Fibromyalgi i förhållande till oxidativ stress

FIBROMYALGI I FÖRHÅLLANDE

TILL OXIDATIV STRESS

EN KOPPLING TILL BIOMARKÖRER OCH

SMÄRTA

FARAH ATTA

Examensarbete Malmö högskola

Biomedicinsk laboratorievetenskap, 15hp Hälsa och samhälle Biomedicinska analytikerprogrammet 205 06 Malmö

1

FÖRORD

Jag vill tacka min familj för deras stöd under de tio veckor som jag har arbetat med mitt examensarbete. Ett stort tack riktar jag även till min handledare Lennart Ljunggren för vägledningen. Jag tackar även läkarteamet i Ängelholms

specialiserade smärtrehabilitering för hjälpen att få tillfället att informera fibromyalgipatienter. Ännu ett tack riktas till alla deltagare i studien och övrig personal i Malmö högskola hälsa och samhälle.

2

FIBROMYALGI I FÖRHÅLLANDE

TILL OXIDATIV STRESS

EN KOPPLING TILL BIOMARKÖRER OCH

SMÄRTA

FARAH ATTA

Atta, F. Fibromyalgi i förhållande till oxidativ stress. En koppling till biomarkörer och smärta. Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap, 15

högskolepoäng. Malmö högskola: Fakulteten för hälsa och samhälle, institutionen

för Biomedicinsk laboratorievetenskap, 2017.

Fibromyalgi (FM) är en kronisk sjukdom där hjärnans förmåga att hantera

smärtsignaler betraktas vara rubbad. Symtomen omfattar bl.a. smärta i minst 11 av 18 smärtpunkter och annan värk, ofunktionell sömn, stelhet, trötthet,

svaghetskänsla i musklerna, hjärtarytmi, ömhet och stickningskänsla i huden. Symptomen kan vara relaterade till musklerna, endokrina och immunologiska system. FM saknar diagnostiska markörer som kan analyseras och användas för diagnostik av den kroniska sjukdomen. Syftet med denna pilotstudie är att studera några biomarkörer i saliv som samlats i Salivette® från kvinnliga FM patienter, och relatera resultatet till den av patienten upplevda smärtan. Patienter och kontrollgrupp (KG) i studien (FM; n=7, 43±12 år och KG; n=6, 42±14 år) fick besvara frågor gällande bl.a. medicinering, smärta och infektion. Biomarkörer som kvantifierades var fritt cirkulerande mtDNA, urinsyra och IgA. Totalprotein analyserades för att normalisera IgA värdet. Elektrolytanalys utfördes för att granska salivprovets rimlighet. Resultaten visade att medelvärdena av nämnda biomarkörer är högre hos FM patienter än hos KG. Regressionen mellan IgA och urinsyra hos FM är svagt positiv. Det finns ingen korrelation mellan kvoten IgA/totalprotein och urinsyra hos FM. pH i saliv bland FM var lägre än hos KG. Medelvärdet av prov från dag ett och två hos FM i förhållande till den upplevda smärtan under den senaste veckan visar inga signifikanta samband relaterat till kvantifierade biomarkörer. För utveckling av denna studie och inom området krävs det en bättre standardisering av forskningsmetoderna, ett större antal deltagare och en utökad förståelse om sjukdomens variation hos patienter beroende på livsstil och anamnes.

Nyckelord: Biomarkörer, fibromyalgi, inflammatoriska markörer, mtDNA,

3

FIBROMYALGIA IN RELATION

TO OXIDATIVE STRESS

A CONNECTION TO BIOMARKERS AND PAIN

FARAH ATTA

Atta, F. Fibromyalgia in relation to oxidative stress. A connection to biomarkers and pain. Degree Project in Biomedical Science, 15 Credit Points. Malmö University: Faculty of Health and Society, Department of Biomedical Science, 2017.

Fibromyalgia (FM) is a chronic disease in which the brain's ability to manage pain signals are considered to be disturbed. Symptoms include pain in at least 11 of 18 tender points and other pain, non-functional sleep, stiffness, fatigue, weakness in the muscles, cardiac arrhythmia, tenderness and knitting feelings in the skin. The symptoms may be related to the muscles, endocrine and immune system. FM lack of diagnostic markers that can be analyzed and used for the diagnosis of the chronic disease. The purpose of this pilot study is to study some biomarkers in saliva collected with Salivette® by female FM patients, and relate the results to the perceived pain by the patient. Patients and control group (KG) in the study (FM; n = 7, 43±12 years KG; n = 6, 42±14 years) were asked to answer questions regarding e.g. medication, pain and infections. The quantified biomarkers are free circulating mtDNA, uric acid and IgA. Total protein was analyzed for the

normalization of the IgA value. Electrolyte analysis was performed to examine the plausibility of the sample. The results showed that the average values of the biomarkers is higher for FM patients than for KG. The regression between IgA and uric acid of the FM is slightly positive. There is no correlation between the ratio of IgA /total protein and uric acid of the FM. The saliva pH among FM was lower than in KG. The average of samples from day one and two of the FM in relation to the perceived pain during the last week show no significant

associations related to the quantified biomarkers. For the development of this study and in this area it is required a better standardization of research methods, a larger number of participants and an increased understanding of the disease variability in patients depending on lifestyle and medical history.

Keywords: Biomarkers, fibromyalgia, inflammatory markers, mtDNA, pain,

4

INNEHÅLLSFÖRTECKNING

MATERIAL OCH METOD 8

Etisk bedömning 8

Provtagning och provhantering 9

Kvantifiering av mtDNA 9 Kvantifiering av urinsyra 10 Elektrolyt analys 10 Kvantifiering av totalprotein 10 Kvantifiering av IgA 10 Statistisk bearbetning 11 RESULTAT 11 Kvantifiering av mtDNA 11 Kvantifiering av urinsyra 12 Elektrolyt analys 13

Totalprotein och IgA 13

DISKUSSION 14 Metoddiskussion 15 Resultatdiskussion 16 Framtida analyser 17 SLUTSATS 17 REFERENSER 18 BILAGOR 20

5

BAKGRUND

Fibromyalgi är en kronisk sjukdom som drabbar patienten på olika sätt och ger upphov till olika symtom. Syndromets besvär är av varierande grad, som även kan variera mellan olika perioder. Symtomen omfattar en utbredd smärta i muskler, så kallade tender points. Hos människan förekommer 18 sådana smärtpunkter som illustreras i figur 1. Diagnosen fibromyalgi föreligger efter minst tre månaders värk, varav minst 11 smärtpunkter ska upplevas av patienten. Förutom

smärtpunkter finns även annan värk som kan uppkomma i bl.a. slemhinnor, senfästen och fettpolster. Patienter med fibromyalgi upplever oftast sömnbesvär med bl.a. ofunktionell sömn, som på morgonen följs av stelhet och trötthet. Svaghetskänsla i musklerna, ömhet under fotsulorna, hjärtarytmi och

stickningskänsla i huden är andra vanliga symptom. Symptomen som uppkommer behöver inte vara relaterade till musklerna, den påverkande faktorn kan istället vara en endokrin och immunologisk påverkan. Hjärnans förmåga att hantera smärtsignaler betraktas vara rubbad [1].

Figur 1: Visar 18 smärtpunkter, sk. tender points. Bild tagen från Peverell Chiropractic Clinic,

Kelly K, (2015), Fibromyalgia Tender Points [2].

Vävnaden som omger kroppens olika sinnesceller modifierar, d.v.s. påverkar stimuli innan sinnescellerna mottagit stimulansen. De primära sinnescellerna, d.v.s. de specialiserade nervcellerna, kan leda nervimpulser till det centrala nervsystemet genom sinnesreceptorer och axoner (nervfibrer). Smärtsinnet

stimulerar det autonoma nervsystemet genom att bl.a. påverka hjärtfrekvensen [3]. Hos patienter med diagnosen fibromyalgi är de två vanligaste vägarna för smärta rubbade och fungerar inte på ett naturligt sätt, vilket leder till en central

förstärkning av smärtsignaler. Vid friska tillstånd bearbetas smärtan genom två nervbanor, ascending- och descending pathways (stigande- och nedåtgående vägar) [4]. Perifera nerver, d.v.s. nervtrådar som förmedlar signaler från och till det centrala nervsystemet (CNS, hjärna och ryggmärg) har förmågan att bl.a. överföra sensoriska signaler samt nociceptorer. Nociceptorer är smärtinducerande receptorer i sensoriska nervfibrer. Nervimpulser som framkallar den upplevda smärtan bildas i de sensoriska fibrernas fria nervändsslut. Nociceceptorer aktiveras vanligast indirekt till följd av frisatta kemiska produkter som t.ex. adenosintrifosfat (ATP). Förutom nociceptiv smärta som utlöses till följd av stimuli som aktiverat nociceptorer finns även neurogen smärta. Den neurogena smärtan utlöses på andra lokalisations områden i smärtbanorna än i de sensoriska fibrernas fria nervändsslut [3-4]. Kronisk stress har en ständig negativ påverkan

6

på cellerna som i sin tur leder till en ökad trötthetsupplevelse. Påverkan från den kroniska stressen kan noteras i de endokrina systemen hypotalamus, hypofysen och binjurebarken (hypothalamic-pitutitary-adrenal axis, HPA-axeln), men även i det autonoma nervsystemet som vid smärtstimulering. Hypotalamus har en viktig roll i att upprätthålla energi homeostasen i kroppen, vilket har ett samband till trötthet [5-6]. Trötthet är en naturlig konsekvens till fysisk- och mental ansträngning [7].

Inflammatoriska markörer

Hög inflammatorisk aktivitet kan vara en konsekvens av trötthet. Den kroniska tröttheten kan leda till oreglerade centrala- eller perifera cytokiner, som i sin tur kan medföra fysiska- samt neuropsykiska symptom som t.ex. nedstämdhet och sömnbesvär. Förklaringen till detta är signaleringen mellan immunsystemet och hjärnan som sker via neurala- cellulära- och humorala vägar [7]. De tidigare nämnda endokrina organen kopplade till HPA-axeln påverkar även

immunsystemet genom att leda till abnormiteter gällande immunologiska

mekanismer. Detta bidrar även till förändringar av den perifera cytokinnivån som triggar kroppens energibesparingssystem till följd av en negativ energibalans [5]. Immunoglobulin A (IgA) är en antikropp som ingår i kroppens första försvarslinje och skyddar kroppen från patogener som bl.a. sväljs eller andas in. IgA finns i två former, den dominerande formen som finns i serum (IgA1) och den andra formen som finns i sekretoriska vätskor som bland annat tårar och saliv (IgA2). En minskad nivå, eller helt frånvarade förekomst av IgA kan vara en kliniskt signifikant immunbrist [8-9]. IgA2 är en vanlig markör som används vid utredning av immunologiska förändringar som immunologisk aktivering. Vid akuta stressresponser sker vanligen en aktivering av bl.a. IgA i form av en

”korttids” immunförsvarsreaktion. I motsatts till den akuta responsen sker istället en minskning av IgA nivån samt skadlig hälsoeffekt vid kronisk stress. Detta beror på att vid akut stressrespons kommer det autonoma nervsystemet (ANS) aktiveras i samband med en ökad frisättning av glukokortikoider medan IgA lokalt frisätts med hjälp av det sympatiska nervsystemet SNS från spottkörtlar. Vid pågående glukokortikoid frisättning påverkas IgA-produktionen genom att bli långsammare. Detta sker genom en glukokortikoid-förmedlad minskning i IgA producerande B-lymfocyter. Dessutom kan en pågående stress leda till resistens för immuncellers glukokortikoidreceptorer. Resistensen påverkar i sin tur HPA-axeln genom att förhindra korrekt respons till immunsystemet [9].

Oxidativ stress

Oxidativ stress innebär en obalans mellan oxidanter (elektron accepterande molekyler i kemiska reaktioner) och nivån antioxidanter (elektronmottagare som förhindrar eller fördröjer oxidationsreaktioner) i kroppen. Oxidation kan ske på olika sätt, bl.a. genom separation av vätejoner eller elektroner, eller genom tillförsel av syrgasmolekyler. Oxidanter kan erhållas från den endogena andningskedjan i cellernas mitokondrier, enzymer och immunreaktioner [10]. Antioxidanter oxideras enklare än andra kemikalier som kan förekomma i oönskade reaktioner [11].

Till följd av oxidativ stress bildas fria radikaler som både har för- och nackdelar. Fördelen med fria radikaler är att de är ett skydd mot patogener, och reglerar immunsystemet vid inflammation. Nackdelen med ett överflöd av fria radikaler är dess negativa påverkan på de kroppsegna cellerna. De fria radikalerna är

7

bestående av oparade elektroner, vilket ökar den fria radikalens reaktivitet som i sin tur ökar cellens åldrande [11-12]. Detta är anledningen till att oxidativ stress relateras till flera kroniska sjukdomar, där de fria radikalernas långa livslängd och höga reaktivitet kan påverka cellerna intracellulärt samt extracellulärt.

Interaktioner med biomolekyler så som proteiner och nukleinsyror leder oftast till irreversibla skador [13].

Olika biologiska ämnen kan förorsaka oxidativ stress och ge upphov till olika sekundära produkter. Lipidoxidation är ett exempel på en av de mest

förekommande processerna som bidrar till oxidativ stress. Sekundära produkter som erhålls efter lipidoxidation är bl.a. aldehyder som ökar den oxidativa skadan på organismen [10,13].

Mitokondrien

Mitokondriernas huvudsakliga funktion är produktion av ATP som bildas vid oxidativ fosforylering. Oxidativ fosforylering förmedlas via bl.a. det

mitokondriella DNAt (mtDNA) men även av nukleärt DNA. ATP är en del av cellens ämnesomsättning och har en roll som neurotransmittor, detta gör att mitokondrier har en stor roll i energiomsättningen [14-15]. Mitokondrien påverkar även bildning och reglering av fria radikaler genom att deaktivera superoxid. Superoxid orsakar molekylära skador vid överproduktion. Den mitokondriella deaktiveringen av superoxid sker genom att omvandla superoxid till väteperoxid (H2O2) med hjälp av superoxiddismutaser, s.k. oxidoreduktaser som katalyserar

reaktionen mellan superoxider och väte. Med hjälp av bland annat kroppens antioxidantförsvar kommer H2O2 sedan omvandlas till syre och vatten (H2O2 à

O2 + H2O). Superoxider som undgår antioxidantförsvaret kan medföra skador på

DNA, lipider och proteiner. H2O2 reaktivitet är låg, men när den väl reagerar med

trevärt järn (Fe3+_{) bildas reaktiva hydroxylradikaler. Denna form av radikaler har}

en förmåga att initiera lipidoxidation i cellens cellmembran. Den oxidativa stressen orsakad av den mitokondriella produktionen av superoxid initieras även sekundärt av oxidationsprodukter (lipider, proteiner och socker) som leder till protein skador [16-18]. Som tidigare nämnts kan mutationer ske i nukleinsyror, bl.a. mtDNA. Tidigare studier har visat att denna form av mutationer har relaterats till ett antal kroniska sjukdomar där muskelfunktionen, nervsystemet och

träningstoleransen har påverkats [18]. Den oxidativa skadan av den

mitokondriella arvsmassan orsakar kronisk stress som sekundärt initierar stress respons genom att öka nivån glukokotikoider, d.v.s de primära mediatorerna för stress responsen [19]. mtDNA kan släppas fri utanför cellen, där den har

förmågan att aktivera olika skadegörande mekanismer och leda till systemisk inflammation, som sekundärt kan leda till depressiva symtom [19-20], vilket är ett vanligt symptom hos patienter med diagnosen fibromyalgi [1].

Urinsyra

Urinsyra är ett ämne som erhålls till följd av oxidationsreaktioner som

förekommer under den intracellulära katabola (nedbrytning) processen av purin [21-22]. Det är känt att urinsyran har en antioxiderande förmåga, som i sin tur skyddar mot oxidativ skada som kan drabba hjärta, nervsystem och blodkärl [22].

8

Elektrolytbalansen

Elektrolyter är molekyler och partiklar i kroppen med en viss laddning. De har till uppgift att bl.a. reglera vattnet i kroppen genom osmos. De positivt laddade (katjoner) elektrolyterna i kroppen är natrium, kalium, kalcium och vätejoner. De negativt laddade (anjoner) elektrolyterna är kloridjoner, fosfatjoner och

bikarbonatjoner. Med hjälp av buffertsystem där fosfatjoner och bikarbonat ingår hålls ett optimalt pH mellan 7,35-7,45. Vid rubbad pH balans påverkas enzymers funktion och cellskador kan inträffa. Acidos uppstår vanligtvis vid inflammation [23-25]. Den extracellulära vätskan i kroppen och osmolaliteten påverkas av natriumjoner, medan kaliumjoner har en avgörande roll för bl.a. funktionen i musklerna, hjärtat och membranpotentialen i nerverna [24].

Syfte

Fibromyalgi saknar diagnostiska markörer som kan analyseras och användas för diagnostik av den kroniska sjukdomen [7]. Syftet med studien är att studera några biomarkörer i saliv hos kvinnliga patienter med diagnosen fibromyalgi och relatera resultatet till den av patienten upplevda smärtan.

MATERIAL OCH METOD

Studien begränsas genom att endast inkludera beslutskapabla kvinnor över 18 år eftersom sjukdomen vanligast drabbar kvinnor. Deltagarna i studien skulle varken vara rökare eller ha andra smärtrelaterade kroniska sjukdomar. På grund av den korta studieperioden blir det mycket svårt att hitta lika många kvinnor och män villiga att gå med i studien. Kontrollgrupp (KG) valdes med avseende på patientens beräknade BMI (enligt längd och vikt). Deltagarna i studien är sju fibromyalgipatienter (FM) med medelåldern 43 ± 12 år, och sex kontroller med medelåldern 42 ± 14 år.

Val av analysmetoder väljs beroende på provtagningsdatum, ämnets stabilitet och tiden en analysmetod kräver. Studien är en pilotstudie, d.v.s. en förstudie i mindre storlek i syfte att bedöma förutsättningar samt felkällor för framtida studier. Etisk bedömning

Provmaterialet är baserat på humant material och patientkontakt, därför skickades en ansökningsblankett samt bilagor till Malmö högskolas etikråd för etisk

granskning. Studien är godkänd av etikrådet enligt HS 2017/löp nr 28. Provtagningen är smärtfri och inga smittrisker förekommer för patienten.

Patienter informeras muntligt och skriftligt vid ett informationstillfälle. Vid viljan att delta i studien får patienten skriva på en blankett för samtycke och får ett slumpmässigt kuvert som består av en personlig kod, informationsbrev, provtagningsanvisningar, två provrör och ett frågeformulär (se bilaga 1-3). Patienten har rätt till att under provtagningen eller efter avbryta studien utan någon motivering. Deltagandet i studien är helt frivilligt, och patienten har rätt till att ställa frågor och kontakta den studieansvariga. Alla uppgifter i studien

behandlas konfidentiellt där inga uppgifter eller prover kommer att kunna kopplas ihop med någon person. All material lämnas för destruktion efter att analyserna är genomförda, d.v.s. förstörs och slängs.

9

Provtagning och provhantering

I denna studie utfördes olika analysmetoder på salivprov som samlats i Salivette® provrör. Proven tog patienterna själv på morgonen innan de hade sköljt munnen, druckit eller ätit efter en fasta från klockan 22:00 kvällen innan. På provröret skrev patienten sin personliga kod, tid och datum. Provtagningen utfördes två gånger två konsekutiva dagar. Frågor om bl.a. längd, vikt och smärta hos FM patienter på en skala från 1-10 (1= svag smärta, 10= extrem smärta) lämnades tillsammans med en personlig kod och provrör i ett kuvert till patienten vid det muntliga informationstillfället (bilaga 1-3).

Proven förvarades i kylskåp (4 °C) tills alla prov samlats in. En första

centrifugering utfördes vid 1000 G i två minuter. Sedan centrifugeras proven vid 15 000 G under 15 minuter för att avlägsna sediment. Mängden saliv i varje prov antecknades därefter (850±279 hos FM-prov, 992±138 hos KG-prov) 200µl saliv överfördes till sterila PCR-rör och centrifugerades ännu en gång vid 20 000 G i en minut.

Kvantifiering av mtDNA

Mätning av fritt cirkulerande mitokondriellt DNA isolerades från 200µl salivprov från saliv som samlats i Salivette® rör efter centrifugering vid 20 000 G under en minut. Isoleringen utfördes med hjälp av QIAmp 96 DNA Blood Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) enligt tillverkarens anvisningar för blod och kroppsvätska-protokoll med undantag av tillsats av 75µl elueringsbuffert (Buffer AE) istället för 200µl.

Polymerase chain reaction

Med hjälp av Polymerase chain reaction (PCR) utfördes en kvantitativ analys av det cellfria mtDNA:t. Metoden utfördes först på alla prov (prov från KG och FM) i triplikat, d.v.s. en trippelreaktion för varje prov på en LC480 LightCycler (Roche, Mannheim, Tyskland). Dessutom utfördes triplikat på en negativ kontroll (nukleasfritt vatten) och en positiv kontroll (0,57pg/µl ND2). En färdig

spädningsserie utförd av masterstudent, Awatef Alhattami, utförd på Malmö högskola användes för beräkning av mtDNA koncentrationen med hjälp av en standardkurva som de olika crossing-point värdena från de okända proverna jämfördes med.

Primers som användes för PCR amplifieringen var Gen Primer forward (ND2 fwd: 5’ CACACTCATCACAGCGCTAA3') och Gen Primer reverse (ND2 rev: 5’GGATTATGGATGCGGTTGCT 3’). Produkten som bildades är 161 bas par (bp) lång. Sekvenserna hämtades från en databas med accessionsnummer KJ676545 (Life Technologies, Paisley, UK). SYBR Green Technology (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) användes för PCR-reaktionen, d.v.s icke sekvensspecifik fluorescerande reportermolekyl. Varje reaktion bestod av 15 µl av en master mix och 5 µl templat (salivprov med cellfritt mtDNA). Master mixen består av 3 µl nukleasfritt vatten, 1 µl av varje primer (10 µM ND2 fwd- och rev), och 10 µl PCR mix (SYBR MIX, Sensifast, Bioline, London, United Kingdom) för varje reaktion.

LightCycler® 480 användes för att detektera PCR produkten genom mätning av signaler från SYBER Green I fluorescens. När SYBER Green binder till

10

inbunden dsDNA. Denaturering av dsDNA utförs först vid 95 °C i 10 minuter, under vilket vätebindningar bryts. Detta följs av 45 cykler, varav varje cykel varar i 10 sekunder vid 95 °C för smältning. Vid 65 °C förenas sedan enkelsträngarna med primers (annealing) under 10 sekunder (SYBER Green interkalerar), och slutligen bildas nya DNA strängar som är komplementära till templatet (elongering) vid 72 °C i 11 sekunder, fluorecens signaleringen ökar tills den maximala mängden SYBER Green har interkalerat. Mätning av fluorecensen utförs vid 530 nm i slutet av elongeringsfasen. SYBER Green binder även in ospecifikt till dsDNA. Specificitet för analysen utförs genom smältpunktsanalys (Melting Curve analysis) som kontroll genom mätning av fluorecensen

kontunuerligt med start vid 60 till 97 °C [26]. Kvantifiering av urinsyra

Kvantifiering av urinsyra utfördes med hjälp av Randox kit (Randox laboratoris, County Antrim, UK) som baseras på en kolorimetrisk metod där

urinsyra-koncentrationen bestäms indirekt. Urinsyran får reagera i en så kallad enzymkatalyserad tvåstegsreaktion där urinsyran omvandlas av urikas till

allantoin och väteperoxid. Med peroxidas kommer en oxidationsreaktion ske (3,5-diklor-2-hydroxybensensulfon syra och 4-aminofenason oxideras) vilket leder till en röd-violett produkt. Produktens färgintensitet är proportionell mot

urinsyramängden.

Metoden tillämpades enligt Randox proceduranvisning i en 96-håls

mikrotiterplatta och mättes spektrofotometriskt (Bio-tek, USA) vid 546 nm. Proven blandades dessutom noga tillsammans med reagens i eppendorfrör innan 300 µl överfördes till en mikrotiterplatta för fotometrisk bestämning.

Urinsyrakoncentrationen beräknades med hjälp av en standard enligt formeln _𝑥= Std. konc.× 𝐴𝑃𝑟𝑜𝑣−𝐴𝐵𝑙𝑎𝑛𝑘

𝐴𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟𝑑−𝐴𝐵𝑙𝑎𝑛𝑘 . Där x är urinsyrakoncentrationen i mg/dl och A står för

absorbansen vid 546 nm. Elektrolyt analys

Elektrolytanalys i saliv för 9 utvalda prov utfördes med ABL80 FLEX blood gas analyzer (Radiometer Medical, Brønshøj, Danmark) enligt instruktioner som administreras av maskinen enligt panel för analys av övriga kroppsvätskor Kvantifiering av totalprotein

Proteinbestämning i salivprov bestämdes med Bradford med bovint serum albumin (BSA) som protein standard (2 mg/ml) enligt anvisningar för Sigma-aldrich (St. Louis, USA) 96 well Plate Assay Protocol. Med hjälp av en spädningsserie av BSA mellan 0,1-1,4 mg/ml utfördes en standardkurva för beräkning av proteinkoncentrationen. Mätningen utfördes spektrofotometriskt vid 595 nm (Bio-tek, USA).

Kvantifiering av IgA

IgA kvantifierades i salivprov med Kit från LDN Immunoassay IgA Saliva ELISA (Labor Diagnostika Nord, Nordhorn, Tyskland). Metoden är en immunoenzymatisk kolorometrisk analys som baseras på den simultana bindningen mellan IgA och två specifika antikroppar, en monoklonalt

immobiliserad antikropp på en mikrotiterplatta och en polyklonalt konjugerad antikropp med horseradish peroxidase (HRP). Enzymet i den bundna fraktionen reagerar med det använda substratet (H2O2) och TMB substratet som medför en

11

blå färgbildning. Efter tillsats av stopplösning (H2SO4) sker färgomslag till en gul

färg. Färgintensiteten avspeglar IgA koncentrationen i provet, d.v.s. mängden antigen som har bundit in till de immobiliserade antikropparna i mikrotiterplattan. Absorbansmätning utfördes vid 450 nm (Bio-tek, USA). En färdig standard användes med koncentrationerna 0, 6,9, 62, 132, 400 ng/ml.

Statistisk bearbetning

Med hjälp av datorprogrammet Statistical Package for Social Sciences (IBM SPSS statistics 23, IBM, New York, US) utfördes olika statistiska beräkningar för jämförelse mellan FM och KG. Resultaten från dag ett och två är angivna som medelvärde ± SD. Signifikanta värden i denna studie anses vara p<0,05. Data mellan grupperna jämfördes med t-test och lådagram (Box-plot). Samvariationen mellan IgA och urinsyra, och kvoten IgA/totalprotein och urinsyra analyserades genom en regressions- och Peasons korrelationsanalys m.h.a. ett

spridningsdiagram och genom bestämning av p-värde med wilcoxon rangtecken. Excel användes som bearbetningsprogram.

RESULTAT

Medelvärdet av prov från dag ett och två hos patienter med fibromyalgi i förhållande till den upplevda smärtan (mellan 1-10) under den senaste veckan visar inga signifikanta samband relaterat till kvantifierade biomarkörer. Kvantifiering av mtDNA

Erhållna värden från PCR analysen användes för kvantifiering av mtDNA. Från resultaten av den färdiga spädningsserien gjordes en standardkurva (y =

-1,638ln(x) + 15,886) som användes för att beräkna koncentrationen mtDNA i pg/µl, vilket sedan användes för beräkning av mitokondriella enheter (C/µl) för varje salivprov. Antalet cykler för varje prov användes för att beräkna

koncentrationen mitokondriella enheter enligt formeln 𝐶 µ𝑙< = (>?@AB⁄(DE) HIJ)

(KLMNO@A?BPQR (ST)>UUV)×6,022×10\], där 660 står för vikten av varje baspar i kg/Da (dalton). Mängden DNA i g/µl dividerades med storleken PCR-fragment (bp) och molar massan per bp i g/mol. Kvoten multipliceras med Avogadro´s konstant.

Medelvärdet mtDNA hos patienter med fibromyalgi (0,11±0,12 C/µl) är högre än medelvärdet hos kontrollgrupp (0,05±0,04 C/µl). p-värdet (0,25) av t-testet är större än α-värdet (0,25 > 0,05).

12

Figur 2: Lådagram (Box-plot) som visar minimum, maximum samt median kvantiteten av mtDNA

i C/µl i salivprov från patienter med fibromyalgi och kontrollgrupp.

Lådagrammet visar att medianen mtDNA C/µl i salivprov från patienter med fibromyalgi är högre än medianen för salivprov från motsvarande kontrollgrupp. Den nedre kvartilen (minimum) är nästan lika hos både grupper, medan den övre kvartilen (maximum) är mycket högre hos FM.

Kvantifiering av urinsyra

Medelvärdet för urinsyra hos FM (5,04±5,97 mg/dl) är högre än medelvärdet hos KG (2,85±2,00 mg/dl). p-värdet för urinsyrakoncentrationen är större än α-värdet (0,39 > 0,05). Med lådagram visas det att medianen urinsyra (mg/dl) i salivprov från FM är högre än medianen för salivprov från motsvarande KG. Den nedre kvartilen (minimum) är mycket lägre hos FM patienter, dessutom är den övre kvartilen (maximum) också mycket högre hos fibromyalgi gruppen. Spridningen bland proven hos FM är mycket större än hos KG.

Figur 3: Lådagram (Box-plot) som visar minimum, maximum samt median kvantiteten av

13

Elektrolyt analys

Elektrolyter mäts för att normalisera värdet, d.v.s. kontrollera att inget gått fel, och granskar rimligheten. Antalet prov begränsades beroende av antalet analyser kvar i apparaturen (9 analyser). Eventuella skillnader mellan grupperna noterades. Patienterna har lägre pH än motsvarande kontrollgrupp, där 60% av resultaten är utanför referensintervallet (n=5, 6,6±0,6). Alla pH värden hos kontrollgruppen ligger inom referensintervallet (n=4, 7,3±0,3). Natriumhalten hos FM (n=5, 45,0±8,9) är lägre än hos KG (n=4, 52,5±11,9). Kaliumhalten hos 80% av FM är högre (n=4, 28,9±13,6) än halten hos motsvarande kontroll (n=4, 19,5±2,3), varav ett av värdena är utanför mätområdet. Kloridjonkoncentrationen varierar generellt i båda grupperna, varav 60% av fibromyalgiproven (n=5, 223,6±184,9) ger högre koncentration än motsvarande kontroll (n=4, 147,8±20,5). Vätekarbonathalten hos FM (n=5, 5,5±8,1) är 80% lägre än halten hos motsvarande kontroll (n=4,

8,4±3,4).

Totalprotein och IgA

Det erhållna totalproteinmedelvärdet hos FM (n=7, 2,5±1,3 mg/ml) var inte signifikant högre än hos KG (n=6, 1,6±0,8 mg/ml). Medelvärdet av

koncentrationen IgA hos FM (0,6±0,3) är högre än medelvärdet hos KG (0,4±0,3 mg/ml) med 0,2±0,1 mg/ml. Kvoten IgA/totalprotein är i detta fall även högre hos FM (0,22±0,09) än hos KG (0,21±0,12), dock endast med 0,01±0,03. Det finns inga signifikanta skillnader i koncentration av varken IgA eller IgA/totalprotein. Två lådagram visar att medianen IgA (mg/dl) i saliv från FM patienter är mycket högre än motsvarande KG. Den nedre kvartilen (minimum) för FM är högre än medianen för KG, medan den övre kvartilen (maximum) är lite högre hos

fibromyalgi gruppen. Spridningen bland proven hos FM är mycket mindre än hos KG, se figur 4. Andra lådagrammet baseras på kvoten IgA/totalprotein, medianen är i detta fall nästan lika hög, dock högre hos FM. KG har i detta fall även högre övre kvartilavstånd till skillnad från FM vilket visas i figur 5.

Figur 4: Lådagram (Box-plot) som visar minimum, maximum samt median kvantiteten av IgA i

14

Figur 5: Lådagram (Box-plot) som visar minimum, maximum samt median kvantiteten av kvoten

IgA/totalprotein i salivprov från patienter med fibromyalgi och kontrollgrupp.

Regressionen mellan IgA och urinsyra hos FM är svagt positiv enligt figur 6, till skillnad från regressionen hos KG där en spridning är noterbar (bilaga 4). Med Pearsons korrelatonsanalys bekräftas det att graden linjärt samband är svagt positiv (0,580_{≈1) hos patienter med fibromyalgi, dock förstärks inte detta av} p-värdet som är större än α-p-värdet. P-p-värdet för regressionen mellan kvoten IgA/totalprotein och urinsyra hos FM är signifikant, 0,028<0,05, dock bekräftas inte detta med Pearsons korrelationsanalys (0,022≠1).

Figur 6: Spridningsdiagram för regressionen mellan IgA och urinsyra hos fibromyalgipatienter.

DISKUSSION

Komponenter som vanligtvis är biologiskt aktiva förekommer i fri form, d.v.s. icke proteinbundna. Fördelen med analys av koncentrationen fria komponenter i

15

saliv till skillnad från plasma är att saliven består av fria komponenter som motsvarar plasmans komponent koncentration [27].

Enligt en studie utförd i Polen spelar saliven en viktig roll för diagnostisering av sjukdomar som kan drabba olika delar av kroppen, och inte bara sjukdomar relaterade till munhålan. I studien konstateras även att vid bestämning av den totala antioxidant nivån i saliv kan bestämning av antioxidant kapaciteten i hela kroppen utföras [28].

Även om denna pilotstudie har visat låga eller höga kvantitativa värden av IgA2, och potentiella markörer för oxidativ stress (mtDNA och urinsyra) i saliv hos patienterna med diagnosen fibromyalgi, har den inte lyckats att visa på

signifikanta skillnader i jämförelse med KG vilket förmodligen kan förklaras av det begränsade antalet deltagare i studien.

Metoddiskussion

Studien är väldigt översiktlig och för större specificitet och noggrannhet bör fler frågor ställas till FM patienter. För en mer noggrann analys av smärtan i

förhållande till kvantifierade biomarkörer bör fler specifika frågor om smärtan ställas, t.ex. den upplevda smärtan vid provtagningstillfället och upplevda smärtpunkter den senaste veckan och vid provtagningstillfället. I en pilotstudie publicerad i Rheumatology (Oxford) har det observerats att FM patienter som varit sjuka i mer än två år fått högre koncentrationer av den inflammatoriska markören IL-6 i perifert blod, samt serum IL-8 jämfört med den erhållna koncentrationen från FM patienter med kortare sjukdomsvaraktighet [29]. Sjukdomens varaktighet i denna studie hos FM patienterna är okänd, vilket innebär att analyskomponenternas påverkan av sjukdomens varaktighet också är okänd i detta fall och bör tas hänsyn till vid framtida studier och utveckling av denna pilotstudie.

I frågeformuläret ställdes en fråga gällande medicinering utan att urval gjordes i studien beroende på medicineringen. Detta beror på att majoriteten av FM

patienterna medicineras mot bl.a. sömnbesvär med saroten. Den aktiva substansen i saroten är amitriptylin som förutom reglerar sömnen även används som

antidepressivt medel och är smärthämmande [30]. Detta bör tas hänsyn till i framtida studier.

Till denna studie förmedlades information för provtagningen både skriftligt och muntligt för att åstadkomma samma förhållande för provtagningen. Detta ger ett indirekt mått på salivmängden under en minut. Dessutom analyserades alla prov i samma körning i syfte att minska variabilitet mellan analyserna.

Val av kontroller utfördes beroende av deltagande patienters ålder och beräknade BMI. Variabiliteten mellan åldersfördelningen mellan FM och KG var mycket liten (FM 43 ± 12 år, KG 42 ± 14 år). För framtida studier bör det tas hänsyn till att ha ett större antal deltagare inom varje åldersgrupp.

Val av biomarkörer för analys påverkades av komponentens stabilitet. Urinsyra valdes på grund av dess stabilitet, medan malondialdehyd (MDA) kvantifiering fick uteslutas på grund av dess höga reaktivitet. För att mäta MDA borde proven hanteras på ett annorlunda sätt genom bl.a. direkt nedfrysning och analys inom en mycket kort tid.

16

MDA är en produkt av lipidoxidation, som används i olika metoder vid

kvantifiering av nivån oxidativ stress. Den största orsaken till bildning av MDA är oxidation av fleromättade fettsyror [10,12].

Resultatdiskussion

Det kan förekomma olika okända felkällor som påverkar kvantifieringen av biomarkörer. I denna studie har inga korrigeringar utförts beroende på eventuella spädningar av komponenter i salivprovet beroende på den erhålla salivmängden inom en minut. Enligt en studie är IgA- och totalprotein halten i provet beroende av salivsekretionshastigheten, och detta bör tas hänsyn till i framtida studier och utveckling av denna studie [31]. Inga korrigeringar av erhållna värden har gjorts beroende på ålder och BMI.

Medelvärdet av prov från dag ett och två hos FM i förhållande till den upplevda smärtan under den senaste veckan visar inga signifikanta samband relaterat till kvantifierade biomarkörer. Detta kan bero på som tidigare nämnts bristerna i frågeformuläret, där extrem smärta hos en patient kan upplevas som medel smärta hos en annan patient beroende på den högsta graden av upplevd smärta sedan sjukdomen inträffat.

Medelvärdet mtDNA, urinsyra, totalprotein, IgA och kvoten IgA/totalprotein är högre hos FM (MV±SD) än hos KG. Det finns inget signifikant bevis som stödjer undersökningen för koncentrationsskillnad av tidigare nämnda biomarkörer hos patienter med FM och KG eftersom p-värdet är större än α-värdet (mtDNA p=0,25 > 0,05, urinsyra p=0,39 > 0,05, totalprotein p=0,16>0,05, IgA p=0,33>

0,05, och IgA/totalprotein p= 0,85> 0,05) och därav accepteras nollhypotesen. Orsaken till att minimum nästan är lika hos båda grupperna i de flesta analyser kan bero på att antalet deltagare i studien är mycket få, vid avvikande av en parameter kan detta påverka resultatet i större grad.

Den höga koncentrationen av fritt cirkulerande mtDNA hos FM patienter leder till en högre produktion av fritt ATP som i sin tur, som tidigare nämnts, kan leda till aktivering av nociceptorer.

Spridningen av urinsyra i saliv bland proven hos FM är mycket större än hos KG, detta kan bero på antioxidant förbrukningen i förhållande till sjukdomens grad, dock erhölls inga signifikanta bevis på detta i denna studie.

Spridningen bland IgA proven hos FM patienterna är mycket mindre än hos KG. Detta kan bero på, som tidigare nämnt i introduktionen, en minskning av IgA nivån vid kronisk stress. När IgA-produktionen blivit långsammare kan det vara möjligt att nivån IgA hos FM stabiliseras utan att stiga eller sjunka alldeles för mycket. Detta resonemang förstärks dock inte av andra analyser i denna studie och resultatet kan bero på slumpen.

Regressionen mellan IgA och urinsyra hos FM patienter är svagt positiv, vilket även bekräftas med Pearsons korrelationsanalys (0,58_{≈1), dock förstärks inte} detta av p-värdet. P-värdet för regressionen mellan kvoten IgA/totalprotein och urinsyra hos FM är signifikant, 0,03<0,05, dock bekräftas inte detta med Pearsons korrelationsanalys (0,02≠1).

17

Majoriteten av mätta FM prover ligger utanför pH- referensintervall, detta kan bero på rubbningar i syra-basbalansen, där försurning av saliven framgår, detta förstärks även av den låga vätekarbonathalten hos 60% av FM proven. Som tidigare nämnt påverkas enzymers funktion och cellskador kan inträffa vid rubbad pH balans. Dock uppstår acidos vanligtvis vid inflammation, och anledningen till att spottkörtlarna i detta fall producerar surt saliv är okänd. Natriumhalten hos FM är lägre än hos KG dock framgår ingen hyponatremi. Störningar i främst

natriumjonkoncentrationen återspeglas i den extracellulära volymen och inte i plasma [24]. Kloridjonkoncentrationen varierar generellt i båda grupperna, varav 60% av fibromyalgiproven (n=5, 223,6±184,9) ger högre koncentration än

motsvarande kontroll (n=4, 147,8±20,5). Kaliumhalten hos FM är högre än halten hos motsvarande kontroll, alla prov har värden utanför referensintervallet. Den höga kaliumkoncentrationen kan bero på läckage från celler till följd av den sena analysen. Som tidigare nämnt har kaliumjoner en avgörande roll för bl.a.

funktionen i musklerna, hjärtat och membranpotentialen i nerverna och därför bör denna analys utföras med större säkerhet i framtida studier eftersom trots läckage från celler har FM högre koncentration.

Framtida analyser

Undersökningens värden är endast i forskningssyfte. Erhållna värde ger en grund för vidare forskning inom ämnet och möjligen framtida diagnostiska metoder för fibromyalgi. För utveckling av denna studie kan långsiktiga prospektiva studier utföras där biomarkörer i denna studie analyseras på nytt tillsammans med välarbetade frågeformulär för patienter och kontrollgrupp, med hög validitet och reliabilitet.

SLUTSATS

I denna studie hittades ingen signifikant skillnad mellan KG och FM, eller den av patienten upplevda smärtan i förhållande till biomarkörer. För utveckling av denna studie och utveckling inom området krävs det en bättre standardisering av forskningsmetoderna, provhanteringen och en utökad förståelse om sjukdomens variation hos patienter beroende på livsstil och anamnes.

18

REFERENSER

1. Tapper M, (2007) Fibromyalgi-kronisk värk och trötthet. Mita bokförlag. 2. Kelly K, (2015), Fibromyalgia Tender Points.

>http://www.peverellchiropractic.co.uk/fibromyalgia-tender-points/< (2017-01-31).

3. Bjålie, Jan G. Haug, Egil. Sand, Olav. (2007) Människokroppen: Fysiologi

och anatomi. Stockholm: Liber AB.

4. Clauw D J, Arnold L M, McCarberg B H, (2011) The Science of Fibromyalgia. Mayo clinic proceedings, 86, 907–911.

5. Doerr J M, Fischer S, Nater U M, Strahler J, (2017) Influence of stress systems and physical activity on different dimensions of fatigue in female fibromyalgia patients. Journal of Psychosomatic Research, 93, 55–61. 6. Fernández-de-las-Peñas C, Peñacoba-Puente C, Cigarán-Méndez M,

Díaz-Rodríguez L, Rubio-Ruiz B, Arroyo-Morales M, (2014) Has catechol-O-methyltransferase genotype (Val158Met) an influence on endocrine, sympathetic nervous and humoral immune systems in women with fibromyalgia syndrome? The clinical journal of pain, 30,199-204. 7. Strahlera J, Skoludaa N, Rohlederb N, Natera U M, (2016) Dysregulated

stress signal sensitivity and inflammatory disinhibition as a pathophysiological mechanism of stress-related chronic fatigue.

Neuroscience & Biobehavioral Reviews, 68, 298–318.

8. LDN (2016) IgA Saliva ELISA. Immunoassay and services, version 6. 9. Viena T D, Banks J B, Barbu I M. Schulman A H., Tartar J L, (2012)

Differential effects of mild chronic stress on cortisol and S-IgA responses to an acute stressor. Biological Psychology, 91, 307–311.

10. Ranzolina A, Duarteb A L B P, Da Costa Netob C A, Bredemeierc M, Ascolid B M, Wollenhaupt-Aguiard B, Kapczinskid F, Xaviera R M, (2016) Evaluation of cytokines, oxidative stress markers and brain-derived neurotrophic factor in patients with fibromyalgia – A controlled cross-sectional study. Cytokine, 84, 25–28.

11. Sutton R, Rockett B, Swindells P (2009) Chemistry for the Life Sciences. Boca Raton, FL: CRC Press Inc.

12. Del Rioa D, Stewartb A J, Pellegrinia N, (2005) A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress. Nutrition, Metabolism and Cardiovascular Diseases, 15, 316–328. 13. NCIthesaurus (2016) Malondialdehyde

>http://ncit.nci.nih.gov/ncitbrowser/ConceptReport.jsp?dictionary=NCI_T hesaurus&ns=NCI_Thesaurus&code=C94711< (2017-01-30).

14. Johannsen D L, Ravussin E, (2014) The role of mitochondria in health and disease. Current Opinion in Pharmacology, 9, 780-786.

15. MeSH (2017) Adenosine triphosphate

>https://mesh.kib.ki.se/term/D000255/adenosine-triphosphate< (2017-02-24).

16. Brand M D, (2011) The sites and topology of mitochondrial superoxide production. Experimental Gerontology, 45, 466–472.

17. MeSH (2017) Superoxide Dismutase

>https://mesh.kib.ki.se/term/D013482/superoxiddismutas< (2017-02-24). 18. Cordero M D, Alcocer-Gómez E, Marín-Aguilar F, Rybkina T, Cotán D,

Pérez-Pulido A, Alvarez-Suarez J M, Battino M, Sánchez-Alcazar J A, Carrión A M, Culic O, Navarro-Pando J M, Bullón P, (2016) Mutation in

19

cytochrome b gene of mitochondrial DNA in a family with fibromyalgia is associated with NLRP3-inflammasome activation. Journal of medical

genetics, 53,113-122.

19. Picard M, Juster RP, McEwen BS, (2014) Mitochondrial allostatic load puts the 'gluc' back in glucocorticoids. Nature Reviews Endocrinology, 10, 303–310.

20. Nicod J, Wagner S, Vonberg F, Bhomra A, Schlicht KF, Tadic A, (2016) The amount of mitochondrial DNA in blood reflects the course of a depressive episode. Biological Psychiatry, 80, 41–42.

21. MeSH (2017) Uric Acid >https://mesh.kib.ki.se/term/D014527/uric-acid< (2017-01-31).

22. Sautin Y Y, Nakagawa T, Zharikov S, Johnson R J, (2007) Adverse effects of the classic antioxidant uric acid in adipocytes: NADPH oxidase-mediated oxidative/nitrosative stress. American Journal of Physiology -

Cell Physiology, 293, 584-596.

23. Theodorsson E, Malm J (2012) Rubbningar i syra-basbalansen. I: Nilsson-Ehle P, Berggren Söderlund M, Theodorsson E (red) Laurells klinisk kemi i praktisk medicin (upplaga 9). Lund: Studentlitteratur. 24. Theodorsson E, Malm J (2012) Rubbningar i salt-vattenbalansen. I:

Nilsson-Ehle P, Berggren Söderlund M, Theodorsson E (red) Laurells klinisk kemi i praktisk medicin (upplaga 9). Lund: Studentlitteratur. 25. Ke-Li Tsai, Seu-Mei Wang, Ching-Chow Chen, Tsorng-Harn Fong,

Mei-Lin Wu, (1997) Mechanism of oxidative stress-induced intracellular acidosis in rat cerebellar astrocytes and C6 glioma cells. Journal of

Physiology, 502.1, 161-174.

26. Roche Diagnostics GmbH (2008) Detection formats for the LightCycler®

480 Instrument (software version 1.5). Tyskland: System description.

27. Theodorsson E, Grankvist K, Nilsson-Ehlen P (2012) Tolkning av

analysresultat. I: Nilsson-Ehle P, Berggren Söderlund M, Theodorsson E

(red) Laurells klinisk kemi i praktisk medicin (upplaga 9). Lund: Studentlitteratur.

28. Krawczyk D, Błaszczak J, Borowicz J, Mielnik-Błaszczak M (2014) Life style and risk of development of dental caries in a population of

adolescents. Annals of Agricultural and Environmental Medicine, 21, 576– 580.

29. Wallace D.J, Linker-Israeli M, Hallegua D, Silverman S, Silver D, Weisman M.H (2001) Cytokines play an aetiopathogenetic role in fibromyalgia: a hypothesis and pilot study. Rheumatology, 40, 743–749. 30. FASS (2016) Saroten

>http://www.fass.se/LIF/product?nplId=19631018000072< (2017-03-25). 31. Ericson D, Hamberg K, Bratthall G, Sinkiewicz-Enggren G, Ljunggren L

(2013) Salivary IgA response to probiotic bacteria and mutans streptococci after the use of chewing gum containing Lactobacillus reuteri. Pathogens

20

BILAGOR

Bilaga 1: Informationsbrev utdelat vid muntligt informationstillfälle.

21

Bilaga 2: Provtagningsanvisningar utdelat vid muntligt informationstillfälle.

22

Bilaga 4: Spridningsdiagram för reggresionen mellan IgA och urinsyra hos