Abstract
An organism that has been in focus for many years as a potential candidate for consolidated bioprocessing (CBP) in second-generation biofuel production is Clostridium thermocellum. However, the native ethanol yields and titers of C. thermocellum are insufficient for economic competition with fossil fuels. The low ethanol yields are caused by its heterofermentative nature, i.e. the simultaneous production of a variety of end-products. This challenge can be overcome with metabolic engineering strategies that increases the ethanol production while eliminating production of other end-products.
However, despite extensive research, a strain with economically competitive ethanol yields and titer (90% of theoretical maximum and 40 g/L, respectively) has yet to be developed. This is due to the metabolism of C. thermocellum not being completely understood, partly due to its complexity. The aim of this study was to construct a homolactic C. thermocellum strain with simplified metabolism by increasing the lactate production and knocking-out competing pathways, and to evaluate previous metabolic engineering strategies by physiologically characterizing the strains. The targeted knock-outs were the adhE and pta-ack genes. The bifunctional adhE gene encodes for aldehyde dehydrogenase (ALDH) and alcohol dehydrogenase (ADH) and is responsible for ethanol production. The pta-ack genes encodes for phosphate acetyltransferase (PTA) and acetate kinase (ACK), respectively and is responsible for acetate production. Knocking-out these pathways could divert the carbon and electron flux towards lactate. These knock-outs were attempted on two strains, both had heterologous pyruvate kinase (PYK) inserted and one of the strains had overexpression of lactate dehydrogenase (LDH) inserted after the PYK. However, the knock-outs were not successful despite multiple attempts.
In addition, physiological characterization of the two strains used as platform organisms for the knock- outs showed growth defects and lower than expected product yields. The lack of successfully transformed strains combined with the fermentation data of the previously constructed strains raised questions whether the strains with heterologous PYK in their current state are viable as platform organisms for adhE and pta-ack knock-outs. Instead, an alternative strategy was suggested in which another strain with LDH overexpression and without PYK is used as a platform organism instead.
Key words
Consolidated bioprocessing Lignocellulose
Clostridium thermocellum Homolactic fermentation Metabolic engineering Serum bottle fermentation Physiological characterization
Sammanfattning
En organism som har varit i fokus som potentiell kandidat för sammanslagen bioprocessering (eng.
Consolidated bioprocessing, CBP) för andra generationens biodrivmedelsproduktion är Clostridium thermocellum. Dock är det naturliga utbytet och titern för etanol i C. thermocellum otillräcklig för att konkurrera med fossila bränslen. Det låga etanolutbytet är på grund av att den är heterofermentativ, d.v.s. den bildar diverse ämnen som jäsningsprodukt. Denna utmaning kan lösas med metabolic engineering strategier som ökar etanolproduktionen medan konkurrerande biprodukter elimineras.
Dock har ingen stam med ekonomiskt konkurrenskraftigt etanolutbyte och titer (90 % av teoretiskt maximum respektive 40 g/L) utvecklats, trots omfattande forskning. Detta är på grund av att metabolismen i C. thermocellum inte är helt förstått, delvis på grund av dess komplexitet. Syftet med denna studie var att konstruera en homolaktisk C. thermocellum stam med en förenklad metabolism genom att öka laktatproduktionen och knocka konkurrerande metaboliska vägar, och att undersöka tidigare metabolic engineering strategier genom att karakterisera de fysiologiska egenskaperna i stammarna. Generna av intresse var adhE och pta-ack. Den bifunktionella adhE genen kodar för aldehyddehydrogenas (ALDH) och alkoholdehydrogenas (ADH), och ansvarar för etanolproduktion.
Generna pta-ack kodar för fosfat acetyltransferas (PTA) respektive acetatkinas (ACK), och ansvarar för acetatproduktion. Genom att knocka dessa metaboliska vägar kan kol- och elektronfluxet ledas mot laktat istället. Dessa knockar försöktes i två olika stammar, båda hade uttryck för heterologt pyruvatkinas (PYK) och en av stammarna hade överuttryck av laktatdehydrogenas (LDH) placerat efter PYK. Knockarna var dock inte framgångsrika trots flera försök. Dessutom, genom fysiologisk karakterisering visade det sig att de två stammarna som användes som platformsorgansim hade defekt tillväxthastighet och lägre produktutbyte än förväntat. Bristen av framgång i transformering av stammar kombinerat med data från tidigare konstruerade stammar väckte frågan huruvida stammarna med hetorologt PYK i deras nuvarande tillstånd är användbara som platformsorganismer för knockning av adhE och pta-ack. Istället föreslogs en alternativ strategi där en annan stam med överuttryck av LDH och utan PYK används som platformsorganism istället.
Nyckelord
Sammanslagen bioprocessering (eng. Consolidated bioprocessing) Lignocellulosa
Clostridium thermocellum Homolaktisk jäsning Metabolic engineering Jäsning i serumflaskor Fysiologisk karakterisering
