt debuterar vid olika tider i livet. Bröstcancer uppträder generellt vid en lägre ålder än prostatacancer varpå ökad incidens av cancer till följd av den stigande medellivslängden kommer vara mer framträdande hos män. Antalet cancerfall förutspås kunna öka med upp till 50% för män samt 27% hos kvinnor fram till år 2050. Att cancerincidensen ökar beror dock inte enbart på den åldrande befolkningen och invånarantalet utan även på att fler cancerfall upptäcks samt diagnosticeras i allt tidigare skede. Detta till följd av förbättringar och tillämpningar av nya diagnostiska metoder och screeningar för vanliga cancerformer[2].
Maligna sjukdomar är en av orsakerna till vätskeutgjutning av kroppsvätska vilket kan orsaka vätskeansamlingar, effusioner, i flera av kroppens hålrum, däribland i lungsäcken, bukhålan och även kring hjärtat. Cytologisk provtagning av dessa vätskeansamlingar kan medverka till diagnostik, prognos och behandling av cancersjukdom i de fall där vätskeutgjutningen orsakats av en lokal eller metastaserad malignitet
1 https://www.socialstyrelsen.se/globalassets/sharepoint-dokument/artikelkatalog/statistik/2018-6-10.pdf Cancer i siffror 2018, ISBN: 978-91-88161-18-5
2018-6-10 (Socialstyrelsens artikelnummer)
5 Pleuravätska
Pleuravätska kan ackumuleras vid vanligt förekommande tillstånd som hjärtsvikt och infektioner och kan då ge upphov till pleurala vätskeansamlingar av icke-malign typ. Men även fortskriden lungcancer, bröstcancer och lymfom samt andra cancerformer som
metastaserat kan ge upphov till så kallade maligna pleurala effusioner (MPE)[3,4]. Tidigare studier har visat att man hos 15% av patienter som deltagit i studier post mortem och som innehaft någon form av cancerdiagnos kunde påvisa maligna celler i pleuravätskan[4].
Vid uppkomsten av pleural effusion innebär det att en vätskeansamling bildats i hålrummet mellan pleurans inre membran pleura viscerale som bekläder lungan och det yttre membranet pleura parietale som angränsar mot bröstkorgen. Dessa hålrum kallas lungsäckar och ska normalt innehålla endast en mindre mängd vätska som agerar som smörjmedel och kan, tillsammans med det negativa undertrycket mellan det inre och yttre membranet, medverka till att lungorna svarar mot bröstkorgens rörelser vid in- respektive utandning. När hålrummet blir vätske- eller luftfyllt komprimeras lungan eftersom trycket inte upprätthålls, vilket kan ge kliniska symptom främst i form av dyspné[5]2
Ascites
Även bukhinnan, peritoneum kan bli vätskefylld. Bukhinnan består av hålrummet cavitas peritonei som avgränsas av ett yttre membran lamina parietalis som angränsar mot bukväggen samt det inre membranet lamina visceralis som bildar ytan mot bukens intraperitoneala organ.
2ABC om Pleuravätska, läkartidningen nr 20–21 2007 volym 104
6
Vätskeansamling i bukhinnans hålrum, som i dagligt tal benämns ascites (efter det grekiska ordet askos; säck) kan orsakas av såväl icke-maligna som maligna tillstånd. Ansamlingen av ascites orsakas dock främst av tillstånd som levercirros, men har även visats förekomma med maligna fynd särskilt vid vissa cancerformer. Dessa cancerformer är bland annat lymfom, kolorektalcancer, gynekologisk cancer, bröstcancer samt pleuralt mesoteliom som
metastaserat till peritoneum[6]. Det mest tydliga kliniska tecknet till ansamling av ascites är en uppsvälld buk till följd av den stora vätskevolymen.
Diagnostik
Vid misstanke om att den bakomliggande orsaken kan vara en malignitet är det vanligt att cytologiska prover i form av finnålsaspirat (FNA) väljs som den inledande metoden för att studera cellernas struktur och kunna påvisa eventuella maligna celler. Provmaterialet utgörs då av exsudat som är en inflammatorisk vätskeutgjutning eller transudat som bildas när serum tränger ut från blodkärlen och ansamlas i kroppens håligheter. Dessa kan tas i form av FNA eller tappning av ascites från bukhålan eller pleuravätska från lungsäcken där förstagångs- tappning anses vara indikation för cytologi, särskilt när bakomliggande orsak är okänd.
FNA är mindre invasivt än provtagningen för andra provmaterial som vävnadsbiopsier och kräver inte alltid administrering av bedövningsmedel. Det är därför en fördelaktig
provtagningsmetod i samband med bilddiagnostik i ett inledande skede vid misstanke om malignitet hos en patient[7].
Cytologiska färgmetoder
May-Grünewald Giemsa (MGG) är en kombination av två färgningar tillhörande gruppen Romanowsky-färgningar där färgningar som Field, Giemsa, Jenner, Leishman, May-
7
Grünewald och Wright ingår. Gruppen är namngivna efter den ryska forskaren Dmitri Leonidovich Romanowsky (1861-1921) som demonstrerade användbarheten av dessa polykroma färgningstekniker[8].
Det som är utmärkande för Romanowsky-färgningar är att de består av metylenblått, azur och eosin. May-Grünwald består av Metylenblått samt Eosin Y löst i alkohol (metanol) och Giemsa innehåller metylenblått och Eosin Y samt även Azur B i vattenbaserad lösning.
Metylenblått och Azur B är snarlika färgningskomponenter eftersom metylenblått vid degradering bildar Azur B. De går under gemensamt namn som så kallade Thiaziner[9].
MGG användes ursprungligen inom parasitologin [9] för att färga tjocka blodpreparat där man letar efter parasiter i olika stadier av malariacykeln, men har senare tillämpats även inom hematologi och cytologi där metoden nu används rutinmässigt.
MGG inom cytologin
Cytologiska prover färgas ofta med Romanowsky-färgningar däribland May-Grünewald- Giemsa (MGG) samt den patientnära varianten av MGG, Quick-Stain MGG som utförs i anslutning till punktionstillfället för så kallad rapid on site evaluation (ROSE)[10]. ROSE innebär att utstryket granskas vid provtagningstillfället så att punktionen kan göras om omedelbart om ej fullgott prov erhållits eller om det inte färgats in optimalt. Tillämpning av ROSE vid ultraljudsguidad provtagning har visat sig ge en högre andel bedömbara FNA[11].
Pleuravätska och ascites prepareras rutinmässigt genom centrifugering för att koncentrera cellprovet varpå konventionella utstryk utförs på objektglas. För traditionell MGG luftfixeras utstryken innan färgning med May-Grünewald och Giemsa alternativt kan färgmetoderna
8
MGG Quick Stain eller Diff Quick användas i patientnära sammanhang där en snabbare metod krävs för att kunna bedöma att adekvat provtagning utförts som resulterat i tillräckligt material för aktuell diagnostik. Vid efterföljande mikroskopibedömning granskas hela preparaten för att identifiera eventuell malignitet och i sådana fall den histologiska typen hos tumören samt dess ursprung i kroppen.
Syfte
Denna studie jämför metoderna traditionell MGG och snabbfärgningen MGG-Quick Stain samt undersöker om implementering av fosfatbuffert till rutinlaboratoriets färgningsprotokoll för MGG kan stävja den problematik laboratoriet haft under längre tid. Rådande rutiner har medfört mer blåaktiga infärgningar av pleura- och ascitesutstryk än önskat vilket är
ofördelaktigt vid granskning av preparaten. Syftet med studien är således att jämföra färgningsmetoderna och att hitta strategier för att optimera färgningsresultatet för MGG- färgningen vilka kan implementeras på rutinlaboratoriet i fråga.
Material Studiematerial
I det första experimentet användes två patientprover pleuravätska för färgningsmetod A-I och i det andra experimentet nyttjades två patientprover pleuravätska samt ett ascitesprov för metodvarianterna J-Q. Totalt ingick således fyra pleuravätskor samt ett ascitesprov i denna studie.
Etiska överväganden
Avidentifierat överblivet provmaterial som inte längre kan kopplas till en enskild individ omfattas inte av Biobankslagen (2002:297) eller Etikprövningslagen (2003:460), varpå sådant
9
provmaterial som annars skulle destruerats efter slutförd analys kan brukas vid metodutveckling eller valideringsarbete inom rutinsjukvården3.
Inget etiskt tillstånd behövde sökas för det här projektet eftersom det är ett förarbete till intern metodutveckling av cytologiska färgmetoder vid Gävle sjukhus. Allt biologiskt material som användes under arbetet var kvarvarande material från patientprover som redan hanterats enligt laboratoriets rutiner. Inga uppgifter som riskerar att koppla proverna till patienternas identitet kommer att publiceras.
Hållbarhetsperspektiv
Hållbarhet kan definieras som alltifrån att spara på jordens resurser till att skapa en hållbar arbetsmiljö, att planera och arbeta på ett ekonomiskt hållbart sätt samt att värna om miljön.
Detta kan tas i uttryck bland annat genom att i möjligaste mån spara in på samt återanvända förbrukningsmaterial för att begränsa nyttjandet av jordens resurser och genom att handskas med hälso- och miljöfarliga ämnen på ett ansvarsfullt sätt både av hälsoskäl och för att ge en så liten miljöpåverkan som möjligt.
I så stor utsträckning som det har gått har preparaten i studien färgats vid tillfällen planerade på sådant sätt att nya reagenser inte hällts upp fler gånger än nödvändigt om preparat kunnat färgas under samma omgång. Detta för att hålla nere volymen av reagenser ur ett ekonomiskt perspektiv samt miljöperspektiv eftersom alla färgningsreagenser till MGG samt MGG QS är att betrakta som miljö- och hälsofarliga.
3 https://biobanksverige.se/personal/faq-personal/
10
Samtliga av dessa miljöfarliga reagenser som använts har kasserats enligt laboratoriets fastställda direktiv för att förhindra negativ miljöpåverkan. Detta genom att särskilja
vattenlösliga och metanollösta komponenter och särskild uppsamling av giemsa-lösning samt metanol.
Metod
Preparering och utstryk av pleuravätska
Punktatens ursprungsflaskor omblandades noggrant på skakapparat för att ge ett homogent prov och lösa upp eventuellt slem i botten. En mindre provvolym, uppskattningsvis 5 centimeter upp från centrifugrörets botten, dekanterades över till ett 100 milliliters rundbottnat centrifugrör av glas, som centrifugerades 10 minuter vid 1570-g i
rumstemperatur. Det centrifugerade röret dekanterades i slasken för att endast behålla en liten vätskevolym samt celler i glasrörets botten. Efter omblandning pipetterades en liten droppe från cellsuspensionen till kortsidan av ett objektglas. Ett rent objektglas användes för att med 30 graders vinkel fånga upp droppen bakom glaset och göra ett utstryk. Preparatet lades att lufttorka helt tort.
Dessa steg upprepades för att producera ett tillräckligt stort antal utstryk från varje prov för att utvinna minst ett godtagbart preparat avseende utstrykets kvalité (liknade tjocklek på
utstryken för varje prov). För att ett enstaka utstryks kvalité inte skulle påverka bedömningen alltför mycket i senare skede utfördes några extra utstryk för att kunna välja ut de glas inom ett individuellt patientprov som hade mest lika utstrykstjocklek att gå vidare med för färgning.
11 Färgning och montering av lufttorkade preparat
I det första experimentet delades de lufttorkade preparaten upp enligt provnummer (1 och 2) och i bokstavskodade uppsättningar (A-I) som stod för de olika metodvariationerna där kranvatten, destillerat vatten och fosfatbuffert användes i olika kombinationer. Utstryken tilläts lufttorka i upp till en vecka innan färgning. Preparaten i grupperna A och I färgades med MGG Quick Stain och övriga glas (grupp B-H) med laboratoriets standard MGG enligt tabell 1.
Tabell 1. Färgningsprotokoll 1 för MGG (B-H) och MGG Quick Stain (A, I) som visar sköljningsstegen samt vilken spädning som gjorts för giemsa för respektive grupp för färgning av prov 1 och 2.
Grupp Metod 1:a sköljning Giemsa 22,5 mL + 240 mL
spädningslösning:
2:a sköljning
A MGG QS destillerat vatten - -
B MGG kranvatten destillerat vatten kranvatten C MGG destillerat vatten destillerat vatten destillerat vatten D MGG fosfatbuffert fosfatbuffert fosfatbuffert
E MGG fosfatbuffert fosfatbuffert kranvatten
F MGG fosfatbuffert fosfatbuffert destillerat vatten
G MGG kranvatten fosfatbuffert kranvatten
H MGG destillerat vatten fosfatbuffert destillerat vatten
I MGG QS fosfatbuffert - -
I det andra experimentet delades de lufttorkade utstryken upp enligt provnummer (3-5) och i bokstavskodade uppsättningar (J-Q) där J-M färgades med Quick-Stain-metoden och N-Q färgades med traditionell MGG enligt tabell 2.
Tabell 2. Färgningsprotokoll 2 för MGG Quick-Stain (J-M) samt MGG (N-Q) som visar användningen av fosfatbuffert pH 6.5, 6.8 och 7.1 för färgning av prov 3-5.
Grupp Metod 1:a sköljning Giemsa 22,5 mL + 240 mL
spädningslösning:
2:a sköljning
J MGG QS Fosfatbuffert 6.5 - -
K MGG QS Fosfatbuffert 6.8 - -
L MGG QS Fosfatbuffert 7.1 - -
M MGG QS Destillerat vatten - -
N MGG Fosfatbuffert 6.5 Fosfatbuffert 6.5 kranvatten O MGG Fosfatbuffert 6.8 Fosfatbuffert 6.8 kranvatten P MGG Fosfatbuffert 7.1 Fosfatbuffert 7.1 kranvatten Q MGG kranvatten Destillerat vatten kranvatten
12 MGG Quick Stain
Lösningarna till MGG Quick Stain bestod av tre färdigberedda lösningar: Reagent A, Reagent B och Reagent C (Bio-Optica ref 04-090805M). Dessa hälldes upp i ordning enligt A, B och C i kyvetter samt med en extra kyvett för efterföljande sköljning. Preparaten färgades en och en genom fem dopp i vardera tre lösningar med sådan hastighet att lite av lösningen hann droppa tillbaka i kyvetten mellan upptag och nedsänkning i reagenskyvetterna. Som avslutande steg sköljdes preparatet ca tio sekunder i en kyvett med destillerat vatten eller fosfatbuffert beroende av sin bokstavskodade metodvariation enligt tabell 1 och 2. Efter lufttorkning helt torra rengjordes glasens baksida med saltsur sprit varpå de monterades med Pertex® (HistoLab ref 00840) och objektglas, 24 x 55 millimeter.
Traditionell MGG
Alla utstryk, från olika patientprover men med samma bokstavskod, laddades på en
objektglashållare och färgades tillsammans vid den traditionella MGG-färgningen. Samtliga preparat färgades enligt laboratoriets rutiner för inkubationstider och duration för
sköljningsstegen. Inledningsvis inkuberades de i May-Grünwald fem minuter, varpå de sköljdes 30 sekunder, inkuberades 15 minuter i Giemsalösningen och till sist sköljdes i 30 sekunder. För de olika metodvarianterna B-H samt N-Q användes olika sköljmedium samt olika spädningslösning till Giemsalösningen, se tabell 1 och 2. De färdigfärgade glasens baksida torkades med saltsur sprit varpå de tilläts lufttorka helt torra före montering med Pertex® (HistoLab ref 00840) och objektglas, 24 x 55 millimeter.
Gradering av infärgningskvalité
Alla färgade preparat granskades i ljusmikroskop. Ett representativt glas valdes ut inom varje grupp för respektive patientprov för att tidseffektivisera bedömningen inför den efterföljande
13
oberoende granskningen av cytodiagnostiker och cytologer. Glasen valdes ut med avseende på avsaknad av ej färgningsrelaterade artefakter samt celltäthet för att underlätta gradering av färgningen. Vid icke homogena glas inom samma patientprov och färgningsprotokoll
konsulterades cytodiagnostiker vid val av det glas som ansågs representativt för metoden.
Detta särskilt gällande MGG QS där mindre tidsskillnader vid färgning ger fel nyans.
Fackmannamässig bedömning av färgningskvalitet utfördes enligt tilldelat formulär där gradering utfördes med avseende på infärgningen av cellkärnor och cytoplasma enligt en skala från 0-3 (0-Ej bedömbar, 1-Otillfredställande färgning, 2-Tillfredställande färgning, 3- Optimalt färgade kärnor och cytoplasma). Vid bedömningen av preparaten var det inte känt för granskaren hur varje enskilt preparat hade processats för att undvika att bedömningen påverkades av antaganden om vilken metod som förväntades ge mest optimalt utfall.
Statistik
Resultat från samtliga graderingar visualiserades i box plot-diagram för att tydliggöra
eventuella skillnader mellan metoder samt spridningen av bedömningen. Vid sammanslagning av graderingar i det andra experimentet uteslöts prov 3 från det gemensamma diagrammet och statistiska beräkningar på grund av provets kvalité då provet var blodrikt men cellfattigt även i tjockare områden vilket påverkat bedömningen sådant att några av granskarna graderat de celler som observerats medan andra bedömt celltätheten som för låg för att uttala sig om färgningen. Jämförelser mellan grupper utfördes med Kruskal-Wallis signifikanstest via webbaserade Social Science Statistics för andra experimentet. P-värden under 0,05 ansågs statistiskt signifikanta.
Resultat
14
I det inledande experimentet undersöktes mindre metodskillnader gällande sköljning i kranvatten, destillerat vatten och fosfatbuffert pH 7,1 samt i vilka steg i färgningsprocessen som fosfatbuffert eventuellt bör implementeras. Vid resterande experiment utfördes färgning med fosfatbuffert av flera pH-värden (pH 6,5; 6,8 och 7,1) som tillämpades i enlighet med resultatet från det inledande experimentet.
Första färgningsomgången
I det inledande experimentet observerades likvärdiga resultat för MGG QS utan och med fosfatbuffert (metod A respektive I). Ursprungsmetoden (metod B) för MGG graderades förhållandevis lågt för båda proverna och föredrogs inte av någon av granskarna. Metod A,D,E och I hade för prov 1 och 2 tillsammans ett medelvärde över 2. Metod D och E tillhörde båda traditionell MGG med användning av fosfatbuffert, eftersom medelvärdet var snarlikt och prov 1 ansågs mer representativt för ett normalt ascitesprov valdes metod E att gå vidare med för resterande experiment med jämförelse av fosfatbuffertar av olika pH för den traditionella MGG-färgningen (tabell 3).
Tabell 3. Medelvärden för respektive metod under Experiment 1 där mindre skillnader testades mellan MGG QS och MGG för kranvatten, destillerat vatten och fosfatbuffert pH 7,1.
Metod Medelvärde:
Prov 1
Medelvärde:
Prov 2
Medelvärde:
Prov 1 & 2
A 2,3 1,8 2,1
B 1,8 1,6 1,7
C 1,2 1,5 1,4
D 2,2 2,5 2,3
E 2,4 1,8 2,1
F 1,7 2 1,8
G 2,1 1,8 1,9
H 2 1,6 1,8
I 2,3 2 2,2
15
Vidare så visualiserades data från tabell 1 i figurer där resultaten från gradering av
cytodiagnostiker och cytolog kunde ses mer överskådligt för prov 1 (figur 1) och prov 2 (figur 2). Resultaten för prov 2 var mycket mer spridda än för prov 1 till följd av provens
egenskaper. Metod B och C (sköljning i kranvatten respektive destillerat vatten) bedömdes vara ofördelaktiga tillvägagångssätt och graderades lägre än övriga metoder av samtliga granskare.
Figur 1. Sammanställning av graderingen för prov 1 för färgningsprotokoll enligt A-I där n=6.
Figur 2. Sammanställning av graderingen för prov 2 för färgningsprotokoll enligt A-I där n=6. Stor spridning mellan granskare till följd av provets beskaffenhet.
16 Andra färgningsomgången
Spridningen mellan granskare samt sammanställning av samtliga graderingar för prov 3, 4 och 5 vid det andra experimentet visualiseras i figur 3, figur 4 respektive figur 5. Inga statistiskt signifikanta skillnader (p=0,882) observerades mellan glas färgade med MGG QS vars eftersköljsteg varierats mellan destillerat vatten och fosfatbuffertar (metod J-M) av olika pH-värden (pH 6,5; 6,8 och 7,1). Detta illustrerats även i figur 6 där resultaten från prov 4 och prov 5 sammanslagits. Enligt kommentarer i fritext ansågs glas färgade med MGG QS
generellt vara något överfärgade. Figur 6 visar även på generellt större spridning mellan granskare för MGG (N-Q) än MGG QS (J-M).
Figur 3. Sammanställning av gradering av färgningresultatet J-Q för prov 3 där n=5. Spridda graderingar till följd av provets beskaffenhet.
17
Figur 4. Sammanställning av gradering av färgningresultatet J-Q för prov 4 där n=5.
Figur 5. Sammanställning av gradering av färgningresultatet J-Q för prov 5 där n=5.
18
Figur 6. Sammanställning av gradering av färgningresultatet J-Q för prov 4 och 5 där n=5.
Vid jämförelse mellan metoderna M-P (standard MGG QS respektive MGG med
fosfatbuffertar) sågs inga statistiskt signifikanta skillnader (p=0,235) men nyansskillnader mellan respektive metod förekommer vilket kan ses i figur 7-16 där resultatet för prov 5 (ascites) visas.
Inom MGG-metoden observerades signifikanta skillnader mellan metod N-Q (p=0,046).
Samtliga glas ansågs generellt vara något underfärgade enligt kommentarer i fritext vid graderingen och för metod Q var de kraftigt underfärgade.
Tydliga nyansskillnader sågs även visuellt mellan tunnare och tjockare områden på glasen.
Dessa skillnader var mindre framträdande för samtliga metodvariationer där fosfatbuffert med lägre pH använts vilket särskilt kan ses i figur 9-10 som visar olika områden av ett glas färgat med metod N för samma prov. För MGG utan buffert (metod Q) vilket kan ses i figur 15-16 är skillnaderna mellan olika områden av glaset störst, i tjockare delar ses endast blå-
grönanyanser (figur 16).
19
Figur 7. Tunnare del av utstryk för glas 5M (MGG QS, destillerat vatten).
Figur 8. Tjockare del av utstryk för glas 5M (MGG QS, destillerat vatten).
Figur 9. Tunnare del av utstryk för glas 5N (MGG, fosfatbuffert pH 6,5).
20
Figur 10. Tjockare del av utstryk för glas 5N (MGG, fosfatbuffert pH 6,5).
Figur 11. Tunnare del av utstryk för glas 5O (MGG, fosfatbuffert pH 6,8).
Figur 12. Tjockare del av utstryk för glas 5O (MGG, fosfatbuffert pH 6,8).
21
Figur 13. Tunnare del av utstryk för glas 5P (MGG, fosfatbuffert pH 7,1).
Figur 14. Tjockare del av utstryk för glas 5P (MGG, fosfatbuffert pH 7,1).
Figur 15. Tunnare del av utstryk för glas 5Q (MGG, kranvatten).
22
Figur 16. Tjockare del av utstryk för glas 5Q (MGG, kranvatten).
Diskussion
Samtlig metodik följde laboratoriets metodbeskrivningar för preparering och färgning med MGG och MGG Quick Stain med undantag för sköljning under och efter färgningarna samt för spädning av giemsalösningen. Där undersöktes inledningsvis skillnader mellan kranvatten, destillerat vatten samt fosfatbuffert i varierande konstellationer för första och andra
sköljsteget samt även för spädning av giemsa i det första experimentet där två patientprover pleuravätska användes. I ett andra experiment undersöktes skillnader i färgningsresultat för utstryk av två prover pleuravätska och ett ascites där fosfatbuffert av samma koncentration använts men vid olika pH-värden (pH 6,5; 6,8 och 7,1). Fosfatbuffertarna användes då vid det första sköljsteget och till spädning av giemsalösningen.
Vid tolkning av resultaten har prov 1 och prov 3 delvis uteslutits ur bedömningen på grund av provens sammansättning samt hur graderingen utförts. Detta eftersom de anses vara ojämlikt granskade där man i vissa fall graderat de fåtal celler som finns, fokuserat på färgningen i sig och bortsett från övriga intryck i helhetsbilden av provet medan man i andra fall bedömt cellantalet som för lågt för bedömning. Alltför olika tänk vid graderingstillfället medför att dessa data inte kan sammanställas på lika grund, varpå mindre hänsyn tas till dessa två prover vid övergripande bedömning av metodernas kvalitet.
23
Inga signifikanta skillnader observerades mellan glas färgade med MGG QS vars
eftersköljsteg varierats mellan destillerat vatten och fosfatbuffertar av olika pH-värden. Detta gällde för samtliga prover. Resultatet var som förväntat men ansågs intressant att undersöka eftersom företagets rekommendation var att skölja i destillerat vatten alternativt fosfatbuffert pH cirka 7 vid ej fullgott färgningsresultat för sköljning i destillerat vatten. Med stöd av detta resultat drogs slutsatsen att fosfatbuffert ej är nödvändigt vid färgning med MGG QS.
Visuellt sågs en större spridning mellan graderingarna för MGG i jämförelse mot MGG QS som bedömdes mer enhetligt. Då MGG med pH-justerande fosfatbuffert gav upphov till stora nyansskillnader och att samtliga glas ansågs något underfärgade tyder detta på att skillnaden i spridning troligtvis beror på skillnader i den personliga preferensen snarare
Graderingen av samtliga glas färgade med MGG QS utgav ett högre medelvärde i jämförelse mot den traditionella MGG-färgningen, om än ej signifikant, och bedömdes av flertalet granskare också visa tendenser till överfärgning vid metodik enligt tillverkarens instruktioner, detta främst gällande cellernas cytoplasma. Därav rekommenderas att förkorta färgningstiden något vid användning av MGG QS, särskilt för lite tjockare utstryk som suger åt sig mer färglösning. Eftersom glasen oftast färgas en och en med denna metod och resultatet kontrolleras omedelbart efter färgning, kan färgningstiden justeras inför nästa glas även vid färgning i patientnära sammanhang om flera glas färgas efter varandra. Erhållen erfarenhet gällande att bedöma utstrykets sammansättning och tjocklek makroskopiskt innan färgning kan också vägleda för färgning med MGG QS. Det är en väldigt känslig metod på grund av den korta färgningstiden på fem sekunder per lösning varpå små skillnader kan påverka
24
resultatet mycket. Något för lång färgningstid kan också vara en anledning till att de alla bedömts som överfärgade i denna studie.
Vid jämförelse mellan fosfatbuffert med något surt pH (pH 6.5 och 6.8) mot glas färgade med traditionell MGG med kranvatten eller fosfatbuffert pH 7.1 sågs stora nyansskillnader.
Färgning utan fosfatbuffert visade en blå-grå nyans på cellerna, särskilt i tjockare områden.
Detta gör det svårt att granska cellkärnornas form och kromatinteckning särskilt i mer celltäta områden av utstryken där cellkärnorna är kraftigt underfärgade. Användning av buffert med något surt pH gav stabilare nyans på hela glaset medan ett något basiskt pH resulterade i större skillnader mellan tunna och tjockare områden av utstryken. Att färgningen ger ett likvärdigt resultat oberoende av utstrykets tjocklek kan anses vara en värdefull egenskap särskilt i de fall laboratoriet emottar färdiga utstryk från primärvård/sjukhus i närområdet som inte har egna cytologilaboratorier. Detta eftersom man måste arbeta med det material som finns och också har begränsad möjlighet att påverka utstrykens kvalité samt inte alltid möjlighet att göra egna utstryk lokalt på laboratoriet om extra provmaterial inte finns tillgängligt.
Att nya diagnosmetoder identifierar primärtumörer i högre utsträckning är ett känt faktum.
Det kan vara av stor vikt för den enskilde patienten eftersom primärtumörens ursprung och typ kan vara avgörande för prognosen. Därför krävs ofta kompletterande immunocytokemiska analyser (ICC) vid maligna fynd för FNA[12], men eftersom kostnaden för dessa är ofta är hög och metoderna specifika, vill man kunna göra en grundläggande gallring avseende maligna respektive benigna prover samt kunna urskilja aktuell celltyp vid maligna fynd innan man går vidare med ICC på cell-block. Därav är även ”grova” metoder som MGG viktiga för rutindiagnostiken trots en skenande utveckling mot mer avancerade analyser.
25
Cell-block är en teknik där celler från FNA prepareras genom koncentrering och
formaldehydfixering och bildar ett block som kan snittas och användas som material för vidare diagnostik med ICC eller molekylära analyser[13]. För glas färgade med PAP, en färgning ofta använd som komplement till MGG, kan ICC utföras direkt på tidigare färgade objektglas efter avfärgning, något som dock varit svårt för just MGG-färgade celler[7,13].
Att finna metoder för att kunna arbeta med det material som finns tillgängligt är centralt inom diagnostiken. Förutom klassiska cytologiska färgningsmetoder och ICC har även andra analysmetoder för cytologiska prover förekommit i studier det senaste årtiondet. För flertalet cytologiska aspirat, däribland pleuravätska, kan man även utföra molekylära och
cytogenetiska analyser för att undvika falskt negativa provsvar eller för
differentialdiagnostik[7,14]. Efter implementering av ROSE vid provtagningstillfället för aspirationscytologi och i takt med mer forskning kring molekylära analyser av dessa har FNA visats ha högre celltäthet och andel tumörceller än grovnålsbiopsier[15] och kan därför vara fördelaktiga provmaterial där skäl finns till att utföra Next Generation Sequencing, särskilt för pleuravätska hos lungcancerpatienter[7,16]. Detta särskilt eftersom FNA är ett icke-
formaldehydfixerat provmaterial och därför inte riskerar att störa metoden till följd av fixeringens korslänkning av nukleinsyror. Molekylära analyser kan med fördel utföras vid vätskebaserad cytologi (prepareringsmetod som bildar enkelskiktat cellager) för pleuravätska vid vidare diagnostik och för att kunna ge prognostisk information till patienten[17].
Studier på senare tid har även kretsat kring nya färgningsmetoder där MGG jämförts med Leishman-Giemsa cocktail (LG)[18], en annan kombination av två Romanowsky-färgningar, för att undersöka skillnader i detaljrikedom som återges med respektive färgningsteknik. LG har påvisats ge en bättre återgivelse av cellkärnornas kromatinteckning. Detta var ett
26
intressant fynd då den främsta nackdelen med MGG lyfts fram som just begränsad kvalité med avseende på cellkärnornas struktur. LG skulle kunna visa sig få stor nytta kliniskt om liknande resultat kan återskapas lokalt på aktuella laboratorier där LG jämförs med
rutinlaboratoriets egna MGG-protokoll. Detta under förutsättning att MGG-färgningen på aktuellt laboratorium är av god kvalité och därigenom representativ för färgningstekniken.
Den mest uppenbara begränsningen av denna studie var provmaterialets omfattning.
Provantalet begränsades avsiktligt för att anpassas till rådande resurser på aktuellt kliniskt laboratorium för att granskningstiden av färdiga preparat skulle rymmas inom tidsramen för projektet. Denna begräsning kan ha påverkat studiens statistiska styrka (statistical power)[19].
Att utföra en estimering på förhand om hur stort provmaterial eller vilken gruppstorlek som krävs i en studie bör ofta ingå i planeringsfasen. Det är en simpel parameter som lätt kan justeras i planeringen i försök att säkerställa studiens statistiska styrka. Detta för att kunna genomföra experimentella studier där typ-1- och typ-2-fel undviks och således kunna acceptera eller förneka nollhypotesen på goda grunder, vid användning av ett statistiskt signifikanstest.
Eftersom studien enbart grundats på subjektiva bedömningar av färgningarnas kvalitét ansågs det viktigt att erhållna resultat utvunnits på väl underbyggda resonemang från flera erfarna kliniker som dagligdags arbetar med klinisk bedömning av det valda studiematerialet och med den berörda färgningsmetoden snarare än att använda ett mer omfångsrikt studiematerial.
Resultaten från denna studie tillåts utgöra bakgrund till eventuell metodutveckling av MGG- färgningen på aktuellt laboratorium. Ett möjligt alternativ till optimering av metoden
identifierades då tillämpning av fosfatbuffert föredrogs av samtliga kliniker när detta
27
jämfördes mot ordinarie färgningsprotokoll för den traditionella MGG. Eventuell implementering av fosfatbuffert till laboratoriets redan existerande färgningsprotokoll prognostiseras ha god tillämpbarhet på laboratoriet då fosfatbuffertar för MGG-färgningar finns kommersiellt tillgängliga och således inte heller medför någon ytterligare
arbetsbelastning.
Tillkännagivanden
Först och främst vill jag tacka Helena Östlund och Christina Frykman för projektidéer och för att de välkomnat mig att genomföra detta arbete på Klinisk Patologi och Cytologi på Gävle sjukhus. Riktar ett särskilt tack till Helena för all praktisk hjälp längs vägen och för våra diskussioner kring de frågor och funderingar som dykt upp. Tack också till alla andra medarbetare på Patologen/Cytologen samt övriga delar av Laboratoriemedicin, för resurser och expertis. Vill även passa på att tacka min opponentgrupp där Avin Sadun, Elin Peterson och Yelda Shamoun bistått mig med värdefull feedback under projektets gång.
28 Referenser
[1] Pedersen JK, Engholm G, Skytthe A, Christensen K; Academy of Geriatric Cancer Research (AgeCare). Cancer and aging: Epidemiology and methodological challenges. Acta Oncol. 2016;55 (Suppl 1):7-12.
[2] Modig K, Drefahl S, Andersson T, Ahlbom A. The aging population in Sweden: can declining incidence rates in MI, stroke and cancer counterbalance the future demographic challenges?. Eur J Epidemiol. 2012;27(2):139-145.
[3] Light RW, Erozan YS, Ball WC Jr. Cells in pleural fluid. Their value in differential diagnosis. Arch Intern Med. 1973;132(6):854-860.
[4] American Thoracic Society. Management of malignant pleural effusions. Am J Respir Crit Care Med. 2000;162(5):1987-2001.
[5] Yalcin NG, Choong CK, Eizenberg N. Anatomy and pathophysiology of the pleura and pleural space. Thorac Surg Clin. 2013;23(1):1-v.
[6] Runyon BA, Hoefs JC, Morgan TR. Ascitic fluid analysis in malignancy-related ascites.
Hepatology. 1988;8(5):1104-1109.
[7] Beraki E, Olsen TK, Sauer T. Establishing a protocol for immunocytochemical staining and chromogenic in situ hybridization of Giemsa and Diff-Quick prestained cytological smears. Cytojournal. 2012;9:8.
[8] Bezrukov AV. Romanowsky staining, the Romanowsky effect and thoughts on the question of scientific priority. Biotech Histochem. 2017;92(1):29-35.
[9] Benattar L, Flandrin G. Morphometry and quality control for a May-Grunwald Giemsa stained preparation. A 40 centers cooperative study. Leuk Lymphoma. 1999;33(5-6):587-591.
[10] de Koster EJ, Kist JW, Vriens MR, Borel Rinkes IH, Valk GD, de Keizer B. Thyroid Ultrasound-Guided Fine-Needle Aspiration: The Positive Influence of On-Site Adequacy
29
Assessment and Number of Needle Passes on Diagnostic Cytology Rate. Acta Cytol.
2016;60(1):39-45.
[11] Cai XJ, Valiyaparambath N, Nixon P, Waghorn A, Giles T, Helliwell T. Ultrasound- guided fine needle aspiration cytology in the diagnosis and management of thyroid nodules.
Cytopathology. 2006;17(5):251-256.
[12] Shidham VB, Layfield LJ. Cell-blocks and immunohistochemistry. Cytojournal.
2021;18:2.
[13] Kulkarni MB, Prabhudesai NM, Desai SB, Borges AM. Scrape cell-block technique for fine needle aspiration cytology smears. Cytopathology. 2000;11(3):179-184.
[14] Factor RE, Dal Cin P, Fletcher JA, Cibas ES. Cytogenetics and fluorescence in situ hybridization as adjuncts to cytology in the diagnosis of malignant mesothelioma. Cancer.
2009;117(4):247-253.
[15] Roy-Chowdhuri S, Chen H, Singh RR, et al. Concurrent fine needle aspirations and core needle biopsies: a comparative study of substrates for next-generation sequencing in solid organ malignancies. Mod Pathol. 2017;30(4):499-508.
[16] Grigoriadou GΙ, Esagian SM, Ryu HS, Nikas IP. Molecular Profiling of Malignant Pleural Effusions with Next Generation Sequencing (NGS): Evidence that Supports Its Role in Cancer Management. J Pers Med. 2020;10(4):206.
[17] Rossi ED, Bizzarro T, Schmitt F, Longatto-Filho A. The role of liquid-based cytology and ancillary techniques in pleural and pericardic effusions: an institutional experience.
Cancer Cytopathol. 2015;123(4):258-266.
[18] Garbyal RS, Agarwal N, Kumar P. Leishman-Giemsa cocktail: an effective Romanowsky stain for air-dried cytologic smears. Acta Cytol. 2006;50(4):403-406.
[19] Beck TW. The importance of a priori sample size estimation in strength and conditioning research. J Strength Cond Res. 2013;27(8):2323-2337.
