Examensarbete, 30 hp Masterprogrammet Farmaci 120 hp
Rapporten godkänd: VT 2020 Handledare: Jerker Fick, Examinator: Anders Öhman
Förfalskade läkemedel
En fallstudie i Nigeria
Sabah Ibrahem Ali
Sammanfattning
Förfalskade läkemedel och läkemedel av bristande standard är ett allt större problem världen över, speciellt i medel- och låginkomstländer. Problemen med dessa läkemedel är många och de medicinska framgångar som gjorts det senaste seklet riskerar att undermineras. Det finns studier om förekomsten av förfalskade och undermåliga antibiotikum i Nigeria. Dessa studier visade att kinolonantibiotika såsom Ciprofloxacin, är ett av de antibiotikum där problemet med förfalskade och undermåliga varianter är som störst. Det finns där med ett behov av att analysera kinolonantibiotika från Nigeria.
Syftet med det här arbetet är att göra ett stickprov av den Nigerianska läkemedelsmarknaden för att undersöka förfalskade läkemedel på marknaden.
Frågeställningarna är: Hur stor andel av den analyserade kinolonantibiotikan från Jos är förfalskad eller av undermålig kvalitet med avseende på halt av aktiv substans?Hur stor är haltvariationen inom samma batch? Arbetet är en fallstudie och inriktar sig på bredspektrumantibiotikumet Ciprofloxacin. Materialet är inhämtat delvis från vetenskapliga publiceringar publicerade i databasen PubMed och delvis från läkemedelsanalytiska laborationer i Umeå.
Resultatet visade att 87,4 % av de analyserade ciprofloxacin tabletterna var av förfalskad eller undermålig kvalitet med avseende på andel aktiv substans jämfört med deklarerat värde. Resultatet från haltvariationen inom samma batch visade att den är låg, 11 procentenheter, orsaken skulle kunna vara att en felaktig mängd intern standard tillsattes. Andelen förfalskade och undermåliga antibiotikum med avseende på aktiv substans skiljer sig från WHO:s och andra studier i Nigerias uppgifter om hur stor andel av antibiotikum och specifikt Ciprofloxacin som är av förfalskad eller undermålig kvalitet i Afrika och speciellt i Nigeria.
Fler studier behöver göras för att bättre kunna få en bild av problemets omfattning.
Förfalskade och undermåliga antibiotika är fortfarande är ett stort problem i Nigeria och mer behöver göras för att förbättra situationen.
Nyckelord: förfalskade läkemedel,Ciprofloxacin, Counterfeitdrugs in Nigeria, UHPLC-MS
1
Bakgrund
Förfalskade och undermåliga läkemedel
Förfalskade läkemedel och läkemedel av undermålig kvalitet blir ett allt större problem världen över, speciellt i medel- och låginkomstländer p.g.a. bl.a. bristande läkemedelskontroller och sämre teknologisk kapacitet (1, 2). Förfalskade läkemedel definieras som: medicinska produktersom uppsåtligen är av missvisande karaktär, sammansättning eller ursprung. Dessa läkemedel innehåller ingen eller för liten halt aktiv substans. Ibland kan de även innehålla helt andra aktiva substanser i helt fel mängder och därmed vara livsfarliga att använda. Undermåliga läkemedel definieras som:
auktoriserade medicinska produkter som inte uppnår antingen kvalitetskrav eller specifikation, eller både och. Läkemedel av bristande standard uppkommer bl.a. av undermålig tillverkning, transport eller lagring eller om läkemedlet säljs efter utgångsdatum (2).
Problemen med dessa läkemedel är många och de medicinska framgångar som gjorts det senaste seklet riskerar att undermineras, speciellt i utvecklingsländer kan morbiditet och mortalitet för första gången på länge öka för sjukdomar som fram till nyligen varit relativt lättbehandlade (1, 2). Ett väldigt uppmärksammat problem är förfalskade och undermåliga malarialäkemedel. Med rätt medicin är sjukdomen behandlingsbar, men förekomsten av förfalskade och undermåliga läkemedel, där endast en liten mängd aktiv substans tillsatts, utgör ett stort problem i utvecklingsländer. Resultatet är ökad mortalitet och dessutom ökad resistensutveckling hos malariastammar. Uppskattningsvis dör runt 250.000 människor om året till följd av förfalskade och undermåliga malarialäkemedel (1). Ett annat exempel är de 109 dödsfall hos barn i Nigeria på 90-talet till följd av undermåliga paracetamol tabletter. Det uppgavs i tabletternas specifikation att propylenglykol används som hjälpämne, men i själva verket var det etylenglykol som är giftigt och orsakar njursvikt (3).
Ett annat problem med dessa läkemedel är att de riskerar att underminera samhällets tilltro till läkare och farmaceuter. När medicinen inte gör nytta, eller till och med skada, är det läkare och farmaceuter som riskerar mest kritik från samhället eftersom det är dessa två yrkeskategorier som förskriver och tillhandahåller dessa läkemedel.Ytterligare ett problem med förfalskade och undermåliga läkemedel är intäktsförlust för de legitima läkemedelsföretagen som utsätts för konkurrens av de icke-legitima förfalskande läkemedelsföretagen (1). Även för samhället i stort blir dessa läkemedel en ekonomisk förlust, med ökad morbiditet som resulterar i försämrad arbetsförmåga och en ökad andel sjuka i samhället som måste försörjas av en allt mindre arbetsför andel människor.
Marknad för förfalskade och undermåliga läkemedel
Problemet med förfalskade och undermåliga läkemedel har länge antagits vara något som sker småskaligt, men i själva verket är denna olagliga verksamhet mer utbredd än så.
Denna marknad styrs delvis av organiserad brottslighet där internationella nätverk av oseriösa läkemedelsföretag konkurrerar med de legitima läkemedelsföretagen (1). När det gäller produktionen av dessa läkemedel anses Indien vara det land där produktionen är som störst, hela 35 % av alla förfalskade och undermåliga läkemedel tros produceras där.
Världshälsoorganisationen (WHO) uppskattar att 10,5% av alla världens läkemedel är förfalskade och bara 1 % av dessa läkemedel tros finnas i höginkomstländer, dock har en liten ökning setts de senaste åren även i höginkomstländer (2).
Gemensamt för de länder därdessa läkemedel förekommer i stor utsträckning är bristande kontroll över läkemedelsmarknaden samt att lagar om läkemedelsproduktion, läkemedelskontroll och läkemedelsimport sällan implementeras till fullo. Det beror delvis på korruption och delvis på att nyckelaktörer inte tar sitt ansvar p.g.a. avsaknad av incentiv(4). Marknaden för förfalskade och undermåliga läkemedel är väldigt lukrativ med lägre produktionskostnader än legitima läkemedelsföretag, höga marknadspriser och hög efterfrågan. Några av de kostnadsbesparingar som illegitima läkemedelsföretag gör är
2 bl.a. uteblivna kostnader för forskning och utveckling eftersom detta inte bedrivs, uteblivna kostnader för att försvara eller söka patent, uteblivna kostnader för att följa Good Manufacturing Practice (GMP) samt uteblivna kostnader för marknadsföring eftersom de använder redan existerande läkemedelsnamn.
Som tidigare nämnts innehåller förfalskade och undermåliga läkemedel ofta ingen aktiv substans alls eller väldigt liten halt, ibland är den aktiva substansen ersatt med något annat ämne som t.ex. krita, färg, skrivarbläck eller antifrysmedel, vilket också utgör en kostnadsbesparing men även livsfara för den som använder dessa läkemedel.
Produktionen av dessaläkemedel görs billig genom att outsourca till länder med låga kostnader och där läkemedelskontrollerna är eftersatta, såsom Indien eller Kina.
Transporten sköts ofta av aktörer i tredje hand. Internet spelar idag en stor roll där flera illegitima internetapotek säljer förfalskade och undermåliga läkemedel. En studie gjord med mysteryshoppers 2008 runt om i Europa av över 100 internetapotek visade att 60 % av alla läkemedel som köptes var förfalskadeeller undermåliga (1).
Tidigare forskning internationellt
Trots den ökade problematiseringen kring förfalskade och undermåliga läkemedel är problemets utsträckning inte tillräckligt utforskat, men det finns ett fåtal studier att tillgå (2). I en artikel publicerad av Delepierre et al. (2012) menar författarna att antibiotika är den vanligast förekommande förfalskade och undermåliga medicinen i världen och svarar för 28 % av det totala antalet förfalskade och undermåliga läkemedel (5). Förfalskad och undermåliga antibiotika förekommer mest i Sydostasien och Afrika, en mindre andel i Nordamerika och Europa. En metaanalys med syfte att undersöka prevalensen och den ekonomiska bördan av dessa läkemedel i medel- till låginkomstländer har utförts av Ozawa et al. (2018) (2).
De utgick från fem databaser: Pubmed, EconLit, Global Health, Embase och Scopus.
Kravet på de artiklar som ingick i studien var att de undersökte prevalensen av förfalskade och undermåliga läkemedel, deras kvalitet och/eller den ekonomiska bördan för samhället som dessa läkemedel resulterade i. Artiklar publicerade på engelska, kinesiska, portugisiska, spanska, franska eller tyska före november 2017 inkluderades i studien. De artiklar som inte handlade om ett medel- eller låginkomstland exkluderades.
Totalt ingick 96 artiklar i studien. Artiklar från Afrika (50,2 %) och Asien (30,4 %) utgjorde störst andel av alla granskade artiklar. Det förekom även artiklar från Sydamerika, Europa, Nordamerika samt Oceanien. De vanligaste läkemedelsgrupperna som studerats i de granskade artiklarna var antimalarialäkemedel (44,2 %) och antibiotika (39,2 %). Resultatet visade att prevalensen av förfalskade och undermåliga läkemedel var 18,7 % i Afrika och 13,7 % i Asien. Medelprevalensen av förfalskade och undermåliga antimalarialäkemedel var 19,1 % och för antibiotika 12,4 % (2).
Studien identifierade dock en del kvalitetsproblem hos de granskade artiklarna, bl.a. hur prevalensen rapporterades, dessutom har en del studier som granskats inte använt tillfredsställande randomisering eller analysmetod. Andra problem som förekommer med de prevalensstudier för förfalskade och undermåliga läkemedel som utförs är sampling bias, dåliga förvaringsförhållanden, för litet urval för att få en rättvis bild av problemet, inkonsekventa definitioner, farmakopéer och insamlingsmetoder. Vissa studier har inte ens publicerats. Dessa problem visar på att det behövs fler studier med bättre metodstandardföratt förbättra generaliserbarheten hos resultaten (2, 6).
Kvalitetsproblem som dessa studier uppvisar leder till att problemet med förfalskade och undermåliga läkemedel inte kan utvärderas ordentligt med metaanalyser och litteraturgenomgångar (2).
3 Situationen i Nigeria
Studien av Ozawa et al. visade, trots de kvalitetsproblem som uppmärksammats hos en del av de granskade studierna, att problemet med förfalskade och undermåliga läkemedel är allvarligt och understuderat. Som studien av Ozawa et al. visade är förekomsten av dessa läkemedel som störst i Afrika. Ett av de afrikanska länder som har stora problem med dessa läkemedel är Nigeria. Det finns få vetenskapliga studier som undersökt problemet i Nigeria och merparten av den information som finns att tillgå inom området kommer från journalistik (6). Nigeria klassas som ett av världens mest korrupta länder och läkemedelsförfalskning har förekommit i landet sedan 60-talet (7).
Andelen förfalskade och undermåliga läkemedel tros på 90-talet ha uppgått till över 50 % i landet (8). Under 90-talet gjordes försök att minska förekomsten, försäljningen och produktionen av dessa läkemedel i Nigeria men på grund av otillräcklig infrastruktur och politiska incentiv gick arbetet trögt. När National Agency for Food and Drug Administration and Control (NAFDAC) år 2001 fick en ny generaldirektör, Dora Akunyili, genomgick organisationen en rad förändringar för att förbättra arbetet mot förfalskade och undermåliga läkemedel.
Det resulterade i att andelen av dessa läkemedel i omlopp i Nigeria från 2002 till 2006 föll med 80% jämfört med nivån 2001. Situationen har alltså förbättrats de senaste åren i Nigeria men fortfarande cirkulerar förfalskade och undermåliga läkemedel i landet.
Girighet, ignorans och korruption är de huvudsakliga anledningarna till att denna verksamhet är så pass utbredd i Nigeria. Läkemedelsmyndighet, domstol och läkemedelsimportörer i landet är korrupta och förbiser ofta förekomsten av dessa läkemedel (4).
Förfalskadeoch undermåliga antibiotika i Nigeria
Den vanligaste typen av förfalskade och undermåliga antibiotika är betalaktamantibiotika, mer än 50 % av förfalskade och undermåliga antibiotika utgörs av betalaktamantibiotika, följt av kinoloner, makrolider, linkosamider, cykliner m.fl. (5, 6).
Epidemiologiska data från WHO visar att i Afrika saknas det aktiv substans i 7,6 % av de vanligaste anibiotikumen och att 17,8 % av antibiotikumen i Afrika var av undermålig kvalitet. Det finnsett fåtal studier som undersökt prevalensen av dessa antibiotikum i Nigeria. En studie gjord av Taylor et al. (2001) undersökte kvaliteten på olika läkemedel och beredningsformer från apotek i Lagos och Abuja. De analyserade proven bestod av kapslar, tabletter, sirap, suspensioner och injektioner innehållandes bl.a. ampicillin, cloxacillin eller metronidazol. Proven analyserades med HPLC-teknik och resultatet visade att mer än 50 % av de undersökta läkemedlen innehåll för låg halt aktiv substans eller helt saknade aktiv substans (9). En tidigare studie av Taylor et al. (1995) i Nigeria undersökte halten aktiv substans i bl.a. kapslar med amoxicillin. Analysmetoden som användes rapporterades inte. Resultatet visade att 30 % av amoxicillin kapslarna var förfalskade eller av undermålig kvalitet (10). En tredje studie som genomförts i Nigeria gjordes av Iwuagwu et al. (1992). Studien använde sig av sönderfalls- och upplösningsmetoder och visade att av 13 olika märken av ampicillin kapslar var 25 % förfalskade eller av undermålig kvalitet (11).
Den vanligast undersökta antibiotikan i Nigeria är betalaktamantibiotika men som tidigare nämnts utgör kinolonantibiotika också en stor andel av den förfalskade och undermåliga antibiotikan i världen. Förekomsten av förfalskade och undermåliga kinoloner uppgick år 2009 till 12 % världen över (5). Staden Jos i Nigeria är en av de städer i Nigeria där problemet med dessa läkemedel finns, det var även i Jos som den tidigare nämnda paracetamolkatastrofen som tog flera barns liv ägde rum på 90-talet. Jos ligger i centrala Nigeria och har runt 600.000 invånare. Staden har ävenen viktig kommersiell roll i området (12). Kinolonantibiotika såsom Ciprofloxacin, som är ett bredspektrumantibiotikum, är ett av de antibiotikum där problemet med förfalskade och undermåliga varianter är som störst i Nigeria, bl.a. i Jos. Det finns därmed ett behov och ett intresse av att analysera kinolonantibiotika från Nigeria.
4
Syfte och frågeställning
Syftet med det här arbetet är att göra ett stickprov av den Nigerianska läkemedelsmarknaden för undersökande av förfalskade och undermåliga läkemedel.
Frågeställningarna är:
Hur stor andel av den analyserade kinolonantibiotikan från Jos är förfalskad eller av undermålig kvalitet med avseende på halt av aktiv substans?
Hur stor är haltvariationen inom sammabatch?
Metod
Studiedesign
Arbetet är en fallstudie om förfalskade och undermåliga antibiotikum i Jos, Nigeria, och inriktar sig på bredspektrumantibiotikumet Ciprofloxacin.Tabletter är den vanligaste beredningsformen för Ciprofloxacin och därför inriktar sig det här arbetet endast på ciprofloxacin tabletter. Ett utval antal ciprofloxacin tabletter har verifierats och de preparat som uppfyllde kriterierna för analytisk standard redovisades mot dem som inte uppfyllde kriterierna. Ciprofloxacin tabletterna analyserades med avseende på aktiv substans. De inklusionskriterier som använts för att välja ut ciprofloxacin tabletter till arbetet var ciprofloxacin tabletter som fanns att köpa receptfritt på de fem största apoteken och på de två största marknaderna i staden Jos, Nigeria. Av dessa tabletter införskaffades 3 förpackningar av alla olika tillverkare tisdagen den 5:e januari 2016.
Textmaterialet är inhämtat delvis från vetenskapliga publiceringar publicerade i databasen PubMed och delvis från läkemedelsanalytiska laborationer. Inklusionskriterier för de vetenskapliga publikationer som används i arbetet är: artiklar som handlar om förfalskade och/eller undermåliga antibiotikum i Nigeria; artiklar skrivna på engelska;
åtkomst till hela artikeln. Sökord som användes för att hitta artiklarna var ”market for fake drugs in Nigeria”, ”fake drugs Ciprofloxacin in Nigeria”, ”counterfeit drugs in Nigeria” och ”fake antibiotics in Nigeria”. De läkemedelsanalyser som utfördes ägde rum vid Umeå Universitet 11-15 november 2019.
Analytisk metod
Analysmetoden som användes var Ultra High Pressure Liquid Chromatography (UHPLC) kopplad till en trippelkvadrupol masspektrofotometer (TQS,ThermoScientific). UHPLC är idag en mycket använd teknik inom läkemedelsanalys. Fördelar med tekniken är hög upplösning, hög effektivitet, snabb analys, hög robusthet, tillförlitliga resultat och ett brett utbud av olika UHPLC-instrument och stationärfaser. UHPLC kan kopplas till masspektrometri som detektionsmetod och det medför ytterligare fördelar med avseende på sensitivitet och selektivitet. Användandet av elektrospray som joniseringsmetod anses vara den mest fördelaktiga för UHPLC-MS, utöver det kan mer optimal nebulisering, desolvering och jonisering åstadkommas med uppvärmd elektrospray (13).
Vätskekromatografin är en separationsmetod som är vanligt förekommande inom läkemedelsanalys, det beror delvis på att de flesta läkemedelssubstanser är icke-flyktiga och värmestabila, vilket innebär att vätskekromatografi är att föredra framför gaskromatografi där substanserna som ska separeras behöver vara flyktiga och värmestabila. Normalt består en HPLC-anordning av en degasser, en collector, pumpar och en detektor. Auto-injektorn för analyten till den mobila flytande fasen som för analyten till kolumnen. Pumparna ställs in så att rätt tryck och hastighet förekommer i kolumnen för att få bra separation. I slutet av kolumnen sitter en detektor som genererar en signal proportionell mot mängden analyt som passerar detektorn.
Kolumnen innehåller ett material ditt substanser i analyten kan adsorbera, eftersom olika substanser kan ha olika affinitet för adsorbenten, får man även olika retentionstider och därmed kan separation av olika substanser uppstå. Adsorbenten är ofta kiseldioxid eller
5 någon slags polymer, som är poröst, där substanser kan fastna.Vätskan som används i den mobila fasen är ofta en blandning av acetonitril och metanol, man justerar proportionerna efter hur polär/opolären substanser är som man vill separera. Skillnaden mellan UHPLC och vanlig vätskekromatografi är att UHPLC använder ett högre vätsketryck i kolumnen (14).
Det UHPLC-system som användes var utrustat med en Ultimate 3000-pump, en avgasare, en PALHTC-autosamlare (CTC Analytics, AG, Zwingen, Schweiz) samt en temperatur kontrollerad kolumn. LC-pumpen var kopplad med en kolumn av typen AccucoreQ (2.1 x 100 mm, 2,6 µm, ThermoScientific). Kolumnen användes med en skyddskolumn av typen AccucoreQ (2.1 x 10mm, 6 µm, ThermoScientific). Lösningsmedel som användes var vatten i kanal C och acetonitril i kanal D.Joniseringsmekanismen i masspektrometern var uppvärmd elektrospray i positivt läge. För detaljerad information kring analysen med vätskekromatografi kopplad till masspektrometri se appendix 1.
Laborativt förfarande
Med denna metod analyserades 29 olika ciprofloxacin produkter i form av tabletter. Från varje batch togs tre tabletter och placerades i mikrorör (2 mL), det blev totalt 87 olika mikrorör. Till rören sattes sedan 10-15 st. zirkoniumkulor och med hjälp av mini Beadbeater (Biospec. Bartlesville, USA) pulveriserades och homogeniserades tabletterna i rören under fyra minuter vid 42.000 oscilleringar per minut. Alla tabletter pulveriserades inte vid första körningen, en del blev bara delvis pulveriserade eller inte alls, därefter kördes dessa i fyra minuter till. Sedan flyttades minirörens innehåll till provrör med platt botten och 10 mL acetonitril tillsattes till varje provrör. Därefter togs 100 µL från varje provrör till nya provrör och 9,9 mL acetonitril tillsattes, denna spädning upprepades en gång till. Totalt späddes det ursprungliga provet ut 10.000 gånger. Därefter togs 1 mL ut från varje provrör och sattes till LC vialer. 31 µL intern standard (160,7 µg/mL) späddes med 5 mL metanol och blandades ordentligt med en vortexapparat. Sedan togs 50 µL av lösningen och tillsattes till alla provflaskor. Dessa provflaskor placerades sedan i UHPLC- maskinen för analys.
Tabletterna analyserades med avseende på halt aktiv substans, d.v.s. Ciprofloxacin. För protokoll gällande kromatografi och MS se appendix 1. För kvantifiering av halten aktiv substans i tabletterna togs gjordes en spädningsserie med kända koncentrationer av Ciprofloxacin vid 1000 ng/mL, 2500 ng/mL samt 5000 ng/mL. Med dessa koncentrationer på x-axeln och signalen för Ciprofloxacin/signalen för IS på y-axeln togs en standardkurva fram och utifrån linjens ekvation kunde sedan kvantifiering av Ciprofloxacin i de analyserade tabletterna ske, se appendix 2. Den deklarerade halten aktiv substans i tabletterna var 500 mg. Eftersom dessa 500 mg aktiv substans löstes i 10 mL acetonitril bör koncentrationen i provröret innan spädningarna vara 50 mg/mL. Den uppmätta halten aktiv substans i varje tablett fick ligga inom intervallet 80-125% av referensvärdet (500 mg) för att bli godkänd. Batch 7 valdes slumpmässigt utför att göra en haltvariationsanalys inom batchen. Från batch 7 valdes 20 tabletter slumpmässigt ut och analyserades, för att följa farmakopékravet (15).
Resultat
Nedan presenteras resultatet av körningarna. I figur 1 visas ett kromatogram över körningarna där den översta toppen föreställer Ciprofloxacin och den nedersta toppen föreställer IS. I figuren syns även retentionstiderna (RT) och hur starka signalerna (AA) är för respektive substans.
6 Figur 1. Kromatogram efter läkemedelsanalys. Topparna motsvarar Ciprofloxacin högst upp och IS längst ned. Tidsskalan för retentionstiden på x-axeln är i minuter och på y- axeln är relativ absorbans (absorbans för Ciprofloxacin/absorbans för IS).
Nedan presenteras resultatet från läkemedelsanalysen, se tabell I. Koncentrationen av aktiv substans i de analyserade proven har beräknats med hjälp av en standardkurva, se appendix 2. I Tabellen nedan presenteras även den teoretiska koncentrationen i ursprungsproven före de båda spädningarna, den uppmätta halten aktiv substans i varje tablett som analyserats samt hur stor andel aktiv substans varje tablett innehåller i relation till det deklarerade värdet.
Tabell I. Uppmätt halt aktiv substans för olika tillverkares Ciprofloxacin tabletter, samt andel aktiv substans jämfört med deklarerat värde. De halter aktiv substans som uppfyller farmakopékravet för haltvariation är markerade i fetstil.
Namn, Batchnr. Provnr. Uppmätt mängd aktiv
substans (mg)
Andel aktiv substans jämfört med
deklarerat värde (%)
RAPIDFLOX, E415 1 140 28
2 670 134
3 130 26
CIFLAXIN, 1001201 1 290 58
2 270 54
3 220 44
CIPROXAMED, ECFT-
001 1 350 70
2 370 74
3 70 14
7
CYPLOX, 640029 1 440 88
2 400 80
3 330 66
PEMCIPRO, 141221 1 30 6
2 40 8
3 20 4
CIPROKRIS, KP15100 1 70 14
2 80 16
3 50 10
CIFLOMAX, GTT4001 1 20 4
2 45 9
3 310 62
SIPROSAN, SPS009B 1 380 76
2 250 50
3 300 60
ZINDOCIP 1 190 38
2 320 64
3 150 30
CIPROMAX, 143121016 1 190 38
2 210 42
3 300 60
CIPROHEAL, CF4030 1 400 80
2 540 108
3 460 92
ZIBATAB, ZX0011403 1 87 17,4
2 240 48
3 350 70
VPL.CIPROFLOXACIN,
140727 1 160 32
2 130 26
3 260 52
CIPROFAX, 140615 1 20 4
2 160 32
3 140 28
CIPAD, 4T66004 1 210 42
8
2 240 48
3 35 7
VITAPRO, 5640054 1 100 20
2 200 40
3 120 24
CIPRONOL, 140202 1 25 5
2 68 13,6
3 11 2,2
RUMAXINE, 015 1 110 22
2 710 142
3 130 26
CENOX, CNXH0160 1 150 30
2 230 46
3 230 46
CIPROTAB, VG1404 1 220 44
2 210 42
3 260 52
PROX, (10)G014021 1 150 30
2 250 50
3 130 26
CIPROTAB 1 35 7
2 31 6,2
3 9 1,8
CIPROFLOXACIN 500MG CAPLETS, 131175
1 80 16
2 45 9
3 110 22
CIPROF-500, GT15010 1 73 14,6
2 130 26
3 560 112
GRAKKOFLOX,
GK14001 1 440 88
2 380 76
3 430 86
GECIP, 141112 1 90 18
2 37 7,4
9
3 67 13,4
ZYPROX, 111 1 400 80
2 380 76
3 540 108
CIFRAN, 2662288 1 400 80
2 230 46
3 240 48
RAPIDFLOX, E132 1 150 30
2 45 9
3 32 6,4
Tillverkare nr. 7 valdes som tidigare nämnts ut slumpmässigt för att utföra en haltvariation inom samma batch. Nedan presenteras resultatet från de 20 mätningar som gjordes från tillverkare nr 7. där variationen inom samma batch var stor (CIFLOMAX, GTT4001). För att beräkna koncentrationerna i varje prov användes linjens ekvation från diagram 1ovan.
Tabell II. Uppmätt halt aktiv substans för 20 olika prover av Ciprofloxacin tillverkaren CIFLOMAX, GTT400100 samt andel aktiv substans jämfört med deklarerat värde.
Provnr. Uppmätt mängd
aktiv substans (mg) Andel aktiv substans jämfört med deklarerat värde (%)
1 36,8 7,4
2 28 5,6
3 15 3
4 54 10,8
5 17 3,4
6 30 6
7 30 6
8 68 13,6
9 29,3 5,9
10 41 8,2
11 17 3,4
12 19,5 3,9
13 30 6
14 30 6
15 40 8
16 13 2,6
10
17 36 7,2
18 26 5,2
19 18 3,6
20 21 4,2
Efter den första läkemedelsanalysen av de 87 ciprofloxacin tabletterna var det 87,4% av de som inte uppnådde kravet på halt aktiv substans.
Efter den andra läkemedelsanalysen, av de 20 ciprofloxacin tabletterna från tillverkare nr. 7, var det 100% som inte uppnådde kravet på halt aktiv substans.
Diskussion
Syftet med det här examensarbetet har varit att göra ett stickprov av den Nigerianska läkemedelsmarknaden för att undersöka förfalskade läkemedel på marknaden. För att göra detta analyserades Ciprofloxacintabletter från 29 olika tillverkare med UHPLC-MS.
Svaret på den första frågeställningen är att av 87 de Ciprofloxacin tabletter som analyserats, uppvisade 76st. förfalskadeller undermåliga kvalitet baserat på masshaltsanalys, d.v.s. 87,4%, se tabell I. Intervallet som i studien användes för godkänd andel aktiv substans jämfört med deklarerat värde var 80–125%. Resultatet från denna studie (87,4%) är mycket högre än WHO:s data, som säger att 17,8 % av antibiotikumen i Afrika är av undermålig kvalitet. Denna stora skillnad i resultat skulle kunna bero på att denna studie bara analyserat kinolonantibiotika från 29 olika tillverkare och specifikt i Nigeria (9). Som tidigare nämnts finns det stora problem med korruption i Nigeria och läkemedelsförfalskning har förekommit sedan 60-talet (7). Det finns inte många vetenskapliga studier om förfalskade och undermåliga ciprofloxacin antibiotika i Nigeria.
Det finns några studier om förfalskade och undermåliga betalaktam antibiotika i Nigeria, de visar på att mellan 25 – 50 % av betalaktamantibiotikan på marknaden är av förfalskad eller undermålig kvalitet, vilket är en stor andel (9, 10 & 11). Utifrån den stora andelen förfalskad och undermålig betalaktam antibiotika i landet och det faktum att förfalskad och undermålig ciprofloxacin antibiotika anses vara ett stort problem i Nigeria var det ett intressant ämne att studera. Goda kontakter och ett samarbete fanns dessutom sedan en tidigare med människor inom läkemedelsbranschen i Nigeria och det var därför möjligt att utföra denna studie.Tidigare studier av bl.a. Ozawa et al. har visat att medelprevalensen av förfalskade och undermåliga antibiotikum i Afrika är 18,7% (2).
I studien av Ozawa et al. definierades antibiotikum som mer än bara Ciprofloxacin, vilket skulle kunna vara en anledning till studiens låga resultat. Anah et al. undersökte ciprofloxacin tabletter från 15 olika tillverkare i Nigeria med avseende på bl.a. andel aktiv substans jämfört med deklarerat värde (500 mg) (16). Resultatet i den studien visade att 26,7% av de analyserade tabletterna inte uppfyllde kraven för andel aktiv substans jämfört med deklarerat värde (16). Dock skiljer sig den studien åt jämfört med denna, den studien använde ett snävare intervall för andel aktiv substans (90–110%) jämfört med denna studie (80–125%). Dessutom analyserade den studien endast en tablett från varje tillverkare, vilket innebar att studien bara innehöll 15 tabletter, jämfört med denna studie som innehöll 87 tabletter. En annan studie av Igboasoiyi et al. som också är gjord i Nigeria, undersökte bl.a. andelen aktiv substans jämfört med deklarerat värde i 500 mg ciprofloxacin tabletter från 10 olika tillverkare (17). I studien analyserades 20 tabletter från varje tillverkare och intervallet för godkänd andel aktiv substans jämfört med deklarerat värde var 95-105% (17).
Metoden var spektrofotometri vid 276 nm (17). Resultatet visade att 70% av de analyserade tabletterna låg inom intervallet (17). Studien hade också ett snävare intervall än denna studie (80-125%), dock var stickprovet större (200 tabletter jämfört med 87 tabletter). Metoden som användes var inte UHPLC-MS, utan spektrofotometri, vilket
11 innebär att de båda studierna använt olika känsliga metoder för analys och därför kan resultaten skilja sig åt. Resultaten från dessa andra studier visar på att det inte råder någon direkt konsensus om hur omfattande problemet med förfalskade ciprofloxacin antibiotika i Nigeria faktiskt är. Som nämnts har studierna dels olika kriterier för analys, dels olika stora stickprov och även i vissa fall olika analysmetoder. Den analysmetod som använts i denna studie, UHPLC-MS är en vanlig analysmetod inom läkemedelsanalys och är väldigt noggrann, därför beror troligtvis inte denna studies resultat på att metoden varit olämplig.
För att få en korrekt bild av hur det ser ut måste fler studier göras med ett större stickprov från fler läkemedelsföretag, dessutom bör studierna ha liknande intervall för analys samt samma analysmetod för att resultaten ska vara jämförbara med varandra.
Utöver situationen i Nigeria finns det intresse för liknande studier runt om i Afrika för att förstå hur stort och utbrett problemet med förfalskade och undermåliga antibiotika faktiskt är. Risken för felkällor i denna studie var som störst under det förarbete som utfördes innan proven analyserades, t.ex. vid sönderdelning av tabletter, spädning med acetonitril, tillsatts avintern standard mm.
Den andra frågeställningen handlade om haltvariationen inom samma batch.
Haltvariationen av aktiv substansbatch 7 som slumpmässigt valdes ut för analys (CIFLOMAX, GTT4001), var 4–62%, d.v.s. 58 massprocentenheter. Enligt farmakopékravet analyserades ytterligare 20 tabletter från slumpad tillverkares batch där den inbördes skillnaden i halten ciprofloxacin var stor. Resultatet visade att alla 20 tabletter som analyserades från denna batch var långt ifrån farmakopékravet när det gäller masshalt, de låg mellan 2,6% och 13,6% vilket är långt under de 80% som är farmakopékravet, se tabell II. Den inbördes masshaltsvariationen var inte lika stor bland de 20 tabletterna som analyserades från CIFLOMAX, GTT4001 (11 procentenheter) jämfört med de tre som först analyserades (variation 58 procentenheter). Anledningen till varför den inbördes masshaltvariationen för de 20 tabletterna från batch 7 inte var lika stor denna gång kan inte ha berott på ändrat metodsprotokoll eftersom samma utförande gjordes. Däremot kan orsaken ha varit att en felaktig mängd intern standard tillsattes, vilket kan ha resulterat i de låga signalerna.
Vissa av tabletterna pulveriserades inte vid tablettförberedelserna, antingen delvis eller inte alls. Det skulle kunna bero på hög tabletthållfasthet eftersom de olika tablettillverkarna skulle kunna ha använt olika sorters bindmedel och presstryck vid tablettillverkningen. Detta skulle kunna påverka resultatet negativt, men eftersom endast två tabletter inte löstes upp helt och resten gjorde det, har det troligtvis inte så stor inverkan på resultatet.
Slutsats
Resultatet från det här arbetet visar att förfalskade och undermåliga läkemedel fortfarande är ett stort problem i Nigeria. 76 st.av de 87 tabletter plus samtliga av de ytterligare 20 tabletterna som analyserats uppvisade undermålig kvalitet baserat på halt aktiv substans. De ytterligare 20 tabletter som analyserades p.g.a. masshaltsvariation inom samma batch uppvisade låg inbördes variation (11 procentenheter), men däremot innehöll de väldigt lite (mellan 2,6 och 13,6%) aktiv substans jämfört med deklarerat värde. Metoden som användes, UHPLC-MS, var en lämplig analytisk metod som kunde haltbestämma ciprofloxacin tabletterna. Fler studier med större stickprov, samma inklusions- och exklusionskriterier och samma analysmetod behövs på området för att ge en klar bild av problemets omfattning och för att kunna jämföra studieresultat. Det finns mycket att göra för att förbättra situationen med förfalskade och undermålig ciprofloxacin antibiotika, inte minst i Nigeria.
12
Tack
Jag vill tacka min handledare, Jerker Fick, för bra handledning och ett bra samarbete. Jag vill även tacka min fru för all hjälp och allt stöd under det här examensarbetet.
13
Appendix 1
Analysmetod Ciprofloxacin Kemikalier och reagenser
Salpetersyra och saltsyra var av renhetsgraden Suprapur (Merk, Darmstedt, Tyskland).
Ultrapure-vatten (MilliQ) togs från ett Merck MilliporeAdvantage A10-system.
Referensstandarden för ciprofloxacinvar > 98% rent. Deuterium inmärkt ciprofloxacin- D8 användes som intern standard och 5 ng tillsattes.
Mätningar av ciprofloxacin
En Thermo TSQ Quantum EMR trippel quadrupol-masspektrometer användes för alla mätningar av Ciprofloxacin. Ciprofloxacin mättes enligt en tidigare publicerad metod av Grabic et al. 2012. I korthet så analyserades proverna med ett vätskekromatografimasspektrometri UHPLC-system anslutet till en TSQ Quantiva trippel quadrupol-masspektrometer (ThermoScientific) utrustad med en uppvärmd elektrospray jonkälla i positivt läge. Vätskekromatografin utfördes på ett UHPLC-system utrustat med en Ultimate 3000-pump, avgasare, en autosampler och ett temperaturkontrollerat kolonnfack. Detta system bestod av en PAL HTC autosampler (CTC Analytics AG, Zwingen, Schweiz), Ultimate 3000 pump (HPG-3400SD) och en AccucoreaQ analytisk kolonn (2,1 x 100 mm, 2,6 um, ThermoScientific) kolumn användes med en skyddskolonn AccucoreaQ (2,1 x 10 mm, 6 | im, ThermoScientific) och kolonnens temperatur hölls vid 40 ° C. Injektionsvolymen var 10 mikroliter och gradienten av mobilfas bestående av vatten med 0,1% myrsyra (A) och acetonitril med 0,1% myrsyra (B) med en flödeshastighet av 0,2 ml / min användes. HESI utfördes med användning av, en förångartemperatur av 338 ° C och en kapillärstemperatur på 350 ° C. Argon användes som kollisionsgas med ett tryck på 1,5 mTorr. En upplösning av 0,7 FMWH användes.
SRM övergångar. Q: kvatifieringstransition, q: kvalifikations transition, CE: Kollision energi, Lens: volt på RF lins.
QAQC
Två MS / MS-övergångar användes för positiv identifiering av analyser med kriteriet att förhållandet mellan övergångarna inte fick avvika mer än +/− 30% från förhållandet i motsvarande kalibreringsstandard. Retentionstiderna för alla analyser måste också ligga inom +/− 2,5% av retentionstiden i motsvarande kalibreringsstandard.
Överföringseffekter utvärderades genom att injicera standarder vid 1000 ng L− 1 följt av två mobilfasämnen. Flera blankprover inkluderades i de analytiska körningarna.
Compound Type Polarity Precursor Product CE Lens
Ciprofloxacin Q + 332.1 314.1 20.6 71
q + 332.1 288.0 17.0 71
Ciprofloxacin-IS Q + 340.1 322.1 20.6 74
q + 340.1 296.1 17.9 74
14
y = 0.07x R² = 0.9887
0 50 100 150 200 250 300 350 400
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
Standardkurva Appendix 2
Standardkurva för Ciprofloxacin
Standardkurva med koncentration på x-axeln (ng/mL) och kvoten signal prov/signal intern standard. Linjens ekvation visas i digrammet som används för att beräkna halten Ciprofloxacin i de analyserade tabletterna.
koncentration (ng/mL) Ciprofloxacin-signal/ IS-signal
15
Appendix 3
Beräkningar
Beräkning av halt aktiv substans.
Linjens ekvation från standardkurvan y=0,07x
(Signal prov/Signal Intern Standard)/0,07=koncentration aktiv substans i det analyserade provet EFTER spädning. Spädningsfaktorn är 104, därför multipliceras koncentrationen med 10.000, därefter divideras svaret med 109 för att omvandla nanogram till gram. Denna beräkning ger koncentrationen av aktiv substans i det ursprungliga provet FÖRE de båda spädningarna.
Halten aktiv substans i tabletterna beräknas sedan genom att multiplicera koncentrationen (g/mL) som beräknats ovan, med 10mL, eftersom tabletterna lösts upp i 10mL acetonitril.
16
Referenser
1. Davison M. Pharmaceutical anti-counterfeiting. Combating the Real Danger from Fake Drugs. Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons, Inc., ; 2011.
2. Ozawa S, Evans DR, Bessias S, Haynie DG, Yemeke TT, Laing SK, et al.
Prevalence and Estimated Economic Burden of Substandard and Falsified Medicines in Low- and Middle-Income Countries: A Systematic Review and Meta-analysis. JAMA Netw Open. 2018;1(4):e181662.
3. SO A. Death for sale: A study of drug poisoning and Deaths in Nigeria.
Social science & Medicine. 1994;38(1):97-103.
4. Chatterjee P. India's trade in fake drugs--bringing the counterfeiters to book. Lancet. 357. England2001. p. 1776.
5. Delepierre A, Gayot A, Carpentier A. Update on counterfeit antibiotics worldwide; public health risks. Med Mal Infect. 2012;42(6):247-55.
6. Kelesidis T, Falagas ME. Substandard/counterfeit antimicrobial drugs. Clin Microbiol Rev. 2015;28(2):443-64.
7. Burns W. WHO launches taskforce to fight counterfeit drugs. 2006.
8. Olusegun A. Counterfeit drugs in Nigeria: A threat to public health. African Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2013;7(36):2571-6.
9. Taylor RB, Shakoor O, Behrens RH, Everard M, Low AS, Wangboonskul J, et al. Pharmacopoeial quality of drugs supplied by Nigerian pharmacies.
Lancet. 2001;357(9272):1933-6.
10. Taylor RB, Shakoor O, Behrens RH. Drug quality, a contributor to drug resistance? Lancet. 346. England1995. p. 122.
11. M.A. IN, Onyeonwu. In vitro assessment of ampicillin capsules marketed in Nigeria. International journal oh pharmacy practice. 1992;1(3):167-71.
12. archive.today. World Gazetter 2013 [Available from:
https://archive.is/l9R0E.
13. Nováková LS, Pavel. & Pavlík, Jakub. Liquid Chromatography - Fundamentals and Instrumentation 2017. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B97801280539350002
94.
17
14. Ahuja S, W. Dong M. Handbook of pharmaceutical analysis by HPLC:
Elsevier Academic Press; 2005.
15. Pharmacopoeia E. Uniformity of mass of single-dose preparations. 2008. p.
278-9.
16. Anah VU, Ebong AS, Charles GE, Esenam FD, Ukpanah II, Essien AA, et al.
Quantitative and qualitative analysis of some brands of ciprofloxacin tablets sold in Uyo metropolis, Akwa Ibom State, Nigeria.2019; 8(3):[15-22
pp.]. Available from:
http://nijophasr.com/articles/volume8/issue3/article193.pdf.
17. Igboasoiyi AC, Offor AC, Egeolu AP. Quality Assessment of Various Brands of Ciprofloxacin Hydrochloride Tablets Sold In Uyo Metropoli2018;
7(2):[89-93 pp.]. Available from:
http://nijophasr.com/articles/volume7/issue2/article143.pdf.
18 Institutionen för Integrativ Medicinsk Biologi
Umeå Universitet 901 87 Umeå www.umu.se
