Imobilizace kyseliny hyaluronové na nanovlákenné substráty
Bakalářská práce
Studijní program: B3942 – Nanotechnologie Studijní obor: 3942R002 – Nanomateriály
Autor práce: Vojtěch Svěchota Vedoucí práce: Ing. Miroslava Rysová
Liberec 2016
Immobilization of hyaluronic acid on nanofibrous substrates
Bachelor thesis
Study programme: B3942 – Nanotechnology Study branch: 3942R002 – Nanomaterials
Author: Vojtěch Svěchota
Supervisor: Ing. Miroslava Rysová
Liberec 2016
Poděkování
Rád bych poděkoval vedoucí mé bakalářské práce, Ing. Miroslavě Rysové, za její ochotu, cenné rady, připomínky a čas, který mé práci věnovala. Dále bych chtěl poděkovat Ing. Pavlu Kejzlarovi, Ph.D. za pomoc při rastrovací elektronové mikroskopii. Velké díky patří Ing. Haně Tománkové, Msc. a Mgr. Markétě Schaabové za pomoc s kvantifikací NH2 skupin. Závěrem bych velice rád poděkoval celé své rodině za podporu, bez které by tato práce nevznikla.
Abstrakt
Bakalářská práce se zabývá funkcionalizací povrchu křemičitých nanovlákenných substrátů s cílem imobilizace kyseliny hyaluronové.
V teoretické části jsou shrnuty poznatky získané rešerší, zaměřenou na metody zpracování a aplikaci kyseliny hyaluronové ve formě nanostruktur v medicíně. V další části rešerše jsou diskutovány metody modifikace kyseliny hyaluronové a možnosti využití anorganických nanovlákenných substrátů v medicíně.
Experimentální část se zabývá optimalizací silylační reakce, kdy jako modifikační činidlo je zde využit 3-aminopropyltriethoxysilan (APTES). Byl sledován vliv koncentrace silylačního činidla a čas reakce na výsledný výtěžek aminoskupin (NH2) kovalentně navázaných na povrch křemičitých nanovlákenných substrátů. V závislosti na výtěžnosti silylace za různých reakčních podmínek byl stanoven optimální postup pro povrchovou modifikaci křemičitých nanovláken. Další část zahrnuje imobilizaci kyseliny hyaluronové na předem modifikovaný nanovlákenný substrát, kde byl zkoumán vliv pH a čas reakce na výsledný výtěžek kyseliny hyaluronové.
Klíčová slova
Kyselina hyaluronová, modifikace, biomateriály, silylace, APTES, křemičitá nanovlákna,
Abstract
The bachelor thesis deals with surface functionalization of silica nanofibrous substrates with the goal of surface immobilizationthe of hyaluronic acid.
The theoretical part summarizes the knowledge obtained from literature research, focusing on processing methods and applications of hyaluronic acid in the form of nanostructures in medicine. In the next section of theoretical part, there are discussed modifications of hyaluronic acid and the possibility of using inorganic nanofibrous substrates in medicine.
The experimental part deals with the optimization of silanization reaction with the use of 3-aminopropyltriethoxysilane as a modifying agent. In addition, the effect of the silanization agent concentration and reaction time on the final yield of covalently bonded amine group, were also observed. Depending on the yield of silanization under the various reaction conditions, the optimal procedure for surface modification of silica nanofibers was determined. In the case of the hyaluronic acid immobilization procedure the effect of the reaction pH and time was studied.
Key words
Hyaluronic acid, modification, biomaterials, silanization, APTES, silica nanofibers,
8 | S t r á n k a
Obsah
1 Kyselina hyaluronová ... 11
1.1 Chemická struktura ... 11
1.2 Vlastnosti kyseliny hyaluronové ... 12
1.2.1 Hydrofilita ... 12
1.2.2 Vlastnosti reologické ... 12
1.2.3 Lubricita ... 12
1.2.4 Komerční dostupnost ... 13
1.3 Výskyt a funkce kyseliny hyaluronové ... 13
1.3.1 Kyselina hyaluronová v kůži ... 15
1.3.2 Kyselina hyaluronová v synoviální tekutině a kloubech ... 15
1.3.3 Kyselina hyaluronová v extracelulární matrix ... 16
2 Modifikace kyseliny hyaluronové ... 17
2.1 Modifikace karboxylové funkční skupiny (COOH) ... 17
2.1.1 Amidace ... 17
2.1.2 Esterifikace ... 19
2.2 Modifikace hydroxylové funkční skupiny (OH) ... 21
2.2.1 Tvorba etherů ... 21
2.2.2 Esterifikace ... 22
2.2.3 Síťování pomocí glutaraldehydu (GTA) ... 22
2.2.4 Tvorba karbamátů ... 23
3 Biomateriály na bázi kyseliny hyaluronové ... 24
3.1 Nanomateriály HA ... 24
3.2 Hydrogely na bázi HA ... 25
3.3 Metody zpracování biomateriálů ... 26
3.3.1 Fázová separace ... 26
3.3.2 Bioprinting ... 27
3.3.3 Electrospinning ... 27
3.3.4 Odstředivé lití ... 27
3.3.5 Lyofilizace ... 28
4 Aplikace biomateriálů na bázi HA v medicíně ... 29
4.1 Výplně prostoru a hojení ran ... 29
4.2 Oprava kostní a chrupavčité tkáně, regenerace ... 29
4.3 Oprava nervové a mozkové tkáně ... 29
9 | S t r á n k a
5 Nanovlákenné substráty ... 30
5.1 Nanovlákenné substráty tvořené oxidem křemičitým ... 30
6 Experimentální část ... 32
6.1 Použité materiály a chemikálie ... 32
6.2 Použité metody ... 33
6.2.1 Silylace křemičitých nanovláken ... 33
6.2.2 Kvantifikace vázaných aminoskupin ... 34
6.2.3 Metody charakterizace křemičitých nanovláken ... 35
6.2.4 Imobilizace kyseliny hyaluronové ... 36
6.2.5 Kvantitativní stanovení HA na povrchu SiO2 nanovláken ... 37
7 Výsledky měření a diskuze ... 39
7.1 Morfologie čistých křemičitých nanovláken ... 39
7.2 Fluorescenční stanovení koncentrace aminoskupin ... 40
7.2.1 Morfologie křemičitých nanovláken po silylaci ... 43
7.2.2 Optimální podmínky silylační reakce ... 47
7.3 Kvantitativní stanovení imobilizované HA ... 48
7.3.1 Morfologie křemičitých nanovláken po imobilizaci ... 49
Závěr ... 52
Seznam použité literatury ... 53
Příloha A ... 57
Příloha B ... 58
Příloha C ... 60
9 | S t r á n k a
Seznam použitých termínů a zkratek
APTES 3-aminopropyltriethoxysilan BDDE 1,4-butandiol diglycidyl ether
CHO aldehydová funkční skupina
CMPI 2-chlor-1-methylpiridin jodid
BrCN bromkyan
CO–NH–NH2 hydrazidová funkční skupina COOH karboxylová funkční skupina
CTAB cetyltrimethylamoniumbromid
DMF N,N-dimethylformamid
DMSO dimethylsulfoxid
DVS divinyl sulfon
EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimid FITC fluorescein-isothiokyanát
FTIR infračervená spektroskopie
GAG glykosaminoglykan
HA kyselina hyaluronová
NH2 aminová funkční skupina
NHS N-hydroxysukcinimid
NMM N-methylmorfolin
HOBt hydroxybenzotriazol
NPs koloidní částice, nanočástice
OH hydroxylová funkční skupina
PEDGA polyethylen glykol akrylát
PEO olyethylenglykol
SEM skenovací elektronová mikroskopie
SiO2-APTES-HA křemičitá nanovlákna po imobilizaci kyseliny hyaluronové S. equi bakterie rodu Streptococcus equi
S. zooepidemis bakterie rodu Streptococcus zooepidemis
TBA tetrabutylamonium
TIPS fázová separace indukovaná teplem UV ultrafialové záření
10 | S t r á n k a
Úvod
Kyselina hyaluronová je přírodní polysacharid, který představuje medicínsky velice zajímavý materiál, významný především pro oblast hojení ran.
Obtížná zvláknitelnost v důsledku vysoké molekulové hmotnosti kyseliny hyaluronové však významně limituje možnosti jejího zpracování do nánovlákenných struktur. Jednou z možností získání nanovlákenné struktury s obsahem kyseliny hyaluronové je její imobilizace na povrch nanovláken, kdy testovaným nanovlákenným substrátem je substrát na bázi oxidu křemičitého.
Křemičitá nanovlákna jsou unikátním materiálem zajímavý především pro aplikace v medicíně, kde mohou být tato vlákna využívána jako nosiče pro účinné látky, enzymy apod., které nemají dostatečnou stabilitu a bez jejich imobilizace by bylo jejich použití velmi obtížné či nemožné. Výhodou křemičitých materiálů je jejich univerzálnost, dobrá mechanická stabilita, velký specifický povrch a zdravotní nezávadnost.
11 | S t r á n k a
1 Kyselina hyaluronová
Kyselina hyaluronová (HA) je přírodní polysacharid patřící do skupiny mukopolysacharidů neboli též glykosaminoglykanů (GAG), což jsou látky, jejichž řetězce jsou lineární. Jejich typickým znakem je struktura tvořená z opakujících se disacharidických jednotek. V případě kyseliny hyaluronové se opakující disacharidická jednotka skládá z monosacharidu kyseliny glukuronové a monosacharidu N-acetylglukosaminu. Tyto monosacharidy jsou mezi sebou spojeny glykosidickou vazbou β 1-3. Jednotlivé disacharidické jednotky jsou pospojovány v polymer s vysokým polymeračním stupněm glykosidickými vazbami β 1-4. Tato kyselina se vyskytuje u obratlovců prakticky ve všech tkáních a vzhledem k tomu, že se tato látka v organismu povětšinou nachází jako sodná nebo jiná sůl, prosazuje se označení hyaluronan.
1.1 Chemická struktura
Po chemické stránce je hyaluronan negativně nabitý, lineární GAG tvořený opakující se disacharidickou jednotkou složenou z β(1,3)-D-glukuronové kyseliny a β(1,4)-N-acetyl-D-glukosaminu. Molární hmotnost řetězců HA se pohybuje v rozmezí 1 – 8.106 g.mol-1, přičemž nejčastější molární hmotnost je 2 – 5.106 g.mol-1 [1] [2].
D-glukuronová kyselina N-acetyl-D-glukosamin Obrázek 1: Chemická struktura kyseliny hyaluronové [3]
Hyaluronan tvoří intramolekulární vodíkové vazby a vyskytuje se buď jako volný řetězec, nebo je kovalentně vázán na proteiny. HA se od ostatních glykosaminoglykanů liší hlavně tím, že se neváže na proteinové jádro, neobsahuje sulfátovou skupinu a dále se liší také extrémní délkou molekul [4].
12 | S t r á n k a
1.2 Vlastnosti kyseliny hyaluronové
Kyselina hyaluronová je důležitou složkou extracelulární matrix (ECM) a je přítomna všude tam, kde je potřeba udržovat vlhkost mezi vrstvami tkáně nebo zabraňovat nežádoucímu tření. HA má unikátní sadu vlastností, mezi které patří především hydrofilita, lubricita a vlastnosti reologické. Kromě těchto vlastností se HA také projevuje jako signální molekula účastnící se imunologických procesů a ovlivňuje mobilitu a adhezi buněk v rámci jejich proliferace a diferenciace. Dále má významné antioxidační vlastnosti a působí jako vychytávač volných radikálů [1]
[5].
1.2.1 Hydrofilita
Ze struktury uvedené v kapitole 1.1 je patrné, že se jedná o polymer, který je díky existenci velkého množství hydroxylových skupin (OH) ve své struktuře schopen vázat velké množství vody a který je ve vodě poměrně dobře rozpustný díky nábojové repulsi vyvolané karboxylovými skupinami (COOH). Studium úhlové závislosti rozptylu světla vedlo k závěru, že molekuly HA vytváří v roztoku strukturu, která připomíná tuhá klubka, a tato klubka jsou schopna zadržet dokonce až tisíckrát větší množství vody, než je vlastní hmotnost HA. Hydrofilní charakter HA usnadňuje její interakci s různými tkáněmi. [3] [5].
1.2.2 Vlastnosti reologické
Lineární polymerní řetězce kyseliny hyaluronové zaujímají v roztoku tvar klubka, ve kterém se tyto řetězce vzájemně spojují již při malých koncentracích, což přispívá k jejím neobvyklým reologickým vlastnostem. Při vyšších koncentracích vykazují roztoky HA extrémně vysokou, ale na smykové rychlosti závislou viskozitu. Roztok o koncentraci 1 % vypadá jako gel, avšak pokud na něj působíme tlakem, snadno se pohybuje a může být aplikován i velmi tenkou injekční jehlou. Z hlediska reologie se tedy HA chová jako pseudoplastický materiál [3] [5].
1.2.3 Lubricita
Mimořádné reologické vlastnosti roztoků obsahujících HA, které jsou popsány v předchozí kapitole, z nich dělají ideální lubrikační materiál. Je dokázáno,
13 | S t r á n k a že HA odděluje většinu tkáňových ploch, které se po sobě navzájem posouvají. Dále bylo taktéž prokázáno, že extrémní lubrikační vlastnosti HA snižují pooperační adheze a to především po břišní a ortopedické chirurgii [3] [5].
1.2.4 Komerční dostupnost
Z hlediska dostupnosti a přijatelnosti pro organismus je ideálním materiálem právě skupina glykosaminoglykanů existujících v živočišných tkáních.
Všichni tito zástupci, kam patří i kyselina hyaluronová, jsou prakticky nemutagenní, neimunogenní a netoxické látky. Ovšem jejich průmyslové získávání, až na HA, představuje velký problém, protože je možné je těžit pouze ze živočišných tkání, kde se sice tyto látky vyskytují, avšak ve velmi malém, průmyslově využitelném, množství. Navíc jejich čistota není dostatečně vysoká v důsledku obsahu určitého množství imunogenních bílkovin. Jedinou výjimkou je právě HA, kterou lze vyrábět v dostatečném množství a přitom ve vysoké čistotě biotechnologicky z určitých druhů kultivovaných bakterií. Tyto mikroorganismy jsou přirozeně obaleny kapsulou, která je tvořena čistou HA [6].
Kromě těchto klasických zdrojů pro izolaci HA patří k dalšímu způsobu získávání HA také izolace z kohoutích hřebínků. Jedna společnost, Pharmacia AB (Uppsala, Švédsko), vyvinula speciální kmen kohoutů s velmi bujnými hřebeny, ze kterých se sloučenina izoluje. Komerčně dostupný materiál se dodává v molekulové hmotnosti v rozmezí 1.106 g.mol-1 – 8.106 g.mol-1 [5].
1.3 Výskyt a funkce kyseliny hyaluronové
HA se vyskytuje prakticky ve všech tkáních obratlovců, a to ve dvou podobách. Jednak vázaná elektrostatickými a kovalentními silami k dalším molekulám ECM a jednak volná jako humektant (kůže), lubrikant (klouby) či látka udržující stálý tvar (oční bulva) nebo jako výplňová složka některých orgánů (pupeční šňůra). Téměř polovina HA v těle se nachází v kůži s největším zastoupením v intracelulárním prostoru, kde jí může být až 2,5 g/l [7]. Bohužel má HA poločas rozpadu kratší než 3 dny, a proto je nutné, aby tělo neustále HA doplňovalo. Změny v koncentraci HA jsou pozorovány při stárnutí, hojení ran a degenerativních onemocněních [8]. Přehled koncentrace kyseliny hyaluronové v živočišných tkáních a tekutinách je zaznamenán v níže uvedené Tabulka 1.
14 | S t r á n k a Aktivita HA je silně závislá na molekulové hmotnosti. Obecně platí, že HA s vysokou molekulovou hmotností nejeví prakticky žádnou biologickou aktivitu ve smyslu regulace pochodů v organismu nebo regulace buněk a její funkce je spíše organizační. Ovšem HA s velmi nízkou molekulovou hmotností (tedy s molekulovou hmotností pod 5.105 g.mol-1) má vliv na různé pochody v tkáních a buňkách, přičemž bylo dokázáno, že čím nižší je molekulová hmotnost hyaluronanu, tím větší je jeho biologická aktivita [6].
Kyselina hyaluronová má také spoustu dalších funkcí. Je důležitým hydratačním mediem, klíčem k embryonálnímu vývoji a především se podílí na obnovení tkání a regeneraci. Molekuly HA mají další velmi specifické funkce, mezi které patří i účast na angiogenezi. Dále se tyto molekuly podílejí na podpoře hojení ran [9].
Výskyt HA není typický pouze pro obratlovce. Jak je již zmíněno v kapitole 1.2.4, HA je součástí pouzder některých bakterií, např. některých kmenů streptokoků (S. zooepidemicus, S. equi, atd.) [7] [9].
15 | S t r á n k a
Tabulka 1: Koncentrace HA v živočišných tkáních a tekutinách [7]
Tkáň nebo tělní tekutina Koncentrace
[μg/ml] Poznámky
Kohoutí hřebínek 7500 živočišná tkáň s nejvyšším obsahem HA Lidská pupeční šňůra 4100 tkáň s relativně vysokou molekulovou
hmotností HA Lidská synoviální
tekutina 1400–3600 při zánětu dochází k poklesu
koncentrace HA v důsledku zvětšení objemu synoviální tekutiny
Hovězí nosní chrupavka 1200 často se užívá jako model chrupavky v experimentálních studiích
Sklivec lidského oka 140–340 při zrání této tkáně dochází ke zvýšení koncentrace HA
Dermis 200–500 zde je HA navržena jako omlazující prostředek v kosmetické dermatologii
Epidermis 100 koncentrace HA je vyšší kolem
syntetizovaných buněk
Králičí mozek 65 _
Králičí srdce 27 _
Lidská hrudní lymfa 0,2–50
malá molární hmotnost HA je
vysvětlena přednostní absorpcí větších molekul buňkami jater
Lidská moč 0,1–0,3 je zdrojem enzymu hyaluronidázy Krevní plazma 0,01–0,1 u starších lidí, pacientů s artritidou
nebo cirhózou jater je koncentrace HA vyšší
1.3.1 Kyselina hyaluronová v kůži
HA plní řadu důležitých funkcí v kůži, ke kterým patří zadržování vody ve tkáních. Tím dochází ke změně dermálního objemu a stlačitelnosti, což může ovlivnit buněčnou proliferaci a diferenciaci. Dále působí v kůži jako „zachycovač“
volných radikálů, které jsou generovány UV zářením ze slunce. UV světlo způsobuje oxidační procesy na buňkách a může tak dojít k poškození jejich genetického materiálu, což by mohlo způsobit degeneraci a smrt [7].
1.3.2 Kyselina hyaluronová v synoviální tekutině a kloubech
HA se nachází ve všech kostech a chrupavčitých strukturách v celém těle.
V kloubech, i přes relativně nízký obsah, funguje HA jako důležitý konstrukční prvek matrice tvořící agregační centrum pro aggrekan. V synoviální tekutině poskytují vysoké koncentrace vysokomolekulární HA mazání pro klouby. Dále
16 | S t r á n k a slouží jako tlumič nárazů, snižuje tření kostí a zmenšuje opotřebení kloubů. Při zánětlivých artritických stavech, jako je např. osteoartritida nebo revmatoidní artritida, dochází k degradaci vysokomolekulární HA reaktivními kyslíkovými sloučeninami, které snižují její viskozitu a poškozují tak lubrikační a tlumivé vlastnosti, což vede ke zhoršení pohyblivosti kloubů a bolestivosti [7] [8].
1.3.3 Kyselina hyaluronová v extracelulární matrix
HA hraje v ECM několik důležitých rolí díky schopnosti interakce s buňkami, které jsou pevně zakotveny v ECM. Jedna z nejdůležitějších interakcí je interakce mezi HA a receptorem CD44, který zprostředkovávají buňky, a který se nachází na povrchu většiny buněk. Jedná se o receptor bílkovinné povahy, který pomáhá regulovat pochody odehrávající se v buňce a to právě přes interakce s jeho ligandem, tedy kyselinou hyaluronovou. Změny v expresi tohoto receptoru jsou spojovány s celou řadou nádorových onemocnění, což způsobuje velký zájem o tento receptor kyseliny hyaluronové. Zdá se, že zvýšená exprese CD44 podporuje vazbu HA, což u některých tumorů souvisí s vyšší tendencí metastáz [6] [10].
17 | S t r á n k a
2 Modifikace kyseliny hyaluronové
Kyselina hyaluronová může být chemicky modifikována dvěma různými způsoby: síťováním nebo konjugací. Tyto dvě metody, jejichž mechanismy jsou znázorněny na Obrázek 2, jsou založeny na stejné chemické reakci a odlišují se tím, že v případě konjugace dochází k navázání sloučeniny na řetězec HA pouze jednou vazbou, kdežto v případě síťování jsou odlišné řetězce HA spojeny dvěma či více vazbami, což zajišťuje stabilitu výsledného derivátu. Kromě toho, existují různé typy síťovacích postupů: přímé síťování, síťování derivátů HA a síťování různých derivátů HA. Pro síťování nebo konjugaci HA existuje řada metod, kdy některé vyžadují přítomnost vody, jiné zase přítomnost organického rozpouštědla v důsledku citlivosti molekuly na hydrolýzu.
Chemická modifikace HA může být provedena na dvou možných funkčních skupinách HA a to na karboxylové (COOH) nebo hydroxylové (OH).
2.1 Modifikace karboxylové funkční skupiny (COOH)
2.1.1 Amidace
Amidace je jednou z možných modifikací karboxylové funkční skupiny HA.
Princip všech těchto reakcí je stejný a liší se pouze v druhu vybraného aktivačního činidla, rozpouštědlu a podmínkách reakce, mezi které patří především hodnota
Obrázek 2: Konjugace a síťování polymeru [11]
18 | S t r á n k a pH. Prvním krokem amidační reakce je aktivace COOH skupiny HA pomocí síťovacího činidla, při kterém dochází ke vzniku meziproduktu. Tento meziprodukt posléze podléhá nukleofilnímu ataku aminu a vzniká tak finální produkt ve formě derivátu HA.
Jak je již výše zmíněno, existuje celá řada amidačních reakcí, které vedou k produkci derivátů HA. Jednou z nejčastěji používaných metod modifikace HA, kterou se ve svých článcích zabývají Prestwich a kol. [12] a Bulpitt a Aeschlimann [13], je amidace pomocí karbodiimidů, kde využívají EDC jako síťovacího činidla.
EDC aktivuje molekulu COOH za vzniku nestabilního meziproduktu O-acyl isomočoviny, který ihned reaguje s vodou a vzniká tak N-acyl močovina jako vedlejší produkt, čímž se zabrání reakci s aminem. K tomu, aby se zabránilo vzniku N-acyl močoviny jako nevratného produktu, je zde potřeba použít sloučeninu NHS nebo HOBt, která zabraňuje hydrolýze. Výhodou EDC je jeho rozpustnost ve vodě a interakce se sodnou solí HA, což vede k udržení molekulové hmotnosti HA a tedy k zachování jejích viskoelastických vlastností.
Magnani a kol. [14] se taktéž ve své práci zabývají chemickou modifikací HA, kde využívají 2-chlor-1-methylpiridin jodid (CMPI) jako aktivační činidlo.
Zásadní rozdíl oproti amidaci karbodiimidy je ten, že tato reakce probíhá v organickém rozpouštědle DMF, aby se minimalizovala hydrolýza CMPI.
V důsledku nerozpustnosti sodné soli HA v organických rozpouštědlech je sodná sůl HA převedena na sůl TBA. Dále je při této reakci využit triethylamin jako neutralizační prvek jodidových aniontů. Pokud při této reakci není přítomen amin, dochází k tzv. samozesíťování, což znamená, že pyridinový meziprodukt reaguje s vlastním hydroxylem za vzniku esteru.
Bergman a kol. [15] popsali novou metodu amidace HA užitím 2- chlordimethoxy-1,3,5-triazinu (CDMT) jako aktivačního činidla COOH skupin. Tato reakce probíhá ve směsi voda:acetonitril v poměru 3:2 a za přítomnosti NMM, který neutralizuje chloridové anionty.
Všechny výše uvedené reakční mechanismy amidací jsou zobrazeny v níže uvedeném Obrázek 3.
19 | S t r á n k a a
b
c
d
e
2.1.2 Esterifikace
Esterifikace je taktéž jednou z nejčastějších modifikací karboxylové funkční skupiny HA. Mechanismy všech esterifikačních reakcí jsou opět stejné, tudíž výsledným produktem je ester HA.
Společným faktorem většiny esterifikačních reakcí je organické rozpouštědlo DMSO, ve kterém dané reakce probíhají. Výjimku tvoří esterifikační reakce užívající epoxidů jako síťovacích činidel, kdy rozpouštědlem je zde voda.
Obrázek 3: Amidační reakce za použití samotného EDC (a), EDC/NHS a EDC/HOBt (b), CMPI s aminem (c), samotné CMPI (d), CDMT/NMM (e) [11]
20 | S t r á n k a a
b
c
d
S tím také souvisí převedení sodné soli HA na TBA sůl, jak již bylo zmíněno v kapitole 2.1.1. Nejjednodušším postupem tvorby esterů HA, patentovaným vědci Della Valle a Romeo [16], je alkylace alkylhalogenidů, kdy nejčastěji je využito alkyljodidů a alkylbromidů. Huin-Amargier a kol. [17] využívají esterifikace HA pomocí tetraethylen glykolu, který je funkcionalizován dvěma skupinami tosylátu.
Za zmínku stojí i esterifikace HA využívající diazomethanu, kterou popisují Hirano a kol. [18].
K esterifikaci HA jsou využívány i epoxidy, jako např. glycidyl methrakrylát , které primárně reagují s COOH skupinou HA. Ovšem epoxidy mohou interagovat i s OH skupinami HA za vzniku tzv. trans-esterifikace, což je reversibilní děj podrobně popsaný v článku Bencherif a kol. [19].
Všechny výše uvedené reakční mechanismy esterifikací jsou zobrazeny v níže uvedeném Obrázek 4.
Obrázek 4: Esterifikační reakce za použití alkylhalogenidů (a), tetraethylen glykolu ditosylátu (b), diazomethanu (c), glycidyl methakrylátu (d) [11]
21 | S t r á n k a a
b
c
2.2 Modifikace hydroxylové funkční skupiny (OH)
2.2.1 Tvorba etherů
Existuje celá řada reakcí vedoucích ke tvorbě etherů HA, z nichž nejvýznamnější je tvorba etherů HA pomocí epoxidů a pomocí DVS (Obrázek 5).
Podstatou reakcí využívajících epoxidů je otevření epoxidového kruhu za vzniku etherové vazby s molekulou OH. Etherová vazba však může vznikat i na COOH skupině HA, jak již bylo zmíněno v kapitole 2.1.2. Důležitým faktorem vzniku etherové vazby je pH. Pokud je HA vystavena vysokým hodnotám pH (pH >
13), které jsou vyšší než hodnoty pKa OH skupin, pak dochází k deprotonaci skoro všech OH skupin nacházejících se na HA a tedy reakce přednostně probíhají na OH skupinách HA. V opačném případě dochází ke vzniku esterové vazby s COOH skupinou HA. Nejvíce využívaným síťovacím činidlem z řad epoxidů je 1,2,3,4- diepoxybutan nebo BDDE [11].
Balazs a Leschiner [20] využívají DVS jako síťovacího činidla, přičemž dochází k vytvoření sulfonyl bis-ethylových vazeb mezi OH skupinami HA. Výhoda této metody je v rychlosti reakce, která se spustí během 5 minut po přidání DVS a ukončí se během 1 hodiny. I přesto, že je výchozí látka vysoce reaktivní a karcinogenní, vzniklý derivát HA ve formě hydrogelu je biokompatibilní.
Obrázek 5: Tvorba etherů pomocí BDDE při zásaditém pH (a), při kyselém pH (b) a pomocí DVS (c) [11]
22 | S t r á n k a 2.2.2 Esterifikace
Další možnou modifikací COOH skupiny HA je úprava prostřednictvím esterů. Často využívanými aktivačními činidly jsou anhydridy kyselin, jako např.
alkyl anhydrid kyseliny jantarové či anhydrid kyseliny methakrylové.
Užití alkyl anhydridu kyseliny jantarové (Obrázek 6) jako modifikačního činidla popisují Toemmeraas a Enschooten [21] a užití anhydridu kyseliny methakrylové popisují Smeds a Grinstaff [22]. Obě reakce probíhají ve vodném prostředí a to při zásaditém pH. Navíc methakrylová skupina obsažená v anhydridu kyseliny methakrylové umožňuje fotosíťování derivátů HA.
2.2.3 Síťování pomocí glutaraldehydu (GTA)
Modifikací HA za přítomnosti GTA vznikají hemiacetálové vazby mezi OH skupinami HA (Obrázek 7). Celá reakce probíhá ve směsném rozpouštědle skládajícím se z vody a acetonu. Při použití GTA jako síťovacího prvku byla vyzkoušena i směs vody s ethanolem. Ovšem při této kombinaci došlo k inhibici síťovací reakce, což je způsobené navázáním ethanolu na OH skupinu HA. Hlavní nevýhodou této metody je toxicita GTA, a tudíž je potřeba důkladné čištění konečného produktu [11] [23] [25].
Obrázek 6: Esterifikační reakce pomocí alkyl anhydridu kyseliny jantarové [11]
Obrázek 7: Tvorba hemiacetálu pomocí GTA [11]
23 | S t r á n k a 2.2.4 Tvorba karbamátů
Tato reakce je založena na využití BrCN jako aktivátoru OH skupin.
Vznikající kyanát esteru HA interaguje s aminem za vzniku karbamátového hlavního produktu a jako vedlejší produkt je zde přítomna HA-isomočovina (Obrázek 8). Jelikož tato reakce probíhá ve vodném prostředí, není potřeba upravovat výchozí látku, kterou je sodná sůl HA [24].
Obrázek 8: Tvorba karbamátů za pomoci CNBr [11]
24 | S t r á n k a
3 Biomateriály na bázi kyseliny hyaluronové
I když se kyselina hyaluronová v tkáních vyskytuje převážně v polymerní podobě s vysokou molekulovou hmotností, je v této podobě ve tkáňovém inženýrství prakticky nepoužitelná, a to zejména pro svou dobrou rozpustnost ve vodě, snadnou biodegradovatelnost a nevhodné mechanické vlastnosti. Je tedy potřeba sáhnout k chemickým modifikacím, které z nativního biopolymeru vytvoří materiál vhodný pro tkáňové inženýrství. Vlastnosti těchto biomateriálů se mohou výrazně lišit od nativního polymeru, ovšem většinou si zachovávají biodegradabilitu a biokompatibilitu, stejně jako nativní polymer. Na základě rozdílných velikostí těchto biomateriálů je lze obecně rozdělit na nanomateriály a makroskopické útvary, tzv. hydrogely.
3.1 Nanomateriály HA
Mezi nanomateriály na bázi HA patří především koloidní částice (NPs) s průměrem menším než je 1 μm, které vznikají stabilizací derivátů HA pomocí síťovacích činidel. NPs mohou být síťovány kovalentně, tedy chemickou vazbou (nanogely) nebo nekovalentně, jako např. elektrostaticky, iontově či pomocí vodíkových můstků (nanokompozity, pevné koloidní částice potažené HA). Metody vybrané pro přípravu NPs jsou silně závislé na rozpustnosti výchozích látek.
Nejvíce využívanou metodou přípravy NPs HA je inverzní emulgace. Principem emulgačního síťování je reakce, která nastává ve vodných kapkách HA nebo jejím derivátu. Tyto deriváty jsou rozprostřeny v organické fázi společně se surfaktantem, který je v této fázi rozpustný. Jedná se o emulzi typu “voda v oleji“ a rychlost této reakce ovlivňuje velikost vzniklých NPs [26]. Nevýhodou emulgačních metod je užití ultrazvuku, což může nepříznivě ovlivňovat biologické molekuly, které mohou být enkapsulovány např. v nanogelech.
V závislosti na vnitřní struktuře jsou rozlišovány 4 typy NPs na bázi HA:
nanogely, nanokompozity, micely a pevné koloidní částice pokryté HA. Všechny tyto struktury jsou zobrazeny v níže uvedeném Obrázek 9.
Nanogely jsou útvary, které vznikají propojením dlouhých řetězců HA s náhodně orientovanými hydrofobními skupinami. Jedná se o unikátní materiál, který rapidně nepodléhá degradaci v těle. V důsledku přítomnosti HA, která je
25 | S t r á n k a schopna absorbovat velké množství vody, mohou být nanogely považovány za hydrogely ovšem s rozdílnou velikostí. Nanogely společně s nanokompozity mají tu výhodu, že mohou ve své struktuře obsahovat ještě jiné anorganické nanočástice v závislosti na jejich poréznosti, na rozdíl od samotných anorganických NPs potažených HA [27].
3.2 Hydrogely na bázi HA
Za hydrogely na bázi HA jsou považovány 3D struktury, které vznikají náhodným síťováním a obsahují velké množství vody. Dominantou těchto materiálů je právě robustnost a větší odolnost vůči enzymatické degradaci, kdy tato vlastnost je stejná i pro výše definované nanogely. Stejná je i příprava hydrogelových materiálů, tedy kovalentním či nekovalentním síťováním, kdy právě kovalentní síťování je hojně využíváno v medicíně. Jednou z hojně využívaných aplikací hydrogelů v medicíně jsou injektáže, jejichž cílem je tvorba hydrogelu in situ (v místě působení) mísením dvou polymerních derivátů a to za krátkou dobu. Většinou se jedná o dva deriváty obsahující hydrazidovou (CO–NH–
NH2) a aldehydovou (CHO) skupinu[28] [29]. Nevýhodou kovalentního síťování je toxicita činidel a drsné podmínky, které nejsou vhodné pro enkapsulaci buněk. Je tedy třeba vyselektovat chemismus syntézy hydrogelů HA tak, aby nedocházelo k vytváření vedlejších toxických produktů nebo k vážné degradaci HA [26] [27].
Na základě vnitřní struktury hydrogelů je lze obecně rozdělit na hydrogely s jednoduchou strukturou a hydrogely, jejichž struktura je hierarchicky uspořádána. Možnosti hierarchicky uspořádané strukturu společně s jednoduchou strukturou jsou znázorněny na Obrázek 10.
Obrázek 9: Strukturní klasifikace NPs na bázi HA [27]
26 | S t r á n k a Struktura hydrogelů vykazuje vysokou poréznost, která je účinná pro zachycení NPs, čímž dochází k vyztužení těchto materiálů a tedy ke zlepšení jejich mechanických vlastností. Z výše uvedeného obrázku je patrné, že hierarchicky strukturované materiály mohou vznikat kovalentním navázáním NPs na polymerní matrici, síťováním NPs polymerním řetězcem nebo dvojitým síťováním [27].
3.3 Metody zpracování biomateriálů
Existuje celá řada metod, kterými lze biomateriály na bázi HA zpracovávat.
Nicméně v této práci jsou popsány pouze běžně používané techniky.
3.3.1 Fázová separace
Fázová separace je druh techniky, pomocí které lze připravit především porózní hydrogely a nanovlákenné substráty. Fázová separace polymerního roztoku může být indukována několika způsoby. Prvním z nich je separace fází bez rozpouštědla, dále pak chemicky indukovaná fázová separace a tepelně indukovaná fázová separace (TIPS). TIPS je relativně novou metodou, při které dochází k tvorbě porézního materiálu vlivem snížení teploty. Jakmile je poté z dané fáze odstraněno rozpouštědlo, např. extrakcí či odpařením, dochází ke ztuhnutí daného polymeru a v místech, ve kterých bylo rozpouštědlo, vzniknou póry, jejichž velikost je závislá na koncentraci polymerního roztoku, rozpouštědle a teplotě fázové separace [30] [31].
Obrázek 10: Strukturní klasifikace hydrogelů na bázi HA [27]
27 | S t r á n k a 3.3.2 Bioprinting
Principem technologie bioprintingu je zhotovení 3D struktury, která vzniká na základě skládání jednotlivých buněčných vrstev a biomateriálů. Toto skládání je precizně řízeno robotickým přístrojem, díky kterému jsou tyto struktury využívány jako funkční tkáně. Velkým omezením bioprintingu je dostupnost biomateriálů, které musí být vytlačovatelné, cytokompatibilní, robustní, biologicky rozložitelné a kompatibilní s tiskovým zařízením [32] [33].
Nejvíce využívaným biomateriálem v oblasti bioprintingu je thiolovaná HA společně s deriváty želatiny. Tyto dva deriváty byly podrobeny síťovací reakci, kdy síťovacím činidlem zde byl polyethylen glykol tetraakrylát. Po přidání určité koncentrace buněk byl finálním produktem hydrogel, který byl tištěn ve formě makroskopických vláken a tato vlákna prokázala životaschopnost po dobu 4 týdnů [34].
3.3.3 Electrospinning
Electrospinning neboli elektrostatické zvlákňování je unikátní proces výroby ultratenkých vláken s průměry od submikronů do nanometrů. Výhodou těchto vláken je jejich vysoce specifický povrch a vysoká pórovitost, která je ovšem špatně kontrolovatelná [35].
I při téhle metodě byla využita thiolovaná HA, která byla nejprve zesítěna přítomností činidla PEDGA a poté zvlákněna za vzniku 3D nanovlákenné struktury.
Při síťování byl použit PEO jako modifikátor viskozity usnadňující formování 3D struktury. Na tento nanovlákenný substrát byl adsorbován fibronektin, což je glykoprotein usnadňující migraci fibroblastů [36].
3.3.4 Odstředivé lití
Metoda odstředivého lití využívá odstředivých sil vznikajících při rotaci k vytváření 3D struktur trubicovitých tvarů. Tyto trubicovité struktury jsou tvořeny hydrogelem skládajícím se z thiolované HA a želatiny, ve kterém jsou enkapsulovány buňky. Hydrogel tvořený thiolovanou HA a želatinou vytváří syntetický ECM. Využití této metody je široké, od kapilár přes cévy až dokonce k planárním strukturám [37].
28 | S t r á n k a 3.3.5 Lyofilizace
Lyofilizace je proces vysoušení hydrogelu mrazem za přítomnosti porogenu, látky, která má specifický tvar a velikost, a která se používá k tvarování struktur pomocí pórů. Jakmile je daný hydrogel zmražen, nastává sublimační proces ve vakuu, pomocí kterého je odstraněn porogen a tím vzniká porézní strukturní síť. Výhodou této metody je kontrola velikosti pórů pomocí nastavení mrazicí teploty [38].
29 | S t r á n k a
4 Aplikace biomateriálů na bázi HA v medicíně
4.1 Výplně prostoru a hojení ran
Unikátní vlastnosti těchto biomateriálů, mezi které patří robustnost a bioadhezivita, zaručují jejich využití jako vyplňovače prostoru. Kromě toho, musí hydrogelové materiály splňovat řadu požadavků, jako je schopnost udržení požadovaného objemu nebo zachování strukturální integrity po určitou dobu [25].
Jejich využití v biomedicíně je široké a zahrnuje spoustu oblastí, jako je urologie, kde slouží jako implantáty při léčbě inkontinence moči [39] nebo rekonstrukční chirurgie [40] či kosmetika [41].
Důležitou oblastí v medicíně je hojení ran, kde se tyto materiály používají k léčbě především komplikovaných a těžce se hojících ran [42].
4.2 Oprava kostní a chrupavčité tkáně, regenerace
Jednou z nejdůležitějších vlastností materiálů užívaných k regeneraci kostí a chrupavek je proliferace buněk. Jelikož kyselina hyaluronová výrazně zvyšuje buněčnou proliferaci, jsou tedy biomateriály na bázi HA vhodným kandidátem.
Např. lyofilizované deriváty HA společně s chitosanem byly využity k enkapsulaci chondrocytů [43] nebo lyofilizované deriváty HA společně s kyselinou polyglykolovou byly využity k zapouzdření buněk menisků [44].
4.3 Oprava nervové a mozkové tkáně
Unikátní vlastnosti struktur na bázi HA předurčují jejich použitelnost v centrálním nervovém systému jako nosičů buněk využívaných při zotavování po mozkové mrtvici [45]. V těchto aplikacích je využíváno derivátů HA společně s kyselinou polymléčnou, které jsou zpracovány metodou elektrostatického zvlákňování. Vzniklé biomateriály jsou použity jako nosiče buněk lidské kostní dřeně [46] a jelikož mají pozitivní vliv na regeneraci motorické funkce, mohou být taktéž využívány jako nosiče lidských mezenchymálních kmenových buněk [47].
30 | S t r á n k a
5 Nanovlákenné substráty
Pro termín nanovlákno existuje mnoho různých používaných definic.
Nanomateriály jsou technicky definovány jako materiály, jejichž rozměry jsou menší než sto nanometrů a to alespoň v jednom směru. Nanovlákna jsou tedy lineární útvary splňující toto tvrzení. Ovšem velmi často je termín nanovlákno používán pro všechna vlákna mající průměr menší než 1 μm [48].
Nanovlákenné materiály vykazují celou řadu unikátních vlastností, které jsou spojeny s jejich rozměry, a tudíž jejich využití zasahuje do mnoha oblastí. Mezi tyto oblasti patří např. tkáňové inženýrství, filtrační technologie či elektronika [48].
Výhoda těchto materiálů oproti běžně produkovaným materiálům pramení z jejich unikátních vlastností, mezi které patří vysoká porozita, vysoký specifický povrch, lepší mechanické vlastnosti, jako je tuhost či napětí v tahu a především jejich flexibilita k povrchové modifikaci [49].
5.1 Nanovlákenné substráty tvořené oxidem křemičitým
V současné době se v medicínských aplikacích ve většině případů aplikují látky – antibiotika, analgetika, kortikoidy, enzymy, dezinfekční látky apod. přímo in situ. Ovšem při těchto aplikacích velmi často dochází ke ztrátám účinné látky z daného místa a to buď vyplavováním tělními tekutinami, nebo odplavováním krevním řečištěm do dalších částí organismu. Průnik léčivých látek do dalších částí organismu, které nesouvisí s daným místem aplikace, je nežádoucí a může vést ke vzniku nežádoucích reakcí v organismu [50].
Z tohoto důvodu je snaha tyto látky imobilizovat na vhodné substráty s cílem zamezit jejich ztrátám z místa aplikace. Důležitá je stabilita vazby mezi substrátem a účinnou látkou, dále pak zachování určité koncentrace dané látky a samozřejmě i zachování funkčnosti dané látky, kterou měla před imobilizací.
V současné době jsou křemičitá nanovlákna hojně studována za účelem jejich využití v medicíně v tzv. drug delivery systémech, scaffoldech (lešení, nosič) pro tkáňové inženýrství, membránách pro separaci a dalších aplikacích. Ačkoliv jsou anorganické nanomateriály často kritizovány v důsledku nízké tolerance organismem, studium křemičitých nanomateriálů ukázalo, že jsou tyto materiály
31 | S t r á n k a velmi dobře tolerovány a v některých případech dokonce biodegradovány organismem. Důvody pro použití křemičitých nanovláken v biomedicínských aplikacích jsou především tyto:
- Cílené dodání účinných látek do místa určení;
- Prodloužení in vivo (v živém těle) působení léčiv;
- Zkrácení doby léčení;
- Nízká finanční nákladnost;
- Vynikající snášenlivost organismem – biodegradabilita;
Výhodou křemičitých nanomateriálů jsou široké možnosti modifikace povrchu, které umožňují navázání účinných molekul [50] [51] [52].
Důležitou vlastností křemičitých nanovlákenných substrátů je jejich velký specifický povrch, díky čemuž je možné dosáhnout požadovaných koncentrací účinných látek. Další charakteristickou vlastností je jejich vysoká stabilita při biochemických reakcích, kdy lze regulovat dobu jejich degradace pomocí tepelného zpracování. Jsou rozpustné v tělních tekutinách, kde se tato nanovlákna rozpouštějí na kyselinu křemičitou, která je vyloučena močí během 1 – 2 týdnů.
Důležitá je i jejich vynikající smáčivost a především netoxicita. Navíc křemičitá nanovlákna obsahují na svém povrchu velké množství OH skupin, které lze využít pro jejich modifikaci a navázání účinných látek, viz kapitola 2.2 [53].
32 | S t r á n k a
6 Experimentální část
Experimentální část této bakalářské práce byla zaměřena na optimalizaci podmínek silylačního procesu křemičitých nanovlákenných substrátů s využitím 3- aminopropyltriethoxysilanu jako modifikačního činidla. Byl zkoumán vliv podmínek silylace na výslednou koncentraci kovalentně navázaných aminoskupin na povrch modifikovaných křemičitých nanovláken. Sledovanými parametry, které ovlivňovaly silylační reakci, byly: doba silylace a koncentrace použitého silylačního činidla.
Druhá část experimentů byla zaměřena na kvantifikaci aminoskupin kovalentně vázaných na povrch křemičitých nanovláken pomocí přístroje Microplate Reader Synergy HTX (BioTek Instruments, USA).
Další část práce se věnovala imobilizaci kyseliny hyaluronové na povrch modifikovaných nanovláken na bázi oxidu křemičitého, která plní funkci nosného substrátu.
V poslední části byly experimenty zaměřeny na kvantifikaci kyseliny hyaluronové, která je pomocí aminoskupin vázána s křemičitými nanovlákennými substráty.
6.1 Použité materiály a chemikálie
- Křemičitá nanovlákna, Si-J32/20-1, J32/20-2, TUL - Ethanol bezvodý, PENTA
- 3-aminopropyltriethoxysilan (APTES) 98%, Sigma-Aldrich - Kyselina octová 99%, PENTA
- Kyselina citronová bezvodá, p. a., PENTA - Kyselina chlorovodíková 35%, PENTA - Demineralizovaná voda, TUL
- Ultračistá voda, TUL
- Fluorescein isothiokyanát (FITC) isomer ≥ 90%, Sigma-Aldrich - Hydroxid sodný, p. a., PENTA
- Hyaluronan sodný, MW 1,3 MDa, ρ = 0,143 g/cm3, obsah proteinu ≤ 0,1 % - Hydrogenfosforečnan disodný dihydrát, p. a., PENTA
- N-hydroxysukcinimid (NHS) 98%, Sigma-Aldrich
33 | S t r á n k a - 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimid (EDC) ≥ 98%, Sigma-
Aldrich
- Cetyltrimethylamoniumbromid (CTAB) ≥ 99%, Sigma-Aldrich
6.2 Použité metody
6.2.1 Silylace křemičitých nanovláken
Elektrostaticky zvlákněná nanovlákenná vrstva na bázi oxidu křemičitého (o rozměrech 5 x 5 cm a 4 x 3 cm), která byla stabilizována při teplotě 180 °C po dobu 2 hodin, byla vložena do plastové Petriho misky, kam byl následně přidán stanovený objem (20 ml) silylačního roztoku APTES v 96% ethanolu. Silylační roztok byl připraven v plastové kádince, kde byl připraven 96% ethanol jako směs ethanolu a demineralizované vody. Po přidání silylačního činidla APTES bylo před samotnou silylací pomocí roztoku kyseliny octové upraveno pH roztoku na hodnotu 5. Pro optimalizaci silylace byla připravena série roztoků o koncentraci silylačního činidla 2, 3 a 4 %. Silylace byla provedena ve vzduchově utěsněné Petriho misce obsahující křemičitá nanovlákna spolu se silylačním činidlem při současné agitaci na třepačku Heidolph Hei-Tec (Heidolph Instruments, Německo) s rychlostí třepání 50 ot/min. Silylace probíhala při laboratorní teplotě a odběry vzorků probíhaly vždy po 1, 2, 3, 4, 5 hodině.
Po skončení reakce vždy v odpovídající čas byl silylační roztok odtažen pomocí pipety a ke vzorkům bylo přidáno 4 x 20 ml 96% ethanolu za účelem promytí vzorků a odstranění zbylého reakčního činidla z nanovlákenné vrstvy.
Vždy poslední 2 promývání probíhala na třepačce při 50 ot/min po dobu 5 minut.
Následně byla nanovlákenná vrstva přenesena pomocí pinzety na antiadhezní podložku, na které byla při laboratorní teplotě vysušena. Takto připravené vzorky byly uloženy do vzduchotěsných polyethylenových sáčků, kde byly uchovány pro další použití.
34 | S t r á n k a
6.2.2 Kvantifikace vázaných aminoskupin
Stanovení aminoskupin na povrchu křemičitých nanovlákenných substrátů po silylaci bylo provedeno metodou založenou na značení aminoskupin pomocí barvení fluorescein-isothiokyanátem (FITC). Postup celého procesu je uveden níže.
Roztok FITC o koncentraci 136,4 μM použitý k analýze byl připraven zředěním zásobního roztoku FITC o koncentraci 3,41 mM s použitím ethanolu.
Dále byla nanovlákenná vrstva po silylaci o rozměrech 1 x 1 cm vložena do tmavé plastové zkumavky a inkubována s roztokem FITC na třepačce při 50 ot/min po dobu 24 hodin.
Druhý den byl roztok FITC odtažen pomocí pinzety a nanovlákenné vrstva byla promyta 4 x 3 ml ethanolu, přičemž poslední 2 promývání probíhala na třepačce při 50 ot/min po dobu 5 minut. Poté byly ke vzorkům přidány 3 ml 0,2 M roztoku hydroxidu sodného. Uzavřená zkumavka byla umístěna na kývačku po dobu 24 hodin, během kterých došlo k rozpuštění nanovlákenné vrstvy s navázaným FITC.
Následná kvantifikace byla provedena měřením intenzity fluorescence při podmínkách Fex/Fem: 485/528. Z výsledného roztoku, který vznikl rozpuštěním křemičitých nanovláken značených FITC, bylo pro měření na mirkotitrační destičce
Obrázek 11: Vzorky křemičitých nanovláken (4 x 3 cm) po silylaci 2%
roztokem APTES
35 | S t r á n k a použito 200 μL. Pro stanovení intenzity fluorescence stejně jako ke konstrukci kalibrační křivky byl použit přístroj Multiplate Reader Synergy HTX (Obrázek 12).
6.2.3 Metody charakterizace křemičitých nanovláken
Studium morfologie ‒ skenovací elektronová mikroskopie (SEM)
Morfologie nanovlákenné vrstvy na bázi oxidu křemičitého byla pozorována pomocí skenovacího elektronového mikroskopu Tescan Vega 3 (Tescan Orsay Holding, Česká republika) a pomocí skenovacího elektronového mikroskopu Zeiss Ultra plus (Zeiss, Německo). Použité urychlovací napětí u mikroskopu Tescan Vega 3 (Obrázek 13) bylo 30 kV, kdežto u mikroskopu Zeiss Ultra plus bylo použito 2 a 5 kV. Před vlastní analýzou byly vzorky křemičitých nanovláken potaženy vrstvou zlata o tloušťce cca 6 nm v přístroji Quorum SC7620 (Qurom Technologies, Ashford, UK), čímž byly dané vzorky zvodivěny. Takto připravený materiál byl následně použit pro vlastní analýzu.
Obrázek 12: Zařízení pro měření fluorescence - Microplate Reader
36 | S t r á n k a 6.2.4 Imobilizace kyseliny hyaluronové
Hlavními parametry studovanými při imobilizační reakci kyseliny hyaluronové byla doba a pH pufru, ve kterém byla daná kyselina hyaluronová rozpuštěna. Na základě dostupných publikací, které se zabývaly imobilizací HA, byla zvolena časová škála v rozmezí 1 – 15 hodin. Konkrétně byly vzorky odebírány po 1, 3, 5, 10 a 15 hodinách. Zvolený rozsah hodnot pH byl od 3 – 6 a to konkrétně 3, 4, 5, 6. Popis celého procesu je uveden níže.
Nejprve byl připraven modifikovaný McIlvainův pufr na bázi hydrogenfosforečnanu didraselného a kyseliny citronové s hodnotou pH = 6.
Následně byl pufr rovnoměrně rozdělen do 4 kádinek o objemech 250 ml. Takto rozdělené roztoky byly pomocí pH metru podrobeny úpravě pH na požadované hodnoty 3, 4, 5, 6. V připravených pufrech byla následně sodná sůl kyseliny hyaluronové. Rozpouštění probíhalo po dobu 24 hodin na magnetické míchačce s nastavenou rychlostí na 350 ot/min.
K tomu, aby nastala imobilizační reakce, je potřeba dvou důležitých komponentů, EDC a NHS, tudíž bylo potřeba připravit zásobní roztoky těchto látek.
Obrázek 13: Skenovací elektronový mikroskop Tescan Vega 3
37 | S t r á n k a Princip jejich reakce je popsán v kapitole 2.1.1. Zásobní roztoky připravené v imobilizačním pufru měly koncentraci 0,75% EDC a 0,125% NHS. Po úplném rozpuštění všech látek byla provedena příprava kompletních imobilizačních roztoků, kdy byly v plastových zkumavkách smíseny všechny připravené komponenty ve vhodném pořadí. Připravené roztoky byly homogenizovány na rotační třepačce po dobu 15 minut při rychlosti 15 ot/min.
V připravených roztocích byla provedena imobilizace HA na předem silylované vzorky nanovlákenných vrstev o rozměru 4 x 3 cm. Proces imobilizace probíhal ve vzduchově utěsněné Petriho misce a při agitaci na třepačce po určitou dobu při 150 ot/min. Po uplynutí stanovených časových úseků - 1, 3, 5, 10, 15 hodin, byla imobilizace ukončena odtažením imobilizačního roztoku a každá nanovlákenná vrstva byla promyta 3 x 15 ml demineralizované vody, přičemž při každém promývání byly vzorky umístěny na třepačku po dobu 15 minut a při 150 ot/min. Následně byly vzorky pomocí jemné manipulace a pinzety přeneseny na podklad, kde se při laboratorní teplotě nechaly vysoušet.
6.2.5 Kvantitativní stanovení HA na povrchu SiO2 nanovláken
Princip stanovení koncentrace kyseliny hyaluronové na povrchu křemičitých nanovláken je podobný principu používanému ke kvantitativnímu stanovení aminoskupin s tím rozdílem, že při této metodě není využíváno FITC jakožto značícího činidla aminoskupin, nýbrž je zde využíváno zakalení, které vzniká při reakci cetyltrimethylamoniumbromidu (CTAB) s roztokem obsahujícím HA. Podrobný popis celého postupu je uveden níže.
Z důkladně vysušených nanovlákenných vrstev (o rozměrech 4 x 3 cm) byly pomocí čtvercové raznice vyraženy vzorky o rozměrech 1 x 1 cm. Všechny vzorky byly zváženy na analytických vahách. Takto vyražené vzorky byly, stejně jako v případě kvantifikace rozpuštěny v 0,2 M roztoku hydroxidu sodného. Nanovlákna byla v uzavřených zkumavkách rozpuštěna při současné agitaci po dobu 24 hodin.
Takto získané roztoky byly použity ke kvantifikaci imobilizované kyseliny hyaluronové. Ta byla provedena smísením 100 μl testovaného roztoku se 100 μl roztoku CTAB. Před vyhodnocením byla mikrotitrační destička umístěna na třepačku při 100 ot/min po dobu 10 minut a inkubována při teplotě 37 °C.
Kvantifikace přítomné kyseliny hyaluronové byla provedena na základě hodnot
38 | S t r á n k a absorbance (400 nm) naměřených přístrojem Microplate Reader Synergy HTX na 400 nm vlnové délky. U každého vzorku byla kvantifikace HA provedena ve třech opakováních. U každého opakování potom bylo hodnocení na Microplate Readeru provedeno v triplikátu tak, aby bylo možný výpočet základních statistických charakteristik. Kvantifikace HA byla provedena srovnáním s kalibrační křivkou. Ta byla připravena stejnou metodou s použitím roztoků kyseliny hyaluronové o známé koncentraci (viz Graf 6).
39 | S t r á n k a Obrázek 14: Nanovlákna SiO2 před modifikací APTES, snímky ze SEM zvětšení 10kx (A) a
25kx (B)
7 Výsledky měření a diskuze
7.1 Morfologie čistých křemičitých nanovláken
Morfologická analýza neupravených křemičitých nanovláken provedená elektronovou mikroskopií ukázala, že se jedná o vlákna poměrně uniformní a s hladkým povrchem, což také dokazují snímky pořízené ze skenovacího elektronového mikroskopu Tescan Vega 3 (Obrázek 14). Průměr těchto vláken před modifikací APTES byl stanoven na (210 ± 130) nm; (x ± σn-1, n = 120).
Histogram četností naměřených průměrů je uveden níže (Graf 1). V analyzované nanovlákenné vrstvě byl pozorován malý počet silných vláken a vad. Ty mohou při elektrostatickém zvlákňování křemičitého solu vznikat vlivem odpařování rozpouštědla a tím způsobeným nárůstem koncentrace a tím i viskozity. Vady mohou v případě křemičitých nanovláken vznikat také vlivem klimatických podmínek (vzdušná vlhkost, teplota). Vznik nehomogenit vlivem klimatických podmínek může být vyřešen použitím klimatizační jednotky, která zajistí konstantní podmínky po celou dobu výrobního procesu.
A) B)
40 | S t r á n k a
7.2 Fluorescenční stanovení koncentrace aminoskupin
Spektrofotometrické metody, mezi které patří i metoda využívající reakce s FITC, jsou často užívány ke stanovení koncentrace funkčních skupin. Výhodou této metody je právě možnost kvantitativního stanovení koncentrace aminoskupin i v jejich nízkých koncentracích, na rozdíl od většiny analytických metod, které hodnotí přítomnost aminoskupin pouze kvalitativně nebo jsou tyto hodnoty pod jejich detekčním limitem. Použití spektrofotometrických metod může být naopak nevýhodné v případě vysokých koncentrací funkčních skupin na povrchu, kdy je horní limit citlivosti metody závislý na rozestupech mezi kvantifikovanými skupinami a dále na velikosti molekuly barviva (FITC). Jak je patrné z porovnání spekter označených jako SiO2 a SiO2-APTES získaných metodou infračervené spektroskopie (FTIR) a zobrazených v Příloha A, není efekt silylace vzhledem k detekčním limitům této metody vůbec prokazatelný. Počet funkčních skupin vázaných na povrch nanovláken je tedy relativně malý. Z těchto důvodů byla pro ověření vlivu jednotlivých parametrů na účinnost silylace zvolena kvantifikace specifickou vazbou FITC na volné aminoskupiny. Výsledy analýzy provedené dle postupu uvedeného v kapitole 6.2.2 jsou uvedeny v tabulkách 2 až 4.
Graf 1: Histogram četností průměrů neupravených křemičitých nanovláken 0
5 10 15 20 25 30 35 40 45
50 100 150 200 250 300 350 400 Další
Četnost [%]
Průměr vláken [nm]
41 | S t r á n k a Tabulka 2: Výsledky fluorescence a koncentrace aminoskupin (1. měření)
Koncentrace APTES [% obj.]
Doba silylace
[hod] Fluorescence Koncentrace
NH2 [μM/L] Váha NH2
[ng/cm2]
2 1 818 2,66 128
2 1381 5,10 245
3 759 2,41 115
4 1061 3,72 178
5 942 3,20 154
3 1 702 2,16 104
2 723 2,25 108
3 1119 3,97 190
4 907 3,05 146
5 859 2,84 136
4 1 532 1,42 68
2 765 2,43 117
3 633 1,86 89
4 776 2,48 119
5 758 2,40 115
Tabulka 3: Výsledky fluorescence a koncentrace aminoskupin (2. měření) Koncentrace
APTES [% obj.]
Doba silylace
[hod] Fluorescence Koncentrace
NH2 [μM/L] Váha NH2
[ng/cm2]
2 1 847 2,79 134
2 1413 5,24 252
3 813 2,64 127
4 1065 3,73 179
5 967 3,31 159
3 1 694 2,12 102
2 744 2,34 112
3 1178 4,22 203
4 899 3,01 145
5 869 2,88 138
4 1 530 1,41 68
2 781 2,50 120
3 670 2,02 97
4 784 2,51 121
5 756 2,39 115
42 | S t r á n k a Graf 2: Závislost množství aminoskupin na době silylace při použití různých koncentrací
modifikačního činidla APTES 0
50 100 150 200 250 300
1 2 3 4 5
NH2 [ng/cm2 ]
Doba silylace [hod]
2% APTES 3% APTES 4% APTES Tabulka 4: Výsledky fluorescence a koncentrace aminoskupin (3. měření)
Koncentrace APTES [% obj.]
Doba silylace
[hod] Fluorescence Koncentrace
NH2 [μM/L] Váha NH2
[ng/cm2]
2 1 869 2,88 138
2 1408 5,22 251
3 813 2,60 127
4 1052 3,68 176
5 967 3,30 159
3 1 690 2,11 101
2 737 2,31 111
3 1178 4,22 203
4 906 3,04 146
5 871 2,89 139
4 1 526 1,39 67
2 777 2,48 119
3 646 1,91 92
4 772 2,46 118
5 757 2,40 115
Kvantifikace byla vzhledem k nehomogenitě vzorků provedena v triplikátu pro každý typu vzorku. Zmíněná nehomogenita mohla být mírně ovlivněna i nespecifickou adsorpcí malého množství FITC na nanovlákna. Tento efekt by však měl být minimalizovaný důkladným promytím vzorků.
43 | S t r á n k a Výsledné hodnoty uvedené v tabulkách výše (Tabulka 2, Tabulka 3, Tabulka 4) byly zprůměrovány a zaneseny do Graf 2. Z grafu je patrné, že nejvyšší výtěžnost aminoskupin byla u většiny časových bodů získána při použití silylačního roztoku s obsahem 2% APTES, což tedy znamená, že existuje určitá mezní koncentrace silylačního činidla, nad kterou již nedochází ke zvýšení počtu detekovatelných skupin. Příčiny toho limitu mohou být dvě. Za prvé může dojít k vyčerpání veškerých hydroxylových skupin dostupných se na povrchu křemičitých nanovláken použitím 2% roztoku APTES a tedy další nárůst koncentrace silylačního činidla se neprojeví. Druhou možností je, že se zvyšující se koncentrací APTES dojde k navázání takového množství aminoskupin na povrch křemičitých nanovlákenných substrátů, že metoda založená na reakci s FITC již není schopná aminoskupiny detekovat v důsledku omezení počtu navázaných molekul FITC, což je dáno sterickými nároky molekul barviva. Tato domněnka by však musela být ověřena s použitím minimálně jedné další kvantifikační metody. Nejvyšší průměrná hodnota navázaných aminoskupin, tedy 249 ng NH2 na cm2 nanovlákenného substrátu byla získána při modifikaci 2% roztokem APTES po dobu 2 hodin. Na základě tohoto výsledku byly tyto podmínky silylace zvoleny pro další experimenty.
7.2.1 Morfologie křemičitých nanovláken po silylaci
Jak je patrné z výsledků silylace diskutovaných v předchozí kapitole, kvalita vzorku taktéž ovlivňuje výtěžnost silylační reakce. To se prokázalo při provádění silylačních reakcí díky použití vzorků odebraných z různých míst nanovlákenné vrstvy a tedy s odlišnou morfologií (průměrem nanovláken), která významně ovlivňuje měrný povrch nanovlákenné vrstvy. Tento efekt je patrný při porovnání výsledků silylace uvedených v tabulkách výše, kde pro každou skupinu vzorků (tabulku) byly vzorky odebrány v jiném místě vrstvy, což v důsledku vedlo k rozdílům v počtu navázaných aminoskupin při použití materiálu z okrajů a ze středu nanovlákenné vrstvy. Při kvantifikaci účinnosti silylace touto metodou a porovnatelnost výsledků je tedy důležité užití stejné šarže materiálu (tzn. vybírat stejné místo pro odběr vzorku pro všechny testy). Velice důležité je také ověřit morfologii použité nanovlákenné vrstvy před úpravou i po ní.
44 | S t r á n k a Snímky pořízené na skenovacím elektronovém mikroskopu Zeiss Ultra Plus, uvedené níže, ukazují kvalitu křemičité nanovlákenné vrstvy po silylační reakci při různých koncentrací modifikačního činidla APTES. Na snímcích po silylaci 2%
roztokem APTES (Obrázek 15), 3% roztokem APTES (Obrázek 16) ani 4%
roztokem APTES (Obrázek 17) nejsou patrné žádné výraznější změny v morfologii.
Provedením silylace těmito roztoky tedy nedošlo k poškození nanovlákenné vrstvy, výrazné korozi povrchu nanovláken nebo jejich praskání. U těchto nanovlákenných vrstev byly naměřeny průměry vláken pro 2% roztok APTES (180 ± 90) nm, pro 3% roztok APTES (190 ± 110) nm a pro 4% roztok APTES (190 ± 160) nm. Při porovnání s průměry neupravených nanovláken (210 ± 130) nm je vidět, že silylace měla vliv na morfologii nanovláken a u ve všech případech silylace došlo k mírnému snížení průměrné hodnoty jejich průměru.
Obrázek 15: Nanovlákna SiO2 po modifikaci 2% roztokem APTES, snímky ze SEM zvětšení 15kx, odběr po 1h (A) a po 5h (B)
A) B)
45 | S t r á n k a V níže uvedených histogramech je zaznamenáno zastoupení jednotlivých průměrů nanovláken ve vzorcích po silylaci 2% roztokem APTES (Graf 3), 3%
roztokem APTES (Graf 4) a 4% roztokem APTES (Graf 5). Jak je patrné, tak jednotlivá zastoupení průměrů ve vzorcích se mírně odlišují četností jednotlivých Obrázek 16: Nanovlákna SiO2 po modifikaci 3% roztokem APTES, snímky ze SEM zvětšení
15kx, odběr po 1h (A) a po 5h (B)
Obrázek 17: Nanovlákna SiO2 po modifikaci 4% roztokem APTES, snímky ze SEM zvětšení 15kx, odběr po 1h (A) a po 5h (B)
A) B)
A) B)
