Förekomst av SARS-CoV-2 varianter av
särskild betydelse i Region Dalarna,
december 2020-januari 2021
Occurrence of SARS-CoV-2 Variants of
Concern in Region Dalarna, Sweden,
December 2020-January 2021
Författare: Johanna Eriksson
Vårterminen 2021
Examensarbete: Grundnivå, 15 högskolepoäng Huvudområde: Biomedicinsk laboratorievetenskap
Biomedicinska analytikerprogrammet, inriktning laboratoriemedicin BMLV, Examensarbete, 15 högskolepoäng
Institutionen för hälsovetenskaper, Örebro universitet. Handledare: Karin Elfving, PhD Master of Science, Klinisk
Mikrobiologi, Falu Lasarett. Hong Yin, MD, PhD, Klinisk Mikrobiologi, Falu Lasarett.
SAMMANFATTNING
Bakgrund: Den pågående pandemin COVID-19 orsakas av viruset SARS-CoV-2.
Sedan december 2020 har nya varianter av viruset med betydande genetiska förändringar upptäckts, gemensamt benämnt varianter av särskild betydelse eller variants of concern (VOC). Just nu är det tre VOC som bevakas särskilt; B.1.1.7 (först upptäckt i Storbritannien), B.1.351 (först upptäckt i Sydafrika) respektive P.1 (först upptäckt i Brasilien). Den tidigaste statistiken från Folkhälsomyndigheten om förekomsten av VOC i Region Dalarna är från februari 2021. Förekomsten av VOC innan dess är fortfarande okänd. I regionen delas analysering av prover vid misstanke om COVID-19 in i de olika kategorierna patienter, vårdpersonal, smittspårning och allmänhet. Befintlig statistik om förekomsten av VOC grundar sig nästan enbart på förekomsten bland allmänhetens prover.
Syfte: Syftet med denna studie var att undersöka förekomsten av SARS-CoV-2
varianter av särskild betydelse i prover tagna från patienter, vårdpersonal och
smittspårningar under december 2020-januari 2021 i Region Dalarna. Studien syftade också till att undersöka när spridningen av respektive VOC kan ha startat i regionen.
Metod: Provmaterialet bestod av SARS-CoV-2 positiva prov tagna inom
analyskategorierna under tidsperioden. Prover analyserades med RT-PCR och smältkurvsanalys för detektion av VOC-karaktäristiska mutationer.
Resultat: Ett fåtal fall av B.1.1.7 detekterades redan i december och en stigande andel
av B.1.1.7 påvisades inom analyskategorierna under januari, som tecken på att en regional spridning kan ha startat vid tidpunkten. Endast ett fåtal fall av B.1.351 och/eller P.1 detekterades inom analyskategorierna under tidsperioden, vilket tyder på att en regional spridning av dessa ännu inte hade startat i januari.
Nyckelord: SARS-CoV-2, Enbaspolymorfism, Genotypning, Polymeraskedjereaktion,
ABSTRACT
Background: The ongoing pandemic COVID-19 is caused by the virus SARS-CoV-2.
Since December 2020 new variants of the virus with significant mutations have been discovered, referred to as variants of concern (VOC). At the point, the occurrence of three VOC is especially monitored; B.1.1.7 (discovered in UK), B.1.351 (discovered in South Africa) and P.1 (discovered in Brazil). The earliest statistics about the occurrence of VOC in Region Dalarna, Sweden, is from February 2021 and the occurrence before that is still unknown. In the region analysis of specimen in case of suspected COVID-19 is divided into the different categories patients, healthcare-staff, infection tracing and public. Existing statistics is based almost exclusively on the occurrence of VOC in specimen from the public.
Aim: The aim of this study was to examine the occurrence of SARS-CoV-2 VOC
among specimens collected from patients, healthcare staff and infection tracing in Region Dalarna during December 2020-January 2021. The study also aimed to examine when the spread of each VOC started in the region.
Method: SARS-CoV-2 positive specimen collected within the categories during the
time was analyzed with RT-PCR and melting curve analysis for detection of VOC-characteristic mutations.
Results: A few cases of B.1.1.7 was detected already in December and an increased
percentage of B.1.1.7 was detected within the categories during January, suggesting that a regional spread started at the time. Only a few cases of B.1.351 and/or P.1 was
detected within the categories, suggesting that a regional spread of these had not yet started in January.
Keywords: SARS-CoV-2, Single Nucleotide Polymorphism, Genotyping, Polymerase
INNEHÅLLSFÖRTECKNING
BAKGRUND ... 1
COVID-19 ... 1
SARS-CoV-2 ... 1
Genom och struktur ... 1
Virulens ... 2
Diagnostik vid COVID-19 ... 2
Provtagning... 3
Förvaring av RNA ... 3
RNA-extraktion... 3
RT-PCR ... 3
Realtids-PCR... 4
Varianter av särskild betydelse (VOC) ... 4
B.1.1.7 ... 5
B.1.351 ... 5
P.1... 5
Detektion av VOC ... 6
Typnings-PCR... 6
Förekomst av VOC i Region Dalarna ... 7
Syfte ... 8
MATERIAL OCH METOD ... 9
Provmaterial ... 9 Urval ... 9 RNA-extraktion ... 10 Typnings-PCR ... 10 Kvalitetskontroller ... 11 Statistisk bearbetning ... 12 Etiska överväganden ... 12 RESULTAT ... 13
Urval och bortfall ... 13
Förekomst av VOC ... 14 DISKUSSION ... 16 Slutsats ... 19 REFERENSER ... 20 BILAGOR ... 25 Bilaga 1 ... 25
1
BAKGRUND
COVID-19
I december 2019 upptäcktes en ny art av coronavirus i Kina hos patienter med lunginflammation (1). Det nya coronaviruset kom att benämnas severe acute respiratory coronavirus 2 (SARS-CoV-2) och sjukdomen viruset orsakar tilldelades namnet coronavirus disease 2019 (COVID-19) (2). Viruset har sedan dess spridits globalt och resulterat i den pågående COVID-19-pandemin. Vid COVID-19 ses ofta milda symtom från övre luftvägar innefattande feber, torrhosta och muskelvärk. Infektionen kan också vara asymtomatisk eller ge allvarliga symtom som dyspné och andningssvikt. Andningssvikt anses vara den största orsaken till dödsfall i samband med sjukdomen till följd av det starka immunsvar som kan uppstå då SARS-CoV-2
replikeras i lungorna (3). I början av maj 2021 har drygt 156 miljoner fall av SARS-CoV-2 konstaterats världen över och drygt tre miljoner dödsfall kopplats till sjukdomen. Vid samma tidpunkt i Sverige har drygt en miljon sjukdomsfall konstaterats och cirka 14 000 dödsfall kopplats till sjukdomen (4).
SARS-CoV-2
Genom och struktur
SARS-CoV-2 klassas som en art av subgenuset β-coronavirus, tillhörande familjen coronavirus. Genomet består av linjärt enkelsträngat RNA med positiv polaritet och har en storlek på cirka 29.9 kilobaspar (kb). Genomet omges av nukleokapsid (N)-protein som bildar en helikal nukleokapsid med nukleinsyran. Viruset omges också av ett yttre hölje av envelope (E)-protein med klubbliknande utskott av spike(S)-protein. I virusets hölje återfinns också membran (M)-protein (figur 1). De strukturella proteinerna kodas av S-, E-, M- respektive N-gen i virusets genom. I genomet finns också två open
reading frames (ORF), ORF1a respektive ORF1b, som kodar för flera icke- strukturella protein (nsp1-16) deltagande i virusets replikation. I ORF1b kodas bland annat RNA depended RNA polymeras (RdPd/nsp12) som initierar replikation av viruset (5–6).
2
Figur 1. Struktur för SARS-CoV-2. Virusets genom består av enkelsträngat RNA som omges av nukleokapsid (N)-protein. Viruset omges av ett yttre hölje bestående
av envelope (E)-protein med utskott av spike (S)-protein. I höljet återfinns också membran (M)-protein. Källa:
https://www.stratech.co.uk/aat-bioquest/research-solutions-for-coronavirus-14/#1601910822595-fc5132f3-727f
Virulens
SARS-CoV-2 förmåga att orsaka sjukdom grundar sig till stor del på virusets adhesionsmolekyler. En receptorbindande domän finns i virusets S-protein och det är via denna som viruset binder in till receptorn angiotensin-converting enzyme 2 (ACE 2), som bland annat uttrycks i humant luftvägsepitel, och på så vis tar sig in i värdcellen. Efter inträde i värdcellen replikeras viruset varpå nya virus frigörs och kolonisering kan ske. Immunförsvarets respons till följd av koloniseringen leder till symtom i form av feber, muskelvärk och luftvägssymtom (7).
Diagnostik vid COVID-19
Snabb och tillförlitlig diagnostik av COVID-19 är av stor betydelse för att minska smittspridningen av viruset. Analys för detektion av SARS-Cov-2 sker idag som regel med realtids reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) för detektion av nukleinsyrasekvenser i virusets i S-, E-, N- och/eller RdRp-gen (8).
3 Provtagning
Flera olika provtagningslokaler kan användas vid misstanke om COVID-19 för
detektion av SARS-CoV-2 med realtids-RT-PCR. Nasofaraynxprov rekommenderas då provtagningen kan utföras av utbildad hälso- och sjukvårdspersonal. Vid
egenprovtagning rekommenderas i stället prov från näshåla kombinerat med svalg- och salivprov (9).
Förvaring av RNA
RNA är en instabil molekyl som snabbt bryts ned av ribonukleaser och kräver därför noggrann förvaring för att undvika degradering. Analys för detektion av SARS-CoV-2 RNA bör därför ske så snart som möjligt efter provtagning vid kylförvaring av prover. Vid förvaring i minus 20ºC är prov avsett för detektion av RNA hållbart upp till en månad. Förvaring under en längre tid bör ske i minst minus 70ºC (10).
RNA-extraktion
Innan detektion med PCR utförs måste nukleinsyran extraheras genom lysering och renframställning. Lysering av virus sker ofta med hjälp av enzym så att cellerna lyseras och nukleinsyran frigörs. För att renframställa nukleinsyran finns olika tillvägagångssätt för att binda den frigjorda nukleinsyran så att resterande komponenter kan tvättas bort och nukleinsyran slutligen elueras (10).
RT-PCR
Huvudprincipen för PCR är att en specifik nukleinsyrasekvens (målsekvens) amplifieras till detekterbara nivåer genom användning av specifika primers. Primers består av korta enkelsträngade DNA-fragment som är komplementära till en specifik del av den
nukleinsyrasekvens i virusets genom som ska detekteras. Primers blandas med polymeras-enzym och fria deoxynukleotider (dNTPs) i en reaktionsmix som tillsätts extraherat DNA. Vidare denatureras DNA genom upphettning i 95ºC och då
temperaturen sänks till mellan 50–70 ºC kan en primer binda in till vardera sträng om målsekvensen finns närvarande. Om en primer bundit in initieras syntetisering av målsekvensen så att nya dNTPs adderas med hjälp av polymeras vid en temperatur på 72ºC och två nya DNA-strängar bildas. Genom upprepade temperaturväxlingar initieras
4
syntetisering om och om igen, med en fördubbling av antalet målsekvenser efter varje cykel. Då den eftersökta nukleinsyrasekvensen består av RNA används RT-PCR för att dubbelsträngat DNA ska bildas innan själva amplifieringen med PCR. Enzymet omvänt transkriptas tillsätts extraherat RNA tillsammans med gen-specifika primers och fria nukleotider. Primers hybridiserar till RNA så att syntetiseringen av en ny sträng initieras. Nya nukleotider adderas sedan med hjälp av omvänt transkriptas vid en temperatur på cirka 50 ºC så att dubbelsträngat DNA bildas (10).
Realtids-PCR
Vid realtids-PCR detekteras antalet kopior av målsekvensen i realtid efter varje cykel vid PCR. Detta sker exempelvis med hjälp av hydrolys- eller hybridiseringsprober som är märkta med flourescerande ämnen, exempelvis fluorescein. Gemensamt för de olika typerna av prober är att de hybridiserar till målsekvensen och fluorescens avges vars intensitet blir proportionell mot mängden kopior. Fluorescensen detekteras i realtids-PCR-instrumentet och sätts sedan som funktion av antalet cykler. För att avgöra om den eftersökta sekvensen är närvarande eller inte måste fluorescensen överstiga ett visst värde, benämnt tröskelvärde. Även ett cykeltröskel (Ct)-värde erhålls som anger vid vilken cykel fluorescensen överstigit tröskelvärdet. Ett lågt Ct-värde innebär därmed att det ursprungligen funnits mer templat och även mer virus i provet från början än vid ett högre Ct-värde. Om ingen fluorescens erhålls eller inte uppnår tröskelvärdet anses målsekvensen inte finnas närvarande i provet och därmed inte heller viruset (10).
Varianter av särskild betydelse (VOC)
SARS-CoV-2 uppvisar en hög förändringshastighet genom mutationer i form av enbaspolymorfism (11). Under dess globala spridning har flera olika genetiska grupper av viruset identifierats utifrån dess genetiska variation (12). Sedan december 2020 har varianter med betydande genetiska förändringar upptäckts, gemensamt benämnt varianter av särskilt betydelse (VOC). Spridningen av VOC är särskilt intressant att övervaka då de genetiska grupperna har rapporterats vara mer spridningsbenägna samt kopplats till reinfektioner och vaccingenombrott. Just nu är det tre VOC som bevakas av Folkhälsomyndigheten (FHM); B.1.1.7 klassificering), B.1.351 (Pangolin-klassificering) respektive P.1(B.1.1.28.1 enligt Pangolin-(Pangolin-klassificering) (13).
5 B.1.1.7
B.1.1.7 har flera karaktäristiska mutationer i S-genen, varav en återfinns i position 501 där adenin ersatts av tymin. Mutationen leder till en aminsosyrasubstitution där tyrosin (Y) kodas i stället för asparagin (N) och benämns N501Y. N501Y påverkar strukturen för den receptorbindande domänen i S-proteinet så att inträde i värdceller underlättas. Till följd av mutationen har varianten associerats med ökad smittsamhet. Varianten har också en deletion i position 69–70 (del69-70) i S-genen som påverkar S-proteinets struktur. B.1.1.7 upptäcktes först i Storbritannien och har sedan dess haft stor spridning globalt. I Sverige rapporterades det första fallet i början av januari 2021 och i den senaste statistiken från FHM i början av april utgjorde varianten upp till 100% av samtliga fall av SARS-CoV-2 i de olika regionerna. Totalt hade då drygt 15 000 fall av B.1.1.7 bekräftats i Sverige (14–16).
B.1.351
B.1.351 uppvisar likt B.1.1.7 mutationen N501Y och associeras också med ökad smittsamhet. Varianten uppvisar även mutationen E484K där guanin ersatts av adenin i position 484 och därav kodas lysin i stället för glutaminsyra. Till följd av den senare mutationen har det rapporterats att varianten uppvisar viss resistens mot neutraliserande antikroppar bildade till följd av naturlig infektion eller vaccinering. Varianten misstänks därmed kunna leda till reinfektioner och vaccingenombrott. B.1.351 upptäcktes först i Sydafrika och i Sverige rapporterades det första fallet i början av januari 2021. I den senaste statistiken från FHM i början av april utgjorde den upp till 14% av alla fall i vissa regioner och det totala antalet bekräftade fall var då drygt 600 (14–18).
P.1
P.1 uppvisar likt B.1.1.7 och B.1.351 också mutationen N501Y och har även mutationen E484K gemensamt med B.1.351. Även P.1 associeras med ökad
smittsamhet och misstänks också kunna leda till reinfektioner och vaccingenombrott till följd av viss resistens mot neutraliserande antikroppar. P.1. upptäcktes först i Brasilien och det första fallet i Sverige i början av februari 2021. I den senaste statistiken från FHM i början av april hade P.1 låg spridning i Sverige och det totala antalet bekräftade fall var då 35 (14–16, 19).
6
Detektion av VOC
För att med säkerhet identifiera VOC krävs fullständig eller delvis sekvensering av SARS-CoV-2 genomet för att bestämma nukleotidernas ordning. Detta är i sig en dyr och tidskrävande metod och utförs endast på en liten andel av alla SARS-CoV-2 genom som detekteras. Ett snabbare, enklare och billigare alternativ till sekvensering i den epidemiologiska övervakningen av VOC är typnings-PCR. Typnings-PCR används för att avgöra om en specifik mutation finns närvarande eller inte och ger på så vis
information om genotypen för ett SARS-CoV-2 genom och därav även möjlighet att identifiera misstänkta varianter (13,20).
Typnings-PCR
Vid typnings-PCR amplifieras områden runt en eller flera mutationer med hjälp av mutationsspecifika primers. Efter amplifieringen utförs smältkurvsanalys för att skilja på olika amplikon. Smältkurvssanalys bygger på att det krävs olika temperatur för att dubbelsträngat DNA skall denatureras beroende av sammansättning av nukleinsyran och sekvenslängd. Genom märkning av den amplifierade sekvensen med exempelvis Simpleprober kan kontinuerlig mätning av fluorescensen utföras då temperaturen gradvis ökas. Principen för Simpleprober är att de endast avger fluorescens vid hybridisering till målsekvensen och på så vis kommer fluorescensen att avta när DNA denatureras genom ökande temperatur. Fluorescensen sätts som funktion av temperaturen och den temperatur som erhålls då fluorescensen halverats för en viss sekvens definieras som dess smältpunkt (Tm). Ofta beräknas den negativa derivatan av fluorescensen för att förtydliga data, där en topp i diagrammet motsvarar sekvensens smältpunkt. Tm ger ett mått på hur komplementärt proben binder målsekvensen vilket innebär att ju mer skillnad som föreligger i nukleotidsekvensen desto lägre blir
smältpunkten. På så vis erhålls toppar vid olika smältpunkter beroende på om en mutation finns närvarande eller inte (figur 2) (10).
7
Figur 2. Exempel av smältkurva vid detektion av enbaspolymorfism. Negativa derivatan (-d/dT) av fluorescensen ses som funktion av temperaturen vid användning
av mutationsspecifika prober. I figuren ses två skilda toppar som identifierar
smältpunkten för två olika sekvenser. Toppen vid den högre temperaturen indikerar närvaro av mutationen och den vid lägre temperatur vildtyp. Källa:
https://www.tib-molbiol.de/covid-19
Förekomst av VOC i Region Dalarna
Den tidigaste statistiken från FHM om förekomsten av VOC i Region Dalarna är från februari 2021 och förekomsten av VOC innan dess är fortfarande okänd (15). I Region Dalarna har graden av detektion av VOC varierat mellan olika analyskategorier. Analysering av prover vid misstanke om COVID-19 delas in i de olika kategorierna patienter, vårdpersonal, smittspårning och allmänhet. Prover från allmänheten har genotypats i mycket högre uträckning än resterande kategorier för detektion av VOC och befintlig statistik grundar sig nästan enbart på förekomsten bland allmänheten. Prover från allmänheten finns idag inte kvar medan prover från resterande
analyskategorier sparats i biobank (personlig kommunikation Karin Elfving, Molekylärbiolog, Klinisk Mikrobiologi Laboratoriemedicin Dalarna 2021-03-15).
8
Syfte
Syftet med denna studie är att med typnings-PCR undersöka förekomsten av SARS-CoV-2 varianter av särskild betydelse i prover tagna från patienter, vårdpersonal och smittspårningar under december 2020-januari 2021 i Region Dalarna. Studien syftar också till att undersöka när spridningen av respektive VOC kan ha startat i regionen.
9
MATERIAL OCH METOD
Provmaterial
Provmaterialet utgjordes av överblivet provmaterial ursprungligen avsett för detektion av SARS-CoV-2 med realtids-RT-PCR vid Klinisk Mikrobiologi, Laboratoriemedicin, Dalarna. Proverna var erhållna via kombinerat nasofarnyx- och svalgprov med Dryswab Purflock (Medical Wire & Equipment, Wales, England) eller ESwab (Copan Diagnstics, California, USA) med förvaring i sterilt rör innehållande 1ml fysiologiskt koksalt. Proverna hade sedan ursprunglig analys förvarats frysta i minus 20ºC under cirka två till tre månader.
Urval
Samtliga prover som varit positiva för SARS-CoV-2 vid den ursprungliga analysen för detektion av SARS-CoV-2 inom analyskategorierna patienter, vårdpersonal och
smittspårning under vecka 51–53 i december 2020 samt vecka 1–4 i januari 2021 inkluderades (n=1031). Den ursprungliga analysen utgjordes av en in house-metod med realtids-RT-PCR för detektion av RdRp-genen, uppsatt enligt publikation från Corman et al. (21) med modifierade primers från FHM. Prover med erhållet Ct-värde> 32 vid den ursprungliga analysen exkluderades från studien. Gränsen för exkluderande
avseende Ct-värde >32 sattes utifrån att cirka 200 prover analyserats med typnings-PCR för att undersöka vid vilka Ct-värden resultat kunde erhållas. Gränsen sattes därefter för att så många prover som möjligt skulle inkluderas, men utesluta prover med otillräcklig koncentration av RNA för detektion med den aktuella metoden.
Ytterligare exkluderades prover så att endast ett prov från respektive individ förekom i sammanställningen. Kriterier för exkluderande av prov från samma individ var att proven alltid skulle uppvisa samma genotyp. I de fall där det ena av proven från samma individ inte kunde bedömas eller hade ett ursprungligt Ct-värde >32 exkluderades alltid detta. Om samtliga prov från samma individ inte kunde bedömas till följd av låg SARS-CoV-2 RNA koncentration eller hade ett ursprungligt Ct-värde> 32 exkluderades alltid det prov som tagits senast under den aktuella tidsperioden.
10
RNA-extraktion
Prover tinades i samband med analys till 2–8 ºC. För avdödning och lysering av provmaterial blandades identiska volymer av prov och MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation (Roche Diagnostics Scandinavia AB, Solna, Sverige) till en volym på 200 µl. Den totala volymen på 200 µl användes vid lysering och renframställning med MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small volume kit enligt instruktioner från
tillverkaren i MagNA Pure 96 (Roche Diagnostics Scandinavia AB, Solna, Sverige) enligt protokoll Pathogen Universal 200 till en slutlig elueringsvolym på 50µl.
Typnings-PCR
För detektion av VOC användes VirSNiP SARS del69,70 + 484K + 501Y-kit
(TIB MolBiol, Berlin, Tyskland) innehållande primers och prober specifika för de tre mutationerna del69-70, E484K och N501Y. Reaktionsmix för RT-PCR och
smältkurvsanalys bereddes enligt instruktioner från kittet (bilaga 1) med Multiplex RNA Virus Master (LightCycler®, Roche Diagnostics Scandinavia AB, Solna, Sverige). Lika delar eluat och reaktionsmix användes i en totalvolym på 20µl vid RT-PCR (tabell 1) och smältkurvsanalys (tabell 2) i LightCycler® 480 II (Roche
Diagnostics Scandinavia AB, Solna, Sverige) i program enligt kittets instruktion. Bedömning av genotyp och trolig stam gjordes utifrån provernas smältpunkter (tabell 3), också enligt kittets instruktion.
Tabell 1. Cykelprogram för RT-PCR vid användning av VirSNiP SARS del69,70 + 484K + 501Y-kit (TIB MolBiol, Berlin, Tyskland).
RT PCR
Antal cykler 1 1 45 1
Temperatur (°C) 55 95 95 60 72 40 Tid (min:s) 05:00 05:00 00:05 00:15 00:15 00:30 Hastighet (°C/s) 4.4 4.4 4.4 2.2 4.4 1.5
11
Tabell 2. Cykelprogram för smältkurvsanalys vid användning av VirSNiP SARS del69,70 + 484K + 501Y-kit (TIB MolBiol, Berlin, Tyskland).
Smältkurvsanalys Antal cykler 1 - Temperatur (°C) 95 40 75 40 Tid (min:s) 00:30 02:00 00:00 00:30 Hastighet (°C/s) 4.4 1.5 0.19 1.5
Tabell 3. Tolkning av genotyp för SARS-CoV-2 utifrån erhållna smältpunkter vid typnings-PCR för detektion av mutationerna del69-70, 484K och 501Y. Referensstam anger trolig stam för respektive genotyp.
Smältpunkt °C Genotyp Referensstam 48–50 54–56 57–59 63–65 67–69
+ + 484E + 501N Vildtyp + + + del69-70 + 484E + 501Y B.1.1.7
+ + 484K + 501Y B.1.351 eller P.1
+ anger att en smältpunkt finns närvarande vid den aktuell temperaturen.
Kvalitetskontroller
Vid varje analystillfälle användes en positiv och negativ extraktionskontroll bestående av en känd SARS-CoV-2 vildtyp (N501N, E484E) respektive natriumklorid. Ytterligare användes en positiv amplifieringskontroll medföljande VirSNiP SARS del69,70 + 484K + 501Y-kitet (TIB MolBiol, Berlin, Tyskland) vid varje analystillfälle med typnings-PCR. Erhållet resultat ansågs endast giltigt om negativ kontroll inte visade någon signal och positiva kontroller uppvisade korrekt genotyp.
12
Statistisk bearbetning
Antal och andel av respektive VOC för respektive vecka under tidsperioden
sammanställdes utifrån provdagningsdatum i Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Washington, USA) för framställning av beskrivande statistik i tabeller och diagram. Det totala antalet fall av SARS-CoV-2 i Region Dalarna för respektive vecka under tidsperioden inhämtades från Folkhälsomyndigheten för att kunna beräkna andelen genotypade prover för respektive vecka.
Etiska överväganden
Prover avidentifierades så att de inte kunde härledas till en specifik person. Det överblivna provmaterialet analyserades även med samma syfte som ursprungligen avsett, det vill säga detektion av SARS-CoV-2. Detektion av VOC med sekvensering är en analys som också i viss utsträckning utförs normalt på SARS CoV-2 positiva prover och den använda metoden kan likställas med ordinarie uppföljande diagnostik. Studien har godkänts av klinik- och verksamhetschef på Laboratoriemedicin Dalarna.
13
RESULTAT
Urval och bortfall
Av det totala antalet SARS-CoV-2 positiva prover inom de tre analyskategorierna under tidsperioden exkluderades 19 prover så att endast ett prov från respektive individ
inkluderades (n=1012). Antalet prover inom analyskategorierna varierade stort för de olika veckorna under tidsperioden, det högsta antalet prover återfanns vecka 51 för att sedan sjunka de följande veckorna, bortsett från en liten ökning vecka 2 (figur 3a). Ytterligare 121 prover med ursprungligt Ct-värde >32 exkluderades samt två prover där inget provmaterial fanns att tillgå. Vidare hade 27 prov skickats till FHM för
helgenomsekvensering och kunde därför inte inkluderas i studien. Av resterande prover kunde inte genotyp fastställas för 112 prover till följd av låga koncentration av SARS-CoV-2 RNA. Totalt kunde genotyp fastställas för 750 prov (74%) av samtliga 1012 SARS CoV-2 positiva prover. Andelen prover som genotypats för respektive vecka utgjorde mellan 59–81% av samtliga prover inom analyskategorierna, med lägst andel vecka 3 och högst andel vecka 52 (figur 3b).
Figur 3a: Det totala antalet SARS-CoV-2 positiva prover inom analyskategorierna patienter, personal och smittspårningar i Region Dalarna för vecka 51–53, december 2020, och vecka 1–4, januari 2021, då endast ett prov från respektive individ
inkluderats. Figur 3b: Andel och antal genotypade prover för detektion av SARS-CoV-2 varianter av särskild betydelse för respektive vecka i förhållande till andelen
exkluderade och ej bedömbara prover för samma prover och tidsperiod som figur 3a.
274 204 184 110 128 69 43 0 50 100 150 200 250 300 51 52 53 1 2 3 4 A nt al (n= 1012) Vecka 2020/2021 206 165 145 79 82 41 32 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 51 52 53 1 2 3 4 A nde l Vecka 2020/2021
Exkluderade Ej bedömbar Genotypade
14
Andelen prov som genotypats utgjorde mellan 8–18% av samtliga fall av SARS-CoV-2 i Region Dalarna, inklusive allmänhet, för de olika veckorna under tidsperioden (tabell 4).
Tabell 4. Andel prov som genotypats av samtliga fall av SARS-CoV-2 i Region Dalarna för respektive vecka under december 2020-januri 2021.
Vecka 51 52 53 1 2 3 4 Andel genotypade
prover (%)1 18 17 15 11 13 8 9 1Avrundad till heltal
Förekomst av VOC
Utifrån genotyp kunde sammanlagt 39 misstänkta fall av B.1.1.7 (först upptäckt i
Storbritannien) detekteras inom analyskategorierna. Det tidigaste fallet detekterades i ett prov taget vecka 52, december 2020. Ytterligare fall av misstänkta B.1.1.7 kunde
detekteras under de följande veckorna, ett fall vecka 53, tre fall vecka 1, 14 fall vecka 2, 8 fall vecka 3 och 12 fall vecka 4 (tabell 5). En stigande andel av B.1.1.7 påvisades under tidsperioden inom analyskategorierna (figur 4). Andelen var 1% vecka 52 och vecka 53 för att sedan öka till 4% vecka 1 och 17% vecka 2. Vecka 3 avstannade
ökningen något och andelen var då 20%, för att slutligen öka till 38% vecka 4 (tabell 5). Även fem misstänka fall av B.1.351 (först upptäckt i Sydafrika) och/eller P.1 (först upptäckt i Brasilien) kunde detekteras inom analyskategorierna. Det tidigaste fallet detekterades i ett prov taget vecka 1, januari 2021. Ytterligare ett fall detekterades vecka 2 och tre fall vecka 4 (tabell 5). För B.1.351 och/eller P.1 påvisades också en stigande andel under tidperioden (figur 4). Vecka 1 och vecka 2 var andelen 1%, för att sedan stiga till 9% vecka 4. Vecka 3 hittades inga fall av misstänkta B.1.351 eller P.1 (tabell 5). Då B.1.351 och P.1 inte kunnat särskiljas med den använda metoden går det dock inte att fastställa om båda varianterna varit förekommande eller inte.
15
Tabell 5. Antal och andel misstänka fall av B.1.1.7 respektive B.1.351 och/eller P.1 utifrån genotyp i SARS-CoV-2 positiva prover inom analyskategorierna patienter, vårdpersonal och smittspårningar i Region Dalarna tagna vecka 51-4 (december
2020/januari 2021). Andelen genotypade prov anges som andel av samtliga prover inom analyskategoriera för respektive vecka.
Vecka Andel genotypade prov (%)1 Antal B.1.1.7 B.1.1.7 Andel (%)1 Antal B.1.351 /P.1 Andel B.1.351/P.1 (%)1 51 75 - - - - 52 81 1 1 - - 53 79 1 1 - - 1 72 3 4 1 1 2 64 14 17 1 1 3 59 8 20 - - 4 74 12 38 3 9
1 Avrundad till heltal
Figur 4. Andel misstänkta fall av B.1.1.7 respektive B.1.351 och/eller P.1 i SARS-CoV-2 positiva prov i Region Dalarna inom analyskategorierna patienter, vårdpersonal samt smittspårningar för vecka 53-4 (december 2020/januari 2021). Andelen prover som genotypats av samtliga prover inom analyskategorierna för respektive vecka varierar mellan 59–81%. B.1.1.7: misstänka B.1.1.7 utifrån genotyp. B.1.351/P.1: misstänka B.1.351 eller P.1 utifrån genotyp. Övriga: vildtyp och övriga genotyper som inte identifierats som B.1.1.7, B.1.351 eller P.1
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 51 52 53 1 2 3 4 An de l Vecka 2020/2021 Övriga B.1.351/P.1 B.1.1.7
16
DISKUSSION
Syftet med denna studie var att undersöka förekomst av VOC i prover tagna inom analyskategorierna patienter, vårdpersonal och smittspårningar i Region Dalarna under december 2020-januari 2021.Studien syftade också till att undersöka när spridningen av respektive VOC kan ha startat i regionen. Både misstänkta fall av B.1.1.7 och andra möjliga VOC (B.1.351 och/eller P.1) kunde detekteras under tidsperioden. Då det första fallet av P.1 i Sverige detekterades i februari 2021 och varianten också i nuläget har låg spridning är det mest troligt att det är just B.1.351 som detekterats och inte P.1. För att säkerställa att det är just B.1.351 som detekterats hade dock sekvensering av genomen behövt utföras (20).
Vecka 51 detekterades inga VOC vilket tyder på att spridningen av dessa inte startat vid tidpunkten. Enstaka fall av B.1.1.7 detekterades vecka 52, 53 och 1 vilket kan tyda på att spridning av B.1.1.7 startat, men fallen kan också vara kopplade till inresa från andra länder eller regioner. Följande veckor detekterades dock en stigande andel av B.1.1.7 vilket tyder på en regional spridning. Vecka 3 påvisades en liten ökning av andelen av B.1.1.7 från vecka 2, jämfört med den ökning som påvisades mellan övriga veckor i januari. Då vecka 3 var den vecka med högst bortfall och exkluderade prover i
kombination med ett lågt antal prover är andelen av B.1.1.7 dock troligen något högre än vad som kunnat detekterats. Att en regional spridning av B.1.1.7 kan ha startat i januari bekräftas av befintlig statistik från FHM om förekomsten av VOC i Region Dalarna för vecka 5–6, februari 2021, då andelen B.1.1.7 var 18%. Den befintliga statistiken visar också att andelen av B.1.1.7 fortsatt att stiga följande veckor i regionen (15).
Endast ett fåtal fall av B.1.351 och/eller P.1 detekterades under tidsperioden, även om en ökad andel av dessa påvisades inom analyskategorierna i slutet av januari. Då endast enstaka fall detekterades skulle dessa kunna vara kopplade till inresa från andra länder eller regioner och behöver inte tyda på att det finns en regional spridning. I befintlig statistik från FHM för vecka 5–6, 2020, hade 13 fall av B.1.351 och/eller P.1 detekterats i regionen och andelen var då 6%. Vecka 7 minskade andelen till 4% för att sedan öka till 15% vecka 8 och 20% vecka 9 (15). Andelen var därmed fortsatt låg följande två veckor, vilket styrker att en regional spridning av dessa ännu inte startat i januari.
17
Då den använda metoden endast kan detektera de specifika mutationerna del69-70, E484K och N501Y kan det inte uteslutas att andra SARS-CoV-2 varianter med samma mutationer detekterats i stället för B.1.1.7, B.1.351 eller P.1. Mutationer som detekteras vid typnings-PCR bör vara unika för de varianter som ska detekteras och regelbundet ses över och anpassas utefter vilka andra varianter som cirkulerar, så att dessa inte felaktigt detekteras istället (20). I nuläget har mutationen N501Y endast upptäckts hos ett fåtal andra genetiska grupper som inte är VOC och kan anses relativt specifika för just B.1.1.7, B.1.351 och P.1. Del69-70 och E484K återfinns också i relativ lite utsträckning bland andra genetiska grupper (22). Sannolikheten att andra varianter skulle ha samma kombination av mutationer och detekterats i stället är därmed liten. För att säkerställa att inga andra genetiska grupper detekterats borde dock åtminstone en andel av alla VOC som detekterats i denna studie verifierats med sekvensering (23). Ytterligare mutationer i anslutning till de detekterade mutationerna kan också leda till att detektion uteblir till följd av sämre bindning mellan prober och målsekvens. Sensitivitet och specificitet för den valda metoden avgörs därför till stor del av vilka andra varianter som cirkulerar och nya framträdande mutationer hos redan kända VOC. Även om typnings-PCR är en snabb och billig metod kan den därför inte ersätta
sekvensering som krävs för att identifiera nya varianter och mutationer (24). Typnings-PCR är däremot användningsbart, förutom i den epidemiologiska övervakningen, i den kliniska verksamheten som en första screening av varianter för att ge vägledning i vilka genom ska sekvenseras (25–26).
I slutet av januari har även fall av B.1.1.7 som uppvisar mutationen E484K upptäcks i Storbritannien (27). Denna variant har därmed också risk att uppvisa viss resistens mot neutraliserande antikroppar och leda till reinfektioner och vaccingenombrott och bevakas nu särskilt av Folkhälsomyndigheten (13). Inget sådant fall detekterades dock bland de prover som inkluderats i denna studie.
En begränsning vid bedömning av andel och spridningsstart av respektive VOC är att prov nödvändigtvis inte är taget vid symtomdebut. Då resultatet är indelat efter provtagningsdatum behöver de detekterade fallen av VOC därmed inte tillhöra den aktuella veckan, men med största sannolikhet i nära anslutning och påverkan på resultat borde därmed vara liten. Ytterligare en begränsning är att de prov som skickats till Folkhälsomyndigheten för helgenomsekvensering i stor utsträckning skickats vid
18
misstanke om att de är varianter av särskild betydelse (personlig kommunikation Karin Elfving, Molekylärbiolog, Klinisk Mikrobiologi Laboratoriemedicin Dalarna 2021-03-15). Andelen av VOC i dessa prover är därmed troligen något högre än för övriga exkluderade prover, vilket troligen påverkat resultatet i viss utsträckning.
För en andel av de inkluderade proverna kunde inte genotyp fastställas till följd av låga koncentrationer av SARS-CoV-2 RNA. Innan studien utfördes upprepades den
ursprungliga analysen med realtids-RT-PCR för detektion av SARS-CoV-2 för några av de inkluderade proverna, för att undersöka om Ct-värden hade förändrats efter en längre tids förvaring i minus 20ºC. Upprepningen av den ursprungliga analysen visade att Ct-värdet hade ökat avsevärt för samtliga prover. Högre Ct-värden tyder på att
koncentration av RNA minskat och orsaken till detta är troligen degradering av RNA till följd av att proverna förvarats i minus 20ºC under en längre tid.
Gränsen för exkluderande avseende ursprungligt Ct-värde sattes utefter den analys som utfördes för att undersöka vid vilka Ct-värden resultat kunde erhållas för de inkluderade proverna, då detektionsgränsen för VirSNiP SARS del69,70 + 484K + 501Y-kittet ännu inte fastställts. Den analytiska sensitiviteten för en PCR-metod avgörs av dess
detektionsgräns, alltså det minsta koncentrationen av nukleinsyra som krävs för att detektion skall kunna ske med den aktuella metoden (28). En validering för att undersöka vid vilka Ct-värden detektion kan ske med den aktuella metoden skulle fördelaktigt kunna utföras och vara av värde för framtida användning av metoden i den kliniska verksamheten.
Då ingen tidigare statistik om förekomsten av VOC finns under denna tidsperiod ger denna studie viktig information om hur spridningen av VOC sett ut i Region Dalarna. Viktig att komma ihåg är att prover från allmänheten inte inkluderats i denna studie och endast en liten andel av samtliga fall av SARS-CoV-2 i regionen under tidsperioden genotypats. Förekomsten av VOC i regionen kan därmed se annorlunda ut och även spridningsstarten. För att klarlägga detta hade förekomsten av VOC i en större andel prover från tidsperioden behövt undersökas. Ur ett epidemiologiska perspektiv skulle det även vara av värde att undersöka spridningsstarten av respektive VOC även i andra regioner och länder för att förstå hur spridningen av dessa sett. Kännedom om detta kan vara av betydelse vid diagnostik och framtida studier av SARS-CoV-2 och COVID-19.
19
Slutsats
Resultatet visar att B.1.1.7 varit förekommande redan i slutet av december 2020 och att andelen fall av B.1.1.7 inom analyskategorierna ökat under januari. En regional
spridning av B.1.1.7 i Region Dalarna kan ha därmed ha startat i januari 2021. Endast ett fåtal fall av B.1.351 och/eller P.1 detekterades inom analyskategorierna, samtliga fall i prover från januari, vilket tyder på att en regional spridning av dessa ännu inte startat i januari. Sannolikt är det B.1.351 som detekterats, men verifiering med sekvensering krävs för att bekräftat detta. Resultatet i denna studie överensstämmer också med vad som framkommit i tidigare statistik från Folkhälsomyndigheten om spridningen av VOC i februari 2021 i Region Dalarna.
20
REFERENSER
1. Zhu N, Zhang D, Wang W, Li X, Yang B, Song J, et al. A novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 2020; 382:727– 733.
2. World Helath Organization (WHO). Naming the coronavirus disease (COVID-19) and the virus that causes it [Internet]. Geneva: WHO; 2020 [citerad 2021-03-16]. Hämtad från: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-
2019/technical-guidance/naming-the-coronavirus-disease-(covid-2019)-and-the-virus-that-causes-it#:~:text=The%20International
3. Hu B, Gau H, Zhou P, Shi ZL. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbil. 2021; 19:141–154.
4. World Helath Organization (WHO). WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard [Internet]. Geneva: WHO; 2021 [uppdaterad 2021-05-08; citerad 2021-05-09. Hämtad från: https://covid19.who.int/
5. Kirtipal N, Bharadwaj S, Gu Kang, S. From SARS to SARS-CoV-2, insights on structure, pathogebecity and immunity aspects of pandemic human
coronaviruses. Infect genet Evol. 2020; 85: 104502.
6. Rastogi M, Pandey N, Shukla A, Singh SK. SARS coronavirus 2: from genome to infectome. I Respir Res. 2020; 21: 318.
7. Cevik M, Kuppalli K, Kindrachuk J, Peiris M. Virology, transmission, and pathogenesis of SARS-CoV-2. BMJ. 2020; 371:m3862.
21
8. Folkhälsomyndigheten. Användning av PCR för påvisning av pågående covid-19, en teknisk vägledning [Internet]. Solna/Östersund: Folkhälsomyndigheten; 2020 [citerad 21-03-23]. Hämtad från:
https://www.folkhalsomyndigheten.se/contentassets/b2c3b5f226ac45d0926cf35
1ea15b0dc/anvandning-pcr-pavisning-pagaende-covid-19.pdf
9. Folkhälsomyndigheten. Provtagning vid PCR-påvisning av SARS-CoV-2 i de övre luftvägarna [Internet]. Solna/Östersund: Folkhälsomyndigheten; 2020 [citerad 21-03-23]. Hämtad från:
https://www.folkhalsomyndigheten.se/contentassets/370e0816bc0a4f179613d6e
f74e903d9/provtagning-pcr-pavisning-sars-cov-2-luftvagarna.pdf
10. Buckingham L. Molecular Diagnostics: Fundamentals, Methods, and Clinical Applications. 3 rev. uppl. Philidelphia; FA Davis Company: 2019.
11. Vanakardi N. Overwhelming mutations or SNPs of SARS-CoV-2: A point of caution. Gene. 2020; 752: 144792.
12. Folkhälsomyndigheten. Helgenomsekvensering av svenska SARS-CoV-2 som orsakar covid-19, del 3 [Internet]. Solna: Folkhälsomyndigheten; 2020. [citerad 2021-04-29]. Hämtad från:
https://www.folkhalsomyndigheten.se/contentassets/088dbf03a535495ba9df441 577eea7ec/helgenomsekvensering-svenska-sars-cov-2-orsakar-covid-19-del-3.pdf
13. Folkhälsomyndigheten. Övervakning av SARS.CoV-2 virusvarianter av särskild betydelse. [Internet]. Solna: Folkhälsomyndigheten; 2021 [uppdaterad 2021-04-19, citerad 2021-04-27]. Hämtad från:
https://www.folkhalsomyndigheten.se/smittskydd-beredskap/utbrott/aktuella-22
utbrott/covid-19/statistik-och-analyser/sars-cov-2-virusvarianter-av-sarskild-betydelse/sars-cov-2-virusvarianter-av-sarskild-betydelse/
14. Gallway, SE, Paul P, MacCannell DR, Johansson MA, Brooks JT, MacNeil A. Emergence of SARS-CoV-2 B.1.1.7 Lineage — United States, December 29, 2020–January 12, 2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2021; 70: 95–99. 15. Folkhälsomyndigheten. Vecka 13: Statistik om SARS-CoV-2 virusvarianter av
särskild betydelse [Internet]. Stockholm: Folkhälsomyndigheten; 2021[uppdaterad 2021-04-23; citerad 2021-04-23] Hämtad från:
https://www.folkhalsomyndigheten.se/smittskydd-beredskap/utbrott/aktuella- utbrott/covid-19/statistik-och-analyser/sars-cov-2-virusvarianter-av-sarskild-betydelse/tidigare-statistik/vecka-13/
16. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Science Breif: Emerging SARS-CoV-2 Variants [Internet]. Atlanta: U.S Department of Health & Human Services; 2021[uppdaterad 2021-01-28, citerad 2021-03-27]. Hämtad från:
https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/science/science-briefs/scientific-brief-emerging-variants.html
17. Zhou D, Dejnirattisai W, Supasa P, Liu C, Mentzer AJ, Ginn HM. Evidence of escape of SARS-CoV.2 variant B.1.351 from natural and vaccine induced sera. Cell. 2021; 184:2348-2361.
18. Planas D, Bruel T, Grzelak L, Guivel-Benhassine F, Staropoli I, Porrot F, et al. Sensitivity of infectious SARS-CoV-2 B.1.1.7 and B.1.351 variants to
neutralizing antibodies. Nat Med. 2021; 27:917-924.
19. Wang P, Wanf M, Yu J, Cerutti G, Nair MS, et al. Increased Resistance of SARS-CoV-2 Variant P.1 to Antibody Neutralization. BioRxiv. 2021; 2021:433466.
23
20. European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC), Word Health Organization (WHO) Regional Office for Europe. Methods for the detection and identification of SARS-CoV-2 variants [Internet]. Stockholm/Köpenhamn; ECDC/WHO Regional Office for Europe: 2021. [citerad 2021-04-27]. Hämtad från:
https://www.ecdc.europa.eu/sites/default/files/documents/Methods-for-the-detection-and-identification-of-SARS-CoV-2-variants-WHO-ECDC.pdf
21. Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DKW, et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020; 25: 2000045.
22. Nextrain. Genomic epidemiology of novel coronavirus – Global subsampling [Internet]. 2021[uppdaterad 2021-04-27, citerad 2021-04-27]. Hämtad från:
https://nextstrain.org/ncov/global
23. European Centre for Disease Prevention (ECDC). SARS-CoV-2-increased circulation of variants of concern and vaccine rollout in the EU/EEA, 14th update
[Internet]. Stockholm; ECDC: 2021. [citerad 2021-05-04]. Hämtad från:
https://www.ecdc.europa.eu/sites/default/files/documents/RRA-covid-19-14th-update-15-feb-2021.pdf
24. Matic N, Lowe CF, Ritchie G, Stefanovic A, Lawson T, Jang W, et al. Rapid detection of SARS-CoV-2 Variants of Concern, Including B.1.1.28/P.1, in British Columbia, Canada. Emerg Infect Dis. 2021; 27: 210532.
25. Harper H. Detecting SARS-CoV-2 variants with SNP-genotyping. PLoS One. 2021;16: e0243185
24
26. European Centre for Disease Prevention (ECDC). Detection and characterization capability and capacity for SARS-CoV-2 variants within the EU/EEA [Internet]. DeStockholm; ECDC: 2021. [citerad 2021-05-05]. Hämtad från:
https://www.ecdc.europa.eu/sites/default/files/documents/Detection-and-characterisation-capability-for-SARS-CoV-2-variants-EU%20EEA.pdf
27. Public Health England. Ivestigation of novel SARS-CoV-2 variant: Variant of Concern 202012/01[Internet]. London: Public Health England; 2021. [citerad 2021-04-26]. Hämtad från:
https://assets.publishing.service.gov.uk/government/uploads/system/uploads/atta chment_data/file/959426/Variant_of_Concern_VOC_202012_01_Technical_Bri efing_5.pdf
28. Styrelsen för ackreditering och teknisk kontroll (SWEDAC).
Validering/verifiering av kvantitiva och kvalitativa metoder-Vägledning [Internet]. Borås: SWEDAC; 2011. [citerad 2021-05-05]. Hämtad från:
25
