Institutionen för medicinsk cellbiologi

Institutionen för medicinsk cellbiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15 hp

THE RELATIONSHIP BETWEEN THE PREVALENCE OF TEN KNOWN PATHOGENS IN WILD SWEDISH BEES AND THE PRESENCE OF A NEARBY APIARY

By Frida Sundblad, VT 21

Examinator: Dick Wågsäter

Institutionen för medicinsk cellbiologi.

ABSTRACT

Pollination by insects is of great importance for the global food production. There is a specific need for pollination by bees in greenhouses and tunnel cultivations to increase the quantity, quality and market value of the crops. Imported bee colonies from central Europe are used for pollination of Swedish crops and have a great economic importance but are also a threat to wild Swedish bees by posing a risk of pathogen transmission between the bee species. The aim of this study was to investigate how imported bees affect the prevalence of pathogens amongst wild bees.

Analysis was performed on 236 wild bees collected in near proximity to tunnel cultivation, greenhouse cultivation and collected from two control landscapes. The abdomen of the bees was used to extract RNA/DNA for further detection and quantification of ten pathogens using qPCR.

The proportion of infected bees within each group was calculated based on the results from the qPCR analysis. A two-proportion z-test was used to determine whether the difference in

pathogen prevalence between the four groups was of statistically significant at α = 0.05. The results show that there was no significant difference when comparing the presence of all pathogens

between bees in the test groups and the bees in the control groups (p= 0,29- 0,33). However, the prevalence of three viruses was significantly higher among bees collected in the near proximity of a greenhouse compared with bees collected from the near proximity of a tunnel cultivation (p<

0,003). For Slow bee paralysis virus the prevalence was 2,5 times higher and for Deformed wing virus and Black queen cell virus the prevalence was 3,5 and 1,3 times higher among bees collected near a greenhouses compared to near a tunnel cultivation.

POPULÄRVETENSKAPLIG SAMMANFATTNING

Insektspollinering har stor betydelse för den globala livsmedelsproduktionen. Det finns ett specifikt behov av pollinering av bin i växthus- och tunnelodling för att öka grödornas mängd, kvalitet och marknadsvärde. Importerade bisamhällen som brukas för pollinering av svenska grödor har således stor ekonomisk betydelse men medför även ett hot mot vilda svenska bin i form av smittöverföring av virus och parasiter mellan arterna. Syftet med studien var att undersöka hur importerade bin påverkar förekomsten av tio sjukdomsalstrande organismer hos vilda bin.

Analys utfördes av totalt 236 vilda bin insamlade i närheten av tunnelodling och

växthusodling som brukar importerade bin samt från två kontrollandskap där inga importerade bin används. Binas buk användes för att utvinna genetiskt material både från biet och från eventuellt virus eller parasit som infekterat biet. Laborativa metoder för att identifiera det främmande genetiska materialet användes sedan för att avgöra om bina varit infekterade med någon

sjukdomsalstrare. Baserat på resultatet beräknades andelen infekterade bin inom respektive grupp.

Andelarna jämfördes sedan för att avgöra om skillnaden i förekomst av de tio sjukdomsalstrande organismerna mellan de olika grupperna var tillräckligt stor för att spela en betydande roll.

Enligt resultatet förelåg ingen betydande skillnad vid jämförelse av den generella

förekomsten av sjukdomsalstrarna mellan test- och kontrollgrupperna. Förekomsten av tre virus var dock 1,3, 2,5 respektive 3,5 gånger högre bland de bin som insamlats i närheten av växthusodling jämfört med bin insamlade i närheten av tunnelodling (p< 0,003).

KEYWORDS

Bombus terrestris, Apis mellifera, Deformed wing virus, pathogen spillover, commercial bumblebee production.

INTRODUKTION

Nyttan av bipollinering

Insektspollinering har stor betydelse för den globala livsmedelsproduktionen [1]. Det finns ett specifikt behov av pollinering av bin i växthusodling av tomat samt i odling av frukt och bär i tunnlar och på friland för att öka grödornas mängd, kvalitet, hållbarhet och marknadsvärde.

Kommersiellt framtagna, importerade, odlade humlor (Bombus terrestris) har haft stor ekonomisk betydelse, i Sverige infördes mellan år 2016 och 2018 över 4 500 humlesamhällen per år enligt TRACES¹. Majoriteten av de importerade humlesamhällena användes i tomatodling i växthus. B.

terrestris anpassar sig bättre till inomhusmiljö samt har förmågan att pollinera vissa växter mer

effektivt jämfört med vilda honungsbin (Apis mellifera) [2]. Vissa arter inom Bombus spp kan även bära en större mängd pollen jämfört med arter inom Apis spp [3].

Taxonomiskt tillhör både A. mellifera och B. Terrestris överfamiljen Apoidae (bin) och familjen Apidae (långtungebin). Släktet Apis översätts på svenska till honungsbin medan släktet Bombus översätts till humlor.

Struktur av importerade humlesamhällen

Vid leverans är ett humlesamhälle av standardmodell tio till tolv veckor gammalt och består av en humledrottning, ungefär 70 arbetare (honor vars uppgift är att ta hand om boet) samt av ägg och larver under tillväxt. Drottningen har genomgått en vintervila och är således äldre och hennes huvudsakliga uppgift är att lägga ägg. Humlorna behöver pollen som proteinkälla för att mata sina larver och är följaktligen effektiva pollinerare. Efter leverans är samhället aktivt i ungefär nio veckor, vilket motsvarar den naturliga levnadstiden.

1 Trade Control and Expert systems: gemensam databas för hela EU, certifieringsverktyg för import och export av

Smittöverföring mellan odlade och vilda bin

Det är väldokumenterat att sjukdomar som är vanliga hos A. mellifera kan överföras inom kolonier såväl som mellan olika biarter och andra insekter [4]. Det finns många möjliga smittvägar, så som sexuell, vertikal, kontaktöverföring, överföring via luft och oral-fekal. De flesta bipatogener ackumuleras i bins avföring varvid de riskerar att överföras till andra individer via exempelvis delning av bo eller delning av blommor. Virus, bakterier, protozoer, svampar, nematoder och kvalster är alla patogener som kan angripa i princip alla arter av bin [5]. Prevalens och incidens av olika patogener skiljer sig dock mellan olika biarter [5]. Import av centraleuropeiska B. terrestris samt användning av dessa för pollinering av svenska grödor medför ett hot mot vilda svenska bin i form av smittöverföring mellan arterna.

Jordbruksverkets projekt

Jordbruksverket har tidigare studerat konsekvenser av vad massdöd av vilda bin innebär samt vilka förebyggande åtgärder som kan sättas in [6]. Myndigheten har även utvecklat en beredskapsstruktur mot skadegörare på honungsbin samt undersökt risken för förgiftning av bin med växtskyddsmedel av typen neonikotinoider [7]. Det var under det senare projektet som projektgruppen insåg att det fanns ett tidigare inte utrett hot mot vilda pollinerare; import av odlade bin. Uppföljningsprojektet blev således att studera detta. Myndigheten för samhällsskydd och beredskap beviljade projektet som genomfördes år 2016-2018 [8]. Projektgruppen bestod av Jordbruksverket, Sveriges

lantbruksuniversitet och Lunds universitet. Under sommaren 2018 samlades stora mängder vilda bin in från olika områden i Skåne, både från platser där kommersiellt framtagna odlade bin används samt från platser där de inte används. Insamlingen skedde vid två tillfällen med sex veckors

mellanrum i syfte att undersöka förekomsten av patogener före och efter pollineringssäsong. Proven från den första insamlingen har redan analyserats och resultatet i rapporten ”Biologiska hot mot

andra omgången. Biproverna som studerats i denna studie består av en tredjedel av dessa. I studien analyseras förekomsten av totalt tio patogener hos vilda bin bestående av fem virus, tre protozoer, en nematod samt ett kvalster.

Virus

Övervakning av virus är svårt eftersom de kan finnas i sin värd i latent form eller vara

asymtomatiska samt angriper många arter. Över 30 olika virus har identifierats hos A. mellifera, men nya stammar upptäcks kontinuerligt [9]. De fem virus som analyserats i denna studie är de vanligast förekommande hos såväl odlade som vilda bin i Sverige. I början av 1900-talet överfördes vektorn Varroa destructor, ett kvalster, från det asiatiska honungsbiet (A. cerana) till det

västerländska honungsbiet (A. mellifera). Förekomsten av vissa virus hos pollinerande insektsarter ökade drastiskt i samband med den nya vektorn [10]. Ett av dessa virus var ”Deformed wing virus”

(DWV) som var nästintill obemärkt hos A. mellifera tills dess att V. destructor aktivt började överföra viruset. I naturliga förhållanden mellan bin och DWV så är viruset icke-virulent, men samspelet med V. destructor har gjort DWV till biodlingens mest fruktade virus.

Ytterligare ett virus som i naturliga förhållanden med bin är icke-virulent men som i samvaro med V. destructor orsakar hög dödlighet är ”Slow bee paralysis virus” (SBPV) [11]. Vid infektion paralyseras biets framben och därefter inträffar döden relativt omgående. På grund av den snabba dödligheten så hinner ingen signifikant virusreplikation ske och därmed förblir viruset förhållandevis sällsynt hos kolonier av A. mellifera [8].

Ett tredje virus som överförs effektivt av V. destructor är ”Acute bee paralysis virus”

(ABPV). Vid infektion av ABPV hos vuxna bin inträffar döden efter en snabb sjukdomsutveckling av förlamning, muskelryckningar, oförmåga till flygning samt håravfall från bröstkorg och buk [12].

Ytterligare ett virus med dödlig utgång vid infektion är Sacbrood virus (SBV) som infekterar larver [13]. Virusnamnet kommer ifrån att infektionen orsakar vätska att ackumuleras under huden på

larven vilket orsakar säckbildning. Viruset förblir virulent i döda larver, honung samt i pollen i upp till fyra veckor [13].

Det femte och sista viruset som undersöks i denna studie är ”Black queen cell virus”

(BQCV). BQCV infekterar drottningar som ger upphov till larver som till en början är symtomfria, symtomen yttrar sig först i puppstadiet [14]. Puppan ändrar färg till gul och sedan svart innan den slutligen dör. Överföringen av virus sker via parasiten Nosema apis som lever i tarmen hos vuxna bin [14].

Protozoer

Protozoer är encelliga eukaryota mikroorganismer som bland annat lever som patogener på djur. Ett exempel är malaria, tre andra exempel är Apicystis bombi, Crithidia bombi och Nosema bombi som samtliga studeras i denna studie och är de som främst infekterar bin. A. bombi har påvisats hos omkring 20 arter inom Bombus ssp världen över [15]. Infektion av A. bombi har fysisk inverkan i form av påverkan på biets fettfördelning samt inverkan på beteende i form av minskad förmåga till kolonibygge, ökad dödlighet bland arbetarbin och kommunikationssvårigheter mellan drottningar och arbetare [15].

C. Bombi är en tarmparasit som infekterar humledrottningar och när drottningar vaknar ur

vintervila kommer en given del att bära på infektion [16]. Efter att ha etablerat en koloni så kommer en smittad drottning att smitta sina arbetare, när kolonierna växer kommer C. Bombi överföras såväl inom kolonierna som mellan kolonier via oral-fekal smittspridning. Även N. bombi är en

tarmparasit som utöver tarmceller även infekterar malpighiska tubuli (insekters motsvarighet till njurtubuli) vid infektionsdebut. N. bombi är en intracellulär mikrosporidian, infektion sker i sporstadiet och sporer sprids vidare via värdens avföring. Infektion hos drottningar är den främsta anledningen till smittspridning till nästa generation, drottningarna påverkas inte själva av

infektionen när det gäller kapacitet att lägga ägg eller förmåga till kolonibygge. Infekterade hanar får dock symtom i form av kortare överlevnad och minskad spermieproduktion [17].

Nematoder

Nematoder (rundmaskar) är mikroskopiska organismer som bland annat finns som parasiter hos andra djur. Den endoparasistiska nematoden Sphaerularia bombi infekterar och steriliserar humledrottningar. Under drottningens vintervila befäster sig S. bombi i hennes hemocoel vilket möjliggör upptag av näringsämnen direkt från hemolymfan. När infektionen fortskrider steriliseras drottningen och tiotusentals parasitavkommor frigörs med feaces [18]. Infektion inducerar

förändringar i värdfenotypen, genuttryck associerade med viktiga biologiska processer såsom mitokondriell funktion, immunsystemet och dygnsrytm förändras för att öka parasitöverlevnaden [19].

Kvalster

Mångfalden av kvalster, en grupp av spindeldjur, är oerhörd och organismerna återfinns över hela världen. Minst 15 olika arter av kvalster har påvisats hos bin och i deras bon men de flesta påverkar inte bina. Det endoparasistiska kvalstret Locustacarus buchneri infekterar dock bin och påverkar starkt deras hälsa och funktionalitet. Kvalstret infekterar larver, puppor och vuxna bins luftvägar där de utvecklas och reproducerar sig, huvudsakligen infekteras vuxna drottningar och arbetare [20].

Provinsamling och analysmetoder

Insamlingen av biproverna till projektet genomfördes sommaren 2018. Insamling skedde i närheten av växthus- och tunnelodlingar där odlade bin nyttjats i minst tolv år samt från matchande

kontrollandskap där odlade bin aldrig använts. Proverna förvarades individuellt och placerades i

-20C frys vid dagens slut. De transporterades till Sveriges lantbruksuniversitet på torris (-40C) och förvarades sedan i -20C fram till analystillfället.

Kvantifieringen av patogener skedde på extraherad nukleinsyra, på RNA omvandlat till cDNA för virus samt på DNA för protozoerna, nematoden och kvalstret. Kvantifieringen av arvsmassa från de tio patogenerna hos varje individuellt biprov utfördes med riktad RT-qPCR med SYBR green detektion. PCR är den känsligaste analysmetoden för syftet p.g.a det låga tröskelvärdet och därmed höga sannolikhet att patogenen i fråga upptäcks. Analysmetoden är även mycket specifik och robust. Det är i princip samma tillvägagångssätt vid varje PCR-analys för de olika patogenerna, det som skiljer sig åt och som gör analysen specifik är vilka primers som används.

Specifika nukleinsyrasekvenser amplifierades och detekterades beroende på val av primerpar, därmed kvantifierades endast arvsmassan från den patogen vars matchande primers användes. Varje PCR-analys avslutades även med en smältpunktsanalys där resultatet är beroende av specificiteten av de amplifierade nukleinsyrasekvenserna i provet. Vid en smältpunktsanalys ökar temperaturen kontinuerligt med korta tidsintervall. Efter varje temperaturökning mäts fluorescensen som är direkt proportionellt mot mängden dsDNA i provet. Smältpunkten, d.v.s. då dsDNA separeras till ssDNA, beror på nukleinsyrasekvensens sammansättning och längd. För att separera strängarna i kortare fragment krävs lägre energitillförsel, smältpunkten är således lägre än för längre fragment.

Varje prov analyserades för fem patogener med DNA-genom och fem patogener med RNA- genom men även för två externa referensnukleinsyror; RNA250 och pJET1.2. Bestämda

koncentrationer av dessa två referenser tillsattes extraktionsbufferten, RNA250 som RNA-referens och pJET1.2 som DNA-referens. Mängden som sedan fanns kvar i provet efter qPCR-analys användes som en omvandlingsfaktor för att uppskatta den sanna kvantiteten av varje patogen i varje enskilt biprov med hänsyn till eventuellt nukleinsyrabortfall under analysernas genomförande.

Teknisk och metodologisk variation i de olika analysstegen togs på så sätt i hänsyn vid sammanställning av den kvantitativa datan. Dock togs inte hänsyn till det eventuella

nukleinsyrabortfallet vid sammanställnings av den kategoriska datan, d.v.s. vid bedömning om proven var positiva eller negativa för respektive patogen. Det är den kategoriska datan som används för att svara på studiens frågeställning och är därmed den data som presenteras i resultatet, de externa referenserna har således ingen inverkan på resultatet i denna studie.

Syfte

Studien är en del av ett större projekt med syftet att undersöka risken av födokonkurrens, genetisk förorening samt smittspridning (före och efter pollinering) mellan kommersiellt framtagna, importerade, odlade bin och svenska vilda bin. Syftet med denna studie var att med hjälp av

molekylärbiologiska metoder undersöka förekomsten av tio patogener hos vilda bin samt avgöra hur smittbilden skiljer sig mellan områden med eller utan odlade bin.

MATERIAL OCH METOD

Material

Studiematerial

Under juni och juli 2018 samlades stora mängder vilda bin in från olika områden i Skåne, både från områden där kommersiellt framtagna odlade bin (B. terrestris) brukades samt från platser där de inte brukades. Insamlingen skedde vid två tillfällen med sex veckors mellanrum i syfte att undersöka förekomsten av patogener före och efter pollinering. En metadata lista utformades innehållande information om insamlingsförhållandet av de individuella bina. I listan inkluderades bland annat datum, tid, GPS-koordinater, väderförhållande, växtart som biet fångats på samt

provtagarens identitet. Även data om avståndet från områdets mittpunkt samt producent och täthet (antal bisamhällen inom 2 km radie) av eventuella odlade bin listades.

Proven från den första insamlingen är analyserade och kvar finns de 600 biprover som samlades in under den andra omgången. I denna studie analyserades 236 av dessa varav 56 prover insamlade i närheten av tunnelodling (T), 79 prover insamlade i närheten av växthusodling (V) samt 38 (KT) respektive 63 (KV) biprover insamlade från matchande kontrollandskap utan odlade bin.

Etik

Ingen etiknämnds etiska godkännande krävdes för denna studie. Studiens syfte var tillämpad forskning inom biologisk miljöövervakning till nytta för bin och deras välfärd samt till ekonomisk nytta för människan. Projektets resultat kan användas som kunskapsunderlag för att eventuellt föra in förebyggande åtgärder för ohälsa hos bin alternativ till underlag för fortsatt forskning inom välfärden av pollineringsinsekter. Massdödande av bin har dokumenterats och att ta reda på den bakomliggande orsaken är avgörande för att förhindra eventuellt framtida utrotningshot. Generellt krävs etiskt godkännande för datahantering (GDPR) samt från etikprövningsmyndigheten och/eller den regionala djurförsöksetiska nämnden (Jordbruksverket) beroende på typ av forskningsmaterial.

En etisk prövning av nytta gentemot lidande krävs inte för denna studie då insekter inte tillhör djurslag som räknas till försöksdjur.

Hållbarhetsperspektiv

Kunskapen som denna studie bidrar med är till nytta ur ett miljömässigt- samt ekonomiskt

hållbarhetsperspektiv. Kunskap om smittspridning medför möjlighet till förebyggande åtgärder och således möjlighet till att minska risken för utrotning av biarter. De ekonomiska förluster som ett eventuellt förbud mot införande av odlade bin alternativ massdöd av bin skulle innebära är ojämförbart större än de ekonomiska kostnaderna av projektet. På laboratoriet minimerades

åtgången av engångsmaterial i största möjliga mån utan att påverka kvaliteten av resultatet och avfall sorterades enligt regelverket för återvinning.

Metoder

Dissektion och homogenisering

Den högsta koncentrationen av patogener återfinns i biets buk vilket är anledningen till att buken användes för homogenisering för vidare RNA/DNA extraktion och kvantifiering. Buken

separerades från resterande kroppsdelar med steril skalpell och placerades i 2 mL eppendorfrör.

Rören innehållande resterande kroppsdelar frystes ned för eventuell framtida användning. Till vardera bukprov tillsattes 800 µL TBS-buffert (50 mM Tris-HCl, pH 7,5/ 150 mM NaCl)

innehållande 10 ng/mL RNA250 och 1 ng/mL pJET1.2. RNA250 (ThermoFisher AM7155) samt pJET1.2 (ThermoFisher K1231) är koncentrationsreferenser för RNA respektive DNA och användes efter qPCR-analys för bedömning av mängden nukleinsyra som bortfallit under analyserna. Extraktionsbufferten tillreddes omedelbart före användning och tillsattes provrören tillsammans med fem till sju glaskulor (1 mm diameter) inför skak i +20C vid 30 hz i 4 min (Laboratory mixer mill Retsch MM400). Inför efterföljande RNA- respektive DNA extraktion delades proverna upp i två 2 mL provrör med 100 µL homogenat i vardera rör.

DNA- och RNA extraktion samt spektrofotometrisk analys

För DNA-extraktionen adderades 180 µL enzymatisk lyseringsbuffert (20 mM Tris-Cl/2 mM EDTA/1,2% Triton X100/20 mg/mL lysozym) till det ena röret med 100 µL homogenat.

Extraktionen utfördes med ”DNeasy blood & tissue kit (250)²”. Det automatiserade QiaCube instrumentet³ (Qiagen) förbereddes med 12 prov, pipettspetsar, Proteinas K (25 µL per prov)

2 https://www.qiagen.com/br/products/top-sellers/dneasy-blood-and-tissue-kit/#orderinginformation. 2021-03-10 3 https://www.qiagen.com/br/products/instruments-and-automation/nucleic-acid-purification/qiacube-connect/?

cmpid=PC_QF_qiacube_0220_SEA_GA&gclid=CjwKCAiAp4KCBhB6EiwAxRxbpOlRc2N-

9CuFES9lScVigcmbI0PP_3zVd6yU6PoYOpoY12_DD_hZmxoCZSUQAvD_BwE&clear=true#orderinginformatio

buffertar samt med en ”DNeasy mini spin column” och ett 2 mL uppsamlingsrör per prov. Buffertar och volymen av dessa som användes per prov vid extraktionen var 200 µL AL-buffert, 200 µL etanol, 500 µL AW1-buffert, 500 µL AW2-buffert samt som elueringslösning användes 100 µL AE- buffert. Analys utfördes sedan enligt protokollet ”Blood and tissue for gram positive bacteria” som inkluderar steg optimerade för framrening av DNA via lysering, inbindning, tvättning och slutligen eluering.

För RNA-extraktionen adderades 350 µL RTL-buffert innehållande 1% β-mercaptoethanol (10 µL/mL, 142 mM) till det återstående röret med 100 µL homogenat. Funktionen av β-

mercaptoethanol var att inhibera ribonukleaser. QiaCube instrumentet (Qiagen) förbereddes med 12 prov, pipettspetsar, buffertar samt med en ”QIAshredder spin column”, en ”RNeasy mini spin column” och ett 2 mL uppsamlingsrör per prov. De buffertar och volymen av dessa som förbereddes per prov var 250 µL etanol, 700 µL RW1-buffert, 1000 µL RPE-buffert och 50 µL ribonukleasfritt vatten som elueringslösning. RNA extraherades sedan enligt protokollet ”RNeasy plant mini”⁴. Spektofotometrisk bedömning utfördes med NanoDrop omgående efter extraktionen eftersom RNA är ostabilt, därefter förvarades proverna i -20C tills cDNA-syntesen.

Efter genomförd RNA- respektive DNA-extraktion bestod vardera av de totalt 236 ursprungsbiproven av ett renat RNA-prov och ett renat DNA-prov. Efter extraktionerna utfördes spektrofotometrisk renhetskontroll och koncentrationsbestämning av DNA-proverna och RNA- proverna med NanoDrop (Thermo scientific). Absorbansmätning utfördes vid 260 nm då nukleinsyror har sin maximala absorbans samt vid 280 nm och 230 nm då proteiners respektive fenolföreningar har sin maximala absorbans. A260/A280 <2.0 indikerar att provet har

kontaminerats med proteiner, A260/A230 <2.0 indikerar kontamination med fenolföreningar.

Som blankprover användes ribonukleasfritt vatten och AE-buffer (10 mM Tris-Cl/0,5 mM EDTA, pH 9) för RNA respektive DNA då dessa användes som elueringsmedel vid föregående

extraktioner. Resultatet av kvantifieringen av total RNA/DNA användes vid spädning av proverna inför efterföljande RNA omvandling till cDNA samt inför qPCR-analys.

RT-qPCR

Förberedelser: cDNA syntes och tillredning av lösningar till standardkurvor

Syntes av cDNA med RNA-proverna som mall utfördes med ”First Strand cDNA Synthesis Kit”⁵ (Thermo scientific, K1612) med total RNA som templat. Inför cDNA-syntes späddes RNA-

proverna med ribonukleasfritt vatten till en slutkoncentration på 100 ng/µL och en totalvolym på 10 µL. Om provets RNA-koncentration var <100 ng/µL så späddes ej provet, slutkoncentrationen blev således detsamma som i ursprungsprovet. Till vardera prov adderades sedan 1 µL ”random hexamer primer” som kan binda till hela RNA-sekvensen vilket säkerställer omvänd transkription av

samtliga sekvenser, 4 µL 5X reaktionsbuffert, 1 µL ”RiboLock RNase inhibitor (20 U/µL)” , 2 µL 10 mM dNTP mix samt slutligen 2 µL av DNA-polymeraset ”M-MuLV Reverse transcriptase” (20 U/µL). cDNA-syntesen utfördes sedan med T100 Thermal Cycler⁶ (BIO RAD) enligt

inkubationsprotokollet: 5 min 25C, 60 min 37C och avslutningsvis 5 min 70C. Därefter späddes proverna 1:10 med ribonukleasfritt vatten till en totalvolym på 200 µL inför RT-qPCR.

För tillredning av sex standardlösningar av de tio patogenerna och för de två externa

referenserna användes syntetiska primers (Eurofins Genomics) respektive RNA250 (ThermoFisher AM7155) och pJET1.2 (ThermoFisher K1231), primersekvenserna anges i tabell 1. Tillredningen utfördes med 1:10 seriespädning i fem steg med TE-buffert (10mM Tris-HCl pH8/0,1 mM EDTA pH8) som spädningslösning. De högsta koncentrationerna av plasmiderna var följande: RNA250 0,010 ng/µL, ABPV 0,02 ng/µL, DWV 0,024 ng/µL, BQCV 0,015 ng/µL, SBV 0,013 ng/µL, SBPV 0,011 ng/µL, pJET1.2 0,05 ng/µL, N. bombi 0,039 ng/µL, A. bombi 0,023 ng/µL, C. Bombi 0,023

5 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K1612?SID=srch-hj-K1612#/K1612?SID=srch-hj-K1612. 2021- 03-10

6

ng/µL, L. buchneri 0,033ng/µL, S. bombi 0,016 ng/µL. Den lägsta koncentrationen efter seriespädningen var således x10^-5 den högsta koncentrationen.

Tabell 1: Primersekvenserna som användes vid tillredning av standardkurvor för respektive patogen och referens samt vid PCR-analys av proven för kvantifiering av respektive patogen och referens.

Patogen/ referens Forward primer 5’-3’ Reverse primer 5’-3’

Deformed wing virus GGTAAGCGATGGTTGTTTG CCGTGAATATAGTGTGAGG

Acute bee parlysis virus CCTTTCATGATGTGGAAAC CTGAATAATACTGTGCGTATC

Slow bee paralysis virus GYGCTTTAGTTCAATTRCC ATTATRGGACGTGARAATATAC

Black queen cell virus AGTGGCGGAGATGTATGC GGAGGTGAAGTGGCTATATC

Sacbrood virus GCTCTAACCTCGCATCAAC TTGGAACTACGCATTCTCTG

C. bombi CTTTTGGTCGGTGGAGTGAT GGACGTAATCGGCACAGTTT

A. bombi CCAGCATGGAATAACATGTAAGG GACAGCTTCCAATCTCTAGTCG

N. bombi TATGCCGACGATGTGATATG CACAGCATCCATTGAAAACG

S. bombi CGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGA GAAGCCTAGTGCGCACCTAAA

L. buchneri GGGAAGGTACAGGAACTGGATGAACT GAATGTAGACCTCTGGGTGTCCGAA

RNA250 TGGTGCCTGGGCGGTAAAG TGCGGGGACTCACTGGCTG

pJET1.2 CGAGGTTTAGAGCAAGCTTC ACACTTTATGCTTCCGGCTC

Efter preparationen av standardlösningarna utfördes RT-qPCR för att säkerställa att standardkurvorna blev som förväntat. Beroende på typ av patogen (RNA- eller DNA-genom) så adderades duplikat av lösningarna till två olika PCR-plattor som sedan analyserades med PCR instrumentet ”CFX Connect Real-Time PCR Detection System”⁷. PJET1.2 analyserades på separat PCR-platta då protokollet skilde sig från DNA-patogenernas. Protokollet för analys av RNA- patogener samt RNA250 var 3 min värmedenaturering i 95C med efterföljande 40 cykler av annealing och amplifiering enligt 95C i 15 sek + 58C i 20 sek. Slutlig smältpunksanalys med en 0.5C ökning var femte sekund från 55C till 95C. Protokollet för analys av DNA-patogener och pJET1.2 var 3 min värmedenaturering i 95C med efterföljande 40 cykler av annealing,

amplifiering och elongering enligt 95C i 15 sek + 60C (58C för pJET1.2) i 20 sek + 72C i 30 sek. Smältpunktsanalyserna följde samma protokoll som för RNA-patogener.

cDNA-prov

De 236 cDNA-proverna (56 T-prover + 38 KT-prover + 79 V-prover + 63 KV-prover) analyserades för fem RNA-virus samt för RNA250. Totalt analyserades 18 PCR-plattor, sex olika analyser per prov (80 prov per platta). Kvantifieringen av patogent cDNA utfördes enligt ovanstående protokoll för RNA-patogener. Analysen av cDNA utfördes med ett qPCR kit, ”SsoFast EvaGreen Supermix⁸” (Bio Rad), enligt medföljande instruktioner. Till 94 brunnar tillsattes 8 µL buffert bestående av mastermix, ribonukleasfritt vatten, samt ”forward primer” (400 nM) och ”reverse primer” (400 nM) bestående av respektive syntetiska primers och RNA250. Till tolv av dessa brunnar tillsattes sedan 2 µL standardlösningar (duplikat), till två brunnar tillsattes 2 µL ribonukleasfritt vatten (duplikat) med funktion som negativa kontroll och till resterande 80 brunnar tillsattes 2 µL cDNA-prov.

DNA-prov

De 236 DNA-proverna (56 T-prover + 38 KT-prover + 79 V-prover + 63 KV-prover) analyserades för fem patogener med DNA-genom (tre protozoer, en nematod, ett kvalster) samt för pJET1.2.

Totalt analyserades 18 PCR-plattor, sex olika analyser per prov (80 prov per platta). Kvantifieringen av patogent DNA samt pJET1.2 analyserades enligt samma protokoll som vid tillredning av

standardlösningarna. DNA-proverna späddes med ribonukleasfritt vatten till en koncentration på 20 ng/µL (baserat på resultatet från föregående spektrofotometri) och en slutvolym på 50 µL. Om DNA-koncentrationerna var <20 ng/µL så späddes ej provet, slutkoncentrationen blev således detsamma som i ursprungsprovet. Utförandet var sedan detsamma som vid analys av cDNA- proverna.

8 https://www.bio-rad.com/en-se/sku/1725201-ssofast-evagreen-supermix-500-x-20-ul-rxns-5-ml-5-x-1-ml?

Statistisk analys

För att bedöma om de eventuella skillnaderna av patogenprevalens mellan grupperna (tunnelodling:

T, växthusodling: V, kontrollprover: KT och KV) var statistiskt signifikant utfördes ”two-proportion z-test” vid signifikansnivå α=0,05. Testet möjliggjorde jämförelse av andelar mellan två grupper bestående av normalfördelad binomialdata. Enligt nollhypotesen fanns ingen skillnad i

patogenprevalens mellan grupperna (H0: p1= p2), den alternativa hypotesen var således att det fanns en skillnad mellan grupperna (H1: p1 ≠ p2). Om z-värdet beräknades till -1,96 ≤ z ≤ 1,96 så

accepterades nollhypotesen medan om z < -1,96 eller z > 1,96 förkastades nollhypotesen till fördel av den alternativa hypotesen.

RESULTAT

Biprover insamlade från tunnelodling (T), växthusodling (V) och matchande kontrollandskap (KT och KV) analyserades för tio patogener vardera med qPCR. Syfte var att bedöma om det förelåg en skillnad mellan patogenprevalensen hos vilda bin som lever i samvaro med odlade bin jämfört med patogenprevalensen hos vilda bin som inte gör det.

Andelen infekterade bin inom respektive grupp (= det kategoriska resultatet) beräknades baserat på qPCR-resultaten. För att eliminera falskt positiva resultat sattes cykeltröskelvärdet till ct

≤ 35. Fluorescenströskelvärdet sattes till 200 Relative fluorescense units (RFU) för att eliminera eventuella tekniska artefakter. Grupperna utgjordes av bin insamlade från tunnelodling (T), bin insamlade från växthusodling (V) samt bin insamlade från matchande kontrollandskap (KT och KV). Patogenprevalensen jämfördes mellan T-prover och KT-prover samt mellan V- prover och KV- prover, utöver detta jämfördes även T-prover med V-prover.

Analysresultaten av bin insamlade från tunnelodling (T) och motsvarande kontrollandskap (KT) presenteras i figur 1. Ingen infektion av ABPV eller S. bombi detekterades hos någon av grupperna. För virusinfektion med SBV och BQCV var andelen infekterade bin signifikant högre hos de bin som levt i närheten av en tunnelodling (p< 0,0003) med en prevalens på 2,6 respektive 2,3 gånger högre bland tunnelproverna . Det motsatta gällde för infektion med DWV (p<0,0003) och L. buchneri (p=0,0122) då andelen smittade bin var signifikant högre hos de bin som inte levt i samvaro med odlade bin. Prevalensen av DWV var 3,6 gånger högre och prevalensen av L.

buchneri var 7,4 gånger högre bland kontrollproverna. Det förelåg inte en signifikant skillnad

gällande den generella prevalensen av samtliga patogener mellan de två grupperna, andelarna var 0,2768 och 0,2632 för T respektive KT (p=0,29).

Figur 1: Andelen infekterade vilda bin av respektive patogen insamlade i närheten av tunnelodling (T) och från kontrollandskap (KT). Det totala antalet analyserade bin var nT = 56 och nKT = 38. Resultaten redovisas som andel ± standardavvikelse. ”*” ovanför stapeln indikerar en statistisk signifikant skillnad i patogenprevalens mellan de två

grupperna. Förklaring av förkortningarna: ABPV= Acute bee paralysis virus, SBPV= Slow be paralysis virus, DWV=

Deformed wing virus, SBV= Sacbrood virus, BQCV= Black queen cell virus.

Patogenprevalensen bland bin insamlade från växthusodling (V) och motsvarande

kontrollandskap (KV) presenteras i figur 2. Andelarna positiva bin varierar beroende på patogen och mellan grupperna. De patogener där prevalensen hos bin var signifikant högre i en av grupperna var DWV och A. bombi. Andelen infektion med DWV var 1,4 gånger högre hos bin som inte levt i samvaro med odlade bin (p=0,0094) medan andelen infektion med A. bombi var 1,4 gånger högre hos de bin som levt i närheten av en växthusodling som brukar odlade bin (p=0,0158). Andelen infekterade bin av samtliga patogener i de båda grupperna var 0,3595 för V-proverna och 0,3698 för KV-proverna (p=0,3264).

Figur 2: Andelen infekterade vilda bin insamlade i närheten av växthus (V) som brukar odlade bin och från kontrollandskap (KV) utan odlade bin. Det totala antalet analyserade prover var nV =79 och nKV= 63. Resultaten redovisas som andel ± standardavvikelse. Utmärkelsen ”*” ovanför stapeln indikerar en statistisk signifikant skillnad i patogenprevalens mellan de två grupperna. För förklaring av patogenförkortningarna se figurtext 1.

Vid jämförelse av grupperna T-prover och V-prover så var den generella skillnaden av samtliga patogenprevalenser signifikant högre bland växthusproverna (p=0,0006), se figur 3.

Andelarna positiva prover var 0,2768 för T-proverna och för V-proverna var prevalensen 1,3 gånger högre med en andel på 0,3595. Gällande infektion av enskilda patogener så påträffades inte ABPV hos någon av grupperna och det var en signifikant högre andel infektion med SBPV (p=0,003), DWV (p<0,0003) och BQCV (p=0,0006) bland bin insamlade i närheten av växthus jämfört med tunnelodling. Prevalensen av ovanstående tre virus var 2,3, 3,5 respektive 1,3 gånger högre bland V- proverna jämfört med T-proverna.

Figur 3: Jämförelse av prevalensen av enskilda patogener hos bin insamlade i närheten av tunnelodling (T) respektive växthusodling (V). Resultatet redovisas som andel ± standardavvikelse. ”*” utmärkelse vid staplarna i figuren indikerar att skillnaden är statistisk signifikant. För förklaring av patogenförkortningarna se figurtext 1.

Slutligen var prevalensen RNA-patogener (DWV, ABPV, SBPV, BQCV, SBV) signifikant högre än prevalensen DNA-patogener (C. bombi, A. bombi, N. bombi, S. bombi, L. buchneri) hos

samtliga analyserade bin (p<0.0003). Den genomsnittliga andelen bin infekterade med DNA- patogener vad 0,2431 och gällande RNA-patogener var prevalensen 1,6 gånger högre med en andel på 0,3915.

DISKUSSION

Import av odlade bin har tidigare visats påverka smittspridningen av patogener bland inhemska bin och kan därmed utgöra ett hot mot vissa biarters överlevnad [21]. Resultatet från denna studie bekräftar inte att införandet av odlade bin i växthus- och tunnelodling leder till en ökad

patogenprevalens bland vilda bin när det gäller tio vanligt förekommande bipatogener i den svenska naturen.

Resultaten var till stor del inkonsekventa när det gäller jämförelse av patogenprevalensen mellan de olika grupperna (T- KT och V- KV). Förutom DWV så var ingen patogen mer

förekommande i båda kontrollgrupperna (KT, KV) alternativt i båda testgrupperna (T, V).

Prevalensen av infektion med DWV var signifikant högre i båda kontrollgrupperna jämfört med respektive testgrupp vilket motsäger orosfrågan gällande att kommersiellt framtagna bin eventuellt ökar förekomsten av patogener hos vilda bin. Graystock et al. [22] utförde en studie år 2011 i England som dock styrker orosfrågan. Författarna undersökte 764 bin från fem växthus som

antingen brukar eller inte brukar kommersiellt framtagna bin. De enskilda bina analyserades för sex patogener, varav fyra var desamma som studerats i denna studie; A. bombi, C. Bombi, N. bombi och DWV. Resultatet visade att prevalensen av infektion med A. bombi och C. Bombi var högre hos bin insamlade i närheten av växthus som brukar odlade bin samt att N. bombi och DWV var sällsynta (<1% prevalens). Resultatet stämmer överens med resultatet från denna studie när det gäller

jämfört med kontrollproverna (KV). Vid jämförelse av resultaten för resterande patogener så motsäger dessa varandra. Författarna såg även en generellt ökad patogenrikedom hos bin insamlade i växthusområden som brukar odlade bin medan denna studie inte visar på en liknande signifikant skillnad.

Alger et al. [23] utförde en liknande studie i Vermont 2015. Författarnas resultat visade bland annat på en högre prevalens av BQCV bland bin insamlade från områden med närliggande bigård med odlade bin jämfört med bin från området utan odlade bin. Resultatet överensstämmer med denna studies resultat då prevalensen BQCV var signifikant högre bland T-proverna jämfört med KT-proverna, sambandet gällde dock inte vid jämförelse av V- och KV- proverna. Andelen BQCV-positiva bin bland T-proverna var 0,6607 medan andelen positiva bin insamlade i närheten av en bigård i studien utförd av Alger et al. var 0,905. För KT-proverna var resultatet 0,2895 och för kontrollproverna i Vermont var resultatet 0,679. Den generella prevalensen av BQCV var därmed högre i resultatet från Alger et al., dock så var skillnaden i prevalens mellan testgrupperna och kontrollgrupperna högre i denna studie. Skillnaden i prevalens var 2,3 gånger högre bland T- proverna jämfört med KT-proverna och endast 1,3 gånger högre i motsvarande resultat från Vermont. Ytterligare detekterade Alger et al. ingen infektion med DWV bland bin som levt utan samvaro med odlade bin vilket står i stor kontrast till resultatet från denna studie.

Anledningen till att resultaten från tidigare studier skiljer sig från denna studie kan vara geografiska av två orsaker, den första gällande i vilket land studien utförts och vilka patogener som är naturligt förekommande bland pollinatörer i området. Den andra gällande var de kommersiellt framtagna, odlade bina har sitt ursprung och därav vilka patogener som de bär med sig.

Anledningarna kan även vara artberoende, det vill säga vilken biart som importerats samt hur länge odlade bisamhällen har brukats i området. Ytterligare anledning kan vara eventuell variation i förekomst av vektorer, exempelvis V. destructor, vilka ökar smittöverföringen mellan vissa biarter [10]. Stickprovens storlek kan även vara en orsak till de varierande resultaten. Slutligen påverkas

även resultatet av studieupplägget, bland annat insamlingsmetoderna, provtransport- och förvaring, val av analysmetoder samt teknisk och metodologisk variation.

En nackdel med upplägget av denna studie var det eventuella bortfallet av mängden

DNA/RNA i proven under analyserna. Från dissektion till slutlig qPCR tinades och frystes proverna ett antal gånger och de var upptinade under längre perioder under analysernas förberedelser. Detta kan orsaka sönderfall av nukleinsyrorna i proverna, i synnerhet gällande extraherat RNA som är extra känsligt för denaturering. De extraherade RNA-proverna genomgick även cDNA syntes vilket var ytterligare ett utsättande steg för proverna. Kvantifieringen av DNA respektive RNA kan således bli falskt låg. Det eventuella bortfallet av nukleinsyra förutsågs vilket var anledningen till att de två externa referenserna RNA250 och pJET1.2 tillsattes extraktionsbufferten. Kvantifieringen av de enskilda proverna justerades därmed med den omvandlingsfaktor som erhållits vid jämförelse av koncentrationen tillsatt extern referens och koncentrationen uppmätt extern referens vid qPCR.

Kvantifieringsresultatet påverkar dock inte frågeställningen i denna studie och redogörs därmed inte i denna rapport. Resultatet som redogörs för i denna rapport är det kategoriska resultatet, det vill säga andelarna positiva prov för respektive patogen. Vid beräkning av detta resultat så togs dock inte hänsyn till det eventuella bortfallet av nukleinsyra. Det kategoriska resultatet erhölls utifrån resultaten från qPCR-analysen där prov som hade ct≤35 och ≤200 RFU efter rensning av resultaten utifrån smältpunktskurvan ansågs positiva för analyserad patogen. En förbättring av studien skulle således vara att ta hänsyn till det eventuella bortfallet av nukleinsyra utifrån analysresultaten av de externa referenserna även vid statistisk analys av den kategoriska datan. Teknisk och metodologisk variation tas på så sätt i hänsyn både vid sammanställning av den kvantitativa datan samt vid den kategoriska datan.

Prevalensen av tre av fem analyserade virus (SBPV, DWV och BQCV) var signifikant högre bland bin insamlade från växthusodling jämfört med bin insamlade från tunnelodling. En anledning till detta kan vara naturgeografin i omgivningen. Kontrollgrupperna (KT och KV) valdes ut för att

matcha respektive område som omgav växthusen respektive tunnelodlingarna. Dock så matchades inte omgivningarna kring växthusen med omgivningarna kring tunnelodlingarna. Bina insamlade och tillhörande de två grupperna levde därmed i olika miljöer vilket kan påverka

patogenprevalensen. Det är aspekter i miljön så som typ av vegetation, berg, jord, vatten och artificiella ytbeläggningar som kan variera och påverka [8]. En justering av detta skulle vara en förbättring inför utförandet av en liknande studie i framtiden.

Enligt denna studies resultat var prevalensen av RNA-patogener signifikant högre än prevalensen DNA-patogener hos samtliga analyserade bin. Orsaker till att RNA-virus är

framträdande bland de patogener som angriper en stor artvariation och däribland pollinatörer är att de uppvisar höga mutationshastigheter och därmed evolverar snabbt [24]. Över 30 olika virusarter har identifierats hos A. mellifera och nya stammar samt variationer inom stammar upptäcks kontinuerligt [9]. Det är fyra grundläggande egenskaper hos virus som leder till den höga

mutationshastigheten, selektionen och genetiska driften, Virus har (I) explosiv replikering, 10⁴ virala kopior kan uppstå från en viruspartikel inom tio timmar [24]. Detta leder i sin tur till (II) en stor populationsstorlek, antalet viruspartiklar hos en värd kan vara 10¹²-faldig. På grund av (III) bristen på korrekturläsning vid replikering ökar mutationerna vilket gör att RNA-virus uppvisar den högsta mutationshastigheten jämfört med någon annan grupp av organismer vilket leder till (IV) små genomstorlekar. RNA-virus genomstorlek varierar mellan 3-30 kb med ett genomsnitt på 9 kb [24].

Resultaten från denna studie stämmer överens med resultaten som hittills erhållits från det större projektet ”Biologiska hot mot humlor” [8]. Projektet har hittills inte kunnat påvisa att odlade bin leder till en ökad förekomst av patogener hos vilda bin i närområdet när det gäller redan

existerande patogener i den svenska naturen. Dock så kan det medföra en ökad smittspridning bland andra vilda pollinatörer. Det större hotet bedöms vara att tidigare okända, nya patogener för vilda bin kan föras in med importerade bin och därmed utgöra en risk och detta även vid låga nivåer av patogenen i fråga [8]. Murray et al. [25] instämmer med detta, författarna säger att överföringen av

patogener från kommersiella bin till vilda populationer orsakar två hot; införandet av nya patogener och att kommersiellt importerade bin kan agera som reservoarer för patogener vilket leder till en ökad förekomst av dessa bland vilda populationer. Framtida studier bör fokusera på dessa två frågeställningar och utföras genom kontrollerade fältstudier.

Efter att med molekylärbiologiska metoder undersökt förekomsten av tio patogener bland vilda bin kan man sammanfattningsvis konstatera att smittbilden inte skiljer sig mellan områden med eller utan importerade kommersiella humlesamhällen (B. terrestris). Resultaten var till stor del inkonsekventa vid jämförelse av prevalensen av de tio individuella patogenerna mellan

testgrupperna (T och V) och kontrollgrupperna (KT och KV). Det förelåg ingen signifikant skillnad vid jämförelse av den generella förekomsten av samtliga patogener mellan T- och KT-prover samt V- och KV-prover. Enligt resultatet är dock prevalensen av RNA-patogener signifikant högre än prevalensen DNA-patogener hos samtliga analyserade bin.

TILLKÄNNAGIVANDE

Jag vill framföra ett stort tack till bigruppen på institutionen för ekologi på Sveriges

lantbruksuniversitet i Uppsala för möjligheten att utföra mitt examensarbete. Särskilt tack till mina praktiska handledare Piero Onorati och Joachim de Miranda för det stöd de givit under det

laborativa arbetet samt för det engagemang och den kunskap de delat med sig av. Jag vill även tacka min projektgrupp för den konstruktiva kritiken jag fått under det skriftliga arbetet med denna rapport.

REFERENSER

[1] Garibaldi LA, Steffan-Dewenter I, Winfree R, Aizen MA, et al, Wild pollinators enhance fruit set of crops regardless of honey bee abundance, Science, 344, (2014), p. 1608-1611.

[2] Olgun T, Everhart SE, Anderson T, Wu-Smart J, Comparative analysis of viruses in four bee species collected from agricultural, urban, and natural landscapes, PLoS One, 15, (2020), e0234431.

[3] Scott Z, Ginsberg HS, Alm SR, Native bee diversity and pollen foraging specificity in cultivated highbush blueberry (Ericaceae: Vaccinium corymbosum) in Rhode Island, Environ Entomol, 45, (2016), p. 1432-1438.

[4] Evans JD, Spivak M, Socialized medicine: individual and communal disease barriers in honey bees, J Invertebr Pathol, 103, (2010), p. 62-72.

[5] McMahon DP, Fürst MA, Caspar J, Theodorou P, et al, A sting in the spit: widespread cross- infection of multiple RNA viruses across wild and managed bees, J Anim Ecol, 84, (2015), p. 615- 624.

[6] Pedersen TR, Bommarco R, Ebbersten K, Falk A, et al, (2009), Massdöd av bin - samhällsekonomiska konsekvenser och möjliga åtgärder, Rapport 2009:24, pp. 1-175, Jordbruksverket, Sverige.

[7] Pedersen TR, Forsgren E, Gröntoft M, Karlsson I, et al, (2020), Biologiska hot mot honungsbin, Rapport 2020:7, pp. 1-40, Jordbruksverket, Sverige.

[8] Pedersen TR, Forsgren E, Henriksson J, Herbertsson L, et al, (2020), Biologiska hot mot humlor, Rapport 2020:14, pp. 1-140, Jordbruksverket, Sverige.

[9] McMenamin AJ, Daughenbaugh KF, Parekh F, Pizzorno MC, et al, Honey bee and bumble bee antiviral defense, Viruses, 10, (2018), p. 395.

[10] Wilfert L, Long G, Leggett HC, Schmid-Hempel P, et al, Deformed wing virus is a recent global epidemic in honeybees driven by Varroa mites, Science, 351, (2016), p. 594-597.

[11] Santillán-Galicia T, Ball BV, Clark SJ, Alderson PG, Slow bee paralysis virus and its transmission in honey bee pupae by Varroa destructor, J Apic Res, 53, (2014), p. 146-154.

[12] Maori E, Lavi S, Mozes-Koch R, Gantman Y, et al, Isolation and characterization of Israeli acute paralysis virus, a dicistrovirus affecting honeybees in Israel: evidence for diversity due to intra- and inter-species recombination, J Gen Virol, 88, (2007), p. 3428-3438.

[13] Grabensteiner E, Ritter W, Carter MJ, et al, Sacbrood virus of the honeybee (Apis mellifera):

rapid identification and phylogenetic analysis using reverse transcription-PCR, Clin Diagn Lab Immunol, 8, (2001), p. 93-104.

[14] Leat N, Ball B, Govan V, Davison S, Analysis of the complete genome sequence of black queen-cell virus, a picorna-like virus of honey bees, J Gen Virol, 81, (2000), p. 2111-2119.

[15] Plischuk S, Meeus I, Smagghe G, Lange CE, Apicystis bombi (Apicomplexa:

Neogregarinorida) parasitizing Apis mellifera and Bombus terrestris (Hymenoptera: Apidae) in Argentina, Environ Microbiol Rep, 3, (2001), p. 565-568.

[16] Yourth CP, Schmid-Hempel P, Serial passage of the parasite Crithidia bombi within a colony of its host, Bombus terrestris, reduces success in unrelated hosts, Proc Biol Sci, 273, (2006), p. 655- 659.

[17] Otti O, Schmid-Hempel P, Nosema bombi: A pollinator parasite with detrimental fitness effects, J Invertebr Pathol, 96, (2007), p. 119-124.

[18] Poinar GO, Hess R, Food Uptake by the Insect-Parasitic Nematode, Sphaerularia bombi (Tylenchida), J Nematol, 4, (1972), p. 270-277.

[19] Colgan TJ, Carolan JC, Sumner S, Blaxter ML, et al, Infection by the castrating parasitic nematode Sphaerularia bombi changes gene expression in Bombus terrestris bumblebee queens, Insect Mol Biol, 29, (2020), p. 170-182.

[20] Plischuk S, Pocco ME, Lange CE, The tracheal mite Locustacarus buchneri in South American native bumble bees (Hymenoptera: Apidae), Parasitol Int, 62, (2013), p. 505-507.

[21] Ravoet J, De Smet L, Meeus I, Smagghe G, et al, Widespread occurrence of honey bee pathogens in solitary bees, J Invertebr Pathol, 122, (2014), p. 55-58.

[22] Graystock P, Goulson D, Hughes WO, The relationship between managed bees and the prevalence of parasites in bumblebees, PeerJ, 522, (2014), e522.

[23] Alger SA, Burnham PA, Boncristiani HF, Brody AK, RNA virus spillover from managed honeybees (Apis mellifera) to wild bumblebees (Bombus spp.), PLoS One, 14, (2019), e0217822.

[24] Moya A, Holmes EC, González-Candelas F, The population genetics and evolutionary epidemiology of RNA viruses, Nat Rev Microbiol, 2, (2004), p. 279-288.

[25] Murray TE, Coffey MF, Kehoe E, Horgan FG, Pathogen prevalence in commercially reared bumble bees and evidence of spillover in conspecific populations, Biol Conserv, 159, (2013), p.

269-276.