1 Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet
Examensarbete 15 hp
Evaluation of a method for determination of glutathionereductase activity in
erythrocytes
Polina Hanna
Handledare: Jon Nordin & Soheir Beshara Avdelning för Klinisk Kemi
Karolinska universitetssjukhuset, Huddinge, Sverige
2
Abstract
Glutathione (GSH) is a molecule that consists of three amino acids: glutamic acid, cysteine and glycine. GSH has several important functions: to protect cells from free radicals, reactive oxygen species and oxidative stress. GSH exists in a reduced form, GSH, and in an oxidized dimeric form, glutationdisulfid, GSSG. The enzymes glutathionereductase (GR) catalyses the reduction of GSSG back to GSH. Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) is required as a coenzyme in the reaction. Deficiency of GSH in the body results in lysis of red blood cells leading to reduced life length of these cells and hemolytic anemia. In this study, we evaluated a method for determining the GR activity used in the investigation of hemolytic anemia. Blood samples containing both normal and high reticulocyte concentration were washed, to extract red blood cells. To analyze GR activity, we used an enzyme activity assay based on spectrofotometry. The method showed reliable results for GR activity and hopefully will be used in diagnostic routines.
Keywords
Glutatione, hemolytic anemia, retikulocytes
3
Introduktion
Blodet är det organ i kroppen som har till uppgift att transportera syre och koldioxid mellan lungorna och övriga organ i kroppen. Även transport av hormoner, näringsämnen och restprodukter och reglering av kroppens temperatur ingår i blodets uppgifter. En vuxen människa har ungefär 5 till 6 liter blod. Blodet innehåller blodkroppar och plasma.
Blodkropparna består av trombocyter som har den primära hemostasen som huvudfunktion, leukocyter som deltar i kroppens immunförsvar och erytrocyter som transporterar syre och koldioxid. Plasman består av vatten, salter, proteiner, vitaminer, hormoner mm.
I blodet förekommer det volymmässigt mest erytrocyter och det är en av de mest
specialiserade cellerna i kroppen [1]. Erytrocytbildning eller erytropoes sker i benmärgen där en differentiering av stamceller till erytrocyter sker i en flerstegsprocess. Från stamceller bildas det pronormoblaster, basofila normoblaster, polykromatiska normoblaster,
ortokromatiska normoblaster, polykromatisk erytrocyter som är reticulocyter och slutligen erytrocyter [2]. Erytrocyterna består av cellmembran, enzymer och hemoglobin som binder och transporterar syre [2,3]. En hemoglobinmolekyl består av 4 globin kedjor och 4
hemgruppmolekyler innehållande 2-värd järnjon [4]. Erytrocyterna saknar cellkärna,
organeller och mitokondrier och är därför beroende av anaerob metabolism av glukos via den glykolytiska vägen.
Vid avvikelser i erytrocyternas normala funktion, kan patienten drabbas av så kallad anemi.
Anemi talar oftast om att mängden hemoglobin är mindre än normal. Även andra mekanismer såsom brist på enzymer, immunologiska avvikelser och brist på B12/folsyra som orsakar hemolys av erytrocyter kan ge upphov till anemi [5]. Ett ökat sönderfall av erytrocyter kallas för hemolytisk anemi [6].
4
Hemolytisk anemi kan antingen vara medfödd eller förvärvad. Brist på enzymer är en orsak till förekomst av hemolytisk anemi. Glukos-6-fosfatdehydrogenas (G6PD) är ett nödvändigt enzym som har till funktion att skydda erytrocyten från oxidativa skador. Vid brist på G6PD kan allvarlig hemolys uppstå [1]. Brist på pyruvatkinas leder också det till en enzymdefekt i erytrocyterna som orsakar hemolytisk anemi [7].
Under erytrocyternas levnadstid kräver de energi för att kunna upprätthålla ett antal vitala cellfunktioner. Dessa innefattar bland annat syntes av glutation och andra metaboliter, skydd av metaboliska enzymer och hemoglobin och membranproteiner från oxidativ denaturering [8]. Oxidativ stress uppstår i celler och vävnader när koncentration av reaktiva syreradikaler överstiger nivåerna av skyddande antioxidanter.
Glutation (GSH) är en molekyl som består av de tre aminosyrorna glutaminsyra, cystein och glycin (tripeptid). GSH har flera viktiga funktioner som att skydda celler från fria radikaler, reaktivt syre och oxidativ stress [9]. GSH förekommer i de flesta celler men främst i lever, mjälte, och njure. GSH finns även i leukocyter och trombocyter.
En viktig roll för GSH i erytrocyter är att förebygga denaturering av hemoglobin och att avgifta kroppsfrämmande skadliga ämnen och reaktiva syreradikaler i erytrocyterna [10].
Glutation kan förekomma i två former, både i reducerad form, GSH, och i en oxiderad dimerform, glutationdisulfid GSSG. Höga koncentrationer av GSSG är skadligt för cellerna [9]. Glutation kan oxideras till GSSG, om cellen blir utsätt för oxidativ stress (se figur nedan) [11].
2GSH + H 2O2 → GSSG + 2H2O
5
Reduceringen av GSSG tillbaka till GSH utförs av enzymet glutationreduktas (GR). GR är ett flavoprotein som katalyserar reduktionen av oxiderat glutation i närvaro av NADPH. Med hjälp av enzymet GR reduceras GSSG-formen till reducerad GSH och NADPH oxideras därvid. Pentofosfatvägen är den viktigaste källan för NADPH [9]. GSSG-formen reduceras till reducerad GSH vid tillsättning av NADPH (se figur nedan) [12].
GR
NADPH + GSSG NADP+ + 2 GSH
När erytrocyterna utsätts för höga nivåer av oxidativ stress, kan cirka 10 % av
glukoskonsumtionen riktas till pentosfosfatvägen för produktion av NADPH som behövs för denna reaktion. Utsätts cellen för oxidativ stress och pentosfosfatvägen inte är funktionell drabbas cellen av lys, hemoglobin precipiterar i form av Heinz kroppar och membranprotein oxideras och förstörs.
Vid brist på GSH drabbas kroppen av lys av erytrocyterna som leder till minskad livslängd av erytrocyterna vilket leder till hemolytisk anemi [13]. I flera sjukdomar har låga nivåer av GSH observerats, till exempel vid levercirros, lungsjukdom, diabetes, pankreas inflammation, och neurodegenerativa sjukdomar [14].
Blodstatus är den vanligaste analys som används för att sätta diagnosen anemi. Testet mäter bland annat hemoglobinkoncentration, antal erytrocyter, antal retikulocyter, antal
trombocyter, medelvolym av erytrocyterna (MCV), medelhemoglobininnehållet (MCH) och medelhemoglobinkoncentrationen (MCHC) [5].
6
Ofta krävs även specialundersökningar av enzymaktiviteter vid misstanke om avvikelse i erytrocyternas metabolism. I första hand analyseras aktiviteten av G6PD och pyruvatkinas då det är de vanligaste formerna av defekter. Man kan även kontrollera koncentrationen av 2,3- difosfoglycerat (2,3-DPG) och GR.
Syftet med denna studie var att utvärdera en metod för bestämning av GR aktivitet som används vid utredning av hemolytisk anemi. Metoden används för närvarande inte i Sverige men målet är att kunna använda metoden inom diagnostiskt verksamhet.
Material och Metod
Till studien användes 21 venösa blodprover som samlades i EDTA-rör från patienter.
Proverna plockades ut ur daglig rutinverksamhet. Till studien användes prover från patienter som hade avidentifierats, patienten hade gett sitt godkännande för provtagning och
användning av material i studien. Prover innefattade både normala och höga
retikulocytvärden behandlades och användes, för att rena fram erytrocyterna genom tvättning.
Rening av erytrocyter Tvättprocedur (I):
En homogen lösning av erytrocyter är nödvändigt för att utföra analysen, eftersom
leukocyterna också innehåller enzymet glutationreduktas (GR). Innan centrifugering mättes blodstatus och retikulocyter. Proverna centrifugerades vid 1000xg i 10min vid 4C. Överfasen och buffy coat innehållande leukocyter och trombocyter togs bort. Erytrocyterna renades därefter genom att suspendera dem i 2mL fysiologisk koksaltlösning. Suspensionen centrifugerades vid 1000xg i 10min vid 4C. Förfarandet upprepades två gånger till.
7
Erytrocyterna lyserades sedan genom att mixa 500µL framrenade erytrocyter med 1,5mL destillerat vatten. Blandningen centrifugerades 15min vid 10000xg i 4C. Supernatanten fördelades i tre rör, cirka 500µL vardera. Leukocyter, trombocyter och retikulocyter analyserades efter tvättningen på visa prover, för att kontrollera reningsmetoden. Efter tvättningen mättes hemoglobin (Hb) på samtliga prover med hjälp av HemoCue Hemoglobin instrument, (Ängelholm, Sweden). Kvoten av Hb innan och efter tvättning användes vid beräkning av spädningsfaktorn. Mätningen utfördes genom att tillsätta en droppe blod till en kuvett, som sedan placerades i Hemocue-apparaten och avläsning skedde sedan per
automatik. Proverna förvarades i -70C frys tills vidare behandling.
Även kitets rekommenderade tvättprocedur (II) utvärderades. Innan centrifugering mättes blodstatus och retikulocyter. Proverna centrifugerades vid 1000xg i 10min vid 4C, varefter överfasen och buffy coat togs bort. Erytrocyterna framrenades genom att mixa 200µL erytrocyter med 1mL analysbuffert. Blandningen centrifugerades 15min vid 10000xg i 4C.
Supernatanten fördelades i två rör, cirka 500µL vardera.
Glutationreduktasanalys
För analysen användes GlutathioneReductase Assay Kit reagens från Biovision (California, USA). Lösningarna i kitet bereddes enligt instruktion från tillverkaren. Reaktionsblandningen till analysen förbereddes genom att blanda analysbuffert, 5,5-ditiobis 2-nitrobensoesyra (DTNB)-lösning och GSSG-lösning. Positiva kontrollen blandades med 100µL analysbuffert i 2 rör som sedan blandades noga med en vortexmixer. Ett tiobis 2-nitrobensoesyra (TNB)- standardkurva förbereddes genom att blanda 500µL analysbuffert med TNB-standard i 5 rör.
Samtliga reagenser förvarades vid -20C om inte analysen utfördes under samma dag.
8 Lösningsförberedning
Frystorkad NADPH-lösning späddes med analysbuffert till en slutlig koncentration i provet på 0,1mM. NADPH-lösningen bereddes färsk vid varje analystillfälle, eftersom NADPH
lösningen inte kunde förvaras i frysen, utan endast en dag på is.
Även frystorkad nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH)-lösning späddes med analysbuffert till en slutlig koncentration i provet på 0,12mM. NADH-lösningen ska inte förvaras i frysen, utan endast en dag på is.
Förbehandling av prover inför analys
Proverna och reagenserna förvarades i isbad under analysen. Till analysen användes kitets rekommenderade förbehandling av prover där 100µL prov tillsattes till brunnen, därefter tillsattes 5µL H2O2. Proverna inkuberades 5min och 5µL katalas tillsattes och blandningen inkuberades ytterligare 5min.
Till analys av prover användes en 96-hålsplatta. I den första brunnen tillsattes 50µL analysbuffert och 50µL reaktionsblandning. Detta användes som blank. Till den positiva kontrollen användes kitets kontroll. 50µL av positiva kontrollen blandades med 50µL
reaktionslösning. Proverna förspäddes 1:10 med analysbuffert, därefter blandades 20µL prov med 30µL analysbuffert och 50µL reaktionslösning som tillsattes till plattan. Inkubationen skedde vid 25C.
GR katalyserar reaktionen där GSSG reduceras till GSH och,- NADPH oxideras till NADP+. GSH reagerar i sin tur med DTNB vilket ger upphov till TNB. TNB har en gul färg med absorptionsmaximum vid 405nm som sedan kan mätas med hjälp av en spektrofotometer.
9
SpectraMax som användes är en automatiserad spektrofotometer avsedd för mikrotiterplattor.
(Spectramax PLUS 384, Molucular Devices, Sunnyvale,USA).
Mätning av glutationreduktasaktivitet
Reaktionen följdes med hjälp av spektrofotometeri där absorbansmätningar plottades mot tiden, 96-hålsplattan placerades i spektrofotometern. Vid varje körning testades flera blodprover.
Bearbetning av data
GR-aktiviteten beräknades utifrån resultaten som erhölls från spektrofotometern. Spädning 1:10 av proverna användes för att minska absorbansen eftersom instrumentet inte klarade av att mäta ospädda prover. Kvoten av Hb innan och efter tvättning användes som mått på spädning vid tvätt. Resultatet dividerades med 2 för att realtera bildat TNB till reduceringen av GSSG.
10
Resultat
Experimentet utfördes med olika spädningar och komponenter för att hitta optimala förhållanden för metoden. Till en början användes fryst NADPH till analysen. Detta
resulterade hög spridning mellan resultaten (Tabell 1). Därefter valdes att utföra experimentet med tillsats av färsk NADPH-lösning vilket visade en betydligt bättre reaktion och bra
överensstämmelse vid upprepad mätning på samma prov (Tabell 1).
Tabell 1. Resultat för glutationreduktasaktivitet vid användning av fryst och färskt NADPH- lösning.
Prov nummer
GR aktivitet (mU/mL) vid användning av fryst NADPH
CV% GR aktivitet (mU/mL) vid användning av färskt NADPH
CV%
1 70,7 30 33,3 11
45,8 28,5
2 258 98 32,8 0,4
47,5 34,8
3 52 23 26,7 1
37,7 23,2
4 163,8 0,8 26,5 0,2
146,4 27,5
11
Det användes även NADH istället för NADPH för mätning av glutationreduktasaktivitet.
Användning av NADPH visade ett mer tillförlitlig resultat. (Tabell 2)
Tabell 2. Resultat för glutationreduktasaktivitet vid användning av färsk NADH-lösning jämfört med färsk NADPH-lösning.
Prov nummer
GR aktivtet mU/mL NADH
CV% GR aktivitet mU/mL NADPH
CV%
1 92 33 33,6 0,4
56,5 35,9
2 86,2 100 32,9 13
14,1 39,8
Tvättförsök utfördes för att frigöra proverna från oönskvärda blodceller. Tvättproceduren resulterade i minskat antal leukocyter, trombocyter och retikulocyter (Tabell 3).
Tabell 3. Exempel på resultat före och efter tvättning (tvättprocedur II) för Hb, leukocyter (LPK), trombocyter (TPK) och retikulocyter.
Hb (g/l) Före Efter
LPK (109/l) Före Efter
TPK (109/l) Före Efter
Retikulocyter (109/l) Före Efter
87 36 7,24 1,53 50 1 32,4 0
86 35 7,65 0,67 55 1 35,5 0
98 41 0,69 0,26 36 1 37,6 0
92 37 1 0,36 5 1 41,7 0
85 42 1,12 0,53 3 0 39,3 0
115 34 3,1 0,61 49 2 111,2 0
12
Det utfördes även ett experiment för att studera relationer mellan förekomst av retikulocyter och GR aktivitet som visas nedan i tabell 4. Inga tydliga kopplingar mellan antal retikulocyter och GR aktivitet kunde dock identifieras.
Tabell 4. Resultat för högt och lågt retikulocytantal i blod och relation med glutationreduktasaktivitet
Retikulocyter låga(109/l)
Retikulocyter höga(109/l)
GR aktivitet mU/mL 32,4 21,75 35,5 44,1
161,5 33 136,6 34,75
Diskussion
Brist på enzymet glutationreduktas anses vara en av flera möjliga orsaker till hemolytisk anemi. För närvarande används metoden glutationreduktas inte i Sverige men den används i andra länder för bestämning av glutationreduktasaktivitet. I den här studien har vi försökt att utvärdera en metod för bestämning av detta enzym som eventuellt kommer att användas inom diagnostik av direkt antiglobulintest (DAT) negativ hemolytisk anemi.
Vid mätning av GSSG i helblod krävs det stor noggrannhet för att förhindra felaktiga värden [12]. Eftersom leukocyter och trombocyter innehåller enzymet glutationreduktas är det viktigt att analysmaterialet helst är helt befriat från dem. Tvättningsprocedurerna resulterade båda i lågt antal leukocyter, trombocyter och inga retikulocyter. Eftersom erytrocyterna i
13
tvättprocedur II framrenades genom att mixa 200µL erytrocyter med 1mL analysbuffert föredrogs den då den var mindre arbetskrävande.
Glutationreduktasanalysen var enkel att utföra och bestämdes med hjälp av kromogent substrat i en spektrofotometer vid 405nm i rumstemperatur. Olika tidsintervaller och spädningar av ingående reaktanter undersöktes för att hitta optimala förhållanden för bäst resultat.
Problem som förekom under utförandet var bland annat nedbrytning av NADPH. NADPH visade sig vara känsligt för temperaturförändringar och nedfrysning vilket orsakade negativa effekter på resultaten. NADPH var hållbar 1-2 dagar i kyl.
En annan faktor som påverkade metoden var förekomst av bubblor vid mätning. Dessa stör analysen, leder till felaktiga värden och kan även leda till oxidation.
Till denna studie testades i början flera olika spädningar, proverna förspäddes 1:10 som visade bra värden. Eftersom metoden inte används än vill man gå vidare med att testa olika spädningar.
Till denna studie testades i början att förbehandla proverna med H2O2 och katalas. Vid tillsättning av H2O2 förstörs GSH och vid tillsättning av katalas tas överflödigt H2O2 bort. Förbehandlingen var arbetskrävande och eftersom den inte gav någon skillnad i resultat valdes detta steg bort.
Eftersom metoden inte används inom diagnostik i Sverige vill man gå vidare med att be andra laboratorier runtom Europa om prover med bestämd glutationreduktasaktivitet. Detta för att säkerställa att man kan identifiera prover som har för låg glutationreduktasaktivitet med metoden. Några sådana prover fanns inte i vårt patientmaterial enligt de resultat som erhölls.
Slutsatsen från denna studie är att metoden visade tillförlitliga resultat utan förbehandling av proverna med väteperoxid och katalas. Metoden visade tillförlitlighet vid de prover som analyserades, dock krävs det valideringar för låga glutation halt innan den kan komma i bruk i
14
diagnostik. TvättprocedurII som ingick i glutationtransferaskitet var bättre jämfört med tvättprocedur I eftersom man efter tvätten hade låga antal leukocyter, trombocyter och inga retikulocyter vilket är önskvärt vid analys av glutationreduktasaktivitet för att inte få med buffy coat och retikulocyter.
Acknowledgement
Till att börja med så vill jag tacka sjukhuskemisten Jon Nordin och läkaren Soheir Beshara som har hjälpt mig med arbetet. Vill även tacka personalen på avdelningen för Klinisk Kemi.
Referenser
[1] Çimen MY. Free radical metabolism in human erythrocytes. Clin Chim Acta. (2008) 390:
1-11
[2] Tsiftsoglou AS, Vizirianakis IS and Strouboulis J. Erythropoiesis: model systems, molecular regulators, and developmental programs. IUBMB Life. (2009) 61: 800-30
[3] Mohandas N, Gallagher PG. Red cell membrane, past, present, and future. Blood. (2008) 112: 3939-48
[4] Kanias T, Acker JP. Biopreservation of red blood cells – the struggle with hemoglobin oxidation. FEBS J. (2010) 277:343-56
15
[5] Sabol VK, Resnick B, Galik E, et al. Anemia and its impact on function in nursing home residents: what do we know. J Am Acad Nurse Pract. (2010) 22: 3-16
[6] Kubo T, Kitaoka H, Terauchi Y, et al. Hemolytic anemia in a patient with hypertrophic obstructive cardiomyopathy. J Cardiol. (2010)55:125-9
[7] Van Wijk R, Van Solinge WW. The energy-less red blood cell is lost: erythrocyte enzyme abnormalities of glycolysis. Blood. (2005) 106:4034-42
[8] Pompella A, Visvikis A, Paolicchi A, et al. The changing faces of glutathione, a cellular protagonist. Biochem Pharmacol. (2003) 66:1499-503
[9] Sentürk M, Gülçin I, Ciftci M, et al. Dantrolene inhibits human erythrocyte glutathione reductase. Boil Pharm Bull. (2008) 31:2036-9
[10] Maher P. The effects of stress and aging on glutathione metabolism. Ageing Res Rev.
(2005) 4:288-314
[11] Iwasaki Y, Saito Y, Nakano Y, et al. Chromatographic and mass spectrometric analysis of glutathione in biological samples. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. (2009) 877:3309-17
[12] Monostori P, Wittmann G, Karg E, Túri S. Determination of glutathione and glutathione disulfide in biological samples: an in depth review. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. (2009) 877:3331-46
16
[13] Erat M, Ciftci M, Effect of melatonin on enzyme activities of glutathione reductase from human erythrocytes in vitro and from rat erythrocytes in vivo. Eur J Pharmacol. (2006) 537:
59-63
[14] Njålsson R. Glutathione synthetase deficiency. Cell Mol Life Sci. (2005) 62:1938-45
