1
Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet
Examensarbete, 15 hp Vårterminen 2011
Comparison of real-time PCR assays for screening of meticillin-resistant Staphylococcus aureus
Sanaz Sharif
Handledare: Markus Klint
Klinisk mikrobiologi, Akademiska sjukhuset, Uppsala universitet
2
Abstract
Staphylococcus aureus belongs to the normal flora. Many healthy people are colonized by the bacterium mainly in the nose but also on the skin and on other mucous membranes without showing symptoms. After damage to the skin, the bacterium can enter the wound and cause infections. Methicillin-resistant S. aureus (MRSA) is resistant to -lactam antibiotics such as penicillin and methicillin. The gene that gives resistance characteristic of MRSA is the mecA-gene. MRSA strains are spread in both hospitals and in the community, and it is important to identify these bacteria with rapid and sensitive methods. In this study, Taq Man RT-qPCR was compared with SYBR Green RT-qPCR (LightCycler480, Roche) to explore which method had the best sensitivity with the least working hours. In addition, Bullet for automated DNA extraction and CAS 1200 ™ for automated pipetting of the samples were evaluated. Twelve patient isolates and 232 patient samples for MRSA screening were included in the study. The results showed that the primers were of major importance for the outcome of the amplification. It was also shown that the Ct-values were clearly lower when the Bullet, CAS 1200 ™ and
LightCycler480 were combined compared with manual DNA extraction, manual pipetting and the Rotor-Gene 6000. In future, the former method will be used by the laboratory when screening patient samples for MRSA.
Keywords: Staphylococcus aureus, nuc-gene, mecA-gene, SYBR Green RT-qPCR and Ct-value.
3
Introduktion
Bakterier tros varit jordens första encelliga levande organismer och idag finns bakterier överallt i hela världen. Bakterier kan vara farliga för både människor och djur genom att de kan orsaka olika infektioner och sjukdomar, då måste de
bekämpas. Samtidigt är de vanliga i vår omgivning och nödvändiga för oss t.ex. K- vitamin tillverkas av bakterier som finns i tarmen.
Staphylococcus aureus är en kliniskt betydelsefull bakterie. Den klassificeras som grampositiv eftersom den kristallvioletta färgen fastnar i det tjocka
peptidoglykanlagret i cellväggen vid gramfärgning. S. aureus kallas också för den gula stafylokocken eftersom den bildar gula pigment på agarplattan vid odling i 20⁰C. Den är rund, cirka 1µm i diameter samt fakultativt anaerob. Dess cellvägg är resistent mot lysozym och den innehåller enzymet katalas. Katalas har förmåga att bryta ner väteperoxid, som används av vita blodceller för att döda infekterande bakterier. På så sätt kan bakterien försvara sig. Dessutom kan bakterien fästa på olika vävnader och orsakar skador på området på grund av enzymet hyaluronidas, som frisätts och bryter ner bindväven. S. aureus har specifika egenskaper som skiljer denna bakterie från andra stafylokocker vilket hjälper till vid identifikationen. Den är bland annat DNas-positiv, koagulas-positiv samt katalas-positiv.
På 1880-talet upptäcktes S. aureus, som orsakade lätta infektioner liksom
hudinfektioner och sårinfektioner efter operation. I slutet av 1940-talet och början av 1950-talet uppkom S. aureus-stammar som var resistenta mot vanligt penicillin.
Penicillin är en typ av betalaktamasantibiotika som binder in till penicillinbindande
4
proteiner (PBP) på bakteriens cytoplasmamembran. Bildningen av peptidoglykani bakteriens cellvägg förhindras och då dör bakterien. De resistenta S. aureus-
stammarna kunde bryta ner penicillin genom att producera enzymet penicillinas. Året 1960 uppfanns ett betalaktamasstabilt penicillinderivat som kallades för meticillin.
Men den första meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA)-stammen identifierades året därpå i Storbritannien. Därefter spreds MRSA till övriga
europeiska länder och MRSA-bakterier spreds snabbt över hela världen under 1970- talet [1].
Upp till 30-50 % av befolkningen är bärare av S. aureus, men det varierar beroende på ålder och yrke. Bärarskap är t.ex. vanligare hos de som jobbar inom vården [2].
Bakterien kan orsaka nosokomiala infektioner, bland annat lunginflammation och variga sårinfektioner som kan spridas genom kontakt mellan patienter [2]. Det finns många studier som har visats att MRSA har ökat betydligt över hela världen under senare år [3]. Patienter med långvarig sjukhusvistelse har den högsta risken att drabbas av nosokomiala infektioner orsakade av MRSA. Detta påverkar både patientens hälsa och sjukhuskostnaderna [3]. Antalet MRSA-diagnostiserade patienter har ökat med mer än 25 % under första halvåret 2010 enligt smittskydd Stockholm. Det har påvisats en ökad smittspridning av MRSA inom äldrevården under senare tid.1 I Sverige är numera samhällsrelaterad MRSA vanligare än sjukvårdsrelaterad MRSA.2
_________________________________
1www.smittskyddstockholm.se, Sök: mrsa statistik 2010, MRSA statistik jan-jun 2010, 2011-04-08
2www.strama.se, Sök: MRSA i samhället, Välj MRSA i samhället, 2011-04-12
5
Hos MRSA har kromosomen fått en extra gen som kallas för mecA. [2]. MecA- genen hos S. aureus har förvärvats via genöverföring till bakteriens genom. MecA- genen kodar för ett 78 kDa penicillinbindande protein, PBP2a, som sitter på bakteriens cellvägg. PBP2a är en förändrad form av penicillinbindande protein, vilket medför resistens mot meticillin och andra betalaktamasantibiotika. MecA- genen sitter på ett mobilt genetiskt element, Staphylococcal Cassette Chromosome MEC (SCC mec). Det har identifierats sju olika typer (VII) av SCC mec med flera olika varianter av dessa SCC mec-typer [2-4]. Eftersom samhällsrelaterade MRSA har spridits mycket, är det viktig att upptäcka S. aureus och/eller MRSA med snabba metoder och att få tillförlitliga resultat. Under de senaste decennierna har flera molekylärbiologiska metoder utvecklats för att identifiera MRSA på kortare tid. Med hjälp av PCR-tekniker kan MRSA skiljas från koagulasnegativa stafylokocker, som också kan ha mecA-genen, genom att man också screenar för nuc-genen som är specifik för S. aureus [5].
I PCR-program ingår enzymaktivering och olika temperaturcykler. Vid
enzymaktivering värms DNA-polymeraset upp för att bli aktivt, eftersom det finns monoklonala antikroppar i blandningen som binder till enzymet och håller det inaktivt till det att det första denatureringssteget påbörjats. Varje temperaturcykel består av tre steg: denaturering, hybridisering och polymerisering. Under första steget denatureras dubbelsträngat DNA (dsDNA) till enkelsträngat DNA (ssDNA) genom att provblandningen hettas upp till 90-95C. Under andra steget binder primrarna till sina komplementära DNA-sekvenser. Det sker när temperaturen
minskas till 50-60C, dvs. annealing-temperaturen, som bestäms av både längden och
6
nukleinsyrasammansättningen. Under tredje steget fäster DNA-polymeraset till de bundna primrarna och bygger sedan en ny sträng av DNA. Den lämpliga
temperaturen för DNA-polymeraset är vanligtvis 65-72C. Cykeln upprepas 30-40 gånger beroende på hur många kopior som behövs. Avståndet mellan primrarna bestämmer hur lång den tillverkade DNA-kopian blir, och det är bara sekvensen mellan primrarna som amplifieras.
Det finns olika varianter av PCR-teknik, såsom realtids-PCR (RT-qPCR) och TaqMan RT-qPCR. TaqMan RT-qPCR analysen bygger på en oligonukleotidprob som är märkt med två fluorescerande ämnen dvs. reporter på sin 5’-ände och quencher på sin 3’-ände, samt ett Taq-polymeras med 5’-3’nukleasaktivitet. Under hybridiseringen binder proben till sin komplementära sekvens och under
polymeriseringen bryter 5’-3’ Taq-polymeraset ned dubbelmärkt prob när enzymet bygger på den nya DNA-kedjan. Vid nedbrytning av proben skiljs reporter och quencher åt och då frigörs energi från den fria reportern i form av fluorescens när den belyses med UV-ljus. Fluorescenssignalen kan tas upp av detektorn i realtids-PCR- instrument och kvantifieras.
SYBR Green I är en annan typ av RT-qPCR som har utvecklats. SYBR Green I är egentligen ett fluorescerande färgämne som binder till dsDNA och kan användas för kvantifiering av dsDNA i PCR-produkter. SYBR Green I har blivit viktigt i många molekylärbiologiska metoder med diagnostiska tillämpningar. Anledningen till att SYBR Green har fått ett så stort användningsområde är, att ämnet har
temperaturstabilitet, selektivitet för dsDNA samt hög känslighet [6].
7
Symptomfria MRSA-bärare som har smittats ute i samhället har stor risk att utveckla MRSA-infektioner. Ett sätt att sänka antalet MRSA-infektioner är att minimera spridningen och därmed ny kolonisering. Därför är MRSA-screening och identifiering av MRSA-bärare i befolkningen av stor betydelse. Det finns en del fördelar med MRSA-screening, som tidig upptäckt samt möjlighet att isolera MRSA- koloniserade patienter innan smittspridning skett. Till andra teoretiska fördelar kan man ange en minskning av både sjuklighet och kostnader p.g.a. korrekt patientterapi med kortare sjukhusvistelse till följd, speciellt om snabba molekylärmetoder används vid MRSA-screeningen [7-13].
Syftet med undersökningen var att jämföra två olika PCR-metoder, dvs. TaqMan RT-qPCR samt SYBR Green I RT-qPCR för screening av MRSA. Detta utfördes för att komma fram till vilken PCR-metod som snabbast kunde detektera bakterien och samtidigt ge ett tillförlitligt resultat med mer känslighet. I detta projekt testades också en pipetteringsrobot, CAS 1200™, samt DNA-extraktionsroboten Bullet, vilka jämfördes med manuell pipettering samt manuell DNA-extraktion.
8
Material och Metod
Bakterier och prover
Det användes 12 S. aureus-isolat i studien. Fyra var från EQUALIS (externa kontroller från andra laboratorier), medan 8 var från patienter. Av de senare kom 6 isolat från MRSA-screening, 1 från sårodling och 1 från odling av luftvägar.
Patientisolaten var från år 2010 och förvarades i – 70C frys före analys. Dessutom användes 232 patientprover från MRSA-screeningen. Proverna var tagna från näsa, perineum, urin, svalg och sår. För patientprover krävdes etiskt tillstånd.
I denna studie användes tre olika kontrollstammar: S. aureus (CCUG 35601; nuc- positiv, mecA-positiv), S. aureus (CCUG 35602; nuc-positiv, mecA-negativ) och S.
epidermidis (ATCC 29887; nuc-negativ, mecA-positiv). Dessa stammar odlades upp från stamförråd på blodagar varje månad och utgjorde positiva kontroller för S.
aureus och KNS (Koagulas-Negativa Stafylokocker). Som negativ kontroll användes PCR-vatten.
Provhantering och DNA-preparation
Frysta isolat och kontrollstammar odlades på blodagar. Plattorna inkuberades över natten i värmeskåp med temperaturen 35C. Dagen efter utfördes DNA-extraktion manuellt för alla isolat och kontrollstammar. DNA extraherades genom att en koloni slammades med steril, vit ögla till märkta safty caps rör med 25 l Lysis reagent (Amplicor Respiratory Specimen Preparation Kit, Roche). Därefter inkuberades de i
9
värmeblock 45 min i 60C. Tjugofem l Neutralisation Reagent (Amplicor Respiratory Specimen Preparation Kit, Roche) tillsattes varje rör.
PCR
Primrarna som användes i studien för att fastställa att det var en S. aureus var nuc primer 1 (Forward), nuc-P1-5’-gttgcttagtgttaactttagttgta-3’ och nuc primer 2
(Reverse), nuc-P2-5’-aatgtcgcaggttctttatgtaattt-3’, båda med koncentrationen 0,8 M (Thermo Scientific,) och nuc-prob-5’-FAM-aagtctaagtagctcagcaaatgca-BHQ1-3’
med koncentrationen 0,4 M (Eurogentec). För att detektera mecA-genen användes mecA primer 1, mecA-P1-5’-aaatattattagctgattcaggttac-3’, mecA primer 2, mec A-P2- 5’-cgttaatattgccattattttctaat-3’, båda med koncentrationen 0,8 M (Thermo Sientific) och mecA-prob-5’-HEX-caaggtgaaatactgattaacccagta-BHQ-3’ med koncentrationen 0,4 M (Eurogentec). Primrar och prober hade använts tidigare i en annan studie skillnaden var att fluoroforen till nuc-proben då var VIC och för mecA-proben FAM [8].
Det användes även andra primrar för identifiering av S. aureus: nuc F (Forward) 5’-tcagcaaatgcatcacaaacag-3’ och nuc R (Reverse) 5’-cctgaagcaagtgcatttacg-3’, bägge med koncentrationen 0,8 M (Thermo Scientific).
Två olika mastermixar testades med olika primerkombinationer på LightCycler480.
En av dem var mastermix PerfeCta qPCR Fastmix med UNG (Quanta Biosciences).
Mastersmixen innehåller AccuFast Taq DNA Polymerase, UNG (uracil- N-
10
glykosylas), nukleotider (dATP, dCTP, dGTP samt dUTP), MgCl2 samt
reaktionsbuffert. DNA innehåller normalt dTTP men genom att ersätta dTTP med dUTP i mastermixen kan enzymet uracil-N-glykosylas bryta ned eventuella PCR- produkter från tidigare körningar och därmed förhindra kontamination.
Vid utprovningen av mastermix undersöktes både nuc- och mecA-genen i separata rör. Reaktionen för nuc-genen och mecA-genen innehöll 0,8 µM nuc-P1, 0,8 µM nuc- P2 och 0,4 µM nuc-prob, alternativt 0,8 µM mecA-P1, 0,8 µM mecA-P2 och 0,4 µM mecA-prob med PerfeCta mastermix i varje rör. DNA från patientisolat utgjorde mall. Det användes en 96-hålplatta (LightCycler480 Multiwell Plate 96, Roche) vars brunnar tillsattes 18 l mastermix samt 2 l mall. På plattan placerades en plastfilm (LightCycler480 sealing Foil, Roche) och sedan centrifugerades den ca 5 s innan amplifieringen för att ta bort luftbubblor i brunnarna. PCR-programmet bestod av 2 min i 45⁰C, 30 s i 95⁰C därefter 3 s i 95⁰C och 20 s i 60⁰C som upprepades i 40 cykler.
Den andra mastermixen var LightCycler 480 SYBR Green I Master som bestod av FastStart Taq DNA Polymerase, nukleotider (dUTP istället för dTTP), SYBR Green I färg, MgCl2 samt reaktionsbuffert. SYBR Green I är ett färgämne som binder till dubbelsträngat DNA och synliggör PCR-produkter. Fluorescenssignalen som frigörs är proportionell mot mängd amplifierat DNA i PCR. För att bevisa att bara önskade PCR-produkter hade amplifierats, utfördes smältkurvsanalyser efter PCR- körningarna. Vid en smältkurvsanalys värms reaktionsblandning sakta upp från 65⁰C till 97⁰C, vilket orsakar smältning av dsDNA samt motsvarande minskning av SYBR
11
Green fluorescensen. Detta ses som toppar på en kurva. Om bara en typ av PCR- produkt bildats, visar smältkurvsanalysen bara en topp.
Till reaktionsmixen blandades LightCycler 480 SYBR Green I Master med olika primerkombinationer. PCR-programmet var enligt följande: 10 min i 95ºC, därefter 10 s i 95ºC, 10 s i 60ºC och 30 s i 72ºC som upprepades i 50 cykler. Smältkurvan analyserades mellan temperaturerna 65ºC-97ºC. PCR-programmet ändrades avseende annealing-temperaturen till 55ºC, 60ºC eller 62ºC under studiens gång.
Amplifiering på Rotor-Gene 6000, som användes rutinmässigt av personal till patientprover bestod av PCR-programmet: 15 min i 95⁰C därefter 30 s i 95⁰C, 30 s i 55⁰C och 30 s i 72⁰C som upprepades i 40 cykler.
Detektionsgräns
För att bestämma känsligheten hos de två instrumenten användes en spädningsserie med spädningsfaktor 1:10 i tRNA med kontrollstammen S. aureus (CCUG 35601).
Anledningen till att använda tRNA i spädningsserier är att DNA har en negativ laddning och lätt fastnar på plaströrens väggar. För att minska risken att DNA:t binder till plasten används tRNA för att blockera fria ytor. Mastermixen blandades som tidigare vid körning med LightCycler480. Alla 10 rören kördes i duplikat.
12 Validering av primrar
Spädningsserien med kontrollstammen S. aureus (CCUG 35601) användes som mall. Mastermixen innehöll LightCycler 480 SYBR Green I Master, 0,8 µM nuc- P1 samt nuc-P2. PCR-programmet beskrevs tidigare. Detta jämfördes med körning av samma prover med Rotor-Gene 6000.
En ny DNA-extraktion på S. aureus (CCUG 35601) och en ny spädningsserie utfördes. Fyra olika primerkombinationer tillsattes mastermixar, den första med nuc R och nuc-P1, den andra med nuc F och nuc-P2, den tredje med nuc-P1 och nuc-P2 och den fjärde med nuc F och nuc R. Primrarna hade koncentrationen 0,8 µM. PCR- programmet var som föregående körning med LightCycler480, men annealing- temperaturen sänktes från 60°C till 55°C.
Det användes 12 patientisolat som beskrevs tidigare. Kontrollstammen S. aureus (CCUG 35602; nuc positiv, mecA negativ) utgjorde positiv kontroll. Proverna kördes med LightCycler480 med samma PCR-program som föregående körning med 55°C i annealing-temperatur och mastermixen innehöll nuc F, nuc R.
Pipettering med CAS 1200™ och körning av patientprover
CAS 1200™ (Corbbett Robotics) är en pipetteringsrobot som är enkel och liten.
Före användandet av apparaten ska underhåll enligt tillverkarens anvisningar utföras.
13
För att se om det fanns variation mellan varje pipettering av CAS 1200™, kördes kontrollstammen S. aureus (CCUG 35601) 16 gånger. DNA extraherades enligt tidigare beskrivning och, utan att centrifugera 96-hålplattan före, kördes den i LightCycler480. Sedan samlades 18 patientprover in för MRSA-screening.
Kontrollstammen S. aureus (CCUG 35601) användes som positiv kontroll, och den kördes 8 gånger tillsammans med patientproverna. Mastermixen och PCR-
programmet var som tidigare körning.
PCR-programmets annealing-temperatur ändrades därefter. Först skedde ändringen från 55ºC till 60ºC och sedan till 62ºC. Detta utfördes för att kunna hitta en bra annealing-temperatur till primrarna, så att de skulle kunna binda perfekt till sin komplementära sekvens och ospecifika PCR-produkter undvikas. Primrarna nuc P1, nuc P2 och nuc F, nuc R och en spädningsserie av DNA från kontrollstammen S.
aureus (CCUG 35601) användes.
Det kördes 28 patientprover vid annealing-temperaturen 62ºC med LightCycler480.
Kontrollstammen S. aureus (CCUG 35601) användes som positiv kontroll.
Analys med Bullet
Bullet (Nordiag) är en extraktionsrobot som renar fram nukleinsyra från olika provmaterial. För detta används Bullet Bugs’n Beads™ kit (Nordiag). Principen för reningen av nukleinsyra är att bakterierna binder till magnetkulor. Ett magnetiskt fält bildas för att möjliggöra avlägsnandet av supernatanten utan att ta bort kulorna.
14
Sedan lyseras bakterierna via lyseringsbuffert för att få fritt DNA i lösningen.
Lyseringen stoppas genom att 96 %-ig etanol tillsätts. Det fria DNA:t som är bundet till kulorna tvättas med 70 %-ig etanol för att ta bort ytterligare cellrester och andra hämmare. Tillslut inkuberas plattan vid 80ºC för att avlägsna resten av etanolen.
Under detta försök kördes 186 patientprover i Bulleten för att extrahera DNA:t.
Mastermixen och PCR-programmet var som vid tidigare körning. Pipettering av mastermix och patientprover utfördes med CAS 1200™. DNA extraherades från samma patientprover manuellt och alla patientprover kördes därefter i
LightCycler480.
Manuell DNA-extraktion utfördes av personal genom att föra över 250 l MRSA- buljong med prov till respektive uppmärkta 1,5 mL eppendorfrör. Proverna
centrifugerades med 13000 g-tal i 2 min. Supernatanten sögs försiktigt av och kasserades. Därefter tillsattes 250 l PCR-vatten, allt blandades tills suspensionen var helt homogen och inkuberades i värmeblock med 100ºC i 15 min och sedan kyldes proverna snabbt ner i frys med -20ºC i 5 min.
15
Resultat
Patientisolat och kontrollstammar som kördes med LightCycler 480 med mastermixen PerfeCta qPCR Fastmix lyckades identifiera både nuc- och mecA- genen. Primrarna hittade sina komplementära sekvenser och alla förväntade positiva prover för nuc-genen var positiva. Kontrollstammen S. epidermidis (ATCC 29887) som var nuc-gen negativ var också negativ. Se Fig 1.
Alla prover och kontrollstammar var positiva för mecA-genen förutom kontrollstammen S. aureus (CCUG 35602) som var mecA-gen negativ.
Fig. 1. Amplifieringskurvor för nuc-genen med PerfeCta mastermix. Kontrollstammar och patientisolat ingick i provmaterialet.
16 Detektionsgräns
Resultatet av detektionsgränsundersökningen med de två instrumenten visade att Taq Man RT-qPCR med LightCycler480 hade en lägre känslighet, eftersom Ct- värdet3 (cykel-tröskelvärde) för de analyserade proverna var högre jämfört med SYBR Green med Rotor-Gene 6000. Se tabell 1.
Tabell 1. Förteckning över detektionsgränserna för seriespädningarna och Ct-värdena för positiva
prover som kördes med LightCycler480 (LC480) och med Rotor-Gene 6000 (RG6000). Ct-värdena anges som medelvärde av duplikat.
Seriespädning Kontrollstam
S. aureus (nuc +, mec A+)
Nuc P1,Nuc P2
(LC480) Annealing- temp. 60οC
Nuc F, Nuc R
(RG6000) Annealing- temp.55οC
Seriespädning Kontrollstam
S. aureus (nuc +, mec A+)
Nuc P1,Nuc
P2 (LC480) Annealing- temp. 60οC
Nuc F, Nuc R
(RG6000) Annealing- temp.55οC
1:10 21,47 12,81 1:105 31,68 23,91
1:102 22,53 15,32 1:106 >35* 26,61
1:103 26,01 18,39 1:107 >35 30,12
1:104 28,87 21,00 1:108 >35 33,88
* >35 räknas som negativt resultat.
_________________________________
3Ct- värdet är antalet cykler när flourescensen passerar tröskeln för att detektera amplikonet.
17 Validering av primrar
Lista på seriespädningar och Ct-värden för positiva prover som kördes med LightCycler480 och med Rotor-Gene 6000 samt annealing-temperaturer återfinns i Tabell 2. Lägre Ct-värden visades för primrarna nuc F och nuc R med 55°C
annealing-temperatur på LightCycler480.
Tabell 2. Förteckning över de seriespädningar och Ct-värden för positiva prover som kördes med
LightCycler480 (LC480) och med Rotor-Gene 6000 (RG6000) samt olika annealing-temperaturer. De två olika instrumenten använder olika räknesätt för att komma fram till Ct-värdet. Ct-värdena anges som medelvärden av duplikat.
Seriespädning Kontrollstam
S. aureus (nuc +, mec A +)
Nuc P1, Nuc P2 (LC480)
Annealing- temp. 60⁰C
Nuc P1, Nuc P2 (LC480)
Annealing- temp. 55⁰C
Nuc P1, Nuc R (LC480)
Annealing- temp. 55⁰C
Nuc F, Nuc P2 (LC480)
Annealing- temp. 55⁰C
Nuc F, Nuc R (LC480)
Annealing- temp.55⁰C
Nuc F, Nuc R(RG6000)
Annealing- temp.55⁰C
1:10 19,89 17,76 17,32 16,94 16,83 14,77
1:102 21,08 21,23 19,40 20,05 19,05 16,26
1:103 25,97 24,78 23,17 23,51 22,12 19,48
1:104 29,61 27,45 26,92 25,97 24,91 22,04
1:105 34,20 31,58 31,40 29,81 28,58 25,30
1:106 37,05 34,96 34,42 33,47 32,64 28,72
1:107 39,55 38,98 40,22 39,29 35,03 33,39
18
Smältkurvsanalysen för de 12 patientisolaten visade att kurvan för alla 12 hade samma smälttemperatur och en topp bildades för varje amplikon. Se Fig 2.
Fig. 2. Smältkurvsanalys för patientisolat. SYBR Green mastermix med nuc Foch nuc R.
Två ytterligare körningar utfördes med LightCycler480 i det första minskades koncentration av primrarna nuc F och nuc R till hälften och resultatet visade ingen större skillnad mellan Ct-värdena. I andra körningen minskades tiden för
enzymaktivering från 10 min till 5 min och resultatet visade ett högre Ct-värde för proverna. Spädningsserien av kontrollstammen S. aureus (CCUG 35601) utgjorde mall. Därför valdes en halvering av koncentrationen av primrarna med 10 min tid för enzymaktivering.
19
Pipettering med CAS 1200™ och körning av patientprover
Resultatet av 16 försök med CAS 1200™ pipettering av kontrollstammen S. aureus (CCUG 35601) visade att det var 0,12 cyklers variation. Vid pipettering med CAS 1200™ bildades inga luftbubblor eftersom PCR-kurvan inte visade några hack.
Vid körning av de 18 patientproverna sågs, till skillnad från patientisolaten, ospecifika smälttoppar vid fel temperatur. Se Fig 3.
Fig. 3. Smältkurvsanalys av patientprover och kontrollstammen S. aureus (CCUG 35601). Det syns många ospecifika bindningar vid fel temperaturer.
För att kunna hitta en bra annealing-temperatur till primrarna testades olika primerpar och spädningsserier av kontrollstammen S. aureus (CCUG 35601).
Resultatet visades att vid 60ºC annealing-temperatur hade primrarna nuc P1, nuc P2 högre Ct-värde än primrarna nuc F, nuc R, men att primrarna nuc F, nuc R inte
20
uppvisade någon större skillnad i Ct-värde vid annealing-temperaturerna 60ºC och 62ºC. Se tabell 3.
Tabell 3. Summering av utfallet av olika spädningar vid annealing-temperaturerna 60ºC och 62ºC
med primrarna nuc P1, nuc P2 samt nuc F, nuc R för prover som kördes med LightCycler480 (LC480). Ct-värdena anges som medelvärden av duplikat.
Seriespädning Kontrollstam
S. aureus (nuc +, mec A+)
Nuc P1,Nuc P2
(LC480) Annealing- temp. 60οC
Nuc F, Nuc R
(LC480) Annealing- temp. 60οC
Nuc F, Nuc R
(LC480) Annealing- temp. 62οC
1:10 22,78 18,61 17,9
1:102 26,39 21,7 21,01
1:103 29,78 24,4 24,5
1:104 32,95 28,2 28,04
1:105 >35* 31,53 31,9
1:106 >35 >35 >35
* >35 räknas som negativt resultat.
I Fig. 4 visas resultatet för de 28 patientprover där primrarna hybridiserade mer specifikt till sin målsekvens. Smältkurvan hade en topp för varje prov vid rätt temperatur.
21
Fig. 4. Smältkurvsanalys för patientprover och kontrollstammen S. aureus (CCUG 35601). Det syns
mer specifik bindning av primrarna vid annealing-temperaturen 62ºC. Smälttoppar med specifika bidningar har numererats med 1, 2, 3 och 4.
Analys med Bullet
I Fig. 5 visas 35 patientprover som var positiva både vid extraktion med Bullet och vid manuell extraktion. Det syns att alla punkter hamnade ovanpå tvärlinjen, vilket innebär att DNA-extraktion med Bullet gav lägre Ct-värden i jämförelse med manuell extraktion.
22
Fig. 5. Jämförelse av Ct-värden mellan två extraktionsmetoder. X-axeln visar Ct-värdena för
patientprover vars DNA extraherats med Bullet. Y-axeln visar Ct-värdena för samma patientprover men med manuell extraktion. De lägre Ct-värdena noteras för DNA:t som extraherats med Bullet.
Av 186 patientprover var 16 prover positiva när DNA:t extraherades med Bullet men inte när deras DNA extraherades manuellt.
Diskussion
Eftersom det finns studier som visar att MRSA har ökat kontinuerligt sedan slutet av 1990-talet i Sverige, och MRSA-infekterade patienter är anmälningspliktiga sedan början av januari 2000 [9], är det av betydelse att bakterien identifieras snabbt och med ett pålitligt resultat. Standardodling med identifiering med hjälp av koagulastest eller liknande och efterföljande resistensbestämning gör att ett svar avseende MRSA-
0 5 10 15 20 25 30 35
0 5 10 15 20 25 30 35
23
förekomst i ett kliniskt prov ibland dröjer 2 till 4 dagar. Den tiden kan vara viktig för patienter, speciellt om behov av att börja en lämplig antibiotikabehandling föreligger.
Dessutom ökar förlängda vistelser på sjukhus kostnaderna [5-10-14].
Denna studie visade att man snabbt och korrekt kunde identifiera MRSA med TaqMan RT-qPCR och att analysen endast tog ca 50 min. För att bestämma detektionsgränsen, jämfördes Taq Man RT-qPCR på LightCycler480 med SYBR Green RT-qPCR på Rotor-Gene 6000 med hjälp av en spädningsserie. En lägre känslighet erhölls för Taq Man RT-qPCR med LightCycler480 eftersom Ct-värdena var höga i jämförelse med de som erhölls från Rotor-Gene 6000. Ct-värdet har stor betydelse i en PCR-körning, eftersom ett lågt Ct-värde visar hur snabb och effektiv PCR:en är, vilket bestäms av primrarnas specifika bindning till sin komplementära sekvens och är även relaterad till mängden DNA i provet. Primerbindningen är också beroende av annealing-temperaturen, som studerades för att hitta en lämplig
annealing-temperatur som gav ett lågt Ct-värde och samtidigt mindre ospecifika PCR-produkter.
Vanligtvis körs inte en MRSA-PCR på framväxta kolonier utan på patientprover i form av urin eller pinnprover från olika delar av kroppen, t.ex. näsa, perineum, svalg och sår. I studien inkuberades dessa prover först i en buljong med antibiotika. Detta medförde att mecA-negativa bakterier dog. Patientprover kan naturligtvis innehålla flera olika arter av bakterier. Trots att många av dem dör i MRSA-buljongen, finns det DNA som kan amplifieras och orsaka ospecifika bindningar. I Fig 3 och 4 sågs en del ospecifika PCR-produkter med mer än en smälttopp och med fel temperatur i
24
smältkurvsanalysen. En annan anledning till ospecifika PCR-produkter kan vara att primrarna binder ospecifikt till gensekvenser eller att primer dimers bildas.
I denna undersökning visades att båda metoderna, dvs. TaqMan RT-qPCR och SYBR Green RT-qPCR, kunde användas för kvantifiering av gener och att de hade förmåga att upptäcka PCR-produkter. TaqMan RT-qPCR är baserad på en specifik hybridisering av en dubbelmärkt prob, medan SYBR Green RT-qPCR är baserad på inbindning av SYBR Green färgämnet till dsDNA. Trots att båda metoderna är snabba och känsliga, är deras analysprincip för upptäckt av målsekvenser och
optimering olika [11]. Det viktigaste för att bestämma hur bra en PCR-analys är dock primrarna, som styr effektiviteten hos en PCR-metod.
En viktig anledning till varför denna studie utfördes var att kunna använda LightCycler480 för screening av MRSA-prover. Idag används på mikrobiologen Rotor-Gene 6000 till flera olika analyser. Apparaten är tungt belastad med
köbildning som resultat, och det innebär ett tidsslöseri. Dessutom är antalet prover som kan köras med Rotor-Gene 6000 endast 72, och hela körningen tar cirka 2,5 tim.
Att utbyta Rotor-Gene 6000 mot LightCycler480 skulle spara tid och möjliggöra fler provanalyser, eftersom hela körningen med LightCycler480 tar 1,5 tim och en 96- hålplatta används. Ytterligare fördelar med den här plattan är att den kan användas för både CAS 1200™ och Bullet. Pipettering med CAS 1200™ gav en mycket liten cykelvariation. Dessutom bildades inga luftbubblor i brunnarna och ingen
centrifugering av plattan behövdes därmed innan PCR-körningen.
25
De potentiella fördelarna med att använda Bullet vid DNA-extraktion, pipettering med CAS 1200™ och PCR-körning på LightCycler480 blev uppenbara genom att arbetstiden minskades och Ct-värdena blev betydlig lägre jämfört med den tidigare manuella hanteringen. Emellertid blev det lite mer arbete, eftersom fler positiva prover noterades vid körning med LightCycler480. Anledningen till detta var troligtvis att DNA-extraktion med Bullet ger renare och mer DNA. Även de andra bakterier som dött i buljongen av antibiotikan p.g.a. avsaknad av mecA-gen kan därmed fångas upp och ge ett falskt positivt PCR-resultat eftersom det finns fritt DNA i buljongen. Det krävdes därför odling av de positiva proverna efter PCR- körningen för att se om de var falskt eller sant positiva. Ett förslag på hur man skulle kunna minska de falskt positiva prover är att sänka cut- offen för ett negativt prov. I studien räknades ett Ct-värde på mer än 35 som negativt. Det skulle dock kunna sänkas till 30, eftersom de sant positiva proverna och positiva kontrollerna hade Ct- värden mellan 11 och 20.
Snabba och specifika PCR-tekniker möjliggör en påskyndad diagnostik och
tidigare upptäckt av MRSA-infektioner jämfört med de äldre fenotypiska metoderna.
Detta i sin tur leder till snabbare behandling och att eventuell smittspridning kan kontrollas bättre [12]. Det har utvecklats flera nya molekylära tester för att upptäcka MRSA och nya MRSA-bärare i olika vårdhygieniska kontrollprogram. Av dessa tester kan namnges LightCycler MRSA Advanced Test, som förefaller att vara snabbt och med hög känslighet och bra specificitet [13].
26
Nyligen hittades en stam av vad som fenotypiskt överensstämde med S. aureus, men som inte hade nuc-gen. Alternativa förklaringar till fyndet är att nuc-genen hade muterat i primersekvensen eller så rörde det sig om hundens motsvarighet till
S.aureus, Staphylococcus pseudintermedius. Denna bakterie är svår att fenotypiskt skilja från S. aurues men saknar nuc-gen. Det är alltid en risk med PCR-tekniker att mutationer i den sökta genen kan förekomma. Forskarna letar efter en gen som kan läggas till för att i framtiden minska risken för att missa MRSA. En sådan gen är t.ex.
Sa442-genen (artspecifik 442-gen) eller CoA-genen, som kan kombineras med nuc- genen i mastermixen för att få fram bättre och säkrare resultat. Dessa gener har redan visat sig vara användbar för påvisande av S. aureus [14-15].
Slutsats
I denna studie undersöktes hur ett kliniskt laboratorium skulle kunna förbättra sin MRSA-diagnostik. Slutsatsen av studien är att i framtiden kommer SYBR Green I RT-qPCR metoden och PCR-maskinen LightCycler480 användas för MRSA- screening på laboratoriet. För att erhålla mer tillförlitliga resultat kommer två primerpar att kombineras i mastermixen, och dessutom blir det en övergång till Bullet för DNA-extraktion och CAS 1200™ för pipettering. Denna rationalisering kommer att spara personalresurser och sänka antalet arbetsskadade i personalen samtidigt som identifieringen av MRSA blir både snabbare och mer effektiv.
27
Referenser
[1] Deurenberg RH, Stobberingh EE. The evolution of Staphylococcus aureus.
Infect Genet Evol 2008 Dec; 8(6):747-63.
[2] Le Loir Y, Baron F, Gautier M. Staphylococcus aureus and food poisoning.
Genet Mol Res 2003 Mar; 2 (1):63-76.
[3] Carroll KC. Rapid diagnostics for methicillin-resistant Staphylococcus aureus:
current status. Mol Diagn Ther 2008; 12(1):15-24.
[4] Deurenberg RH, Stobberingh EE. The molecular evolution of hospital- and community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Curr Mol Med 2009 Mar; 9(2):100-15.
[5] Huletsky A, Giroux R, Rossbach V, et al. New real-time PCR assay for rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus directly from specimens containing a mixture of staphylococci. J Clin Microbiol 2004 May; 42(5):1875-84.
[6] Zipper H, Brunner H, Bernhagen J, et al. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res 2004 Jul; 32(12):e103.
[7] Harbarth S, Hawkey PM, Tenover F, et al. Update on screening and clinical diagnosis of meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Int J Antimicrob Agents 2011 Feb; 37(2):110-7.
[8] Kilic A, Muldrew KL, Tang YW, et al. Triplex real-time polymerase chain reaction assay for simultaneous detection of Staphylococcus aureus and coagulase-
28
negative staphylococci and determination of methicillin resistance directly from positive blood culture bottles. Diagn Microbiol Infect Dis 2010 Apr; 66(4):349-55.
[9] Stenhem M, Örtqvist Å, Ringberg H, et al. Epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Sweden 2000-2003, increasing incidence and regional differences. BMC Infect Dis 2006 Feb; 6:30.
[10] Jonas D, Speck M, Daschner FD, et al. Rapid PCR-based identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus from screening swabs. J Clin Microbiol 2002 May; 40(5):1821-3.
[11] Ponchel F, Toomes C, Bransfield K, et al. Real-time PCR based on SYBR- Green I fluorescence: an alternative to the TaqMan assay for a relative quantification of gene rearrangements, gene amplifications and micro gene deletions. BMC
Biotechnol 2003 Oct; 3:18.
[12] Thomas LC, Gidding HF, Ginn AN, Olma T,et al. Development of a real-time Staphylococcus aureus and MRSA (SAM-) PCR for routine blood culture. J
Microbiol Methods 2007 Feb; 68(2):296-302.
[13] Peterson LR, Liesenfeld O, Woods CW, et al. Multicenter evaluation of the LightCycler methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) advanced test as a rapid method for detection of MRSA in nasal surveillance swabs. J Clin Microbiol 2010 May; 48(5):1661-6.
[14] van Duijkeren E, Kamphuis M, van der Mije IC, et al. Transmission of methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius between infected dogs and cats and contact pets, humans and the environment in households and veterinary clinics.Vet Microbiol. 2011 Jun; 150(3-4):338-43.
29
[15] Sabet NS, Subramaniam G, Navaratnam P, et al. Simultaneous species identification and detection of methicillin resistance in staphylococci using triplex real-time PCR assay. Diagn Microbiol Infect Dis. 2006 Sep; 56(1):13-8.
