Institutionen för kvinnors och barns hälsa Biomedicinska analytikerprogrammet
Examensarbete 15 hp 2020
Analysis and validation of Interferon Regulatory Factor 5 (IRF5) on circulating microparticles in patients with SLE.
Wanwisa Singthongthat
Handledare: Fariborz Mobarrez, universitetslektorer. Avdelningen för Klinisk kemi och farmakologi, Akademiska sjukhuset, Uppsala.
Examinator: Dick Wågsäter. Institutionen för medicinsk cellbiologi.
E-post: dick.wagsater@mcb.uu.se
Abstract
Introduction: Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease that cause various inflammatory conditions in the body. The pathogenesis of this disease is yet
unknown, and the diversity within the patients bring on major obstacle to clinical research for specific diagnostic markers. As a biomarker of SLE, both Interferon Regulatory Factor-5 (IRF5) and Microparticles (MP) have been suggested. Recently a study demonstrated higher concentration of IRF5+ MP in a small number of SLE patients compared to controls.
Aim: The purpose of this study was to validate and analyze IRF5+ MPs in a larger number of SLE patients and compare the results to known SLE subgroup based on IRF5 concentration.
Materials and methods: Totally 50 plasma samples from a larger cohort of SLE-patients (n=35) was analyzed together with population-based controls(n=15). Three different antibodies (in-house and commercial) were used for detection of IRF5+ MP with flow cytometry. Students t-test was used to investigate significant differences between SLE subgroup, controls and compared to the previous values.
Results and Conclusion: The concentration of IRF5+ MP in SLE subgroup was significantly higher compared to controls (p<0,05). However, there were no correlations between our results and the values from the previous study, suggesting that both methods measure various forms of IRF5. These results imply that IRF5+ MP could be a possible biomarker for
pathogenesis in SLE, but further studies are needed for a better understanding of IRF5, as well as of MP.
Populärvetenskaplig sammanfattning
Bakgrund: Systemisk lupus erythematosus (SLE) är en autoimmunsjukdom som orsakar olika inflammatoriska tillstånd i kroppen när immunförsvaret gå till attack mot kroppsegna vävnader. Sjukdomen är obotlig och mekanismen bakom sjukdomen är fortfarande okänd.
Proteinet IRF5 har som funktion att bland annat reglera immunförsvaret, har tillsammans med mikropartiklar (MP) som är små vesiklar som frisätts från celler vid cellaktivering och
celldöd, visat vara associerat med SLE. Nyligen har man upptäckt förekomsten av IRF5 på MP (IRF5+ MP) hos ett mindre antal SLE-patienter. Patienter med SLE har högre
koncentration av IRF5+ MP i plasma jämfört med friska och man tror att proteinet skulle kunna vara en möjlig patogenes för SLE.
Syfte: Målet med denna studie var att validera och analysera IRF5+ MP i en större grupp SLE-patienter och jämföra resultat med tidigare definierade SLE subgrupper baserat på koncentrationen av IRF5.
Material och metod: Totalt analyserades 50 plasmaprover (35 SLE-prover och 15
populationsbaserade kontrollprover). Tre antikroppar användes för detektion av IRF5+ MP med flödescytometer.
Resultat och slutsats: Koncentrationen av IRF5+ MP i SLE-subgrupperna var säkerställt högre jämfört med kontrollprover (p<0,05). Resultaten visade dock ingen korrelation med de värdena från en tidigare studie, vilket talar för att både metoderna mäter olika former av samma protein. Slutsatsen av denna studie visar att IRF5+ MP kan vara en potentiell biomarkör för uppkomsten av sjukdomen, men vidare studier krävs för att öka förståelse av IRF5 och MPs biologiska funktioner.
Keywords
:
Systemic Lupus Erythematosus, Rheumatic disease, Extracellular vesicles,Introduktion
Systemisk lupus erythematosus (SLE)
Systemisk lupus erythematosus är en systemisk autoimmun sjukdom som kännetecknas av olika inflammatoriska tillstånd, som kan drabba alla organ i kroppen. Inflammationen i SLE karakteriseras av olika immunologiska störningar som är oftast associerade med produktion av autoantikroppar mot kroppsegna nukleinsyror, kallat antinukleära antikroppar. Dessa autoantikroppar bildar sedan ett immunkomplex som kan binda in till kroppsegna vävnader och orsaka inflammation [1].
SLE är en multifaktoriell sjukdom där dels miljöfaktorer, hormoner, genetik och epigenetiska förändringar kan bidra till utvecklingen av sjukdomen. SLE är vanligast bland kvinnor i fertil ålder, den hormonella faktorn kan vara en orsak till det [1]. I nuläget finns inga specifika markörer för sjukdomen och diagnosen ställs utifrån kliniska och immunologiska kriterier enligt ”American College of Rheumatology”, som fastställdes i en internationell konferens år 1982 [2]. SLE är obotligt, men de inflammatoriska symtomen kan lindras med hjälp av olika antiinflammatoriska behandlingar och immunsuppressiva terapier. Dessa terapier kan dock medföra biverkningar som ökar risken för andra infektioner samt för benskörhet (osteoporos), därmed är utveckling av en målinriktad terapi önskvärt [1,3].
Mikropartiklar i SLE
Mikropartiklar (MP) är en grupp extracellulära vesiklar som frisätts från olika celltyper till blodomloppet vid cellaktivering eller celldöd. Vid cellaktivering kan MP fungera som en budbärare av signalmolekyler för kommunikation mellan cellerna. Vid apoptos har MP som funktion att bland annat omsluta cellens inre komponenter för att underlätta undanröjning av cellrester. Därmed uttrycker MP samma markörer på sin membranyta som ursprungscellerna
uttrycker vid cellaktivering eller celldöd. I blodet är MP med ursprung från trombocyter vanligast och frisätts vid trombocytaktivering och kan främja pro-trombotisk aktivitet. Det är viktigt att notera att MP och apoptotiska kroppar är två enskilda ämnen. MP är avsevärt mycket mindre än apoptotiska kroppar och definierad som partiklar med storlek mellan 0,1 µm - 1 µm. MP frisätts i form av “avknoppning” av plasmamembranet medan apoptotiska kroppar är cellrester som uppkommer efter cellkrympning eller en apoptotisk process [4].
Hos patienter med SLE kan mikropartiklar vara verksamma som proinflammatoriska mediatorer. Nivåer av MP har visat sig vara förhöjd hos patienter med SLE jämfört med populationskontroller. Detta förklaras med att den instabila immunologiska reaktionen hos patienter med SLE orsakar en ökad cellaktivering och celldöd. Dessa MP kan uttrycka vissa proteiner på sin yta som kan ge upphov till en mer omfattad immunologisk reaktion [5].
IRF5 hos patienter med SLE
”Interferon Regulatory Factor-5” (IRF5) är ett intracellulärt transkriptionsprotein som medverkar dels vid inducering av det medfödda immunsvaret, apoptos och vid reglering av cytokin- och interferonproduktionen [3,6]. IRF5 har visat sig vara en viktigt patogen för autoimmuna sjukdomar som SLE där positiva (”TNF receptor associated factor-6”, ”Inhibitor of nuclear factor kappa-ß kinase subunit beta”) och negativa (”Interferon Regulatory Factor- 4”, IRF5 ”Post-translational modifications”) regulatorer som verkar i aktivering av IRF5 kan vara faktorer. Förlusten eller defekt av de negativa regulatorerna för IRF5 kan leda till
hyperaktivering av IRF5 som i sin tur leder till ökad produktion av inflammationsmedierande interferon och cytokiner. Detta kan därmed orsaka en mer okontrollerad inflammation och slutligen leda till utvecklingen av SLE. Vissa genetiska polymorfier av IRF5 har också visat
vara stark associerad med ökad risk för SLE, där flera polymorfier bidra till ett förhöjt uttryck av IRF5 [3].
I den senaste studien av Idborg et al. har man bekräftat förekomsten av IRF5 på MP (IRF5+
MP) i plasman hos patienter med SLE och visat att nivåer av IRF5+ MP är förhöjt hos SLE patienter jämfört med kontroller. Författarna föreslår en uppdelning av SLE patienter i två subgrupper beroende på nivåer av IRF5+ MP i plasma, subgrupperna benämns som hög IRF5 subgrupp och låg IRF5 subgrupp [7]. Då upptäckten av IRF5+ MP förhållandevis är nytt så är det därmed intressant att studera vidare och validera IRF5 uttryck på MP i en större grupp patienter jämfört med den tidigare studien [7].
Grundprincipen för flödescytometri
Flödescytometri (FCM) är en snabb och relativt enkel analysmetod, som kan användas för att detektera celler och partiklar i suspension. Metoden kan användas för att mäta flera olika egenskaper hos en cell eller en partikel, till exempel storlek, komplexitet och uttryck av ett specifikt protein genom att använda fluorescensmärkta antikroppar. Teknologin för
flödescytometri bygger på mätning av ljusspridning och fluorescensemission som frigörs när excitationsljus träffar en cell eller partikel.
I flödescytometern passerar partiklarna teoretiskt sett genom flödeskanalen en och en. En eller flera lasrar (excitationskälla) av olika våglängder lyser på partiklarna och det ljus som frigörs detekteras. Fluorescensprincipen bygger på övergång av energi som leder till emission av fotoner. En fluorescensmolekyl har ett absorptionsspektrum av olika specifika våglängder där de kan absorbera ljusenergi. Absorptionen gör att en elektron får överskott med energi och exciterar, samtidigt emittera energi i form av foton i olika våglängder, detta kallas för ett
emissionsspektrum. För detektion av ljusspridning och fluorescensemission används olika fotodetektorer. Den ljussignal som genereras efter att en partikel har passerat laserstrålen konverteras till spänningssignaler och sedan till digitala data som redovisas i form av en dotplot, varje prick motsvarar ett event (partikel). Det ljus som passerar i samma axel som laserstrålen mäts som ”forward scatter” (FSC) och är proportionell mot partikelns storlek. Det ljus som sprider sig i 90 graders vinkel mot laserstrålar mäts som ”side scatter” (SSC) och mängden ljussignal i SSC är proportionell mot partikelns komplexitet. Mätning av
fluorescens bestäms genom filtrering av ljus i olika våglängder, fluorescensemission är proportionell mot mängd fluorescerande antikroppar som har bundit till partikel av intresse [8].
Syfte med studie
Än idag saknas bra och relevanta biomarkörer för SLE-patienter. I flera studier har man försökt kartlägga proteiner som kan särskilja SLE-patienter från andra reumatiska sjukdomar men även inom subgrupper av SLE. Då upptäckten av IRF5+ MP förhållandevis är nytt så är det därmed intressant att studera hur IRF5 uttrycks på MP hos SLE-patienter.
I den här studie analyserades totalt 50 plasmaprover från en större kohort av SLE-patienter (n=35) och populationsbaserade kontroller (n=15). Metoden är flödescytometri och för detektion av IRF5+ MP användes tre olika antikroppar mot IRF5 proteinet. Koncentrationen av IRF5+ MP jämfördes statistiskt mellan antikropparna och analysgrupper (IRF5 hög, IRF5 låg och kontroll) samt mot tidigare resultat [7]. Det främsta syftet med denna studie var att validera och analysera förekomsten av IRF5+ MP hos patienter med SLE för att ytterligare bekräfta resultaten från den tidigare studien av Idborg et al [7].
Material och metod
Material:
Studiematerial
Totalt 50 frysta plasmaprover (Citrat plasma) från en ny kohort av SLE-patienter (n=35) och populationsbaserade kontroller (n=15) med matchade medelålder och könsfördelning. SLE- proverna utgjordes av en hög IRF5 subgrupp (n=20) och en låg IRF5 subgrupp (n=15), uppdelat utifrån kriterierna enligt fastställda internationella kriterier [7,9] (Figur 1).
Medelåldern på patienterna var 42±13 år (85% kvinnor). Kontrollerna hade en medelålder på 41±11 år (83% kvinnor).
Figur 1: En schematisk bild över analysflöde och fördelning av plasmaprover (A) som användes till screeningstest (B) och sedan till validering (C).
Etik
Provmaterialet till studien utgjordes av plasmaprover sparade i en biobank. Det finns ett skriftligt samtycke från enskilda patienter för användning av provmaterialet och vid hantering av patientuppgifter och genomgång av patientjournaler. Studien har fått etiskt godkännande av Etikprövningsmyndigheten samt den lokala etikkommittén på Karolinska Institutet och
Karolinska Universitetssjukhuset. Allt provmaterial har ett skriftligt samtycke. Diarienummer:
03–556, 2003-12-16.
Metod:
Utarbetning av analysprotokoll
Två analysprotokoll testades för att bearbeta fram ett protokoll som är lämpligt att använda för studien. Analysprotokollen utgjordes dels av trippelmärkning och dels av singelmärkning för enskilda prover (Figur 2). Bakgrunden till detta test var att tre olika antikroppar användes, en kommersiell antikropp (Bio-techne) och två in-house tillverkade antikroppar (IRF5-5 och IRF5-6) användes för detektion av IRF5. De två in-house tillverkade antikropparna ger mer information om vilken specifik epitop på IRF5 som antikropparna binder till. Undersökningen var till för att kontrollera om proverna var enkelpositiva, dubbelpositiva eller trippelpositiva samt om det fanns en okänd kompetitiv effekt mellan antikropparna vid analys med alla antikroppar samtidigt.
Figur 2: Figuren illustrerar innebörden av trippelmärkning (analyser av alla tre antikroppar samtidigt) och singelmärkning (analyser av tre antikroppar i enskilda provrör).
Konjugering av antikroppar
För att kunna detektera antikroppar bunden till IRF5+ MP, konjugerades antikropparna med olika fluorokromer med olika våglängder. För konjugering användes ”Dylight Fast
Conjugation Kit” (Abcam), samma process utfördes för alla tre antikropparna. Antikroppar inkuberades med respektive ”Modifier-reagens” från respektive konjugeringskit. Sedan överfördes antikroppsmixen till det frystorkade materialet i ”Conjugation Mix” flaskan och inkuberades mörkt i rumstemperatur (RT), i minst 15 min. Därefter tillsattes ”Quencher”
reagens till ”Conjugation Mix” och inkuberades i 5 min. Standardmetoden är att tillsätta 1 uL
”Modifier/Quencher” per 10 uL antikropp.
Förberedelse av provmaterial
Frysta plasmaprover tinades upp med vattenbad (37°C) i ca 5 min. Provet centrifugerade (20 100 g i 45 min, RT, en del av supernatanten sögs bort (en del av supernatant användes för att slamma upp partikelpellet) och provet vortexades i 30 s. Provet blandades med konjugerad antikropp (slutkoncentration 15 µg/mL) i ett flödescytometerrör. Sedan inkuberades provet i 20 min, RT och mörkt. För att stabilisera prover tillsattes fixeringslösning (BD (Becton, Dickinson&Company)) före analys med flödescytometern.
Detektion av mikropartiklar i flödescytometer
För detektion av IRF5+ MP analyserades prover i flödescytometern (Beckman Coulter Gallios). Apparaten finjusterades först med fluorescerande ”microbead” (Biocytex, Megamix- Plus FSC) för att fastställa mikropartiklars ”gate” i flödescytometer, dessa plastkulor har fyra olika diametrar, 0,1, 0,3, 0,5 samt 0,9 µm. MP definierades som partiklar mellan 0,3 - 0,9 µm i diameter (Figur 3). Koncentrationen av IRF5+ MP i MP/µL beräknas utifrån
flödeshastigheten (antal events/sekund) samt provvolymen som instrumentet har använt.
Databearbetning av FCM skedde med dataprogrammet FlowJo (BD (Becton, Dickinsin&Company)).
Figur 3: Gating av mikropartiklar med flödescytometer. ”Microbeads” i prov från SLE- patienter (A). Negativ kontroll där man analyserat ett prov från en SLE-patient med mus- antikropp. En mus-antikropp ska inte binda till något i de humana prover (B). Frisk kontroll med IRF5-5 antikropp (C). Prov från SLE-prover med IRF5-5 antikropp (D).
IRF5 koncentrationer analyserat med multiplex
Samma prover analyserades tidigare med en multiplex-analys (FlexMap3D (Luminex Corp.))
skillnader på koncentrationen av IRF5+ MP med den här studien. Multiplexen (FlexMap3D (Luminex Corp.)) är en antikroppsbaserad array där man märker in antikroppar till färgkodade magnetkulor för att detektera proteiner i plasma eller serum. Analysmetoden är främst lämplig för användning till proteinprofilering [7,10]
Statistik
Värdena från flödescytometern logaritmerades för att erhålla en normalfördelning av data.
Nivåer av IRF5+ MP jämfördes mellan singelmärkta och trippelmärkta, samt mellan analysgrupperna vid analys av respektive antikropp. Nivåer av IRF5 jämfördes också med tidigare värde för IRF5 analyserad med en annan metod från Karolinska Institutet. Tvåsidigt parat Students t-test användes för att studera signifikanta skillnader. Ett p-värde på <0,05 användes som signifikansnivå.
Resultat
Singelmärkning versus trippelmärkning av prover:
Då tre antikroppar användes för detektion av IRF5+ MP genomfördes en screeningstest för att utvärdera om det fanns en signifikant skillnad mellan de två analysprotokollen. En jämförelse av IRF5+ MP-koncentrationen i 5 IRF5-höga SLE-prover gjordes med singelmärkta (märkta med respektive antikropp och trippelmärkta prover (alla antikroppar tillsammans). Resultatet visar att singelmärkta prover hade högre koncentration av IRF5+ MP jämfört med prover som var trippelmärkta (Figur 4).
Figur 4: Koncentrationen av IRF5+ MP i 5 IRF5 höga SLE-prover, märkta med respektive antikropp och som trippelmärkta (alla antikroppar tillsammans).
Koncentration av IRF5+ MP mellan IRF5 hög, IRF5 låg och kontroll:
Till valideringen analyserades prover som singelmärkta, det vill säga med respektive
antikroppar (Kommersiell, IRF5-5 och IRF5-6). Värdena för koncentrationen av IRF5+ MP jämfördes mellan analysgrupper (IRF5 hög, IRF5 låg och kontroll) vid analys med respektive antikroppar. Resultatet visar att koncentration av IRF5+ MP är högre i SLE-subgrupperna jämfört med kontroll, samt att hög IRF5 subgruppen hade högre koncentration av IRF5+ MP jämfört med låg IRF5 subgruppen (Figur 5).
Figur 5: Koncentration av IRF5+ MP i de 15-proverna från respektive analysgrupperna.
Koncentration av IRF5+ MP för prover märkta med den kommersiella antikroppen (A).
Koncentration av IRF5+ MP för prover märkta med IRF5-5 antikroppen (B). Koncentrationen av IRF5+ MP för prover märkta med IRF5-6 antikroppar (C).
Korrelation mellan antikropparna (kommersiell och två in-house)
Korrelationen mellan antikropparna undersöktes för att studera hur bra antikropparna är på att detektera och binda in till IRF5 molekylen i förhållande till varandra. Korrelationen mellan prover som märkta med IRF5-5 antikroppar och prover märkta med IRF5-6 antikroppar hade
”R-squared” (R2) ≈ 72% (Figur 6A). Korrelationen mellan prover märkta med den
6B). Korrelationen mellan prover märkta med den kommersiella antikroppen och prover märkta med IRF5-6 antikroppar visar R2 ≈ 70% (Figur 6C).
Figur 6: Korrelation för koncentrationen av IRF5+ MP i de proverna märkta med respektive antikropp. Korrelation mellan antikropparna IRF5-5 och IRF5-6 (A). Korrelation mellan den kommersiella antikroppen jämför med IRF5-5 antikroppen (B). Korrelation för den
kommersiella antikroppar och IRF5-6 antikroppar (C).
Jämförelse av koncentrationer för IRF5+ MP mellan flödescytometer och multiplex För att undersöka om IRF5+ MP korrelerar till tidigare uppmätta IRF5-koncentrationer, jämförds erhållna värden med de tidigare värden där prover analyserade med multiplex-analys (FlexMap3D (Luminex Corp.)) vid laboratoriet på Karolinska institutet. Korrelationen mellan
analysmetoderna för IRF5 höga proverna visade ett R2≈ 0,52% (Figur 7A) och de IRF5 låga prover hade ett R2≈ 0,64% (Figur 7B).
Figur 7: Korrelation mellan analysmetoderna FCM (Beckman Coulter Gallios) och
FlexMap3D (Luminex Corp.) för analys av IRF5 inom analysgrupperna IRF5 höga och IRF5 låga. Korrelation mellan analysmetoderna för IRF5 höga prover (A). Korrelation mellan analysmetoder för IRF5 låga prover (B).
Diskussion
Många studier har visat att både ett ökat uttryck av IRF5 och ökat nivåer av mikropartiklar i plasman är stark associerad med SLE [3–7]. I denna studien har vi undersökt skillnader mellan antikropparna för detektion av IRF5+ MP och studerat skillnader på koncentrationen av IRF5+ MP mellan SLE subgrupperna och kontroller, vid analys med flödescytometri. Vi har också jämfört våra resultat med tidigare uppmätta värden för IRF5 där man analyserat förekomsten av proteinet i samma patientprover [7].
I det första experimentet visade resultatet en signifikant skillnad på koncentrationer av IRF5+
MP mellan att singelmärka med respektive antikropp och trippelmärka, det vill säga då alla antikroppar tillsättes samtidigt. Proverna som analyserades som singelmärkta hade betydligt
högre koncentration av IRF5+ MP jämfört med prover analyserade som trippelmärkta (p
<0,05). Detta kan innebära att det finnas en kompetitiv effekt mellan antikropparna vid analys som trippelmärkta, men för att undersöka detta vidare krävs mer studier. Resultaten visade också att det finns korrelation mellan antikropparna, men lite sämre korrelation mellan den kommersiella och IRF5-5. Utifrån detta kan man tolka att antikropparna förmodligen binder till samma epitop på IRF5 molekylen. Dock behövs flera analyser genomföras för att
kontrollera skillnad i tendens mellan den kommersiella antikroppen och IRF5-5.
Vid valideringen visade det sig att det finns en signifikant skillnad i koncentrationen av IRF5+ MP mellan SLE subgrupper och kontroll samt mellan de två subgrupperna, vid analys med den kommersiella antikroppen. Att SLE patienter har generellt högre koncentrationer av MP är känt sedan tidigare och talar för en högre cellaktivering och/eller celldöd, vilket är ett kännetecken på SLE [5]. I vår analys är koncentrationer av IRF5+ MP i SLE subgrupperna högre än i kontrollproverna (p <0,05), men skillnaden mellan IRF5+ MP inom SLE
subgrupperna var ej signifikant (p >0,05). Att ingen signifikant skillnad fanns mellan
subgrupperna vid analys med den kommersiella antikroppen kan innebära att antikroppen är mindre specifik för IRF5+ MP men flera analyser behövs göras för att undersöka varför det blev så. Vid analys med antikropparna IRF5-5 och IRF5-6 visar resultatet att det finns en signifikant skillnad mellan både SLE subgrupper och kontrollprover. Koncentrationen av IRF5+ MP i subgruppen IRF5 höga var högre jämfört med subgruppen IRF5 låga och kontroll (p <0,05). För subgruppen IRF5 låga så var koncentrationen av IRF5+ MP högre än
kontrollprovet (p <0,05). Med det så stödjer vårt resultat det tidigare studie av Idborg et al.
där man bekräftade IRF5 på mikropartiklar och definierade SLE subgrupperna utifrån nivåer IRF5+ MP [7].
Vid jämförelse av analysmetoderna visade vårt resultat ingen korrelation mellan FCM och multiplex. Detta kan bero på att analysmetoderna detektera olika former av proteinet. Med FCM detekterade vi IRF5 på MP, medan med multiplex detekterade man IRF5 proteinet, både som bundna till cellen (intracellulärt och extracellulärt) samt som fria proteiner i plasma [7].
Även om ingen korrelation kan ses i vår analys så kan metoderna komplettera varandra då metoderna mäter olika former av proteinet. Både FCM och multiplex är lika bra på att detektera IRF5 men att detektera endast IRF5+ MP är FCM mest relevant som analysmetod.
Trots att analys med flödescytometern kan ger viktig fenotypisk information om proteinet finns det ändå begräsningar med analysmetoden. I vår studie detekterade vi MP mellan 0,3–
0,9 µm utan att i ta hänsyn till mikropartikelns heterogena komposition. Detta kan leda till att man inte kan detektera alla mikropartiklar [11]. I en studie av Mobarrez et al. studerade man mikropartiklar i större spann på storlek. Författarna har visat att större MP (0,7–3,0 µm) är starkare associerad med SLE jämför med mindre MP (ca 0,3–0,7µm) [12]. Därmed kan det vara intressant att undersöka MP vidare för att kvantifiera IRF5+ MP där man även tar hänsyn heterogeniteten inom mikropartikeln.
I en annan studie av Pisetsky et al. visade man att MP som innehåller mitokondrier (mitoMP) kan vara patogena till SLE [13]. Mitokondriestruktur liknar på många sätt en bakteries, samt att de innehåller egna DNA (mtDNA) [14]. Mitokondrier frisätts från celler som fragment eller som komponent i MP vid cellaktivering eller celldöd. Majoriteten av de större MP innehåller hela eller delar av mitokondrier och är associerade med sjukdomsaktivitet för SLE [11]. SLE patienter uttrycker antikroppar mot mitokondrie (”anti-whole mitochondria” (anti- wMITO)) och tillsammans bildar de immunkomplex som kan vara patogena till SLE [13]. En annan studie av Jönsen et al. visade att vissa mtDNA polymorfier är associerat med
utveckling av SLE [15]. Att SLE är vanligast bland kvinnor och att delar av mtDNA ärvs främst från modern kan kanske tyda på att mitoMP är en möjligt patogen för SLE [15–18].
Fler studier krävs för att få en större förståelse för mitoMPs roll i biologiska funktioner.
Slutligen föreslår vi vidare studier för att öka kunskapen av antikroppar (kommersiell, IRF5-5 och IRF5-6) och IRF5+ MP. Det är värt att efterforska mer om de två in-house antikropparna för att optimera de för framtida användning då den kommersiella antikroppen eventuellt kommer att förändras eller försvinna. Då vår studie och många andra studier pekar på att IRF5, MP och IRF5+ MP har stark association med SLE kan det tyda på att dessa skulle kunna vara en möjlig markör för diagnostik av SLE.
Tillkännagivande (Acknowledgement)
Jag skulle vilja tacka patienterna för de studiematerial vi fick. Jag vill också tacka
personalerna på Karolinska institutet som hjälpte till med att analysera prover då det inte var möjligt att laborera under Corona-pandemin. Slutligen vill jag tacka min praktiska handledare Fariborz Mobarrez för allt stöd jag fick under mitt projektarbete samt min opponent Sofie Hellgren för den konstruktiva opponeringen på min uppsats.
Referenser
[1] Tsokos GC, Lo MS, Costa Reis P, Sullivan KE. New insights into the
immunopathogenesis of systemic lupus erythematosus. Nat Rev Rheumatol 2016;12(12):716–
30.
[2] Hochberg MC. Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1997;40(9):1725.
[3] Ban T, Sato GR, Tamura T. Regulation and role of the transcription factor IRF5 in innate immune responses and systemic lupus erythematosus. Int Immunol 2018;30(11):529-36.
[4] Mobarrez F, Svenungsson E, Pisetsky DS. Microparticles as autoantigens in systemic lupus erythematosus. Eur J Clin Invest 2018;48(12):e13010.
[5] Nielsen CT. Circulating microparticles in systemic Lupus Erythematosus. Dan Med J 2012;59(11):B4548.
[6] Almuttaqi H, Udalova IA. Advances and challenges in targeting IRF5, a key regulator of inflammation. FEBS J 2019;286(9):1624-37.
[7] Idborg H et al. Circulating Levels of Interferon Regulatory Factor-5 Associates With Subgroups of Systemic Lupus Erythematosus Patients. Front Immunol 2019;10:1029.
[8] Adan A et al. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol 2017;37(2):163-76.
[9] Tan EM et al. The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1982;25:1271-7.
[10] Schwenk JM, Nilsson P. Antibody suspension bead arrays. Methods Mol Biol 2011;723:29-36.
[11] Chandler WL. Measurement of microvesicle levels in human blood using flow cytometry. Cytometry B Clin Cytom 2016;90(4):326-36.
[12] Mobarrez F et al. Microparticles in the blood of patients with SLE: Size, content of mitochondria and role in circulating immune complexes. J Autoimmun 2019;102:142-9.
[13] Pisetsky DS et al. The binding of SLE autoantibodies to mitochondria. Clin Immunol 2020;212:108349.
[14] Goodsell DS. Mitochondrion. Biochem Mol Biol Educ 2010;38(3):134-40.
[15] Jönsen A et al. Mitochondrial DNA polymorphisms are associated with susceptibility and phenotype of systemic lupus erythematosus. Lupus 2009;18(4):309-12.
[16] Rees F et al. The worldwide incidence and prevalence of systemic lupus erythematosus:
a systematic review of epidemiological studies. Rheumatology (Oxford) 2017;56(11):1945- 61.
[17] Schon EA, DiMauro S, Hirano M. Human mitochondrial DNA: roles of inherited and somatic mutations. Nat Rev Genet 2012;13(12):878-90.
[18] McWilliams TG, Suomalainen A. Mitochondrial DNA can be inherited from fathers, not just mothers. Nature 2019;565(7739):296-7.
