Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap Malmö universitet
METODUTVÄRDERING FÖR
ANALYS AV FRITT
TESTOSTERON I SERUM.
METODUTVÄRDERING FÖR
ANALYS AV FRITT
TESTOSTERON I SERUM.
SOFIE LARSSON
Larsson, S. Metodutvärdering för analys av fritt testosteron i serum.
Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap, 15 högskolepoäng. Malmö Universitet: Fakulteten för Hälsa och Samhälle, Institutionen för Biomedicinsk vetenskap, 2020.
Testosteron är ett könshormon som finns hos både män och kvinnor. Detta hormon finns till största del i bunden form i blodet, då bundet med hög affinitet till sexualhormonbindande globulin (SHBG) eller med låg affinitet till albumin. Den fria formen av testosteron utgör endast 0-2 % och svarar för den biologiska aktiviteten. Serum genomgick ultrafiltrering eller rapid equilibrium dialysis (RED) vid antingen rumstemperatur eller 37 °C därefter kvantifierades fritt testosteron med LC-MS/MS. Efter utvärdering genomfördes en jämförelse mot den nuvarande analysmetoden, total testosteron/SHBG-kvot. Slutligen
undersöktes medelvolym av filtrat, albuminförekomst i filtrat samt inbindning till provbehållare. Resultaten från jämförelse av RED och ultrafiltrering vid
rumstemperatur och 37 °C gav P-värden på, 0,892 och 0,696 respektive. Därmed ses ingen signifikant skillnad mellan provberedning med RED jämfört med ultrafiltrering. Vid jämförelse mellan ultrafiltrering och total testosteron/SHBG-kvot av patientprov gavs R-värde på 0,9089 och 0,879 vilket indikerar ett bra linjärt samband. Dock krävs vidare jämförelser med laboratorier som
koncentrationsbestämmer fritt testosteron i serum med RED för att bekräfta överenstämmelsen mellan ultrafiltrering och RED innan analysen kan sättas i bruk. Resultaten från albuminförekomst i filtrat visade att albumin inte släpps igenom filtren om de inte punkterats med ett spetsigt föremål, då sågs
albuminkoncentrationer likt de i serum. Albumin anses därför vara en lämplig kontroll av ultrafiltrering.
METHOD EVALUATION FOR
ANALYSIS OF UNBOUND
TESTOSTERONE IN SERUM.
SOFIE LARSSON
Larsson, S. Method evaluation for analysis of unbound testosterone in serum. Degree project in biomedical science, 15 credit points. Malmö University: Faculty of Health and Society, Department of Biomedical Science, 2020.
Testosterone is a sex hormone found in both men and women. This hormone is predominantly found in its bound form in blood, either bound with high affinity to sex hormone binding globulin (SHBG) or with low affinity to albumin. The free form of testosterone represents only 0-2 % of the total amount of testosterone but stands for the biological activity. Serum underwent ultrafiltration or rapid
equilibrium dialysis (RED) in either room temperature or 37 °C and was then analyzed with LC-MS/MS. After evaluation a comparison with the current method, total testosterone/SHBG-index, was made. Lastly the mean filtrate volume, presents of albumin in filtrate and binding of free testosterone to sample chamber were studied. The results from the comparison of RED and ultrafiltration at room temperature and 37 °C gave P-values of 0,892 and 0,696. Therefore, no significant difference between sample preparation with RED or ultrafiltration could be seen. The comparison of ultrafiltration and total testosterone/SHBG-ratio of patient samples resulted in R-values of 0,9089 and 0,879, which indicates a good linearity between the methods. However, further comparisons with
laboratories who determine the free testosterone concentration in serum with RED is needed to confirm the agreement between ultrafiltration and RED before the analysis is put into operation. The results obtained from examining the presence of albumin in filtrate showed that no albumin was let through the filter unless the filter was punctured with a sharp object, then the albumin concentration equaled the amount found in serum. Albumin is therefore considered an appropriate control for ultrafiltration.
FÖRORD
Jag vill framföra ett stort tack till samtliga som hjälpt mig under detta
examensarbete. Ett speciellt tack till min handledare Tony Karlsborn som gav mig möjligheten att vara delaktig i utvecklingen av en ny analysmetod och som med sitt eviga tålamod och stöd möjliggjorde detta examensarbete. Jag vill även tacka Anna Gustafsson som tog sig tiden att ge mig feedback på mitt skriftliga arbete.
INNEHÅLLSFÖRTECKNING
FÖRORD ... 4
BAKGRUND ... 6
Ultrafiltrering ... 7
Rapid Equilibrium Dialysis (RED) ... 7
Liquid Chromatography- Mass spectrometry/Mass spectrometry (LC-MS/MS) ... 7
Syfte ... 7
MATERIAL OCH METOD ... 7
Material ... 8 Metod ... 8 Ultrafiltrering ... 8 RED ... 8 Provberedning ... 8 LC-MS/MS... 8 Medelvolym av filtrat ... 9 Albuminförekomst i filtrat ... 10
Inbindning till provbehållare ... 10
Datahantering ... 10 Etik ... 10 RESULTAT ... 10 DISKUSSION ... 15 KONKLUSION ... 17 REFERENSER ... 18
BAKGRUND
Testosteron är ett könshormon som finns hos både män och kvinnor, dock i mycket högre koncentrationen hos män. Detta hormon finns i blodet, till största del bundet med hög affinitet till sexualhormonbindande globulin (SHBG) eller med låg affinitet till albumin. Den fria formen av testosteron utgör endast 0–2 % och om man utgår från den fria hormonteorin svarar för den biologiska aktiviteten [1-5]. Detta resulterar i att mängden fritt testosteron förändras när koncentrationen av SHBG och till viss del albumin ändras, under förutsättning att den totala
mängden testosteron är oförändrad [1-2]. Dock är den fria hormonteorin omdiskuterad och den biotillgängliga teorin som säger att såväl det fria
testosteronet som det bundet till albumin står för den biologiska aktiviteten anses av många vara mer korrekt [4,6-7].
Produktionen av testosteron hos män initieras genom att hypotalamus frisätter gonandotropinfrisättande hormon (GnRH) som stimulerar hypofysen till att utsöndra luteiniserande hormon (LH). Detta hormon stimulerar sedan den slutliga produktionen av testosteron i testiklarnas leydigceller. Denna funktion regleras genom negativ feedback [1-2]. En viss dygnsvariation har kunnat identifieras med koncentrationer som är högst på morgonen och som lägst på eftermiddagen [1-2]. Testosteronet hos män produceras till 90 % i testiklarna medan de resterande procenten bildas främst genom transformation av prekursorn androstendion i lever och muskler [1].
Hos kvinnor bildas testosteron endast som en biprodukt vid syntetiseringen av kortikoider och östrogener, detta innebär att kvinnor inte har någon självständig reglering av testosteron så som män vilket gör att nivåerna kan fluktuera kraftigt till följd av förändringar av steroidsyntesen. Ovarierna och binjurarna bildar 50 % av testosteronet medan de övriga 50 % bildas likt män genom transformation av prekursorn androstendion i lever och muskler [1].
Bestämning av fritt testosteron i serum (S-fritt testosteron) är av värde vid
misstanke om polycystiskt ovarialsyndrom, kongenital binjurebarkhyperplasi samt viriliserande tumörer hos kvinnor, då ses ofta förhöjda värden fritt testosteron. Vad gäller män så är det främst vid hypogonandism, pubertas praecox och pubertas tarda som analysen är av värde, då ses ofta låga värden fritt testosteron [1].
Idag används total testosteron/SHBG-kvot som ett mått på det fria testosteronet. Denna metod har i flera studier kritiserats för att inte ta hänsyn till
koncentrationen av såväl albumin som andra androgener [2-4]. Metoden har trots detta visat en hög korrelation med jämnviktsdialys med membran och har efter det anammats som ett enklare och tillräckligt tillförlitligt alternativ till
jämnviktsdialys med membran [6]. Dock anses ekvilibriumdialys med membran fortfarande vara gyllene standard [4]. Det finns även ett antal studier som tyder på att ultrafiltrering kan vara ett alternativ till jämnviktsdialys med membran då den faktiska koncentrationen fritt testosteron mäts men undgår de tidskrävande stegen i en jämnviktsdialys med membran [8].
Ultrafiltrering
Metoden används för separation av fria och proteinbundna molekyler i små volymer. En korrekt delning av de fria och proteinbundna molekylerna sker på kort tid utan förändringar i koncentration, pH eller jonsammansättning. Tekniken använder sig av lågadsorberande hydrofila membran gjorda av cellulosa som med hjälp av centrifugalkraft separerar de fria och proteinbundna molekylerna [8-10]. Rapid Equilibrium Dialysis (RED)
Jämnviktsdialys är en metod där molekyler filtreras efter sin storlek. Detta genom att de mindre molekylerna kan passera genom det semipermeabla membranet medan de större retineras. Membranets molekylviktsavgränsning är den
genomsnittliga molekylmassan för den minsta molekylen som inte kan diffundera genom membranet. Denna avgränsning är ungefärlig vilket innebär att en liten andel av molekyler med samma massa som membranets molekylviktsavgränsning kommer att diffundera över till bufferten. Förflyttningen av de mindre
molekylerna sker naturligt genom diffusion. Det som skiljer denna metod från andra dialysmetoder är att den har en hög membranyta/volym-ratio, vilket möjliggör den snabba jämnvikten [11-12].
Liquid Chromatography- Mass spectrometry/Mass spectrometry (LC-MS/MS)
Provet transporteras till kolonnen med en mobilfas där den interagerar med de kemiska grupper som finns på stödmaterialet i kolonnen. Sedan förändras
mobilfasen successivt var på analyten släpper från kolonnen och elueras ut. Efter kolonnen transporteras provet in i en förkammare där molekylerna joniseras med hjälp av så kallad electrospray jonisering. Då appliceras en hög spänning över provet som resulterar i en jonisering av molekylerna och vätskan i provet blir en aerosol som förångas med hjälp av kvävgas samt värme. Endast de joniserade molekylerna kommer vidare in i en lins där de fokuseras innan de går vidare till quadropol ett. De joner vars massa genom laddning (m/z) som är större eller mindre än analytens kommer att krocka med elektroderna och där med selekteras bort. I den andra quadropolen fragmenteras moderjonen med hjälp av kvävgas av specifik kinetisk energi, moderjonen fragmenteras i och med detta alltid till samma fragment. Dessa fragment passerar vidare till den tredje quadropolen där endast fragment vars massa/laddning ligger inom ett bestämt intervall vandrar fram till detektorplattan [13].
Syfte
Syftet med denna studie var att jämföra och utvärdera de preanalytiska metoderna ultrafiltrering och RED för koncentrationsmätning av fritt testosteron i serum samt att jämföra den bäst lämpade metoden med total testosteron/SHBG-kvot.
MATERIAL OCH METOD
Serum bereddes med två olika metoder, ultrafiltrering eller RED, vid antingen rumstemperatur (RT) eller 37 °C och analyserades sedan med LC-MS/MS. Efter utvärdering genomfördes en jämförelse mot den nuvarande analysmetoden, total testosteron/SHBG-kvot. Slutligen undersöktes medelvolym av filtrat,
Material
Ett hundratal avidentifierade serumprover sammanblandades. Detta
tillvägagångssätt möjliggjorde ett större antal analyser samtidigt som de etiska förhållningsreglerna upphörde att gälla och den medicinska aspekten inte längre behövdes tas hänsyn till då proverna inte återspeglade en individs tillstånd. I slutskedet användes avidentifierade icke sammanblandade serumprover för att möjliggöra jämförelse av den mest fördelaktiga av metoderna med
testosteron/SHBG-kvot. Metod
Serumet genomgick ultrafiltrering eller RED vid antingen rumstemperatur (RT) eller 37 °C, innan det bereddes inför analys på LC-MS/MS. I de fall där beredning inte skedde samma dag som ultrafiltrering eller RED frystes provet in i -20 °C. Ultrafiltrering
Serumet applicerades på filtret (Centrifree Ultrafiltration Devices, EMD Millipore Corporation, Billerica MA, US) och centrifugerades i 60 minuter 2000 x g vid antingen 37 °C eller RT. Därefter avlägsnades filterkoppen som förseglades lufttätt med tillhörande lock inför vidare provberedning.
RED
Serum och fosfatbuffert med pH 7,4 tillsattes i respektive brunnar och förseglades innan dialysplattan (Rapid Equilibrium Dialysis (RED) Device Single-Use Plate with Inserts, 8K MWCO, Thermo Fisher Scientific, Rockford IL, US)
inkuberades 4 h i 37 °C eller RT på en orbitalskak vid cirka 200 rpm. Efter detta överfördes innehållet från brunnarna till eppendorfrör för förvaring inför vidare provberedning.
Provberedning
400 µL serum späddes med 100 µL 1 % humant serumalbumin (HSA) (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis MI, US) i MilliQ-vatten innehållande
internstandard av testosteron-2,3,4-13C3 (Supelco Inc, Bellefonte PA, US) i en deep well-platta (Microplate deep well, Porvair sciences limited, Wrexham, UK). Om provvolymen inte uppnådde 400 µL späddes provet med 1 % HSA i vatten. Plattan mixades i 1 min på medelhög nivå innan den inkuberades 10min i rumstemperatur. 400 µL prov överfördes sedan från plattan till en SLE-platta (Isolute SLE+, Biotage AB, Uppsala) placerad ovan på en deep well-platta varpå tryck motsvarande 2,5 psi applicerades över plattan i 10 sek innan den
ekvilibrerade 5min i rumstemperatur. Sedan tillsattes 0,7 mL 90/10 n-heptan (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) /etylacetat (VWR International LLC, Radnor PA, US) till SLE-plattan, efter vätskan trängt in i plattan tillsattes ytterligare 0,7 mL 90/10 n-heptan/etylacetat. Proverna indunstades sedan till torrhet vid 40 °C med ett flöde på 40L/min. Det torra extraktet re-suspenderades sedan med 220 µL 80/10/10 MilliQ-vatten/metanol (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) /acetonitril (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) innan plattan förseglades och mixades i 6min på medelhög nivå. Slutligen centrifugerades plattan i 10 min vid 4160 x g innan koncentrationen fritt testosteron i proverna analyserades.
LC-MS/MS
Proverna analyserades på ett LC-MS/MS system bestående av ett ultra high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument och en
masspektrometer. UHPLC-systemet var av Nexera X2 (Shimadzu corporation, Kyoto, Japan) modell med en analyskolonn av typ Kinetex 2,6µm EVO-C18 100Å (Phenomenex, Torrance CA, US) och en Zorbax Eclipse XDB CN (Agilent technologies, Santa Clara CA, US) användes som en trap-kolonn. Båda
kolonnerna var kiselbaserade och av typen reversed phase samt hade
dimensionerna 50x2,1mm. Det som skiljde de åt var de funktionella grupperna samt partikelstorleken, analyskolonnens funktionella grupp var C18 med en partikelstorlek på 2,6µm medan trap-kolonnen hade en partikelstorlek på 1,8µm med nitril som funktionell grupp. Trap-kolonnens syfte var att rena provet samt att öka känsligheten på mätningen medan analyskolonnens var att separera de olika komponenterna i provet.
Injektionsvolymen var 100 µL och en analys tog 9 min. Trap-kolonnens mobilfas A bestod av MilliQ-vatten 2mM ammoniumacetat och mobilfas B utgjordes av endast metanol, flödeshastigheten var 0,45 mL/min. Ugnens temperatur uppmättes till 50 °C och flödeshastigheten för mobilfaserna på analyskolonnen var 0,5 mL/min. Mobilfas A innehöll 0,1mM ammoniumflourid löst i MilliQ-vatten och mobilfas B var likt trap-kolonnen metanol. Den hydrofila mobilfas A
möjliggjorde inbindningen av den hydrofoba analyten till den stationära fasen. Den ordning som molekylerna eluerades ut i hänfördes till deras hydrofobicitet, där den minst hydrofoba eluerades först och den mest hydrofoba sist. Gradienten för mobilfas B redovisas i tabell 1
Tabell 1. Koncentrationsförändringen av mobilfas B vid olika tidpunkter under analysen. Tid (min) Koncentration (%) Tid (min) Koncentrations (%)
0,10 5 3,10 75 0,19 0 3,11 100 0,20 30 3,70 95 0,60 5 3,80 0 0,61 39 4,00 100 2,80 95 4,01 5 2,90 95 4,40 0 3,00 75
En Sciex 5500-2 QTrap (AB Sciex, Concord, Ontario, Canada) masspektrometer användes för kvantifiering av analytfragmenten. Från analyten detekterades två fragment, en quantifier och en qualifier, detta för att konstatera att rätt analyt kvantifierades. Massövergångarna 288,9/97,0 och 288,9/109,100 bevakades och ett samlat utslag erhölls för 97,0-97,004 respektive 109,100-109,104.
Fyra prover med känd testosteronkoncentration samt en blank användes för att tillverka en standardkurva. Proverna tillverkades av testosteron löst i metanol med koncentrationen 1 m/mlL (Lipomed AG, Arlesheim, Switzerland) som sedan späddes med PBS med 1 % HSA för att erhålla följande koncentrationer: 5.6, 22.5, 86.7, 355.4 och 1647 pmol/L.
Medelvolym av filtrat
Filtratens volym fastställdes genom vägning av 48 filterkoppar innan och efter filtrering av 500 µL serum. Vikternas differens användes sedan för beräkning av medelvärde och standardavvikelse.
Albuminförekomst i filtrat
För koncentrationsbestämning av albumin i filtrat överfördes 100 µL från 30 filterkoppar till alikvoteringsrör för immunturbidimetriskanalys på Cobas c502 (F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Switzerland).
Inbindning till provbehållare
En kalibrator användes för att utvärdera det fria testosteronets inbindning till provbehållarna. Vid undersökning av inbindning till dialys-plattan tillsattes 500 µL kalibrator och 750 µL PBS i två brunnar innan plattan inkluderades 4 h i RT. Innehållet från en PBS-brunn användes som kontroll och överfördes till ett eppendorfrör som frystes in i -20 °C. Innehållet från den andra PBS-brunnen flyttades i en serie till tre nya brunnar, detta för att exponera vätskan för större inbindningsyta, innan vätskan frystes in i ett eppendorfrör vid -20 °C. För att undersöka inbindningen till ultrafiltreringskopparna tillsattes 1mL kalibrator till ultrafiltret som centrifugerades 60 min i 37 °C vid 2000 x g, därefter överfördes 250 µL filtrat, som användes som kontroll, till ett eppendorfrör som frystes in i -20 °C, resterande mängd tillsattes till ett nytt filter som centrifugerades, detta upprepades fyra gånger i serie och en del av ultrafiltratet sparades vid varje centrifugering.
Datahantering
Utvärdering av de erhållna resultaten från LC-MS/MS utfördes i
datahanteringsprogrammet Analyst (version 1.6.2, Sierra analytics, Modesto CA, US). Med kromatogrammen konstaterades en retentionstid på 5,93 min. De statistiska analyserna utfördes sedan i Numbers (version 6.2.1, Apple Software, Cupertino CA, US) och Excel (version 16.35, Microsoft Corporation, Redmond WA, US). För alla mätningar beräknades medelvärde och standardavvikelse. Dessutom beräknades P-värdet med ett konfidensintervall på 95 % vilket innebär att ett P-värde under 0,05 visar på en statistisk signifikant skillnad mellan de jämförda metoderna. För att avgöra korrelationen mellan två metoder beräknades korrelationskoefficienten (r) och determinationskoefficienten (r2). För jämförelsen mellan koncentrationsbestämning av fritt testosteron efter ultrafiltrering med LC-MS/MS och total testosteron/SHBG-kvot uppmätt genom immunturbidimetrisk analys gjordes även två Bland-Altman plottar för att presentera
överensstämmelsen mellan metoderna. Etik
Då denna studie syftar till att utveckla en metod samt att proverna är
avidentifierade och där med inte går att spåra tillbaka till en patient samt att proverna i första skedet även är sammanblandat innebär att inget etiskt tillstånd krävs.
RESULTAT
Inledningsvis utfördes ultrafiltrering och RED vid RT med avidentifierat sammanblandat serum för jämförelse av metoderna. Efter dessa resultat togs beslutet att utföra samma försök vid 37 °C, detta gjordes för att säkerställa optimala förhållande. Vidare undersöktes korrelationen mellan ultrafiltrering vid 37 °C och total testosteron/SHBG-kvot. Resultaten presenteras i form av tabeller och diagram nedan.
I tabell 2 redovisas medelvärde, standardavvikelse och antalet replikat för
ultrafiltrering och RED av sammanblandat serum vid 37 °C och RT. Det utfördes 28 replikat vid 37 °C och 48 replikat vid RT, vidare ses ett medelvärde på strax under 10 pmol/L för ultrafiltrering och RED utförda i RT och en nästintill
fördubbling av medelvärdet ses för metoderna utförda i 37 °C. Standardavvikelsen för dialys är strax över 10 pmol/L högre än den för ultrafiltrering. Resultaten visar en trend att de erhållna värdena vid 37 °C är högre än de vid RT, vilket innebär att det optimala är att genomföra de preanalytiska metoderna vid 37 °C, då detta är närmare kroppstemperaturen. Vid resultatutvärdering från RED 37 °C erhölls ett avvikande värde på 215,76 pmol/L, detta resultat uteslöts från medelvärdet och standardavvikelsen presenterad i tabell 2 då dialysmembranet misstänks ha brustit och är där med inte representativt för metoden. P-värdet för ultrafiltrering vid RT och 37 °C samt P-värdet för RED vid RT och 37 °C redovisas tillsammans med medelvärdet och standardavvikelsen för metoderna i figur 1. Från beräkningen av P-värde för ultrafiltrering och RED vid RT erhölls 0,892 och för ultrafiltrering och RED i 37 °C erhölls 0,676.
Tabell 2. Medelvärde och standardavvikelse för preanalytiska metoder vid
koncentrationsbestämning av fritt testosteron i serum, samt antalet replikat som analyserats.
Figur 1. Medelvärde och standardavvikelse samt signifikans för de preanalytiska metoder vid koncentrationsbestämning av fritt testosteron i serum. * = p< 0,05, **=p<0,01, RED= rapid equilibrium dialysis, UL=ultrafiltrering, RT=rumstemperatur.
Korrelationen mellan ultrafiltrering vid 37 °C och total testosteron/SHBG-kvot jämfördes för 63 prover, de prover vilkas analytarea/internstandardarea var högre än den lägsta kalibratorn vid mätning av fritt testosteron med LC-MS/MS delades in i 2 provgruper. Den ena gruppen innefattade 14 prover med förhållandevis höga testosteronkoncentrationer mellan 107,89-773,66 pmol/L. Resultaten presenteras i
Preanalytiskmetod Antal replikat
Fritt Testosteron (pmol/L) Ultrafiltrering vid rumstemperatur 48 9,45 ± 4,71
Ultrafiltrering vid 37 °C 28 18,26 ± 3,26
Rapid equilibrium dialysis vid rumstemperatur
48 9,76 ± 14,77
Rapid equilibrium dialysis vid 37 °C 28 19,59 ± 16,07
0 5 10 15 20 25 30 35 40 RED RT RED 37 °C UL 37 °C UL RT Fritt te sto ster o n ( p m o l/L ) ** *
ett spridningsdiagram, se figur 2. Utifrån spridningsdiagrammet kan ses att koncentrationen fritt testosteron i snitt är 56 % lägre än total testosteron/SHBG-kvoten. P-värdet för linjäriteten beräknades till 9,17*10-12 med ett
konfidensintervall på 95 %. Resultaten visar på en mycket god linjäritet och korrelation
Den andra gruppen omfattade 14 prover med uteslutande låga
testosteronkoncentrationer mellan 12,73-64,97 pmol/L, dock uteslöts två resultat då dessa avvek kraftigt från de resterande resultat i gruppen och var där med inte representativa för analysen. En mycket stor skillnad i korrelationskoefficient och determinationskoefficient kunde ses beroende på om de avvikande värdena inkluderas eller ej. Om dessa prover inkluderats hade resultaten för r och r² ändrats från 0,879 och 0,7733 till -0,2833 och 0,0803. Denna förändring tyder på att de avvikande resultaten inte är representativa för metoden. De representativa resultaten presenteras i form av ett spridningsdiagram, se figur 3. Med
spridningsdiagrammet som grund kan det konstateras att koncentrationen fritt testosteron i snitt är 80 % lägre än total testosteron/SHBG-kvoten. P-värdet för linjäriteten, de avvikande exkluderade, beräknades även här med ett
konfidensintervall på 95 %, då erhölls 3,42*10-10. Resultaten där dessa avvikande proverna är exkluderade visar en mycket god korrelation mellan fritt testosteron och total testosteron/SHBG-kvot.
Figur 2. Koncentrationen fritt testosteron uppmätt genom LC-MS/MS efter ultrafiltrering vid 37 °C i korrelation mot total testosteron/sexualhormonbindandeglobulin-kvot uppmätt genom immunturbidimetrisk analys och beräkning av 14 prover med hög testosteronkoncentration. På X-axeln ses det erhållna värdet för total testosteron/sexualhormonbindandeglobulin-kvot i pmol/L och på Y-axeln ses den uppmätta mängden fritt testosteron i enheten pmol/L.
y = 0,4433x + 23,867 R² = 0,8262 R = 0,9089 0 160 320 480 640 800 0 160 320 480 640 800 Fritt te sto ster o n ( p m o l/L ) Total testosteron/sexualhormonbindandeglobulin-kvot (pmol/L)
Figur 3. Koncentrationen fritt testosteron uppmätt genom LC-MS/MS efter ultrafiltrering vid 37 °C i korrelation mot total testosteron/sexualhormonbindandeglobulin-kvot uppmätt genom immunturbidimetrisk analys och beräkning av 14 prover med låg testosteronkoncentration. På X-axeln ses det erhållna värdet för total testosteron/sexualhormonbindandeglobulin-kvot i pmol/L och på Y-axeln ses den uppmätta mängden fritt testosteron i enheten pmol/L. Den mörka serien redovisar de representativa resultaten och den ljusa serien visar de avvikande proverna.
Utifrån dessa gjordes Bland-Altman plottar, se figur 4 och figur 5. För proverna med höga testosteronkoncentrationer erhölls ett medelvärde och standardavvikelse för differensen mellan total testosteron/SHBG-kvot och fritt testosteron på 171,31 ± 100,84. Vad gäller proverna med låga testosteronkoncentrationer konstaterades ett medelvärde och standardavvikelse på 13,93 ± 36,83.
Figur 4. Bland-Altman plot för 14 prover med hög testosteronkoncentration. På X-axeln ses koncentrationen fritt testosteron uppmätt genom LC-MS/MS efter ultrafiltrering i 37 °C med enheten pmol/L och på Y-axeln ses differensen mellan total
testosteron/sexualhormonbindandeglobulin-kvot, uppmätt genom immunturbidimetrisk analys och beräkning, och koncentrationen fritt testosteron. SHBG=Sexualhormonbindandeglobulin.
y = 0,1986x + 4,2917 R² = 0,7733 R = 0,879 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 Fritt te sto ster o n ( p m o l/L ) Total testosteron/sexualhormonbindandeglobulin-kvot (pmol/L) -125,00 0,00 125,00 250,00 375,00 500,00 0 100 200 300 400 500 (T o tal test o ster o n /SHB G) -(f ritt test o ster o n )
Fritt testosteron (pmol/L)
2SD
Medel
Figur 5. Bland-Altman plot för 13 prover med låg testosteronkoncentration. På X-axeln ses koncentrationen fritt testosteron uppmätt genom LC-MS/MS efter ultrafiltrering i 37 °C med enheten pmol/L och på Y-axeln ses differensen mellan total
testosteron/sexualhormonbindandeglobulin-kvot, uppmätt genom immunturbidimetrisk analys och beräkning, och koncentrationen fritt testosteron. SHBG=Sexualhormonbindandeglobulin.
Av de prover där korrelationen mellan ultrafiltrering vid 37 °C och total testosteron/SHBG-kvot undersöktes låg analytarea/internstandardarea för 36 prover under den lägsta kalibratorn vid mätning av fritt testosteron med LC-MS/MS. Detta innebar att koncentrationen inte kunde bestämmas, dock erhölls det högsta möjliga värdet. Detta värde erhålls genom att multiplicera
spädningsfaktorn för provet med koncentrationen för den lägsta kalibratorn. Dessa resultaten redovisas i tabell 3. Utifrån dessa resultat ses 19 prover där total
testosteron/SHBG-kvot är högre än resultatet från LC-MS/MS. För de resterande 17 proverna stämmer total testosteron/SHBG-kvoten överens med resultaten från LC-MS/MS.
Tabell 3. Koncentrationen fritt testosteron uppmätt genom LC-MS/MS efter ultrafiltrering vid 37 °C samt total testosteron/sexualhormonbindandeglobulin-kvot uppmätt genom
immunturbidimetrisk analys och beräkning.
PN FT(pmol/L) TT/SHBG (pmol/L) PN FT(pmol/L) TT/SHBG (pmol/L) 1 < 6,7032 15,97 31 < 5,04 1,40 2 < 10,08 35,90 32 < 20,16 8,85 5 < 6,7032 29,13 33 < 6,7032 47,63 6 < 6,7032 22,83 34 < 20,16 8,26 7 < 6,7032 11,97 35 < 6,7032 11,89 8 < 6,7032 15,59 36 < 5,04 0,62 10 < 6,7032 3,51 37 < 10,08 6,41 11 < 6,7032 6,72 38 < 6,7032 2,38 12 < 6,7032 9,06 40 < 10,08 52,13 14 < 10,08 4,82 41 < 10,08 7,57 15 < 10,08 4,31 42 < 10,08 1,02 17 < 6,7032 48,39 44 < 20,16 12,37 18 < 5,04 0,91 45 < 6,7032 8,48 22 < 6,7032 11,47 46 < 10,08 0,64 23 < 6,7032 46,05 47 < 10,08 1,97 24 < 6,7032 15,51 48 < 20,16 21,51 25 < 6,7032 14,78 49 < 20,16 15,52 26 < 6,7032 1,79 50 < 6,7032 34,45
PN=Provnummer; FT=Fritt testosteron; TT/SHBG=total testosteron/sexualhormonbindandeglobulin-kvot.
Avslutningsvis gjordes tre mindre undersökningar; medelvolym av filtrat, albuminförekomst i filtrat samt inbindning till provbehållare. Medelvolymen av
-120,00 -60,00 0,00 60,00 120,00 0 30 60 90 120 (T o tal test o ster o n /SHB G) -(f ritt test o ster o n )
Fritt testosteron (pmol/L)
-2SD Medel 2SD
filtratet fastställdes genom vägning av filterkopparna innan och efter filtrering av 500 µL serum, resultatet blev 0,246 ± 0,0733 ml. Detta gjordes för att kunna fastställa mängden serum som krävs för att utföra analysen samt antalet filterkoppar/analys.
Förekomsten av albumin analyserades immunturbidimetriskt på Cobas c502 i 30 filtrat, 5 prover innehållande MilliQ-vatten och 3 replikat sammanblandat serum. Medelvärdet och standardavvikelsen för filtrat blev 0,09 ± 0,08, för MilliQ-vatten erhölls 0,282 ± 0,056 och 45,7 ± 0,39 för sammanblandat serum. Utifrån dessa resultat är slutsatsen att inget albumin kommit igenom filtret då MilliQ-vatten gav högre analyssvar än filtratet. Albuminkoncentrationen analyserades även i filtrat från två manipulerade membran, det ena membranet punkterades med ett spetsigt föremål och det andra membranet manipulerades med ett trubbigt föremål vilket enbart påverkade ytskiktet av membranet. I filtratet vars membran punkterats sågs en likvärdig albuminnivå som i det sammanblandade serumet och i filtratet vars membran endast mekaniskt påverkats med ett trubbigt föremål kunde inget albumin detekteras.
Inbindning av fritt testosteron till provbehållarna undersöktes med PBS lösning innehållande 1 % humant serumalbumin som spikats med testosteron. För att undersöka detta analyserades koncentrationen fritt testosteron i buffertvätska efter dialys samt i buffertvätska som flyttats i serie till tre nya brunnar. Utöver detta analyserades även koncentrationen fritt testosteron i filtrat som genomgått en respektive fyra filtreringar. Koncentrationsbestämningen gjordes med LC-MS/MS. Inbindningen till dialys-plattan konstaterades vara 1,5 pmol/L fritt testosteron/brunn då koncentrationen fritt testosteron analyserades till 86,8 pmol/L i dialysvätskan som endast ekvilibrerats i en brunn och till 80,8 pmol/L i den dialysvätskan som ekvilibrerat i fyra brunnar, detta ger en procentuell minskning på 1,7 %/brunn. Vad gäller ultrafiltrering erhölls en koncentration av fritt testosteron på 156 pmol/L i filtratet som endast ultrafiltrerats en gång och för filtratet som genomgått fyra ultrafiltreringar erhölls koncentrationen 115 pmol/L vilket ger en inbindning av 10,25 pmol/L fritt testosteron/ultrafiltrering samt en procentuell minskning på 6,6 %/brunn. Resultaten presenteras även i tabell 4.
Tabell 4. Koncentrationen fritt testosteron uppmätt genom LC-MS/MS redovisat i enheten pmol/L. Kontrollen utgör den vätskan som endast genomgått en dialys eller en ultrafiltrering och efter fyra har då flyttades i en serie till tre nya brunnar eller genomgått ytterligare tre ultrafiltreringar. Värdena för den mängd fritt testosteron som går förlorad vid varje överföring redovisas under inbindning samt den procentuella minskningen/brunn.
Provtyp Kontroll (pmol/L) Slutlig (pmol/L) Inbindning (pmol/L) Procentuella minskningen/br unn Dialysvätska 86,8 80,8 1,5 1,7 % Filtrat 156 115 10,25 6,6 %
DISKUSSION
Syftet med denna studie var att jämföra och utvärdera de preanalytiska metoderna ultrafiltrering och RED för koncentrationsmätning av fritt testosteron i serum mot total testosteron/SHBG-kvot. Inledningsvis utfördes mätningar för att jämföra ultrafiltrering och RED. Resultaten från beräkningen av P-värde, 0,892 och 0,696, visar att ingen signifikant skillnad ses mellan ultrafiltrering och RED, liknande
resultat har visats av Liljemark et al [8]. Dock ses en mycket större variation för RED än ultrafiltrering, detta misstänks bero på att tre analyser måste genomföras för ett resultat från RED och att varje LC-MS/MS analys har en mätosäkerhet på minst 5 %. Därmed är det möjligt att ekvationen för att få det fria värdet
testosteron vid RED påverkas av variation i de tre enskilda proverna. För att bekräfta överrensstämmelsen mellan ultrafiltrering och RED behövs vidare jämförelser mot laboratorier som utför koncentrationsbestämning av fritt testosteron i serum kliniskt med RED utföras.
Mätningarna utfördes i både RT och 37 °C, utifrån dessa resultaten kunde en trend av högre koncentrationer fritt testosteron vid 37 °C utrönas. Anledningen till detta misstänks vara att albumin binder testosteron med högre affinitet vid RT än vid 37 °C som är den naturliga kroppstemperaturen och att värdena vid 37 °C på så sätt återspeglar koncentrationen av fritt testosteron mer korrekt [14].
RED provberedning vid 37 °C resulterade i att ett av de 28 replikaten från det sammanblandade serumet avvek markant från övriga replikat med tio gånger högre fritt testosteron i buffertkammaren. Detta beror sannolikt på att membranet mellan serum- och buffert-kammare har brustit vilket orsakat genomsläpp av testosteron bundet till SHBG samt albumin. Denna typ av smitta mellan serum- och buffert-kammare är problematisk och är således en anledning till att analys av även albumin är att rekommendera för att kunna påvisa om molekyler av större storlek än membranets porer kan påvisas i buffertkammaren. Av denna anledning analyserades albumin i 30 ultrafiltrat för att se om det kunde påvisas smitta av större molekyler även vid ultrafiltrering. Vid utvärdering av resultaten från albuminanalys i ultrafiltrat så sågs att albuminkoncentrationerna i filtraten var lägre än albuminkoncentrationen i vatten, därmed verkar det som om
membranintegriteten är bättre vid ultrafiltrering jämfört med RED. Det enda positiva resultatet för albumin i filtratet skedde när membranet på
ultrafiltreringskassetten hade punkterats med ett spetsigt föremål, vilket resulterade i att albuminnivån i filtratet var likvärdigt ofiltrerat serum.
Vid såväl höga som låga testosteronkoncentrationer i serum ses en god korrelation mellan analyssvar erhållna med LC-MS/MS jämfört med kvoten total
testosteron/SHBG där total testosteron och SHBG är uppmätta med Cobas e601. Detta ses då R-värden för korrelationen var 0,9089 och 0,879. Dock ses en tydlig bias som antas bero på låga SHBG nivåer, vilket ökar mängden fritt testosteron, och en avsaknad av justering för inbindning av testosteron till albumin. Något som tas upp som problematiskt i litteraturen och enligt vissa bör en mer komplex ekvation användas [4]. Utöver en bias ses även två avvikande prover, för provet där resultatet från LC-MS/MS är över 10 gånger högre än det från total
testosteron/SHBG-kvoten misstänks en graviditet vara orsaken. Anledningen till denna teori är att kvinnor vid graviditet får en ökad koncentration av östradiol i blodet, vilket konkurrerar med testosteron om inbindning till SHBG. På så sätt ökar mängden fritt testosteron och total testosteron/SHBG-kvoten underskattar koncentrationen fritt testosteron. Liknande problematik kan ligga bakom det andra avvikande provet då total testosteron/SHBG-kvot inte tar hänsyn till hormoner som konkurrerar med testosteron om inbindningen till SHBG [1-2]. För de prover där exakt koncentrationsbestämning inte var möjlig erhölls ett värde av högsta möjliga koncentration, detta värdet är mer exakt än den kvot som används idag och är på så vis en förbättring även om exakt koncentrationsbestämning inte var möjlig. Genom att arbeta med större volymer filtrat kommer spädning av prover
undvikas vilket resulterar i att den lägsta uppmätta koncentrationen faller inom mätområdet för analys av fritt testosteron med LC-MS/MS. För att inte behöva späda prover kommer minst 500 µL filtrat behövas, vilket utifrån de erhållna resultaten för medelvärdet av mängden filtrat, innebär att det för ett prov kommer behövas tre filterkoppar med minst 500 µL serum i varje. Det betyder att patienten kommer behöva lämna minst 3 mL helblod, vilket är en normal och hanterbar volym.
Resultaten från inbindningstestet visar en mycket liten inbindning av fritt testosteron till provbehållarna, dessutom är detta testet utfört med en spetsad lösning vilket innebär att den inte återspeglar serum på ett korrekt sätt genom avsaknad av andra proteiner, molekyler och salter. Detta innebär att inbindningen av fritt testosteron i serum till dessa provbehållare kommer vara ännu lägre än de presenterade värdena genom att inbindning reduceras av förekomsten av andra molekyler som binder in till ytor på provkärlen och således minskar
inbindningsmöjligheterna för testosteron i lösningen.
KONKLUSION
Utifrån de resultat som erhållits kan en mycket god överenstämmelse mellan ultrafiltrering och RED ses. Då RED anses vara den gyllene standarden för separering av fria och proteinbundna molekyler antyder detta att ultrafiltrering skulle kunna användas för separering av fritt testosteron i serum. Dock måste vidare jämförelser mot laboratorier som utför koncentrationsbestämning av fritt testosteron i serum med RED göras för att fastställa denna överensstämmelse innan analysen sätts i bruk vid enheten för Specialkemi i Lund. Vidare har 37 °C fastställts som den optimala temperaturen för separering av fritt testosteron från serum oavsett metod. Vad gäller kontroller har det utifrån de erhållna resultaten konstaterats att koncentrationsmätning av albumin i filtratet kan användas som kontroll av membranintegritet för att undvika falskt för höga värden orsakade av läckage av SHBG- och albuminbundet testosteron. Den provvolym som krävs för att genomföra denna analys har identifierats till minst 3mL blod.
REFERENSER
1. Nilsson-Ehle P, Berggren Söderlund M, Theodorsson E, (2003). Laurells klinisk kemi i praktisk medicin. Studentlitteratur, Lund.
2. Melmed S, Polonsky K, Larsen P. R, Kronenberg H, (2011). Williams Textbook of Endocrinology. Elsevier, Philadelphia PA US.
3. Schuijt M P et al, (2019) Validity of free testosterone calculation in pregnant women. Endocrine connections, 8:6, 672-679.
4. Keevil B G, Adaway J, (2019) Assessment of free testosterone concentration. Journal of steroid biochemistry and molecular biology, 190, 207-211.
5. Södergard R, Bäckström T et al, (1982) Calculation of free and bound fractions of testosterone and estradiol-17 to human plasma proteins at body temperature. Journal of steroid biochemistry, 16, 801-810.
6. Vermeulen A, Verdonck L, Kaufman J M, (1999) A Critical Evaluation of Simple Methods for the Estimation of Free Testosterone in Serum. The journal of clinical endocrinology and metabolism, 84:10, 3666-3672.
7. Rinaldi S, Geay A et al, (2002) Validity of free testosterone and free estradiol determinations in serum from postmenopausal women by theoretical
calculations. Cancer epidemiology, biomarkers and prevention, 11, 1065-1071.
8. Liliemark E, Herngren L, Petterson B et al, (1996) Ultrafiltration and subsequenthigh performance liquid chromatography for in vivo
determinations of the protein binding of etoposide. Cancer letters, 106, 91-96. 9. Merck Millipore, (112013). Centrifree Ultrafiltration Devices. EMD
Millipore Corporation, Billerica MA US.
10. Merck Millipore, (102015). Ultracel Membranes. EMD Millipore Corporation, Billerica MA US.
11. Thermo Fisher, (2013). Molecular weight cut-off (MWCO) specifications and rates of buffer exchange with Slide-A-Lyzer Dialysis Devices and Snakeskin Dialysis Tubing. >https://www.thermofisher.com/< HTML (200203)
12. Thermo Scientific, (2017). Single-Use RED Plate with Inserts. Thermo Fisher Scientific, Rockford IL US.
13. Wilson K, Walker J, (2010). Principles and techniques of biochemistry and molecular biology. Cambridge University press, Cambridge.
14. Hausen B S, Signor C, Kober H et al, (2012) Effect of temperature on albumin cobalt binding and its influence on ischemia- modified albumin levels in patient with suspected acute coronary syndrome. Clinical laboratory, 58, 169-172.
