Ezrin som prognosmarkör för rektalcancer

Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap Malmö högskola

BA161B, 15 hp Hälsa och samhälle

EZRIN SOM PROGNOSMARKÖR

FÖR REKTALCANCER

1

EZRIN SOM PROGNOSMARKÖR

FÖR REKTALCANCER

ANDREAS LINDHOLM

Lindholm, A. Ezrin som prognosmarkör för rektalcancer. Examensarbete i

Biomedicinsk laboratorievetenskap 15 högskolepoäng. Malmö högskola:

Fakulteten för hälsa och samhälle, Institutionen för Biomedicinsk vetenskap, 2015.

Rektalcancer drabbar cirka 2000 personer i Sverige per år. Trots förbättringar i preoperativ utredning och behandling, utgör fortfarande lokalrecidiv (lokalt återfall i bäckenet) ett allvarligt problem. I dagsläget överlever inte majoriteten av patienterna som får ett lokalrecidiv. För närvarande finns det inga kliniskt

introducerade prognostiska vävnadsmarkörer för risken att utveckla ett lokalrecidiv. Identifieringen av en sådan markör skulle kunna leda till att en individuell behandlingsplan skapas för patienten, både primärt och postoperativt samt för uppföljning. Patienter med högre risk att utveckla lokalrecidiv skulle identifieras i ett tidigare skede. Proteinet ezrin har rapporterats vara en potentiell tumörmarkör vid olika cancerformer. Association mellan ett högt uttryck av ezrin och dålig prognos har påvisats. Syftet med studien var att undersöka om ezrin är en prognosmarkör för rektalcancer. Därigenom skulle eventuellt en förbättrad individbaserad behandlingsplan kunna skapas. Detta genom framställning av vävnadsklotsar med tekniken tissue microarray för att därefter utföra

immunhistokemisk färgning för detektion av förekomsten av ezrin. Patienterna utgör en kontrollgrupp omfattande patienter som inte har utvecklat lokalrecidiv. I en case-only studie av Jörgren et al. (2010), med patienter som utvecklat

lokalrecidiv fem år från primäroperation, visades att ezrin skulle kunna vara användbar som en prognosmarkör för rektalcancer. I 19,4 % (59/304) bedömdes färgintensiteten i vävnadscytoplasman som svag, som måttlig i 56,9 % (173/304) och som intensiv i 23,7 % (72/304). Intensiteten av cytoplasmafärgningen för ezrin ska analyseras multivariat och dess eventuella prognostiska betydelse värderas.

Nyckelord: Ezrin, immunhistokemi, lokalrecidiv, prognosmarkör, rektalcancer,

EZRIN AS A PROGNOSTIC

MARKER FOR RECTAL CANCER

ANDREAS LINDHOLM

Lindholm, A. Ezrin as a Prognostic Marker for Rectal Cancer. Degree project in

Biomedical Science 15 Credit Points. Malmö University: Faculty of Health and

Society, Department of Biomedical Science, 2015.

Yearly, about 2000 persons in Sweden are diagnosed with rectal cancer. Although advances have been made in tumour detection and its treatment, local recurrence still represents a severe matter. A majority of the patients diagnosed with local recurrence will not survive. There are no clinically available prognostic tissue markers for rectal cancer patients concerning the risk of local recurrence at the moment. The identification of a prognostic marker could lead to the development of an individualized treatment plan for the patient, both primarily and

postoperatively as well as in follow-up. Several published papers have shown that the protein ezrin could be a potential tumour marker in various tumours.

Association between high ezrin expression and poor prognosis has been

demonstrated. The aim of this study was to further explore if ezrin may function as a prognostic marker for rectal. This by manufacturing tissue blocks utilizing the technique of tissue microarray that were stained immunohistochemically for ezrin. By analysing the expression of ezrin in the tumour cell cytoplasms

microscopically by determining the colour intensity. Patients in the study form a control group consisting of only patients that did not develop a local recurrence. The ezrin expression of the control group will be compared to the results from the study of Jörgren et al. (2010) on rectal cancer patients who developed local recurrence within 5 years of surgery, where it was shown that ezrin expression could be used as a prognostic marker for rectal cancer. In 19,4% (59/304) the expression intensity of the tumour cells cytoplasm was assessed as weak, as moderate in 56,9% (173/304) and as intense in 23,7% (72/304). The intensity of the ezrin expression will be analysed multivariately, and the prognostic value further evaluated.

Keywords: Ezrin, immunohistochemistry, local recurrence, prognostic marker,

3

INNEHÅLLSFÖRTECKNING

MATERIAL OCH METOD 7  

Urval och metod 7  

Tissue microarray-konstruktion 8   Immunhistokemisk analys 8   Databehandling 9   Etisk bedömning 9   RESULTAT 10   DISKUSSION 11   Metoddiskussion 11   Resultatdiskussion 12   KONKLUSION 14   ACKNOWLEDGEMENTS 14   REFERENSER 15   BILAGA 1 17  

INLEDNING

Cancerdiagnostik med tillhörande behandling är ett mycket brett och viktigt område med ständigt aktuell forskning till grund för nya framsteg. För närvarande finns det ingen tillförlitlig, kliniskt introducerad prognosmarkör i tumörvävnad från rektalcancer.

BAKGRUND

Årligen diagnostiseras cirka 2000 personer i Sverige med rektalcancer. Adenom, det vill säga benign polyp (neoplastisk epitelial förändring), är prekursor till rektalcancer. Ungefär 10 % av adenomen utvecklas till en invasiv form,

adenocarcinom. Denna process tar 10-15 år att utveckla. I 80 % av patienter som utvecklat rektalcancer uppkom denna sporadiskt, medan resterade procent utgörs av patienter med hereditet för rektalcancer [1].

År 1995 startade det Svenska rektalcancerregistret (SRCR) av Socialstyrelsen med syfte att övervaka och säkerställa kvaliteten av hanteringen av rektalcancer. I registret insamlas data prospektivt för alla nydiagnostiserade individer där det bland annat ingår preoperativ utredning, behandling information och

uppföljningsdata fram till fem år efter operationen. Främst är det personer som är över 70 år som drabbas av rektalcancer [2]. På individnivå finns det inga konkreta riskfaktorer för utveckling av rektalcancer [3]. Tumören klassificeras som T1-T4 beroende på hur djupt den växer in i tarmväggen [1].

Stora framsteg har gjorts i behandlingen av rektalcancer, vilket har medfört att antalet lokalrecidiv (lokala återfall) har minskat och att överlevnadsgraden ökat. Detta har sitt ursprung i framför allt ökad användning av pre- och postoperativ radioterapi och kemoterapi, förfinade operationstekniker (t.ex. TME – total mesorektal excision) samt införandet av multidisciplinära teamkonferenser (MDT). Vid utredning genomförs bland annat rektoskopi där provexcisioner (px) tas från misstänkta förändringar för histopatologisk bedömning. Datortomografi (DT/CT) av thorax och buk utförs för att upptäcka eventuella fjärrmetastaser eller recidiv från tidigare operation. Magnetresonanstomografi (MRT) av lilla bäckenet utförs för att undersöka detaljer kring tumörens djupväxt till omkringliggande organ. Det är främst genom denna undersökning som det föreslås om patienten skall genomgå neoadjuvant behandling (i form av radioterapi eller kemoterapi) eller inte. Detta baseras på avståndet från tumören till den cirkumferentiella resektionsmarginalen (CRM) tillsammans med den histologiska bedömningen av tagna biopsier. CRM avser avståndet mellan den djupast liggande tumörvävnaden och resektionsranden i mesorektum (tarmkäx i rektum) [1,3].

Operation utgör den potentiellt botande behandlingsmetoden för rektalcancer. Trots framgångar i behandlingen av rektalcancer, utgör lokalrecidiv alltjämt ett problem. För patienter som behandlades för rektalcancer mellan åren 1995 och 1998 uppkom lokalrecidiv för 9,5 % av dessa individer inom en femårsperiod efter primäroperationen. Huvudparten av patienterna som utvecklar lokalrecidiv av tumörer överlever inte. Det finns flertalet potentiella riskfaktorer för

lokalrecidiv: patientrelaterade såsom ålder och kön, behandlingsrelaterade som till exempel icke optimal användning av pre- och postoperativa behandlingar samt

5

faktorer relaterade till tumören som vaskulär invasion, dålig tumördifferentiering samt invasion av lymfatisk vävnad. Den nuvarande kunskapen om

prognosmarkörer är otillräcklig. Identifiering av en tumörmarkör för rektalcancer behövs för att bättre kunna anpassa behandlingen till den enskilde patienten och för att kunna differentiera uppföljningen [1-2,4].

En potentiell tumörmarkör som har visat lovande resultat i tidigare publicerade studier är ezrin [4-7]. För att undersöka detta ytterligare analyseras uttrycket av ezrin i biopsier med hjälp av tissue microarray och immunhistokemi.

Tissue microarray

Tissue microarray (TMA) är en form av matris som används för att kunna utföra en större multiplex histologisk analys. Fördelen med TMA-tekniken jämfört med analys av traditionella histologiska snitt är att flera hundratals vävnadsprover kan analyseras samtidigt, vilket är både tids- och kostnadseffektivt. Tekniken har alltjämt sitt störta huvudområde inom forskningen, men utnyttjas alltmer inom den kliniska diagnostiken [8]. Formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) vävnadsklotsar snittas och färgas histologiskt med rutinfärgningen hematoxylin och eosin (H&E). De infärgade objektglasen mikroskoperas för att identifiera och märka upp morfologiskt representativa tumörområden. Områdena stansas sedan ur vävnadsklotsarna (givarklotsar) med hjälp av TMA-apparaten för att konstruera en mottagarklots. En mottagarkloss kan komma att innehålla upp emot 1 000 stycken så kallade tissue cores eller vävnadskärnor. Dessa vävnadskärnor erhålls med hjälp av en ihålig nål som borrars ner i vävnaden och stansar ur en cylindrisk biopsi. Borrkärnorna överförs till mottagarklotsen i en precis matris med ett förutbestämt mellanrum mellan kärnorna [8-9]. Så kallade orientation spots möjliggör orientering av mottagarklotsen genom att dessa innehåller vävnad helt skild från vävnadstypen som skall analyseras – annars skulle det vara omöjligt att påvisa från vilken givarkloss vävnadskärnan urstansats. Orientation spots görs ofta även asymmetriska för att ytterligare skilja dessa från provmaterialet1. Mottagarklossen snittas därefter för användning i histologiska metoder som immunhistokemi eller in situ-hybridisering [9-10].

Immunhistokemi

Vid immunhistokemi används primära antikroppar med hög specificitet för att lokalisera och binda till antigener. Tekniken bygger på identifiering av antigener genom antigen-antikroppsinteraktioner, där bindningsstället identifieras med hjälp av direkt enstegsmetod eller indirekt flerstegsmetod. En antikropp kan ha flera målantigener, men den har bara specifik bindning för en särskild epitop som möjliggörs av antikroppens variabla regioner. För att underlätta för antikroppen att binda till sin epitop görs ofta en slags förbehandling av FFPE snitt.

Prepareringen kallas för antigen retrival eller epitop retrival. Det finns två huvudsakliga tillvägagångssätt: HIER (heat-induced epitope retrival) och EIER (enzyme-induced epitope retrival). HIER utnyttjar en kombination av hög värme med en retrival-buffert för att åstadkomma detta. Enzymbehandling, EIER, innebär att ett proteolytiskt enzym används för att exponera epitopens bindningsställe. För visualisering finns det tre metoder: immunofluorescens, enzymer och radioaktivitet. Vid enzym-immunhistokemi utnyttjas enzymer som är märkta för att kunna demonstrera positionen av antikroppen. För att

visualiseringen ska kunna äga rum behöver enzymet närvaro av substrat och kromogener. Horseradish peroxidase (HRP) och calf-intestinal alkaline phosphatase är de mest frekvent använda enzymerna för visualiseringen. HRP __________________________________

bildar en färgavgivande produkt i närvaro med substratet väteperoxid och kromogenen 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) eller 3-amino-9-etylcarbazol (AEC), varigenom bindningsstället mellan antikroppen och antigenen kan identifieras. Alkaliskt fosfatas synliggörs genom användning av substratet naphthol-AS-fosfatas och ett kromogen som fast-red TR, fast-blue BBN eller fast red-violet LB. För att detektera förekomsten av antigener eller antikroppar i vävnaden respektive serum finns det ett par olika tekniker. I den direkta enstegsmetoden brukas en enzym-märkt primär antikropp som reagerar med antigenen och binder direkt till denna i vävnaden. För metoden används det endast en antikropp som är märkt med ett enzym, till exempel HRP. En indirekt två-stegsmetod involverar en omärkt primär antikropp som binder till målantigenet och en sekundär märkt antikropp (anti-humant Ig) som reagerar med den primära antikroppen. En indirekt trestegsmetod (lösligt enzym-immunkomplex) innefattar ett enzym-antienzymkomplex som reagerar med enzymmärkt sekundär antikropp. Den sekundära antikroppen är märkt med ett enzym och visualiseras med hjälp av ett kromogen. Den primära antikroppen och enzym-antienzymkomplexet måste vara tillverkat i samma djur för att den sekundära antikroppen ska kunna binda ihop dem. Peroxidase-antiperoxidase (PAP-komplex) är ett exempel på denna teknik [11].

Ezrin

Ezrin är ett protein som tillhör familjen ezrin-radixin-moesin, vilka agerar sammanlänkande mellan aktin-innehållande cytoskelett och plasmamembran via cellsignalering av ytmolekyler. Ezrin utgör en viktig roll i cellmotilitet (rörelse), interaktioner mellan celler samt mellan celler och extracellulärt matrix,

signaltransduktionsvägar, proliferation, apoptos, invasion och metastas [4-5,7]. Ezrin, också känt som cytovillin, är en produkt av genen Vil2 och uttrycks i flertalet olika normala celltyper, som till exempel endotelceller och i mikrovilli. I vilande form återfinns ezrin i cytoplasma i en stängd strukturformation, där dess bindningsställen inte är tillgängliga. Vid stimulering sker en konfirmationsändring genom fosforylering vid de terminala domänerna NH2 och COOH vilka

dissocieras från varandra, bland annat genom inbindning till fosfatidylinositol-4,5-bifosfat. Medieringen styrs av Rho. Aktiveringen leder till att ezrin lokaliseras till plasmamembranet och att den fria N-terminalen binder till

transmembranproteiner, i synnerhet adhesionsmolekyler, och C-terminalen binder till aktinfilament. Adhesionsmolekylerna utgörs av bland andra E-cadherin och CD44. E-cadherin reglerar celladhesion samtidigt som ezrin utöver en regulatorisk kontroll av lokalisationen av cadherin till plasmamembranet. Ezrin kan få E-cadherin att aggregera och resultera i en förlust av cell-celladhesion, vilket kan indikera att ezrin främjar metastatisk spridning [12-13]. CD44 är en

membranreceptor, som interagerar med bland annat hyaluronsyra, och reglerar interaktioner mellan celler samt mellan celler och extracellulärt matrix. CD44 har förknippats med metastaser i tidigare studier genom dess cellmigrerande funktion av tumörceller [14-15]. Ezrin associeras med flertalet olika

signaltrasduktionsvägar, många inblandade i onkogenisk signalering, som till exempel PI3K/Akt som reglerar cellulära processer som proliferation och cellöverlevnad. Proteinkinasen Akt är en effektor av PI3K och den aktiverade formen av Akt identifieras frekvent i dåligt differentierade tumörer där Akt framkallar en förbindelse mellan onkogen aktivitet och cellöverlevnad, vilket medför en högre risk för tumörinvasion [5,16]. Akt utövar bland annat sin

signaleffekt på proteinet Bad vars funktion medverkar i initiering av apoptos [16]. Nyligen visade en studie att Akt2 specifikt aktiverade ezrin genom fosforylering

7

[7]. Funktion av ezrin i dessa processer medför att proteinet har en nyckelroll i progressionen av tumörer och metastaser, varför den anses vara en mycket intressant kandidat som en potentiell biomarkör för rektalcancer [4].

Ezrin har bevisat sig vara en vävnadsmarkör för aggressiv tillväxt i ett flertal olika solida tumörer [6]. Dessutom finns det indikationer om att ezrin kan vara en vävnadsmarkör för aggressivitet även i rektalcancer. Studien av Jörgren et al. [4] visade att ezrin uttrycktes i primärtumörer och att nivån av uttrycket kunde prognosera tiden till utveckling av ett lokalrecidiv. Uttrycket av ezrin i

tumörvävnaden bedömdes till att 17 % (18/104) klassificerades som svag, måttlig i 62 % (64/104) av fallen och i 21 % (22/104) intensiv. Tiden för utveckling av lokalrecidiv hos patienter med högt uttryck av ezrin var signifikant kortare jämfört med hos patienter med lågt uttryck av ezrin (p=0,0004). Patienter med högt

uttryck av ezrin uppvisade lokalrecidiv i median efter 316 dagar (intervall 98-961), jämfört med 621 dagar (intervall 127-1673) för patienter med lågt uttryck av ezrin. Studiens slutsats var att ezrin potentiellt kan representera en prognosmarkör för aggressivitet i rektalcancer [4]. Denna teori har stöd i flera andra studier, bland andra Kokeila et al. som påvisade att ezrin möjligt kan användas som en prediktiv biomarkör för patienter med rektalcancer [5] samt Wang et al. som konstaterade en korrelation mellan högt uttryck av ezrin och tumörens malignitet [12].

Fastställs ezrin som en prognosmarkör kan informationen bidra till att anpassa behandling och uppföljning.

Syfte

Syftet med studien var att undersöka om proteinet ezrin kan användas som prognostisk tumörmarkör för rektalcancer. Detta genom att analysera uttrycket ezrin i vävnadsmaterial från patienter som inte uppvisat lokalrecidiv. Resultatet från denna kontrollgrupp används för att jämföra och validera resultatet från en tidigare publicerad studie av Jörgren et al. (2010) där endast patienter som drabbats av lokalrecidiv ingick.

MATERIAL OCH METOD

Detta är en retrospektiv studie där arkiverat material från patienter används. Insamling av kliniska variabler gjordes från SRCR och från arkiverade journaler. En databas konstruerades i Excel®.

Urval och metod

Patientgruppen utgjordes av 287 personer från Skåne som opererades för rektalcancer mellan den 1 januari 1996 och 31 december 2005 och som inte uppvisade lokalrecidiv eller metastaser inom fem år efter primäroperationen. Resultatet från denna kontrollgrupp jämfördes med resultatet från studien av Jörgren et al. [4], vars syfte var att analysera uttrycket ezrin i tumörer från patienter med rektalcancer som utvecklat lokalrecidiv.

Biopsier utgjordes av preoperativa provexcisioner (px) samt av utskuret biopsimaterial från operationspreparat. Totalt utgjordes provmaterialet av 311 stycken FFPE vävnadsklotsar från 287 patienter. Vävnadsklotsar med tillhörande glas framplockades ur patologarkivet, infärgat med rutinfärgningen H&E, om detta fanns tillgängligt. Fanns inga glas snittades dessa klotsar och infärgades med

H&E. Tillsammans med patolog mikroskoperades infärgade glas för markering för TMA. Mottagarklotsen snittades och färgades immunhistokemiskt för ezrin. En databas i SPSS® (Chicago, Illinois, USA) skapades för statistisk analys. En andel av vävnadsklossarna exkluderas innan konstruktionen av TMA på grund av otillräckligt med återstående material för att erhålla vävnadskärnorna. Denna bedömning utfördes makroskopiskt.

Tissue microarray-konstruktion

Konstruktionen av mottagarklotsen utfördes med en halvautomatisk arrayer, Minicore® 3 Tissue Arrayer (Mitogen Ltd, Harpenden, Storbritannien). Till

arrayen tillkommer två datorprogram; Minicore® Control Station, som styr

apparaten, och Tissue Arrays Design Software TMADesigner®2 Version

1.0.0.12, i vilken designen av matrisen konstrueras. Patientdata importerades från Excel® till TMADesigner®2. I programmet bestäms dimensionerna för

mottagarklotsen, storleken av vävnadskärnorna samt mellanrummen mellan dessa i mottagarklotsen, antalet vävnadskärnor per givarklots som skall erhållas,

givarblockets vävnadstyp (exempelvis tumörvävnad) samt därtill att beräkna antalet mottagarklotsar som behövs för arrayen. Designen laddas in i Minicore® Control Station. Med hjälp av Minicore® Control Station sätts markeringar ut var stansen i givarklotsen skall tas enligt markeringarna på de färgade glasen. Varje enskild spot innehar specifika koordinater i matrisen, således behöver användaren inte själv sikta var hålen skall göras utan detta sköter apparaten [17].

En nål som erhåller 1 mm ⌀  stans användes. Det minsta avståndet mellan vävnadskärnorna är diametern av stansen + 100 µm [17]. Mellanrummet

bestämdes till 1600 µm. Från varje givarklots erhölls två stycken vävnadskärnor från tumörområdet. Dubbletter av mottagarklotsen skapades ifall någonting oförutsett skulle inträffa. Den första raden utgjordes utav två stycken orientation

spots, som i detta fall bestod av hjärnvävnad. Totalt 146 vävnadskärnor per

mottagarkloss (exkl. orientation spots) erhölls. Hålet som framställdes i

mottagarklotsen var 4 mm djupt, medan den urstansade vävnadkärnan var 3 mm djup. Detta för att stansen inte skall sticka upp och eventuellt gå av. Dessutom sparar detta förfarande på vävnaden eftersom mottagarklotsen behöver grovsnittas innan snitten erhålls1. TMA-apparaten har tre lägen; recipient, donor och transfer. Recipient är det första steget där hålet i mottagarklotsen utförs. Transfer väljs därefter vilket avlägsnar paraffinstansen från nålen. I läget donor stansas

vävnadskärnan ut och överförs till mottagarklotsen genom att välja transfer. För att validera resultatet och med säkerhet kunna se att vävnadskärnan kommit rätt kan ett foto tas av mottagarklotsen [17].

De färdiga mottagarklotsarna placerades i värmeskåp, 30-37 °C, i 3-4 timmar eller till nästkommande dag för att paraffinet skulle mjukna. Detta renderar en bättre kontaktyta mellan det omgivande paraffinet i mottagarklotsen och

vävnadsmaterialet samt ger en jämn och slät yta. För att säkerställa jämnheten trycktes ett rent objektglas försiktigt över mottagarklotsen. Denna fick därefter vila i ett dygn i rumstemperatur innan snittning1. Det producerades fem stycken mottagarklotsar (totalt tio inräknat dubbletterna) från 311 givarklotsar.

Immunhistokemisk analys

Med mikrotom HM 355S (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) erhölls 4 µm tjocka snitt som överfördes till objektglas specifika för immunhistokemi (DAKO FLEX IHC Microscope Slides K8020, DAKO A/S, Glostrup, Danmark). Snitten

9

torkades över natten och innan den immunhistokemiska färgningen även i värmeskåp, 60 °C, i 1-2 timmar. Detta görs för att snitten skall fästa vid glasen och för att vattnet ska avdunsta. Därefter följde en avparaffinering och

rehydrering i xylen respektive i fallande serie alkoholkoncentrationer till dH2O

(destillerat vatten). Antigen retrival utfördes enligt HIER där glasen sattes i kyvett innehållande TRIS/EDTA-bufferten Target Retrieval Solution pH 9 S2367

(DAKO A/S, Glostrup, Danmark). Kyvetten med glasen sattes i tryckkokare (2100 Retriver, Histolab, Göteborg, Sverige) innehållande 750 ml dH2O och

behandlades i 1 timme. Glasen sköljdes därefter i flera omgångar dH2O. Glasen

infärgades med DakoCytomation DAKO AutostainerPlus (DAKO A/S, Glostrup, Danmark) för ezrin. Visualiseringssystemet som användes var DAKO REAL™ EnVision™ FLEX high pH K8010 (DAKO A/S, Glostrup, Danmark). Systemet detekterar specifika primära antikroppar från mus och kanin som är bundna till antigener i vävnadssnitt genom en indirekt detektionsmetod. Den primära

antikroppen reagerar med enzymmärkt sekundär antikropp i form av en multimer. Multimeren utgörs av ett enzymkomplex bestående av dextran bundit till HRP som är kopplat till sekundära antikroppsmolekyler, get anti-mus/kanin.

Reaktionen visualiseras genom att HRP bildar en färgavgivande produkt i närvaro med kromogenet DAB+ (EnVision™ FLEX DAB+ Chromogen) och substratet väteperoxid (EnVision™ FLEX Substrate Buffer), vilket ger en brun infärgning. Den primära antikroppen utgjordes av monoklonal anti-ezrin (mus IgG1), klon 3C12, från Sigma® (St Louis, MO, USA). Antikroppen späddes 1:5000 med DEKO REAL™ Antibody Diluent S2022. Innan färgning droppas Wash Buffer på snitten för att undvika intorkning. Motfärgning utfördes med hematoxylin (C.I. 75290, EnVision™ FLEX Hematoxylin). Efter avslutade färgning dehydreras snitten och glasen monteras med Pertex® (Histolab, Göteborg, Sverige). Som kontrollvävnad användes tonsill samt placenta. För fullständigt färgningsprotokoll av Ezrin, se bilaga 1 [18]. Rutinmässigt framställs det även glas infärgat med H&E.

I enighet med den tidigare studien av Jörgren et al. [4] användes en fyrgradig skala för bedömning av uttrycket ezrin i vävnaden: negativ (-), svag (1+), måttlig (2+) och intensiv (3+) färgintensitet. Bedömningen gäller endast färgintensitet och inte mängden infärgad vävnad. Negativt och svagt uttryck utgör tillsammans en kategori under beteckningen svagt. Vid den statistiska analysen slogs resultatet från kategorierna svagt och måttligt samman och kategoriserades som ett svagt uttryck. Detta jämfördes med resultatet från den intensiva infärgningen som ansågs vara av högt uttryck. För bedömningen av färgintensiteten i denna studie stod författaren och Gudrun Lindmark (professor, överläkare kolorektal kirurgi, Helsingborgs lasarett). Bedömningen utfördes blindat, det vill säga utan

kännedom om patientdata. Helena Árnadóttir (ST-läkare i kirurgi) och patolog Dejan Korkocic, Helsingborgs lasarett, utförde separat värdering av

färgintensiteten. De vävnadskärnor som bedömdes olika i gruppen omvärderas tills koncensus uppnåddes.

Databehandling

Den statistiska databehandlingen utförs genom multivariabelanalyser i SPSS®. Denna genomförs i slutet av maj månad av Helena Árnadóttir och Fredrik Jörgren.

Etisk bedömning

RESULTAT

Totalt kunde 311 vävnadsklotsar användas till TMA-konstruktionen som

resulterade i fem stycken mottagarklotsar. Ur dessa kunde 304 stycken (97,7 %) analyseras. Bortfallet berodde antingen på att vävnadskärnorna endast innehåll normal slemhinna utan tumörceller eller på att vävnadskärnan saknades helt. Från varje givarkloss erhölls två borrkärnor. Förelåg olika intensitetsstyrka mellan dessa valdes värdet med högst intensitet.

Tabell 1. Resultat från bedömningen gällande färgintensiteten av ezrin i

tumörcellscytoplasma. Siffrorna anger antal vävnadskärnor. Uttryck av ezrin

Icke

bedömbar Svagt Måttligt Intensivt Totalt

Kloss 1 3 12 33 25 73 Kloss 2 0 17 46 10 73 Kloss 3 3 20 37 13 73 Kloss 4 1 9 45 18 73 Kloss 5 0 1 12 6 19 Totalt antal 7 59 173 72 311 % 2,3 18,9 55,6 23,2 100 % (borttaget icke bedömbar) 19,4 56,9 23,7 100

Resultatet från bedömningen redovisas i tabell 1. I 19,4 % (59/304) bedömdes färgintensiteten i vävnadskärnorna som svag, som måttlig i 56,9 % (173/304) och som intensiv i 23,7 % (72/304). Jämförs dessa resultat med resultatet från Jörgren

et al. (17 % (18/104) svag, 62 % (64/104) måttlig och 21 % (22/104) intensiv

intensitet) [4] erhålls en korrelationskoefficient till r = 0,9997. Figur 1 visar på hur bedömningen av färgintensiteten vid mikroskoperingen av vävnadskärnorna har gått tillväga.

11

Figur 1. Bedömning och kategorisering av uttrycket ezrin i vävnader infärgat

immunhistokemiskt för ezrin (klon 3C12, Sigma®, 1:5000). Figuren demonstrerar tumörvävnad som infärgats negativt (A), svagt (B), måttligt (C) och intensivt (D). Bilderna tagna med 10x förstoring.

DISKUSSION

I denna studie analyserades uttrycket ezrin i tumörvävnad från patienter som inte utvecklade lokalrecidiv efter primäroperation. Detta jämförs med resultatet som Jörgren et al. [4] presenterat i en tidigare studie där enbart patienter som drabbats av lokalrecidiv ingick. Mängden patienter som drabbas av lokalrecidiv har under de senaste decennierna minskat, mycket tack vare förbättrade operationsmetoder och neoadjuvanta behandlingar. Genom detta har den cancerspecifika

femårsöverlevnaden för rektalcancer stigit till över 60 % i Sverige [2].

Lokalrecidiv utgör likväl ett stort problem på grund av att det är svårbehandlat och oftast resulterar i att drabbade patienter inte överlever, varför utvecklingen av tillfredsställande kliniskt introducerade prognostiska vävnadsmarkörer är

önskvärd.

Metoddiskussion

TMA-tekniken är en väletablerad vetenskaplig metodik för analys av att stort antal olika vävnader [1,9-10]. Tekniken är smidig och när väl förarbetet, som upptar den mesta tiden, är genomfört fortlöper själva konstruktionen snabbt och effektivt. Det allra viktigaste vid förarbetet är att morfologiskt representativa delar av tumören väljs, eftersom dessa regioner är mest intressanta ur ett prognostiskt perspektiv. Detta bör utföras av en erfaren patolog [9]. TMA-tekniken kan med fördel även användas för att konstruera multiblock innehållandes olika vävnader som kontrollmaterial vid immunhistokemisk analys [8]. Skulle något gå fel vid själva konstruktionen går det att härleda varifrån vilken givarklots som vävnaden __________________________________

är tagen från, allting sparas automatiskt i apparaturens dataprogram. Informationen används därefter för underlag till efterarbetet vid

mikroskoperingen1. Immunhistokemi är en mångfasetterad teknik. Dels ger den underlag till bekräftelse av den frågeställning som klinikern ställt, dels även ett prognostiskt värde samt vilken behandling som ska bli aktuell för patienten. Tillsammans med TMA-teknik är det möjligt att analysera ett stort antal

vävnadsprover tidseffektivt på ett överskådligt och produktivt sätt, där fokus av analysen inte ligger på diagnostik. Immunhistokemi är emellertid en mycket känslig metod där varje glas kan ses som en enskild färgning. De antikroppar som produceras i dagsläget är såpass känsliga att de klarar av att identifiera epitoper trots den rigorösa preparationsprocessen med formalinfixering (ev.) och

paraffininbäddning [11]. Då endast ett fåtal glas infärgas i denna studie, kan samtliga analyseras med samma förutsättningar och utföras med exakt likadana reagenser. Detta ger TMA-tekniken en fördel gentemot traditionella snitt där alla glas inte hade kunnat färgas under samma dag. Dessa kan däremot vara mer svårbedömda jämfört med traditionella snitt eftersom inte hela uppbyggnaden av tarmkanalens vägg finns med, utan endast den utvalda tumörvävnaden. Därtill består mottagarklotsen av olika tumörvävnader som gått igenom olika

dehydreringsprogram (givarklotsar från olika städer) vilket har till följd att mottagarklotsarna blir mycket svårsnittade. Det är av hög vikt att komma ner helt i samtliga vävnadskärnor vid grovsnittning för att undvika ett eventuellt bortfall till analysen. Saknas det vävnadskärnor vid analysen beror det med största sannolikhet på att grovsnittningen inte utförts tillräckligt djupt. Trots att två borrkärnor per tumörvävnad används i studien erhålls arrayer (7) som icke är bedömbara. För att motverka detta problem kan tre borrkärnor göras per tumörvävnad [9]. Tumörheterogeniteten i två borrkärnor bedöms dock adekvat motsvara den från ett helt, traditionellt, histologiskt snitt [8].

Storleken på den urstansade vävnadskärnan kan varieras. Att en 1 mm stans valdes med 1,6 mm mellanrum i matrisen berodde på en högst personlig uppfattning att det ger en behaglig mikroskopering. Vid konstruktionen av matrisen designas den så att hålen inte görs hela vägen ut på mottagarklossen. Detta dels för stabiliteten för klotsen, dels för att ha en yta med paraffin att ta och överföra snitten med pincett till objektglas vid snittningen.

För att förhålla sig objektivt vid mikroskoperingen finns ingen patientdata tillgänglig vid bedömning av färgintensiteten. Råder skiljaktigheter i

bedömningen diskuterades varje fall i samförstånd tills ett fastställande kan göras. Denna form av bedömning är dock högst subjektiv. Figur 1 visar ett typexempel där det med enkelhet går att bedöma intensiteten, men i många fall var det svårt att bedöma infärgningen, särskilt gällande kategorierna måttlig och intensiv. Därför är det rekommenderat att minst två oberoende arbetslag bedömer

färgintensiteten vid separata tillfällen. Den statistiska analysen kommer att utföras i maj månad efter det att en utbildad patolog mikroskoperat och bedömt arrayerna. Därefter sker en multivariat statistik analys. Målet är att projektets resultat ska utmynna i en publikation som ska insändas till en vetenskaplig tidskrift.

Resultatdiskussion

Det önskvärda resultatet skulle påvisa ett signifikant mindre uttryck av ezrin i vävnaderna som ingick i denna studie jämfört med resultat från den tidigare studien. Baserat på bedömningen av färgintensiteten är ezrin inte en

13

gällande rektalcancer. Det föreligger ingen skillnad i uttrycket av ezrin mellan den tidigare studien, som innehöll patienter som drabbats av lokalrecidiv, och denna studie, där endast patienter som inte uppvisade lokalrecidiv eller några metastaser inom uppföljningsperioden fem år efter primäroperationen ingick. Det föreligger en stark korrelation mellan resultaten. Först efter att en patolog granskat arrayerna och analyserat färgintensiteten skall den statistiska analysen genomföras. När den är genomförd går det att med säkerhet uttala sig om den prognostiska funktionen för ezrin.

Samtidigt konstaterade Jörgren et al. [4] att den enda potentiella riskfaktorn (högt uttryck av ezrin, ålder, kön, tumörstadium, differentieringsgrad samt pre- och postoperativ radioterapi) som signifikant förevisade tiden för utvecklade av lokalrecidiv efter primäroperationen var ett högt uttryck av ezrin. Ett högt uttryck av ezrin visade att tiden för utveckling av lokalrecidiv var betydligt kortare än hos patienter med lågt uttryck av ezrin [4].

Den tidigare studien av Jörgren et al. [4] undersökte även om radioterapi påverkade uttrycket av ezrin i vävnaden. Neoadjuvant behandling i form av radioterapi genomgick 26/109 av patienterna. Material från provexcisioner (innan radioterapi) analyserades mot utskuret biopsimaterial från operationspreparat där patienten bestrålats för att utforma en komparativ analys. Resultatet visade att uttrycket av ezrin var oförändrat i 50 % (13/26) av fallen, att uttrycket ökade i 27 % (7/26) av fallen och att det minskade i 23 % (6/26) av fallen [4]. Baserat på resultatet förefaller radioterapi ha liten eller ingen förändring på uttrycket av ezrin i vävnaden. Samtidigt rapporterar Korkeila et al. [5] att det fanns en signifikant skillnad i uttryck av ezrin mellan px och utskuret biopsimaterial för patienter som fått preoperativ radioterapi. Neoadjuvant eller adjuvant radioterapi har bevisats reducera risken för lokalrecidiv och bidrar därmed till en ökad överlevnad [1,19]. Exakta kriterier för vilka patienter som skall genomgå neoadjuvant behandling finns för närvarande dock inte [3].

Ezrin har en stark association till dålig prognos i ett flertal olika cancerformer, bland annat i ovarialcancer, maligna melanom och osteosarkom. Därtill har ett högt uttryck av ezrin kopplats till sämre överlevnadsprognos i kolorektalcancer [4-5,12]. Därför utförs det för nuvarande många studier som syftar till att framta ett läkemedel som skall inhibera förmågan av ezrin eller någon av dess

regulatorer, som Akt2. Bulut et al. [20] rapporterar om molekylerna NSC668394 och NSC305787 som verkar inhiberande på effekten av aktiverat ezrin. Detta genom defosforylering av ezrin vilket får ezrin att återgå till sin inaktiverade formation [6,20]. MK-2206 är en allosterisk inhibitor av Akt och verkar genom inbindning till Akt och därigenom hindrar dess aktivering. MK-2206 verkar även pro-apoptotiskt genom inaktivering av ezrin och därmed förlust av proteinet XIAP (X-linked Inhibitor of Apoptosis). XIAP utövar sin funktion genom inbindning till caspaser vilket därmed inhiberar deras förmåga till apoptos. Dessutom påvisade Agarwal et al. [16] en minskning av fosforylerat Bad (pBad) vid behandling med MK-2206. pBad interagerar med proteinfamiljen 14-3-3 som verkar

anti-apoptotiskt. En minskad interaktion indikerar en minskning av cellöverlevnad. Det framkom även att Bad interagerade mindre med 14-3-3 vilket föreslår att Bad kan utföra sin apoptotiska funktion av tumörceller [16].

KONKLUSION

Studiens framtida värde kan komma att innebära att en behandlingsform som är anpassad för den enskilde patienten kan skräddarsys, till exempel genom tidigare initiering av neoadjuvant behandling i form av radioterapi eller flera omgångar av postoperativ kemoterapi. Gällande denna studie går det inte att uttala sig om den prognostiska funktionen av ezrin innan den statistiska analysen är genomförd och aspekter som överlevnad är inberäknade.

Analys av uttrycket ezrin i vävnadsmaterial kan, tillsammans med

datortomografisk undersökning, utgöra ett viktigt hjälpmedel för att i ett tidigare stadium identifiera patienter med en högre föreliggande risk att utveckla

lokalrecidiv.

ACKNOWLEDGEMENTS

Jag vill framföra ett stort tack till samtliga som hjälpt mig under detta

examensarbete. Till Gudrun Lindmark för att jag fick möjligheten att utgöra en del i projektet. Till handledare för studien Gudrun Lindmark (professor,

överläkare kolorektal kirurgi, Helsingborgs lasarett) och delhandledare Fredrik Jörgren (biträdande överläkare kolorektal kirurgi, Helsingborgs lasarett). Till Eva Rambech (laboratorieingenjör) för introduktion till TMA-tekniken och

rundvisning på Medicon Village i Lund. Till övrig personal i byggnad 404 på Medicon Village för det vänliga bemötandet. Till Gabriela Enggren och Frida Johansson för värdefull feedback.

15

REFERENSER

1. Jörgren F, (2010) Risk Factors of Tumour Recurrence and Reduced

Survival in Rectal Cancer. Lund University: Lund.

2. Påhlman L, Bohe M, Cedermark B, Dahlberg M, Lindmark G, Johansson R, (2007) The Swedish Rectal Cancer Registry. British Journal of

Surgery, 94 (10), 1285-1292.

3. Regionala cancercentrum i samverkan, (2008) Nationellt vårdprogram för

kolorektalcancer.

>http://www.cancercentrum.se/sv/Vardprogram/Kolorektalcancer/< (2015-03-31)

4. Jörgren F, Nilbert M, Rambech E, Bendahl P, Lindmark G, (2012) Ezrin expression in rectal cancer predicts time to development of local

recurrence. International Journal of Colorecetal Disease, 27(7), 893- 899.

5. Korkeila E, Syrjänen K, Bendardaf R, Laulajainen M, Carpén O, Pyrhönen

S, Sundström J, (2011) Preoperative radiotherapy modulates ezrin expression and its value as a predictive marker in patients with rectal cancer. Human Pathology, 42, 384-392.

6. Elzagheid A, Korkeila E, Bendardaf R, Buhmeida A, Heikkilä S, Vaheri A, Syrjänen K, Pyrhönen S, Carpén O, (2008) Intense cytoplasmic ezrin immunoreactivity predicts poor survival in colorectal cancer. Human

Pathology, 39, 1737-1743.

7. Leiphrakpam P, Rajput A, Mathiesen M, Agarwal E, Lazenby A, Are C, Brattain M, Chowdhury S, (2014) Ezrin expression and cell survival regulation in colorectal cancer. Cellular Signaling, 26, 868-879. 8. Van Zwieten A, (2013) Tissue microarray technology and findings for

diagnostic immunohistochemistry. Pathology, 45(1), 71-79.

9. Fernebro E, Dictor M, Bendahl P, Fernö M, Nilbert M, (2002) Evaluation of the Tissue Microarray Technique for Immunohistochemical Analysis in Rectal Cancer. Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 126, 702-705.

10. Kallioniemi O, Wagner U, Kononen J, Sauter G, (2001) Tissue microarray technology for high-throughput molecular profiling of cancer. Human

Molecular Genetics, 10(7), 657-662.

11. Carson F L, Hladik C, (2009) Histotechnology: A Self-Instructional Text. Chicago, Illinois: American Society for Clinical Pathology Press, s 278-289.

12. Wang H, Zhu J, Zhang Q, Sun Q, Guo H, (2009) High level of ezrin expression in colorectal cancer tissues is closely related to tumor malignancy. World Journal of Gastroenterology, 15(16), 2016-2019.

13. Hunter K, (2004) Ezrin, a key component in tumor metastasis. TRENDS in

Molecular Medicine, 10(5), 201-204.

14. Martin T, Harrison G, Mansel R, Jiang W, (2003) The role of the CD44/ezrin complex in cancer metastasis. Critical Reviews in

Oncology/Hematology, 46, 165-186.

15. Ohtani K, Sakamoto H, Rutherford T, Chen Z, Satoh K, Naftolin F, (1999) Ezrin, a membrane-cytoskeletal linking protein, is involved in the process of invasion of endometrial cancer cells. Cancer Letters, 147, 31-38. 16. Agarwal E, Chaudhuri A, Leiphrakpam P, Haferbier K, Brattain M,

Chiwdhury S, (2014) Akt inhibitor MK-2206 promotes anti-tumor activity and cell death by modulation of AIF and Ezrin in colorectral cancer. BMC

Cancer, 14(145), 1-12.

17. Mitogen Ltd (2008) Minicore® 3 Tissue Arrayer Manual. Harpenden, England: Mitogen.

18. DAKO A/S (2011) DAKO REAL™ EnVision™ FLEX high pH Manual. Glostrup, Danmark: Dako.

19. Folkesson J, Johansson R, Påhlman L, Gunnarsson U, (2005) Swedish Rectal Cancer Trial: long lasting benefits from radiotherapy on survival and local recurrence rate. Journal of Clinical Oncology, 23(5), 644-650. 20. Bulut G, Hong S, Chen K, Beauchamp E, Rahim S, Kosturko G, Glasgow

E, Dakshanamurthy S, Lee H, Daar I, Toretsky J, Khanna C, Uren A, (2012) Small molecule inhibitors of ezrin inhibit the invasive phenotype of osteosarcoma cells. Oncogene, 31(3), 269-281.

17

BILAGA 1

Nedan följer det fullständiga protokollet för immunhistokemisk färgning för ezrin på DakoCytomation DAKO AutostainerPlus. Alla reagenser samt utrustning kommer från DAKO A/S (Glostrup, Danmark), såvida inget annat anges. Steg 1-6 respektive 20-21 utförs manuellt, medan steg 7-19 utförs maskinellt. Färgningsmaskinen programmerades att tillsätta reagenser till två stycken droppzoner på glaset där 150 µl tillsätts till varje zon (300 µl totalt).

1. 4 µm tjocka snitt erhålls och överförs till objektglas DAKO FLEX IHC Microscope Slides K8020. Glasen står i rumstemperatur över natten för att torka.

2. Glasen torkas ytterligare i 60 °C i 1-2 timmar. Detta för att snitten skall fästa vid objektglasen bättre.

3. Glasen placeras i xylen (Histolab, Göteborg, Sverige) i 2x5 minuter för avparaffinering av snitten.

4. Snitten rehydreras genom att placera glasen i en serie med fallande

alkoholkoncentration, 99,5 % etanol → 95 % etanol (Solveco, Rosersberg, Sverige), till dH2O i vardera 5 minuter.

5. Glasen sätts i kyvett innehållande Target Retrieval Solution pH 9 S2367. Kyvetten med glasen sattes i tryckkokare (2100 Retriver, Histolab,

Göteborg, Sverige) innehållande 750 ml dH2O och behandlades i 1 timme

(gärna i 2 timmar). Behandlingen demaskerar antigenen och medför att antikropparna kan komma till och binda in, så kallad antigen retrival. Glasen sköljdes därefter i flera omgångar dH2O.

6. Glasen monteras i färgningsmaskinen och Wash buffer droppas på glasen för att förhindra intorkning av snitten.

7. Buffer rinse (sköljbuffert) tillsätts för tvättning.

8. HP-block tillsätts som blockerar vävnadens endogena peroxidasaktivitet (HRP-aktivitet) för att det bundna enzymet skall vara stabilt, vilket ger en minskad bakgrundsfärgning. Inkubationstiden är 5 minuter.

9. Tvättning med buffer rinse.

10. Primär antikropp tillsätts som binder till antigener i vävnadssnittet. Inkubationstiden är 30 minuter. Därefter tvättning med buffer rinse. 11. Enzymmärkt sekundär antikropp, EnVision, tillsätts vilket binder in till

den primära antikroppen. Inkubationstiden är 25 minuter. 12. Tvättning med buffer rinse i två omgångar.

13. Kromogenen DAB+ tillsätts. Inkubationstiden är 5 minuter.

14. Ytterligare en omgång med DAB+ tillsätts. Inkubationstiden är även här 5 minuter.

15. Glasen sköljs med dH2O och tvättas med buffer rinse.

16. Hematoxylin (C.I. 75290) tillsätts för motfärgning. Inkubationstiden är 5 minuter.

17. Glasen sköljs med dH2O.

18. Behandling med en lösning bestående av H2O och Triton för att reducera

ytspänning samt för permeabilisering av cellmembran. Inkubationstiden är 5 minuter.

19. Glasen sköljs med dH2O.

20. Glasen sköljs med rinnande kranvatten i 10 minuter.

21. Dehydrering av snitten genom en stigande alkoholkoncentration, 95 % etanol → 99,5 % etanol, till xylen. Därefter montering av glasen med Pertex (Histolab, Göteborg, Sverige) [18].