Genetiken bakom ALS epidemiologin: en jämförande studie av olika genmutationer associerade med ALS

1

Genetiken bakom ALS epidemiologin: en jämförande studie av olika genmutationer associerade med ALS

Anastasia Haratourian

Självständigt arbete i biologi 2017

Sammandrag

Amyotrofisk lateralskleros (ALS) är en dödlig neurodegenerativ sjukdom som drabbar 2-3 individer per 100,000 varje år. Vad som ligger bakom sjukdomen är fortfarande okänt, däremot vet man att ALS orsakar förlamning i kroppen genom att bryta ned motoriska nervceller, bland annat i hjärnan. Hittills har man identifierat mutationer i generna SOD1, TARDBP, FUS, OPTN, VCP och C9ORF72, som kan vara associerad med ALS. Dessa punktmutationer orsakar oftast inklusioner, aggregat och ackumulering av den motsvarande proteinprodukten i celler, vilket kännetecknar ALS.

Två hypoteser har formulerats de senaste 20 åren som kan förklara mekanismen bakom sjukdomen. Det spekuleras att sjukdomen antingen orsakas av en ”loss-” eller ”gain-of- function” effekt efter mutationerna har skett i respektive gen. Majoriteten av dessa

genmutationer har ett dominant anlag och påvisar en toxisk ”gain-of-function” mekanism, men man har även observerat en ”loss-of-function” mekanism efter mutationer i genen OPTN.

”Gain-of-function” mekanismen för A4V SOD1 genmutationer, där aminosyran alanin ersätts av valin, ökar progressionen av sjukdomen i kroppen och är den vanligaste SOD1 mutationen hos befolkning i Nordamerika. Å andra sidan är den recessiva D90A SOD1 genmutationen vanligare i Europa än Nordamerika.

De flesta genmutationer resulterar i proteinprodukter som har stor benägenhet att aggregera, ackumuleras eller bilda inklusioner i cytoplasman där de orsakar toxiska effekter. Hur dessa toxiska aggregat bildas skiljer sig för de olika mutationerna. Mutationer i FUS-genen orsakar att aggregat bildas i motoriska nervceller genom att blockera exporten av mRNA ut ur cellkärnan, OPTN mutationer har ökad retentionstid i cytoplasman och VCP genmutationer påverkar TDP-43 metabolismen, vilket har visat sig ha toxiska effekter i kroppen. Hur TARDBP-genen orsakar aggregat är fortfarande okänt, dock har man genomfört knockdown experiment på zebrafiskar och möss som bekräftat att TARDBP-genen är essentiell för utvecklingen av friska motorneuroner.

Man har nyligen identifierat en expanderad GGGGCC hexanukleotid i C9ORF72-genen som sägs finnas hos majoriteten av alla ALS-drabbade individer. Av den orsaken, har mycket forskning riktats mot denna mutation med syftet att förstå mekanismen vid vilket denna

”repeat expansion” orsakar degradering av motoriska nervceller. Hittills, har man bekräftat att denna GGGGCC hexanukleotid stör transkriptionen och påverkar RNA-metabolismen, dock vet man inte hur mutationen orsakar ALS. Genom att applicera epigenetiska metoder på C9ORF72-genen har man upptäckt potentiella behandlingar till ALS, där man utnyttjar DNA metyleringar för att tysta den muterade C9ORF72-genen. Detta innebär att produktionen av toxiskt RNA minskar i hjärnan, vilket därmed minskar sannolikheten att individen utvecklar ALS. Av den orsaken betraktas dessa epigenetiska modifieringar som ett potentiellt

tillvägagångssätt för att bota ALS.

2

Innehållsförteckning

Inledning ... 3

ALS associerad SOD1 genmutationer ... 3

Funktionen av SOD1 proteinet ... 4

Punktmutationer i SOD1 genen associerat med ALS ... 4

A4V-mutationen ökar progressionen av ALS i människan ... 5

Potentiella mekanismen för SOD1 associerad ALS ... 5

ALS associerad TARDBP genmutationer ... 6

Funktionen av TDP-43 proteinet ... 6

TDP-43 inklusioner kännetecknar ALS ... 6

Punktmutationer i TARDBP genen associerat ALS ... 6

ALS associerad FUS genmutationer ... 7

Punktmutation i FUS genen kopplat till ALS ... 7

Oxidativ stress rekryterar stressgranuler med FUS ... 8

ALS liknande symptom hos modellorganismer med FUS mutationer ... 8

ALS associerad OPTN genmutationer ... 8

Funktionen av OPTN proteinet ... 8

Hur är OPTN genen och ALS associerat? ... 8

Potentiella mekanismer för OPTN associerat ALS ... 9

Samlokalisering av OPTN och andra ALS associerade gener ... 9

ALS associerad VCP genmutationer ... 9

Funktionen av VCP proteinet ... 9

Hur är VCP genen och ALS associerat? ... 10

Kromosom 9 kopplad VCP ALS ... 10

ALS associerad GGGGCC hexanukleotid repeat expansion i C9ORF72-genen ... 11

Genome-wide association studier identifierar ett samband mellan ALS och kromosom 9 . 11 Expanderad GGGGCC hexanukleotid repeat expansion i icke-kodande regioner av C9ORF72 kopplat till kromosom 9 och ALS... 11

Hur orsakar GGGGCC hexanukleotid repeat expansion nedbrytning av motoriska nervceller? ... 12

Potentiella mekanismer för nervcell-degradering orsakat av GGGGCC hexanukleotid repeat expansion ... 12

DNA metylering av C9ORF72-genen: potentiell behandling för ALS drabbade individer 13 Diskussion ... 14

Framtidsperspektiv ... 15

Tack ... 16

Referenser ... 16

3

Inledning

Amyotrofisk lateralskleros (ALS), även kallad Lou Gehrigs sjukdom, är en progressiv och dödlig neurodegenerativ sjukdom (Hough et al. 2004) som drabbar vuxna individer vid 55-70 års ålder (Cudkowicz et al. 1997). Denna förlamningssjukdom bryter ned de nervceller i hjärnan och ryggraden som är ansvariga för motoriken. Individen drabbas vanligtvis av andningssvikt inom 2-3 år efter att de första symptomen observerats (Renton et al. 2011).

ALS kategoriseras i två grupper: sporadisk ALS (SALS) och ärftlig, autosomal dominant ALS (familjär, FALS). Majoriteten av drabbade individer lider av SALS och bara ca 10 % lider av FALS (Hough et al. 2004). Inga kliniska eller patologiska skillnader har observerats mellan de två grupperna, båda visar tecken på neurodegenerativa processer där, bland annat axoner skadas (Cudkowicz et al. 1997). Man har dock observerat att FALS-drabbade individer utvecklar symptom i genomsnitt vid 46 års ålder, det vill säga tio år tidigare än SALS patienter (Siddique et al. 1996). Dessa symptom inkluderar oftast förlamning i en hand eller fot som sedan sprids till andra delar av kroppen, vilket orsakar muskelförtvining och därmed andningssvikt (Fletcher 2004).

Man vet att ALS kännetecknas av inklusioner (olösliga substanser i cytoplasman), aggregat och ackumulering av proteiner i celler (Okamoto et al. 1991, Neumann et al. 2006), men i dagsläget är orsaken okänd och sjukdomen går inte att bota (Mackenzie et al. 2007). Däremot har man identifierat fem gener; SOD1 (Rosen et al. 1993), TARDBP (Sreedharan et al. 2008), FUS (Vance et al. 2009), OPTN (Maruyama et al. 2010) och VCP (Johnson et al. 2010) som är associerade med ALS. Utöver dessa gener har nya studier visat att en expanderad

GGGGCC hexanukleotid ”repeat expansion” i kromosom 9, open reading frame 72

(C9ORF72) är associerad med ALS och frontotemporal demens (FTD) (DeJesus-Hernandez et al. 2011, Renton et al. 2011). Normalt finns denna sekvens repeterad ca 25 gånger medan i muterade individer kan den finnas över hundra gånger (DeJesus-Hernandez et al. 2011).

Syftet med denna litteraturstudie är att redogöra hur dessa genmutationer och den

expanderade GGGGCC hexanukleotid upprepningsexpansionen är associerad med ALS (och FTD). För att åstadkomma detta kommer stora mängder data att sammanfattas. Detta kommer därför bli en sammanställning av de olika genmutationerna och GGGGCC hexanukleotid upprepningsexpansionen samt hur deras upptäckt har formulerat olika teorier bakom uppkomsten av denna sjukdom. Fokus kommer ligga på genetiken bakom ALS.

ALS associerad SOD1 genmutationer

Det var först år 1869 då den franske neurobiologen Jean-Martin Charcot beskrev den

progressiva och dödliga sjukdom som vi idag kallar ALS, dock har man aldrig kunnat bevisa mekanismen bakom uppkomsten av sjukdomen. Med hjälp av DNA-markörer kunde man år 1991 visa att denna sjukdom har stor sannolikhet att härstamma från en mutation i kromosom 21 (Siddique et al. 1991). Två år senare genomfördes ett experiment av Rosen et al. (1993) där en single-strand conformational polymorfism analys utfördes på 12 familjer vars medlemmar lider av FALS. Med denna analysmetod kunde forskargruppen upptäcka

skillnader i nukleotidsekvensen på den enskilda DNA-strängen. Forskargruppen kunde sedan skilja DNA-fragmenten åt med hjälp av gel elektrofores, där de separerades på grund av skillnader i deras konformation. Utifrån denna analys fick man reda på att mutationen ligger på kromosom 21, i en gen som kodar för antioxidanten Cu/Zn superoxiddismutas 1 (SOD1).

4

Sedan dess har man sammanlagt identifierat mer än 125 mutationer som utbreder sig över fem olika exoner i SOD1-genen (Pasinelli & Brown 2006).

Funktionen av SOD1 proteinet

Proteinprodukten av den eukaryota SOD1-genen består av 153 aminosyror som tillsammans bildar en homodimer (Stevens et al. 2010). En homodimer är ett protein som är uppbyggt av två identiska subenheter, i detta fall binder varje subenhet en koppar och en zink jon (Sea et al. 2015). Denna antioxidant har som uppgift att förstöra fria radikaler i kroppen genom att omvandla toxisk superoxid, som bildas vid oxidativ fosforylering, till syre och väteperoxid (Fig. 1) (Gurney et al. 1994). Eftersom SOD1-genen består av fem exoner är alla dessa mottagliga för många olika typer av mutationer med samma slutresultat, ALS (Deng et al.

1993).

Punktmutationer i SOD1-genen associerat med ALS

I nuläget har mer än 125 mutationer på olika exoner av SOD1-genen identifierats. De flesta mutationer är punktmutationer i exon 1,2,4 samt 5 (Ince et al. 1998) och leder nästan alltid till FALS (Rosen et al. 1993), vilket utgör ca 20-25% av alla FALS fall (Gurney et al. 1994).

Mutationer i exon 3 har observerats men ännu inte bekräftats ha en koppling till ALS (Deng et al. 1993). Denna mutation är väldigt specifik för FALS och har endast observerats i ca 1 % av alla SALS fallen (Andersen et al. 1997). För Rosen et al. (1993) var det oklart om dessa mutationer orsakade en ökning eller minskning i enzymaktiviteten. Hypotesen vid den tiden förklarades som en ”loss-of-function” effekt, där en minskning i enzymaktiviteten ledde till en ökning av fria radikaler som är toxiska för celler. Detta antagande gick dock emot deras hypotes som påstod att sjukdomen är genetiskt dominant då de flesta ”loss-of-function”

mutationer är recessiva. Ifall mutationen orsakade en ökning i SOD1 aktiviteten, skulle det innebära att den muterade proteinprodukten inhiberar funktionen av proteinprodukten från en normal SOD1-gen (Rosen et al. 1993). Drygt ett år senare uppkom hypotesen om en ”gain-of- function” effekt av Gurney et al. (1994). Genom att introducera vildtyp och två muterade former av den humana SOD1 genen i transgena möss erhöll de resultat som indikerade att mutationer i SOD1-genen resulterar i en ”gain-of-function” effekt för individer som lider av FALS. Denna hypotes påstår att SOD1 proteinet får en ny toxisk funktion då peroxynitrit (ONOO^-) bildas från reaktioner mellan de fria radikalerna superoxid (O2-) och kväveoxid (NO) (Gurney et al. 1994).

År 1997 utförde Cudkowicz et al. DNA analyser på blodprov taget från 290 levande familjer drabbade av ALS, varav 27 av dessa hade en mutation i SOD1-genen på exon 1. Denna

Figur 1. Olika reaktioner som katalyseras av superoxiddismutas. (1) Enzymet SOD1 omvandlar fria syreradikaler till väteperoxid och syre. (2) Nedsatt aktivitet av SOD1 antioxidanten orsakar bildningen av hydroxylradikaler, vilket är en mer toxisk reaktiv syreradikal. (3) Nedsatt aktivitet av SOD1 antioxidanten orsakar bildning av peroxynitrit.

5

punktmutation orsakade en aminosyra substitution på kodon 4 där alanin ersattes av valin (A4V-mutation), och var den vanligaste mutationen som förekom i FALS SOD1 gruppen i experimentet. Genom att sekvensera alla fem exoner av SOD1-genen hos 2045 ALS-drabbade individer kunde Andersen et al. (2003) bekräfta att deras resultat stämde överens med

Cudkowicz et al. (1997) samt dra slutsatsen att A4V substitutionen är den vanligaste SOD1 mutationen bland befolkningen i Nordamerika då den observerades i flest individer. I Europa har endast ett fåtal familjer med A4V-mutationer dokumenterats (Andersen et al. 1997).

Ytterligare studier påvisar att haplotypen för A4V-mutationen skiljer sig mellan Européer och Nordamerikaner, men inte för individer inom samma kontinent (Saeed et al. 2009). Ingen skillnad mellan haplotyperna observerades när Saeed et al. (2009) jämförde individer från Sverige och Italien. Detta bevisar att den genetiska variationen förloras när nya populationer bildas, vilket innebär att A4V-mutationen har två grundareffekter. Genetiskt innebär detta att A4V mutationen har två separata ursprung, en för Européer och en för Nordamerikaner (Saeed et al. 2009). Däremot har andra studier visat att en annan typ av mutation, där

asparaginsyra ersätts av alanin på kodon 90 (D90A-mutation) i exon 4 på grund av en A till C substitution på DNA-strängen (Själander et al. 1995), är vanligare i Skandinavien än i

Nordamerika (Luigetti et al. 2009). Denna D90A-mutation är recessiv (Luigetti et al. 2009) och orsakar ALS för individer från Skandinavien som är homozygota för denna mutation (Andersen et al. 1995).

A4V mutationen ökar progressionen av ALS i människan

Det som sker på proteinnivå när A4V-mutationen uppstår är att DNA sekvensen ändras från GCC till GTC (Deng et al. 1993). Detta orsakar en minskning i SOD1-genens stabilitet och samtidigt en ökning av proteinets hastighet att veckla ut sig och dess benägenhet att aggregera (Stathopulos et al. 2003). A4V-mutationen är även allvarlig i den aspekten att den påskyndar sjukdomens progression i kroppen, vilket innebär att individen inte lever längre än två år efter det att första symptomen upptäckts (Hough et al. 2004).

Potentiella mekanismen för SOD1 associerad ALS

Gurney et al. (1994) valde att analysera både A4V- och G93A- (substitution av glycin till alanin) mutationer för att få bättre förståelse bakom mekanismen av nervcell-degradering.

Experimentet gick ut på att introducera humana vildtyper och muterade SOD1-gener i transgena möss. De transgena mössen med muterade gener visade sig bli helt paralyserade i bakbenen, vilket tydde på att de utvecklade en ALS-associerad mutation med en progressiv degradering av nervceller som är ansvariga för motoriken i kroppen. Dessa symptom har endast observerats i transgena möss som uttrycker muterade humana SOD1-gener och inte hos möss med en inaktiv SOD1-gen (Reaume et al. 1996). Mössen i kontrollgruppen var friska och visade inga tecken på utvecklingen av progressiv motorneuron-degradering (Gurney et al.

1994). Diverse SOD1 genmutationer ger upphov till aggregationer av proteinprodukten i olika vävnader i de transgena mössen, vilket föreslår en alternativ toxisk ”gain-of-function”

mekanism till uppkomsten av sjukdomen (Wang et al. 2003).

Man har nyligen formulerat nya hypoteser kring uppkomsten av ALS, där man bland annat förklarar att oxidativ stress orsakar nedbrytning av nervceller (Barber & Shaw 2010). På detta sätt har man hittat ytterligare en koppling mellan SOD1 och ALS (Bowling et al. 1993), då

6

SOD1 har som funktion att skydda celler från oxidativ stress som orsakas av reaktiva

syreradikaler (ROS) (Kato et al. 2004). Redan på 1990-talet kunde Liu et al. (1999) bekräfta att nervcellerna hos ALS-drabbade individer påvisar en ökad oxidativ skada när de

observerade högre väteperoxidnivåer hos transgena möss med muterad SOD1-gen. Sedan dess har man kunnat observera liknande resultat genom att analysera post-mortem vävnader från FALS och SALS patienter, där man bland annat observerade skador på proteiner, lipider och DNA (Calingasan et al. 2005).

ALS associerad TARDBP genmutationer

Funktionen av TDP-43 proteinet

Utöver mutationer i SOD1-genen, har forskning på senaste tiden visat att mutationer i

TARDBP-genen kan ligga till grund för utvecklingen av ALS (Sreedharan et al. 2008). Denna gen kodar för ett DNA-bindande protein (TDP-43) som uttrycks i cellkärnan i de flesta vävnader (Ayala et al. 2005). TDP-43 reglerar transkriptionen av diverse gener, kontrollerar mRNA splicing samt reglerar proteinproduktionen i nervsystemet och organutvecklingen (Buratti et al. 2001). Hittills har man identifierat mer än tio punktmutationer i C-terminalen av TARDBP-genen (Vance et al. 2009).

TDP-43 inklusioner kännetecknar ALS

Grundläggande kännetecken för neuropatologin av ALS är ackumuleringen av ubiquitinerade neurala cytoplasmiska inklusioner (NCIs) i degraderande motoriska nervceller (Arai et al.

2006). Okamoto et al. (1991) var den första forskargruppen att identifiera och beskriva NCIs i patienter som lider av ALS. Sedan dess har man kunnat bekräfta att fosforylerad och

ubiquitinerad TDP-43 (Cairns et al. 2007) är en av huvudkomponenterna av NCIs i SALS (Neumann et al. 2006) och FALS (Mackenzie et al. 2007). I nuläget är mekanismen bakom fosforyleringen, ubiquitineringen och ackumuleringen av TDP-43 fortfarande okänt (Cairns et al. 2007), dock vet man att ackumuleringen av proteiner i nervceller är en utmärkande

egenskap för neurodegenerativa sjukdomar (Mackenzie et al. 2007).

Punktmutationer i TARDBP-genen associerat ALS

I ett försök att undersöka mekanismen bakom TDP-43 i ALS, analyserades mutationer i alla sex exoner av TARDBP-genen hos 154 individer som lider av FALS. Man fann två

punktmutationer i exon 6 men i olika kodon (Sreedharan et al. 2008). En punktmutation identifierades i kodon 337 där valin ersattes av metionin (M337V-mutation) som orsakades av en A till G substitution på DNA-strängen. Den andra mutationen observerades i kodon 331 där lysin ersattes av glutamin (Q331K-mutation) på grund av en C till A substitution på DNA- strängen (Sreedharan et al. 2008). In vivo experiment på kycklingembryon med M337V- och Q331K-mutationer visade en avvikande mognadsutveckling med misslyckad utveckling av normala lemmar och svans (Sreedharan et al. 2008). Yokoseki et al. (2008) identifierade samtidigt en tredje punktmutation i exon 6 men på kodon 343, där ett utbyte av A till G orsakade en glutamin till arginin substitution (Q343R-mutation) och föreslår att mutationen inhiberar mRNA splicing (Yokoseki et al. 2008).

7

Hitintills, har man inte bekräftat mekanismen vid vilket TDP-43 ackumuleringar orsakar ALS, däremot vet man att det handlar om ett ”loss-” eller ”gain-of-function” process. Johnson et al. (2008) uttryckte humant TDP-43 i modellorganismen Saccharomyces cerevisiae

(bagerijäst) och observerade att TDP-43 aggregat var toxiskt även för jäst. Dessa in vivo analyser stöder hypotesen som förklarar att proteinet har en toxisk ”gain-of-function” effekt (Johnson BS et al. 2008). Däremot har knockout och knockdown metoder visat att TDP-43 proteinet kan agera via en ”loss-of-function” mekanism. Knockdown experiment på

TARDBP-genen hos zebrafiskar har visat sig ha dödliga slutresultat, där de flesta zebrafiskar påvisar en avvikande motorneuron utveckling (Kabashi et al. 2010, Schmid et al.

2013).Utöver detta har även knockout experiment genomförts på möss, där man framställt möss som saknar TDP-43 proteinet. Möss som var heterozygota för mutationen visade sig ha en abnorm motorneuron utveckling och de homozygota mössen dog innan födseln (Kraemer et al. 2010).

ALS associerad FUS genmutationer

Likt TARDBP-genen, har FUS-genen visat sig medverka i regleringen av transkription, mRNA splicing och transport. Därmed kan man, med viss säkerhet, anta att dessa gener har en gemensam mekanism som ger upphov till ALS (Vance et al. 2009). Än så länge har man identifierat ungefär 13 mutationer som utbreder sig över 15 exoner i FUS-genen på kromosom 16 (Kwiatkowski et al. 2009).

Punktmutation i FUS-genen kopplat till ALS

Två vanliga mutationer som förekommer i FUS-genen upptäcktes samtidigt av två olika forskargrupper år 2009. Vance et al. (2009) sekvenserade sammanlagt 279 exoner från 197 individer med FALS och hittade en punktmutation i exon 15 där en baspars förändring från C till T skett. Denna förändring resulterade i en arginin till cystein substitution på kodon 521 (R521C-mutation). Utöver detta fann de en annan mutation på samma kodon som orsakade en arginin till histidin substitution (R521H-mutation) på grund av en G till A förändring.

Neuropatologiska studier på individer med dessa två mutationer visade en drastisk minskning av motoriska nervceller i ryggraden och hjärnbalken (Vance et al. 2009). Hur dessa

mutationer orsakar denna minskning är fortfarande okänt (Blair et al. 2010). Samma

mutationer observerades av Kwiatkowski et al. (2009). Genom att sekvensera alla 15 exoner från 81 FALS individer och 293 SALS individer kunde de bekräfta iakttagelserna gjorda av Vance et al. (2009) samt påstå att inga FUS mutationer finns i SALS-drabbade individer (Kwiatkowski et al. 2009, Blair et al. 2010). Däremot fann Belzil et al. (2009) en R521C- och en R521H-mutation i två separata individer som lider av SALS (Belzil et al. 2009). Dessa mutationer är oftast associerade med C-terminalen (Drepper et al. 2011) och har visat sig bilda aggregat i motoriska nervceller genom att blockera exporten av mRNA ut ur cellkärnan (Dormann et al. 2010). Man har även observerat aggregat av mutant proteinet i cytoplasman (Ticozzi et al. 2009). Detta kunde Kwiatkowski et al. (2009) testa genom att märka R521G- mutationen med green fluorescent protein (GTP). Resultatet visade en längre retentionstid av det muterade proteinet i cytoplasman samt en benägenhet att bilda aggregat (Kwiatkowski et al. 2009, Ticozzi et al. 2009). En liknande trend har observerats i C-terminalen av TDP-43 proteinet (Kabashi et al. 2008). Att FUS proteinet oftast aggregerar i cytoplasman har fått

8

forskare att tro att den bidrar till neurodegeneration via en toxisk ”gain-of-function”

mekanism (Kwiatkowski et al. 2009, Vance et al. 2009).

Oxidativ stress rekryterar stressgranuler med FUS

År 2010 kunde Bosco et al. (2010) visa ett samband mellan oxidativ stress och FUS proteinet, där de observerade att muterat FUS protein oftast hittas i stressgranuler (SGs) när celler utsätts för oxidativ stress (Bosco et al. 2010). SGs är täta protein- eller RNA aggregat som hittas i cytoplasman vid stress. Liknande resultat observerades av Vance et al. (2013), forskargruppen kunde även dra slutsatsen att SGs med muterad FUS initierar

aggregatbildning, vilket stör transkriptionen av RNA och därmed orsakar celldöd (Vance et al. 2013). Utöver detta, observerade man att muterad FUS har tendensen att binda vildtyp FUS och orsaka inklusioner och SGs i cytoplasman (Vance et al. 2013).

ALS liknande symptom hos modellorganismer med FUS mutationer

Genom tiden har man använt sig av olika modellorganismer med syftet att klargöra

mekanismen vid vilket FUS orsakar ALS. Tyvärr har man inte kunnat fastställa en mekanism, dock har man kunnat bekräfta att FUS även orsakar bildandet av ackumuleringar, aggregat och inklusioner av SGs i S. cerevisiae (Ju S et al. 2011), Drosophila melanogaster (Lanson et al. 2011) och Caenorhabditis elegans (Murakami et al. 2012). Man har även använt sig av råttor och möss för att studera olika FUS mutationer (Huang et al. 2011, Qiu et al. 2014).

Huang et al. (2011) inducerade R521C-mutationer samt överuttryckte vildtyp FUS i råttor och observerade att de muterade råttorna utvecklade ALS liknande symptom, bland annat

förlamning och axonopati av motorneuroner. Inga ovanliga symptom observerades hos råttorna med vildtyp FUS (Huang et al. 2011). Qiu et al. (2014) genomförde ett liknande experiment men på transgena möss med R521C-mutationer och observerade en minskning av motorneuroner. Ytterligare analyser visade att mutationen orsakade störningar på RNA transkriptionen, vilket i slutändan ledde till döden (Qiu et al. 2014).

ALS associerad OPTN genmutationer

Funktionen av OPTN proteinet

På kromosom 10 hittar man OPTN-genen (Hortobágyi et al. 2011) som kodar för proteinet optineurin (Ito H et al. 2011a). Denna gen består av totalt 16 exoner (Baird et al. 2004) och dess proteinprodukt medverkar i vesikeltransport, transkriptionsinitiering, exocytos samt påverkar nuclear factor kappa B (NF-kB) regleringen (Hortobágyi et al. 2011). NF-kB är ett protein som binder DNA och reglerar transkriptionen (Li et al. 2016). Inte först år 2010 kunde man associera mutationer i OPTN-genen med neurodegenerativa sjukdomar, bland annat med ALS (Maruyama et al. 2010). Senare forskning har även kunnat observera och bekräfta resultatet som Maruyama et al. (2010) erhöll (Shen et al. 2015).

Hur är OPTN-genen och ALS associerat?

Det var först i Japan man hittade en ALS-associerad OPTN mutation hos individer som lider av FALS och SALS. Man fann tre ALS relaterade mutationer i denna studie; en deletion i exon 5 på OPTN-genen och två punktmutationer (Maruyama et al. 2010). Deletionen i exon 5 orsakade en förskjutning i DNA sekvensen, vilket därmed bildade ett stoppkodon. Den ena

9

punktmutationen identifierades i exon 12 där ett C ersattes med ett T (Q398X-mutation) och orsakade en avkortning av aminosyrasekvensen för OPTN proteinet. I slutändan ledde

Q398X-mutationen till en inhibering av proteinets förmåga att binda till ubiquitin på grund av ett för tidigt stopp i translationen (Maruyama et al. 2010). Den andra punktmutationen

identifierades i exon 14, där ett A substituerades med ett G (E478G-mutation). Denna E478G mutation visade sig orsaka toxiska inklusioner i cytoplasman hos nervceller och därmed störa dess funktion (Maruyama et al. 2010).

Potentiella mekanismer för OPTN associerat ALS

Maruyama et al. (2010) påstår att mekanismen vid vilket de två punktmutationerna är verksamma skiljer sig för de två mutationerna. De föreslår att både en Q398X-mutation och en deletion i exon 5 har en ”loss-of-function” effekt samt orsakar en minskning av OPTN proteinet. E478G-mutationer antas däremot öka mängden muterad OPTN protein i celler och axoner, vilket skulle orsaka en ökad mängd inklusioner (Maruyama et al. 2010). Hortobágyi et al. (2011) analyserade vävnader från 138 individer och erhöll resultat som bekräftade närvaron av OPTN framkallade inklusioner i nervceller. Utifrån resultaten kunde man även verifiera att muterade OPTN proteiner aggregerar i celler där genen överuttrycks (Ying et al.

2010, Hortobágyi et al. 2011).

Än så länge är mekanismen för hur OPTN orsakar ALS okänd. I ett försök att identifiera mekanismen, genomförde Ito et al. (2016) ett OPTN homozygot knockout experiment på transgena möss, där båda alleler för OPTN-genen saknas. Inte förrän tredje veckan kunde de observera en drastisk minskning i antalet axoner och en onormal myelination av

motorneuronerna i ryggraden hos mössen (Ito et al. 2016).

Samlokalisering av OPTN och andra ALS associerade gener

Många forskare har studerat OPTN proteinets benägenhet att samlokaliseras med diverse ALS associerade gener, såsom TDP-43, SOD1 och FUS (Ito H et al. 2011b, Korac et al. 2013).

Studier av Keller et al. (2012) och Maruyama et al. (2010) uppvisar en association mellan OPTN och SOD1 genen, dock upptäcktes inget samband mellan generna i studier genomförda av Deng et al. (2011) och Hortobágyi et al. (2011). Detsamma gäller associationen mellan OPTN- och FUS-genen, där Ito et al. (2011b) och Keller et al. (2012) fann ett samband men inte Hortobágyi et al. (2011). Hitintills, är det ännu inte bekräftat vilken hypotes som

stämmer.

ALS associerad VCP genmutationer

Funktionen av VCP proteinet

Valosin-containing protein (VCP) är ett enzym som tillhör AAA+-ATPas familjen och kodas av VCP-genen. Detta protein reglerar många cellulära processer, bland annat cellsignalering, autofagi samt degradering av ubiquitin-märkta proteiner (Ju J-S et al. 2009). Mutationer i VCP -genen påverkar TDP-43 metabolismen, vilket har visat sig ha toxiska effekter i kroppen, såsom TDP-43 ackumulering i cytoplasman (Ritson et al. 2010). För att visa

sambandet mellan VCP och TDP-43, utförde Ritson et al. (2010) ett in vivo experiment där de uttryckte muterad VCP med den ALS associerad TDP-43 mutationen M337V i D.

10

melanogaster. Samtliga flugor dog, vilket bekräftade en TDP-43 ackumulering i cytoplasman (Ritson et al. 2010).

Hur är VCP-genen och ALS associerat?

Hur VCP-genen och ALS är associerade har inte varit så väl utforskat, dock har Johnson et al.

(2010) identifierat mutationer i aminosyrasekvensen för VCP-genen. Med hjälp av

exomsekvensering kunde forskargruppen hitta en G till A substitution (R191Q-mutation) som tidigare identifierats i patienter som lider av Inclusion Body Myopathy (IBM) och

Frontotemporal Dementia (FTD). Vad dessa sjukdomar har gemensamt är ackumuleringen av TDP-43 inklusioner (Watts et al. 2004), därför föreslår Johnson et al. (2010) att VCP

mutationer och ALS är förknippat på något sätt. Genom att sekvensera 210 ALS-sjuka individer hittade de ytterligare mutationer, vilket förstärkte deras hypotes om ett oförklarat samband mellan VCP och ALS. En basförändring från G till A (D592N-mutation) upptäcktes i en av ALS individerna där dess proteinstruktur visade sig ha en koppling till VCP-genen (Johnson et al. 2010). Ännu en G till A förändring identifierades (R155H-mutation) i VCP- genen hos en individ som lider av ALS (Johnson et al. 2010), där en arginin till histidin substitution sker (Custer et al. 2010). Individen visade sig ha en minskning av motoriska nervceller i ryggraden (Johnson et al. 2010). ALS patienter med VCP mutationer, som tidigare negligerats (Kimonis et al. 2008), kan nu användas för att studera mekanismen bakom VCP associerad ALS (Johnson et al. 2010).

Ett samband mellan VCP och degradering av motoriska nervceller har observerats i möss. En punktmutation i en VCP homolog, vacuolar protein sorting 54 (Vps54), har visat sig skada motorneuroner i möss (Schmitt-John et al. 2005). Mekanismen är okänd och kunde inte förklaras med hjälp av det erhållna resultatet, dock kunde man formulera möjliga teorier.

Schmitt-John et al. (2005) föreslog att det muterade Vsp54 proteinet påverkade

axontransporten i motoriska nervceller och på så sätt orsakade en underutvecklad ryggrad hos mössen. År 2010 utfördes ett liknande experiment där Custer et al. (2010) uttryckte humant R155H muterad VCP cDNA i transgena möss. Efter 20 veckor kunde man tydligt se drastisk minskning i aktivitet, vid gränsen av paralysi, på grund av degradering av motoriska

nervceller (Custer et al. 2010).

Kromosom 9 kopplad VCP ALS

Abrahao et al. (2016) identifierade en ny punktmutation i VCP-genen i en familj med

individer som lider av ALS. På kromosom 9, exon 3 hittade de en basförändring från A till T som orsakade en asparagin till tyrosin substitution (c.271A>T-mutation). Denna

basförändring kunde de ytterligare bekräfta med en Sanger sekvensering (Abrahao et al.

2016). Även Abrahao et al. (2016) kunde hitta ett samband mellan VCP associerad ALS och TDP-43 inklusioner.

11

ALS associerad GGGGCC hexanukleotid repeat expansion i C9ORF72-genen

Genome-wide association studier identifierar ett samband mellan ALS och kromosom 9 De senaste åren har stor framgång åstadkommits i att identifiera ett samband mellan ALS och kromosom 9 (van Es et al. 2009). Forskargruppen upptäckte två singel nukleotid

polymorfismer (SNP) i två lokus på kromosom 9, där 103 gener har visat sig ha en koppling till SALS. Med hjälp av genome-wide associations studier (GWAS) kunde de identifiera att dessa SNPs befinner sig i ett linkage disequilibrium (LD) block som bland annat innehåller C9ORF72-genen (van Es et al. 2009). LD är en term som beskriver association av alleler i olika lokus i en given population (Slatkin 2008). Ytterligare ett GWAS utfördes av

Laaksovirta et al. (2010) i den finska befolkningen. Även denna forskargrupp kunde identifiera ett samband mellan kromosom 9 och ALS. Utöver detta hittade de även en SNP haplotyp i ett lokus av kromosom 9 som visat sig öka risken för ALS på grund av ett LD block (Laaksovirta et al. 2010). Denna haplotyp har även identifierats i frontotemporal demens (FTD) (Vance et al. 2006).

Expanderad GGGGCC hexanukleotid repeat expansion i icke-kodande regioner av C9ORF72 kopplat till kromosom 9 och ALS

År 2010 visste man inte orsaken bakom ALS associerad kromosom 9. Drygt ett år senare identifierades en expanderad GGGGCC hexanukleotid ”repeat expansion” i C9ORF72-genen som en sannolik grund till kromosom 9-kopplad ALS och FTD (DeJesus-Hernandez et al.

2011, Renton et al. 2011). Renton et al. (2011) fann denna GGGGCC hexanukleotid ”repeat expansion” i exon 1 och intron 1 av C9ORF72-genen när de analyserade sekvensdata från ALS-drabbade familjer från Nederländerna, Finland och UK. Mer än hälften av individerna som bär på GGGGCC hexanukleotiden bär även på SNP haplotypen (Laaksovirta et al. 2010, Renton et al. 2011). DeJesus-Hernandez et al. (2011) identifierade GGGGCC hexanukleotid upprepningsexpansionen när de analyserade tidigare resultat från Boxer et al. (2011). Boxer et al. (2011) upptäckte en familj med en ny kromosom 9 associerad ALS-FTD och valde att kalla denna familj för Vancouver, San Francisco och Mayo familj 20 (VSM-20). Med syftet att undersöka orsaken till VSM-20 upptäckte DeJesus-Hernandez et al. (2011) GGGGCC hexanukleotiden i den icke-kodande regionen av C9ORF72-genen och fann att denna ”repeat expansion” segregerar med VSM-20 sjukdomen. Ytterligare analyser av 229 ALS-drabbade individer visade att 4,1 % av alla SALS individer och 23,5 % av alla FALS individer bär på GGGGCC hexanukleotid upprepningsexpansionen (DeJesus-Hernandez et al. 2011).

Forskargruppen fann även att denna ”repeat expansion” är det vanligaste genetiska skälet till FALS och SALS när de jämförde alla ALS associerade genmutationer, vanligare än SOD1, TARDBP, FUS, VCP och OPTN mutationer (DeJesus-Hernandez et al. 2011, Renton et al.

2011). För att undersöka ifall denna ”repeat expansion” finns i individer från andra

kontinenter än Europa, valde Renton et al. (2011) att analysera ALS-drabbade individer från Nordamerika och fann att även de bär på denna GGGGCC hexanukleotid i C9ORF72-genen.

Chen et al. (2016) visade även denna ”repeat expansion” finns i ALS-drabbade individer från Asien.

12

Hur orsakar GGGGCC hexanukleotid repeat expansion nedbrytning av motoriska nervceller?

Denna ”repeat expansion” är den första av sin sort att sammankopplas med ALS och har, med hjälp av fluorescence in situ hybridisering (FISH) och Southern blot analyser, uppskattats ha en storlek mellan 700-1500 bp i individer som lider av ALS (DeJesus-Hernandez et al. 2011, Renton et al. 2011). Även friska individer har en GGGGCC hexanukleotid ”repeat expansion”

men den är betydligt kortare, ca 2-23 bp (DeJesus-Hernandez et al. 2011). Med tanke på dess stora storlek och position i C9ORF72-genen, finns det en stor sannolikhet att denna

GGGGCC hexanukleotid ”repeat expansion” stör transkriptionen och därmed påverkar uttrycket av proteinprodukten. För att validera denna hypotes, producerade DeJesus-

Hernandez et al. (2011) tre alternativa former av C9ORF72-genen och såg att två isoformer (isoform a och isoform b) av proteinprodukten bildades, där isoform a orsakade en minskning i mRNA uttryck. Renton et al. (2011) påstår att lokaliseringen av GGGGCC hexanukleotiden i C9ORF72-genen orsakar degradering av motoriska nervceller eftersom det ger upphov till toxiskt RNA som stör transkriptionen av normalt protein och påverkar RNA-metabolismen.

Potentiella mekanismer för nervcell degradering orsakat av GGGGCC hexanukleotid repeat expansion

DeJesus-Hernandez et al. (2011) föreslår två mekanismer vid vilket GGGGCC hexanukleotid

”repeat expansion” kan orsaka nervcell degradering. Forskargruppen observerade en ”loss-of- function” mekanism när de påverkade transkriptionen av C9ORF72-genen, men även en

”gain-of-function” mekanism när de studerade ackumuleringen av RNA-fragment i ryggraden (RNA foci). Dessa toxiska RNA-fragment kunde hittas i cellkärnan hos individer som bär på GGGGCC hexanukleotid upprepningsexpansionen med hjälp av probe-märkning och sägs vara associerat med ALS då de förekommer i individer som drabbats av kromosom 9-kopplad ALS/FTD (DeJesus-Hernandez et al. 2011).

År 2013 formulerades ytterligare en hypotes kring uppkomsten av GGGGCC hexanukleotid

”repeat expansion” associerad ALS. Mori et al. (2013) visade att GGGGCC hexanukleotiden kan koda för tre dipeptid ”repeat” protein (DPR) utan ett startkodon. Experimentet visade även att DPR proteiner har tendensen att ackumulera och forma aggregat i lillhjärnan och hippocampus hos patienter med en GGGGCC hexanukleotid ”repeat expansion” i C9ORF72- genen. De vanligaste DPR protein som bildade aggregat var poly-(Gly-Ala), poly-(Gly-Pro) och poly-(Gly-Arg). Således bekräftar detta att ackumuleringen av DPR protein, som kodats av C9ORF72-genen, är associerat med ALS (Ash et al. 2013, Mori et al. 2013).

I ett försök att förklara mekanismen bakom produktionen av toxiska RNA foci och

ackumuleringen av DPR i ryggraden och hjärnan, har Niblock et al. (2016) formulerat en teori där de menar att bibehållandet av intron 1 i C9ORF72-genen är orsaken. Ackumuleringen av C9ORF72 mRNA i cellkärnan sker när exporten av genen förhindras, vilket inträffar när genen har en inkorrekt klippning och intron 1 är kvar. Vid vissa tillfällen, när oklippt C9ORF72 mRNA exporteras till cytoplasman, kan det koda för DPR proteiner som bildar aggregat (Niblock et al. 2016).

13

DNA metylering av C9ORF72-genen: potentiell behandling för ALS-drabbade individer Man har även utfört epigenetiska studier för att hitta möjliga behandlingar till C9ORF72 associerad ALS, där man bland annat har identifierat DNA metyleringar (CpG metylering) i närheten av GGGGCC hexanukleotid upprepningsexpansionen (Xi et al. 2013). CpG metyleringar är ett sätt att skydda kroppen från instabilt DNA genom att tysta vissa genuttryck. Liu et al. (2014) har observerat ett CpG hypermetyleringar på GGGGCC hexanukleotid upprepningsexpansionen tystar C9ORF72-genen, vilket därmed minskar ackumuleringen av toxiskt RNA och DPR protein aggregat i människohjärnan. De visade även att en de-metylering av promotor regionen av C9ORF72-genen upphäver gentystandet och orsakar oxidativ stress samt ackumuleringen av toxiskt RNA, vilket därmed bevisade att CpG metyleringar skyddar kroppen. Liu et al. (2014) påstår även att det erhållna resultatet bekräftar att GGGGCC hexanukleotiden agerar via en toxisk ”gain-of-function” mekanism, där en metylering bland annat inhiberar ackumulering av toxiskt RNA, minskar oxidativ stress och mängden RNA foci. Detta innebär att epigenetiska modifieringar kan användas som behandling mot neurodegenerativa sjukdomar (Liu et al. 2014).

Tabell 1. visar en sammanfattning av de mutationer som denna översiktsartikel har behandlat.

Tabell 1. Sammanfattning av samtliga mutationer associerade med ALS som presenterats i denna litteraturstudie.

Sjukdom Gen Mutation

Aminosyra

förändring Referens

ALS SOD1* A4V

D90A G93A

AlaVal AspAla GlyAla

Cudkowicz et al. 1997 Själander et al. 1995 Rosen et al. 1993

ALS TARDBP* M337V

Q331K Q343R

ValMet LysGln GlnArg

Sreedharan et al. 2008 Sreedharan et al. 2008 Yokoseki et al. 2008

ALS FUS* R521C

R521H R521G

ArgCys ArgHis ArgAla

Vance et al. 2009 Vance et al. 2009 Kwiatkowski et al. 2009

ALS OPTN* Q398X

E478G

GlnStop GluGly

Maruyama et al. 2010 Maruyama et al. 2010

ALS VCP R191Q

D592N R155H c.271A>T

ArgGln AspAsn ArgHis AsnTyr

Johnson et al. 2010 Johnson et al. 2010 Watts et al. 2004 Abrahao et al. 2016 ALS C9ORF72* GGGGCC hexanukleotid

repeat expansion

DeJesus-Hernandez et al. 2011 Renton et al. 2011

*Mutationer i genen har observerats bland både FALS- och SALS- drabbade individer.

14

Diskussion

Syftet med denna litteraturstudie var att försöka förklara sambandet mellan olika

genmutationer och utvecklingen av ALS. För att göra detta har man bland annat studerat DNA och vävnader från levande och omkomna individer drabbade av SALS respektive FALS, inducerat mutationer i transgena möss (Hough et al. 2004) och D. melanogaster (Ritson et al. 2010) samt utfört genome-wide associations studier (GWAS) (van Es et al.

2009, Laaksovirta et al. 2010)). Dessa experiment har endast kunnat identifiera nya mutationer som kan ligga till grund för ALS, men ingen framgång har gjorts i förståelsen bakom nedbrytningsprocessen av motoriska nervceller. Stora resurser har även investerats på att undersöka möjliga sätt att minska nedbrytnings-aktiviteten av motoriska nervceller med hjälp av epigenetiska modifieringar.

ALS är en progressiv neurodegenerativ sjukdom som bryter ned motoriska nervceller i hjärnan och ryggmärgen (Hough et al. 2004). Degraderingen orsakar muskelatrofi och svaghet, som i slutändan resulterar i förlamning i hela kroppen (Renton et al. 2011). ALS delas upp i två kategorier; sporadisk ALS (SALS) och nedärvd ALS (familjär, FALS), varav 90 % av alla ALS-drabbade individer lider av SALS (Hough et al. 2004). Individer drabbade av ALS lever i ca 2-3 år efter det att första symptomen observerats (Renton et al. 2011). I dagsläget är mekanismen okänd och det finns inga behandlingsmetoder för ALS-drabbade patienter (Mackenzie et al. 2007).

Sedan 1993, då man identifierade första genmutationen associerat med ALS (Rosen et al.

1993), har forskare gjort stora framsteg för att förstå genetiken bakom ALS, med syftet att förklara mekanismen bakom nedbrytningsprocessen av motoriska nervceller. I dagsläget har man identifierat åtta stycken genmutationer på olika kromosom och en GGGGCC

hexanukleotid ”repeat expansion” i C9ORF72-genen (DeJesus-Hernandez et al. 2011, Renton et al. 2011) som visat sig vara associerat med ALS. Fem av dessa mutationer sker i SOD1 (Rosen et al. 1993), TARDBP (Sreedharan et al. 2008), FUS (Vance et al. 2009), OPTN (Maruyama et al. 2010) och VCP (Johnson et al. 2010) generna och är oftast punktmutationer som orsakar enskilda basförändringar.

Tjugo år sedan identifierades den första punktmutation i SOD1-genen som nu sägs ligga till grund för 20 % av alla ALS-drabbade individer (Gurney et al. 1994). Punktmutationer i SOD1-genen ger upphov till en av de vanligaste och mest aggressiva formerna av ALS, en så kallad A4V-mutation (Hough et al. 2004). Ungefär 125 SOD1 ALS mutationer i olika exon har identifierats, varav majoriteten av dem är dominanta (Ince et al. 1998). Proteinprodukten av de muterade SOD1-generna har visat sig bilda aggregat i celler och därmed ha toxiska effekter i kroppen (Rosen et al. 1993, Stathopulos et al. 2003). Benägenheten att bilda toxiska inklusioner i celler orsakas även av proteinprodukten från de muterade TARDBP-generna, TDP-43 (Arai et al. 2006), och har visat sig vara ett viktigt kännetecken för ALS (Mackenzie et al. 2007). Mutationer i TARDBP-genen är dominanta (Rutherford et al. 2008) och utgör ca 4 % av alla FALS individer (Chiò et al. 2012). Man känner till att inklusion, aggregat och ackumuleringar av protein kännetecknar ALS, därför vet man att de flesta gener som ger upphov till detta hos ALS patienter orsakas av en mutation (Okamoto et al. 1991, Neumann et al. 2006). Därför väljer man att inducera mutationer i homologa proteiner i försöksdjur

(Schmitt-John et al. 2005) och observera resultatet. Hittills, har denna metod fungerat bra då flera forskargrupper har kunnat bekräfta att vissa genmutationer verkligen är associerat med

15

ALS. Därför anser jag att denna metod bör fortsätta användas även om vissa djur måste offras för allas bästa.

Strax efter identifieringen av TARDBP associerad ALS via ackumulering av muterad TDP-43 i celler, fann man punktmutationer i FUS-genen (Kwiatkowski et al. 2009, Vance et al. 2009).

Dessa mutationer är dominanta (Kwiatkowski et al. 2009, Vance et al. 2009) och orsakar ALS genom att bilda aggregat i C-terminalen av proteinprodukten (Drepper et al. 2011) som påverkar RNA-metabolismen i motoriska nervceller (Dormann et al. 2010). De flesta

mutationer hindrar transporten av FUS proteinet till cellkärnan, vilket innebär att toxiska inklusioner bildas i cytoplasman (Kwiatkowski et al. 2009, Ticozzi et al. 2009). Ytterligare punktmutationer identifierades i OPTN-genen hos både SALS och FALS patienter. Man hittade dominanta punktmutationer, recessiva deletioner och nonsensmutationer. Fastän mutationer i denna gen sällan orsakar FALS, har man observerat OPTN inklusioner i FALS och SALS-drabbade individer (Maruyama et al. 2010). Sist men inte minst, kunde man år 2010 identifiera mutationer i VCP-genen hos 2 % av alla FALS patienter med hjälp av exomsekvensering (Ritson et al. 2010). Denna typ av mutation visade sig orsaka förlamning och motorneuron degradering hos möss (Schmitt-John et al. 2005).

Stor framgång har gjorts i att identifiera en koppling mellan kromosom 9 och ALS (van Es et al. 2009), där man bland annat har upptäckt en expanderad GGGGCC hexanukleotid ”repeat expansion” i de icke-kodande regionerna av C9ORF72-genen (DeJesus-Hernandez et al.

2011, Renton et al. 2011). Denna GGGGCC hexanukleotid sekvens är bland en av de största orsakerna till ALS, då man observerat förekomsten av upprepningsexpansionen i 40 % av alla FALS patienter och i 4 % av alla individer som lider av SALS (Majounie et al. 2012). Man har även upptäckt att denna ”repeat expansion” stör RNA-metabolismen och på så sätt, genom en okänd mekanism, orsakar neurodegenerativa sjukdomar (DeJesus-Hernandez et al. 2011).

Man har därför använt den kunskapen och epigenetiska metoder för att försöka inhibera störningen av RNA-metabolismen hos möss. Resultatet visar att epigenetiken är ett potentiellt tillvägagångssätt för att inhibera nedbrytningen av nervceller och därmed bota ALS (Liu et al.

2014).

För varje experiment som genomförts med syftet att hitta mekanismen bakom ALS, har nya hypoteser formulerats. Hittills föreslår man att sjukdomen antingen orsakas av en ”loss-of- function” effekt, ”gain-of-function” effekt eller båda tillsammans. Många forskargrupper är oense om just vilken mekanism som gäller. Kontroversiella resultat har erhållits när vissa forskargrupper försökt återskapa experiment som bekräftar en viss mekanism. Man har bland annat erhållit motstridiga resultat när man försökt validera samlokaliseringen av OPTN mutationer med andra ALS associerade gener, såsom SOD1 och FUS (Deng et al. 1993, Maruyama et al. 2010, Hortobágyi et al. 2011, Keller et al. 2012).

Framtidsperspektiv

Trots att stora resurser har satsat på studier av ALS, är mekanismen fortfarande okänd och det har den varit i 20 år nu. Eftersom mekanismen verkar svår att utforska har många

forskargrupper valt att fokusera på andra aspekter av sjukdomen, till exempel att försöka inhibera nedbrytningen av nervceller. Nu när man bekräftat att DNA metylering av

C9ORF72-genen kan minska nedbrytnings-aktiviteten i kroppen, så tror jag att mycket fokus kommer läggas på vidare studier inom DNA metylering och ALS.

16

Man kan med säkerhet dra slutsatsen att mutationer i vissa gener och ALS har ett starkt samband. Av all data som finns tillgängligt kan man inte säkerställa vilken mekanism som orsakar ALS, dock kan man spekulera kring möjliga hypoteser om antingen en ”loss-” eller

”gain-of-function” effekt. Ytterligare en slutsats som kan dras är att inklusioner, aggregat och ackumuleringar av proteinprodukter från genmutationer har ett samband med ALS. Tidigare forskning fokuserar mycket på att hitta mekanismen av genmutationer i

nedbrytningsprocessen av nervceller istället för att förhindra det. Det är möjligt att framtida studier kan leda till upptäckten av mekanismen, men hur lång tid det kommer ta är osäkert.

Däremot har forskning kring DNA metyleringar och ALS visat sig ha succé i att inhibera nedbrytningen av motoriska nervceller. Framtida studier kan därmed inrikta sig mer på denna aspekt av sjukdomen, eftersom det är mer gynnande för människor som lider av ALS.

Tack

Jag vill tacka min handledare Irene Söderhäll för värdefull hjälp, återkoppling och goda råd samt mina medstudenter Josefin Bergklint, Hannah Hansson och Yannick Kamali för deras givande återkoppling. Jag vill även tacka min familj och min bästa vän Tamar

Khatchadourian som stöttat mig under arbetets gång.

Referenser

Abrahao, Abath Neto O, Kok F, Zanoteli E, Santos B, Pinto WBV de R, Barsottini OGP, Oliveira ASB, Pedroso JL. 2016. One family, one gene and three phenotypes: A novel VCP (valosin-containing protein) mutation associated with myopathy with rimmed vacuoles, amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Journal of the Neurological Sciences 368: 352–358.

Andersen, Nilsson P, Keränen ML, Forsgren L, Hägglund J, Karlsborg M, Ronnevi LO, Gredal O, Marklund SL. 1997. Phenotypic heterogeneity in motor neuron disease patients with CuZn-superoxide dismutase mutations in Scandinavia. Brain: A Journal of Neurology 120: 1723–1737.

Arai, Hasegawa M, Akiyama H, Ikeda K, Nonaka T, Mori H, Mann D, Tsuchiya K, Yoshida M, Hashizume Y, Oda T. 2006. TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau- negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Biochemical and Biophysical Research Communications 351: 602–611.

Ash, Bieniek KF, Gendron TF, Caulfield T, Lin W-L, DeJesus-Hernandez M, Blitterswijk MM van, Jansen-West K, Paul JW, III, Rademakers R, Boylan KB, Dickson DW, Petrucelli L. 2013. Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS. Neuron 77: 639.

Ayala, Pantano S, D’Ambrogio A, Buratti E, Brindisi A, Marchetti C, Romano M, Baralle FE.

2005. Human, Drosophila, and C. elegans TDP43: Nucleic Acid Binding Properties and Splicing Regulatory Function. Journal of Molecular Biology 348: 575–588.

Baird, Richardson AJ, Craig JE, Mackey DA, Rochtchina E, Mitchell P. 2004. Analysis of optineurin (OPTN) gene mutations in subjects with and without glaucoma: the Blue Mountains Eye Study. Clinical & Experimental Ophthalmology 32: 518–522.

Barber, Shaw PJ. 2010. Oxidative stress in ALS: Key role in motor neuron injury and therapeutic target. Free Radical Biology and Medicine 48: 629–641.

Belzil, Valdmanis PN, Dion PA, Daoud H, Kabashi E, Noreau A, Gauthier J, Hince P, Desjarlais A, Bouchard J-P, Lacomblez L, Salachas F, Pradat P-F, Camu W,

Meininger V, Dupré N, Rouleau GA. 2009. Mutations in FUS cause FALS and SALS in French and French Canadian populations. Neurology 73: 1176.

17

Blair, Williams KL, Warraich ST, Durnall JC, Thoeng AD, Manavis J, Blumbergs PC, Vucic S, Kiernan MC, Nicholson GA. 2010. FUS mutations in amyotrophic lateral sclerosis:

clinical, pathological, neurophysiological and genetic analysis. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry 81: 639–645.

Bosco, Lemay N, Ko HK, Zhou H, Burke C, Kwiatkowski TJ, Jr, Sapp P, McKenna-Yasek D, Brown RH, Jr, Hayward LJ. 2010. Mutant FUS proteins that cause amyotrophic lateral sclerosis incorporate into stress granules. Human Molecular Genetics 19: 4160.

Bowling, Schulz JB, Brown RH, Beal MF. 1993. Superoxide Dismutase Activity, Oxidative Damage, and Mitochondrial Energy Metabolism in Familial and Sporadic

Amyotrophic Lateral Sclerosis. Journal of Neurochemistry 61: 2322–2325.

Buratti, Dörk T, Zuccato E, Pagani F, Romano M, Baralle FE. 2001. Nuclear factor TDP-43 and SR proteins promote in vitro and in vivo CFTR exon 9 skipping. The EMBO Journal 20: 1774.

Cairns, Neumann M, Bigio EH, Holm IE, Troost D, Hatanpaa KJ, Foong C, White CL, III, Schneider JA, Kretzschmar HA, Carter D, Taylor-Reinwald L, Paulsmeyer K, Strider J, Gitcho M, Goate AM, Morris JC, Mishra M, Kwong LK, Stieber A, Xu Y, Forman MS, Trojanowski JQ, Lee VM-Y, Mackenzie IRA. 2007. TDP-43 in Familial and Sporadic Frontotemporal Lobar Degeneration with Ubiquitin Inclusions. The American Journal of Pathology 171: 227.

Cudkowicz, McKenna-Yasek D, Sapp PE, Chin W, Geller B, Hayden DL, Schoenfeld DA, Hosler BA, Horvitz HR, Brown RH. 1997. Epidemiology of mutations in superoxide dismutase in amyotrophic lateal sclerosis. Annals of Neurology 41: 210–221.

Custer, Neumann M, Lu H, Wright AC, Taylor JP. 2010. Transgenic mice expressing mutant forms VCP/p97 recapitulate the full spectrum of IBMPFD including degeneration in muscle, brain and bone. Human Molecular Genetics 19: 1741–1755.

DeJesus-Hernandez, Mackenzie IR, Boeve BF, Boxer AL, Baker M, Rutherford NJ, Nicholson AM, Finch NA, Gilmer HF, Adamson J, Kouri N, Wojtas A, Sengdy P, Hsiung G-YR, Karydas A, Seeley WW, Josephs KA, Coppola G, Geschwind DH, Wszolek ZK, Feldman H, Knopman D, Petersen R, Miller BL, Dickson D, Boylan K, Graff-Radford N, Rademakers R. 2011. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in non-coding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked frontotemporal

dementia and amyotrophic lateral sclerosis. Neuron 72: 245.

Deng, Hentati A, Tainer JA, Iqbal Z, Cayabyab A, Hung WY, Getzoff ED, Hu P, Herzfeldt B, Roos RP, Et A. 1993. Amyotrophic lateral sclerosis and structural defects in Cu,Zn superoxide dismutase. Science 261: 1047–1051.

Dormann, Rodde R, Edbauer D, Bentmann E, Fischer I, Hruscha A, Than ME, Mackenzie IRA, Capell A, Schmid B, Neumann M, Haass C. 2010. ALS-associated fused in sarcoma (FUS) mutations disrupt Transportin-mediated nuclear import. The EMBO Journal 29: 2841.

Drepper, Herrmann T, Wessig C, Beck M, Sendtner M. 2011. C-terminal FUS/TLS mutations in familial and sporadic ALS in Germany. Neurobiology of Aging 32: 548.e1-548.e4.

Fletcher. 2004. Treatment and quality of life for people with ALS. Neurology 62: E22–E23.

Gurney, Pu H, Chiu AY, Canto MD, Polchow CY, Alexander DD, Caliendo J, Hentati A, Kwon YW, Deng HX, Et A. 1994. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science 264: 1772–1775.

Hortobágyi, Troakes C, Nishimura AL, Vance C, Swieten JC van, Seelaar H, King A, Al- Sarraj S, Rogelj B, Shaw CE. 2011. Optineurin inclusions occur in a minority of TDP- 43 positive ALS and FTLD-TDP cases and are rarely observed in other

neurodegenerative disorders. Acta Neuropathologica 121: 519–527.

18

Hough, Grossmann JG, Antonyuk SV, Strange RW, Doucette PA, Rodriguez JA, Whitson LJ, Hart PJ, Hayward LJ, Valentine JS, Hasnain SS. 2004. From the Cover: Dimer

destabilization in superoxide dismutase may result in disease-causing properties:

Structures of motor neuron disease mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101: 5976.

Huang, Zhou H, Tong J, Chen H, Liu Y-J, Wang D, Wei X, Xia X-G. 2011. FUS Transgenic Rats Develop the Phenotypes of Amyotrophic Lateral Sclerosis and Frontotemporal Lobar Degeneration. PLoS Genetics, doi 10.1371/journal.pgen.1002011.

Ince, Tomkins J, Slade JY, Thatcher NM, Shaw PJ. 1998. Amyotrophic lateral sclerosis associated with genetic abnormalities in the gene encoding Cu/Zn superoxide dismutase: molecular pathology of five new cases, and comparison with previous reports and 73 sporadic cases of ALS. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology 57: 895–904.

Ito H, Fujita K, Nakamura M, Wate R, Kaneko S, Sasaki S, Yamane K, Suzuki N, Aoki M, Shibata N, Togashi S, Kawata A, Mochizuki Y, Mizutani T, Maruyama H, Hirano A, Takahashi R, Kawakami H, Kusaka H. 2011a. Optineurin is co-localized with FUS in basophilic inclusions of ALS with FUS mutation and in basophilic inclusion body disease. Acta Neuropathologica 121: 555–557.

Ito H, Nakamura M, Komure O, Ayaki T, Wate R, Maruyama H, Nakamura Y, Fujita K, Kaneko S, Okamoto Y, Ihara M, Konishi T, Ogasawara K, Hirano A, Kusaka H, Kaji R, Takahashi R, Kawakami H. 2011b. Clinicopathologic study on an ALS family with a heterozygous E478G optineurin mutation. Acta Neuropathologica 122: 223–229.

Ito Y, Ofengeim D, Najafov A, Das S, Saberi S, Li Y, Hitomi J, Zhu H, Chen H, Mayo L, Geng J, Amin P, DeWitt JP, Mookhtiar AK, Florez M, Ouchida AT, Fan J, Pasparakis M, Kelliher MA, Ravits J, Yuan J. 2016. RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS. Science 353: 603–608.

Johnson BS, McCaffery JM, Lindquist S, Gitler AD. 2008. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105: 6439.

Johnson JO, Mandrioli J, Benatar M, Abramzon Y, Deerlin VMV, Trojanowski JQ, Gibbs JR, Brunetti M, Gronka S, Wuu J, Ding J, McCluskey L, Martinez-Lage M, Falcone D, Hernandez DG, Arepalli S, Chong S, Schymick JC, Rothstein J, Landi F, Wang M, Calvo A, Mora G, Sabatelli M, Monsurrò MR, Battistini S, Salvi F, Spataro R, Sola P, Borghero G, ITALSGEN, Galassi G, Scholz SW, Taylor JP, Restagno G, Chiò A, Traynor BJ. 2010. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron 68: 857.

Ju J-S, Fuentealba RA, Miller SE, Jackson E, Piwnica-Worms D, Baloh RH, Weihl CC. 2009.

Valosin-containing protein (VCP) is required for autophagy and is disrupted in VCP disease. The Journal of Cell Biology 187: 875.

Ju S, Tardiff DF, Han H, Divya K, Zhong Q, Maquat LE, Bosco DA, Hayward LJ, Brown RH, Jr, Lindquist S, Ringe D, Petsko GA. 2011. A Yeast Model of FUS/TLS- Dependent Cytotoxicity. PLoS Biology, doi 10.1371/journal.pbio.1001052.

Kabashi, Lin L, Tradewell ML, Dion PA, Bercier V, Bourgouin P, Rochefort D, Bel Hadj S, Durham HD, Velde CV, Rouleau GA, Drapeau P. 2010. Gain and loss of function of ALS-related mutations of TARDBP (TDP-43) cause motor deficits in vivo. Human Molecular Genetics 19: 671–683.

Kabashi, Valdmanis PN, Dion P, Spiegelman D, McConkey BJ, Velde CV, Bouchard J-P, Lacomblez L, Pochigaeva K, Salachas F, Pradat P-F, Camu W, Meininger V, Dupre

19

N, Rouleau GA. 2008. TARDBP mutations in individuals with sporadic and familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature Genetics 40: 572–574.

Kato, Saeki Y, Aoki M, Nagai M, Ishigaki A, Itoyama Y, Kato M, Asayama K, Awaya A, Hirano A, Ohama E. 2004. Histological evidence of redox system breakdown caused by superoxide dismutase 1 (SOD1) aggregation is common to SOD1-mutated motor neurons in humans and animal models. Acta Neuropathologica 107: 149–158.

Keller, Volkening K, Droppelmann CA, Ang LC, Rademakers R, Strong MJ. 2012. Co- aggregation of RNA binding proteins in ALS spinal motor neurons: evidence of a common pathogenic mechanism. Acta Neuropathologica 124: 733–747.

Kimonis, Mehta SG, Fulchiero EC, Thomasova D, Pasquali M, Boycott K, Neilan EG, Kartashov A, Forman MS, Tucker S, Kimonis K, Mumm S, Whyte MP, Smith CD, Watts GDJ. 2008. Clinical Studies in Familial VCP Myopathy Associated With Paget Disease of Bone and Frontotemporal Dementia. American journal of medical genetics Part A 146: 745.

Korac, Schaeffer V, Kovacevic I, Clement AM, Jungblut B, Behl C, Terzic J, Dikic I. 2013.

Ubiquitin-independent function of optineurin in autophagic clearance of protein aggregates. Journal of cell science 126: 580–592.

Kraemer, Schuck T, Wheeler JM, Robinson LC, Trojanowski JQ, Lee VMY, Schellenberg GD. 2010. Loss of murine TDP-43 disrupts motor function and plays an essential role in embryogenesis. Acta neuropathologica 119: 409.

Kwiatkowski, Bosco DA, LeClerc AL, Tamrazian E, Vanderburg CR, Russ C, Davis A, Gilchrist J, Kasarskis EJ, Munsat T, Valdmanis P, Rouleau GA, Hosler BA, Cortelli P, Jong PJ de, Yoshinaga Y, Haines JL, Pericak-Vance MA, Yan J, Ticozzi N, Siddique T, McKenna-Yasek D, Sapp PC, Horvitz HR, Landers JE, Brown RH. 2009.

Mutations in the FUS/TLS Gene on Chromosome 16 Cause Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science 323: 1205–1208.

Laaksovirta, Peuralinna T, Schymick JC, Scholz SW, Lai S-L, Myllykangas L, Sulkava R, Jansson L, Hernandez DG, Gibbs JR, Nalls MA, Heckerman D, Tienari PJ, Traynor BJ. 2010. Chromosome 9p21 in Amyotrophic Lateral Sclerosis in Finland: A Genome-Wide Association Study. Lancet neurology 9: 978.

Li, Song Y, Zhao W, Han T, Lin S, Ramirez O, Liang L. 2016. Small interfering RNA

targeting NF-κB attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats. BMC Physiology, doi 10.1186/s12899-016-0027-y.

Liu, Russ J, Wu K, Neal D, Suh E, McNally AG, Irwin DJ, Deerlin VMV, Lee EB. 2014.

C9orf72 hypermethylation protects against repeat expansion-associated pathology in ALS/FTD. Acta neuropathologica 128: 525.

Luigetti, Conte A, Madia F, Marangi G, Zollino M, Mancuso I, Dileone M, Grande AD, Lazzaro VD, Tonali PA, Sabatelli M. 2009. Heterozygous SOD1 D90A mutation presenting as slowly progressive predominant upper motor neuron amyotrophic lateral sclerosis. Neurological Sciences 30: 517.

Mackenzie, Bigio EH, Ince PG, Geser F, Neumann M, Cairns NJ, Kwong LK, Forman MS, Ravits J, Stewart H, Eisen A, McClusky L, Kretzschmar HA, Monoranu CM, Highley JR, Kirby J, Siddique T, Shaw PJ, Lee VM-Y, Trojanowski JQ. 2007. Pathological TDP-43 distinguishes sporadic amyotrophic lateral sclerosis from amyotrophic lateral sclerosis with SOD1 mutations. Annals of Neurology 61: 427–434.

Majounie, Renton AE, Mok K, Dopper EG, Waite A, Rollinson S, Chiò A, Restagno G, Nicolaou N, Simon-Sanchez J, Swieten JC van, Abramzon Y, Johnson JO, Sendtner M, Pamphlett R, Orrell RW, Mead S, Sidle KC, Houlden H, Rohrer JD, Morrison KE, Pall H, Talbot K, Ansorge O, Consortium TC 9-A, Ftld/Ftld/Als TF research network on, Consortium TI, Hernandez DG, Arepalli S, Sabatelli M, Mora G, Corbo M,

20

Giannini F, Calvo A, Englund E, Borghero G, Floris GL, Remes AM, Laaksovirta H, McCluskey L, Trojanowski JQ, Deerlin VMV, Schellenberg GD, Nalls MA, Drory VE, Lu C-S, Yeh T-H, Ishiura H, Takahashi Y, Tsuji S, Ber IL, Brice A, Drepper C, Williams N, Kirby J, Shaw P, Hardy J, Tienari PJ, Heutink P, Morris HR, Pickering- Brown S, Traynor BJ. 2012. Frequency of the C9orf72 hexanucleotide repeat

expansion in patients with amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia:

a cross-sectional study. Lancet Neurology 11: 323.

Maruyama, Morino H, Ito H, Izumi Y, Kato H, Watanabe Y, Kinoshita Y, Kamada M, Nodera H, Suzuki H, Komure O, Matsuura S, Kobatake K, Morimoto N, Abe K, Suzuki N, Aoki M, Kawata A, Hirai T, Kato T, Ogasawara K, Hirano A, Takumi T, Kusaka H, Hagiwara K, Kaji R, Kawakami H. 2010. Mutations of optineurin in amyotrophic lateral sclerosis. Nature 465: 223–226.

Mori, Weng S-M, Arzberger T, May S, Rentzsch K, Kremmer E, Schmid B, Kretzschmar HA, Cruts M, Broeckhoven CV, Haass C, Edbauer D. 2013. The C9orf72 GGGGCC Repeat Is Translated into Aggregating Dipeptide-Repeat Proteins in FTLD/ALS.

Science 339: 1335–1338.

Murakami, Yang S-P, Xie L, Kawano T, Fu D, Mukai A, Bohm C, Chen F, Robertson J, Suzuki H, Tartaglia GG, Vendruscolo M, Schierle GSK, Chan FTS, Moloney A, Crowther D, Kaminski CF, Zhen M, George-Hyslop PS. 2012. ALS mutations in FUS cause neuronal dysfunction and death in Caenorhabditis elegans by a dominant gain- of-function mechanism. Human Molecular Genetics 21: 1.

Neumann, Sampathu DM, Kwong LK, Truax AC, Micsenyi MC, Chou TT, Bruce J, Schuck T, Grossman M, Clark CM, McCluskey LF, Miller BL, Masliah E, Mackenzie IR, Feldman H, Feiden W, Kretzschmar HA, Trojanowski JQ, Lee VM-Y. 2006.

Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science 314: 130–133.

Niblock, Smith BN, Lee Y-B, Sardone V, Topp S, Troakes C, Al-Sarraj S, Leblond CS, Dion PA, Rouleau GA, Shaw CE, Gallo J-M. 2016. Retention of hexanucleotide repeat- containing intron in C9orf72 mRNA: implications for the pathogenesis of ALS/FTD.

Acta Neuropathologica Communications, doi 10.1186/s40478-016-0289-4.

Nicholas A. Lanson. 2011. A Drosophila model of FUS-related neurodegeneration reveals genetic interaction between FUS and TDP-43. Human Molecular Genetics 20: 2510.

Okamoto, Sameshima Y, Yokoyama S, Terashima Y, Sugimura T, Terada M, Yokota J. 1991.

Frequent allelic losses and mutations of the p53 gene in human ovarian cancer. Cancer Research 51: 5171–5176.

Pasinelli, Brown RH. 2006. Molecular biology of amyotrophic lateral sclerosis: insights from genetics. Nature Reviews Neuroscience 7: 710–723.

Qiu, Lee S, Shang Y, Wang W-Y, Au KF, Kamiya S, Barmada SJ, Finkbeiner S, Lui H, Carlton CE, Tang AA, Oldham MC, Wang H, Shorter J, Filiano AJ, Roberson ED, Tourtellotte WG, Chen B, Tsai L-H, Huang EJ. 2014. ALS-associated mutation FUS- R521C causes DNA damage and RNA splicing defects. The Journal of Clinical Investigation 124: 981.

Reaume, Elliott JL, Hoffman EK, Kowall NW, Ferrante RJ, Siwek DR, Wilcox HM, Flood DG, Beal MF, Brown RH, Scott RW, Snider WD. 1996. Motor neurons in Cu/Zn superoxide dismutase-deficient mice develop normally but exhibit enhanced cell death after axonal injury. Nature Genetics 13: 43–47.

Renton, Majounie E, Waite A, Simón-Sánchez J, Rollinson S, Gibbs JR, Schymick JC, Laaksovirta H, Swieten JC van, Myllykangas L, Kalimo H, Paetau A, Abramzon Y, Remes AM, Kaganovich A, Scholz SW, Duckworth J, Ding J, Harmer DW,

Hernandez DG, Johnson JO, Mok K, Ryten M, Trabzuni D, Guerreiro RJ, Orrell RW,

21

Neal J, Murray A, Pearson J, Jansen IE, Sondervan D, Seelaar H, Blake D, Young K, Halliwell N, Callister J, Toulson G, Richardson A, Gerhard A, Snowden J, Mann D, Neary D, Nalls MA, Peuralinna T, Jansson L, Isoviita V-M, Kaivorinne A-L, Hölttä- Vuori M, Ikonen E, Sulkava R, Benatar M, Wuu J, Chiò A, Restagno G, Borghero G, Sabatelli M, Consortium TI, Heckerman D, Rogaeva E, Zinman L, Rothstein J, Sendtner M, Drepper C, Eichler EE, Alkan C, Abdullaev Z, Pack SD, Dutra A, Pak E, Hardy J, Singleton A, Williams NM, Heutink P, Pickering-Brown S, Morris HR, Tienari PJ, Traynor BJ. 2011. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron 72: 257.

Ritson, Custer SK, Freibaum BD, Guinto JB, Geffel D, Moore J, Tang W, Winton MJ, Neumann M, Trojanowski JQ, Lee VM-Y, Forman MS, Taylor JP. 2010. TDP-43 mediates degeneration in a novel Drosophila model of disease caused by mutations in VCP/p97. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for

Neuroscience 30: 7729.

Rosen, Siddique T, Patterson D, Figlewicz DA, Sapp P, Hentati A, Donaldson D, Goto J, O’Regan JP, Deng HX. 1993. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature 362: 59–62.

Saeed, Yang Y, Deng H-X, Hung W-Y, Siddique N, Dellefave L, Gellera C, Andersen PM, Siddique T. 2009. Age and founder effect of SOD1 A4V mutation causing ALS.

Neurology 72: 1634.

Schmid, Hruscha A, Hogl S, Banzhaf-Strathmann J, Strecker K, Zee J van der, Teucke M, Eimer S, Hegermann J, Kittelmann M, Kremmer E, Cruts M, Solchenberger B, Hasenkamp L, Bebber F van, Broeckhoven CV, Edbauer D, Lichtenthaler SF, Haass C. 2013. Loss of ALS-associated TDP-43 in zebrafish causes muscle degeneration, vascular dysfunction, and reduced motor neuron axon outgrowth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110: 4986.

Schmitt-John, Drepper C, Mußmann A, Hahn P, Kuhlmann M, Thiel C, Hafner M, Lengeling A, Heimann P, Jones JM, Meisler MH, Jockusch H. 2005. Mutation of Vps54 causes motor neuron disease and defective spermiogenesis in the wobbler mouse. Nature Genetics 37: 1213–1215.

Sea, Sohn SH, Durazo A, Sheng Y, Shaw BF, Cao X, Taylor AB, Whitson LJ, Holloway SP, Hart PJ, Cabelli DE, Gralla EB, Valentine JS. 2015. Insights into the Role of the Unusual Disulfide Bond in Copper-Zinc Superoxide Dismutase. The Journal of Biological Chemistry 290: 2405.

Shen, Li H-Y, Chen G-C, Chern Y, Tu P. 2015. Mutations in the ubiquitin-binding domain of OPTN/optineurin interfere with autophagy-mediated degradation of misfolded

proteins by a dominant-negative mechanism. Autophagy 11: 685.

Siddique, Figlewigz DA, Pericak-Vance MA, Haines JL, Rouleau G, Jeffers AJ, Sapp P, Hung W-Y, Bebout J, McKenna-Yasek D, Deng G, Horvitz HR, Gusella JF, Brown RHJ, Roses AD, Collaborators*. 1991. Linkage of a Gene Causing Familial

Amyotrophic Lateral Sclerosis to Chromosome 21 and Evidence of Genetic-Locus Heterogeneity. New England Journal of Medicine 324: 1381–1384.

Slatkin. 2008. Linkage disequilibrium — understanding the evolutionary past and mapping the medical future. Nature reviews Genetics 9: 477.

Sreedharan, Blair IP, Tripathi VB, Hu X, Vance C, Rogelj B, Ackerley S, Durnall JC, Williams KL, Buratti E, Baralle F, Belleroche J de, Mitchell JD, Leigh PN, Al- Chalabi A, Miller CC, Nicholson G, Shaw CE. 2008. TDP-43 Mutations in Familial and Sporadic Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science 319: 1668–1672.

Stathopulos, Rumfeldt J a. O, Scholz GA, Irani RA, Frey HE, Hallewell RA, Lepock JR, Meiering EM. 2003. Cu/Zn superoxide dismutase mutants associated with