Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass
Spectrometry som verktyg för att detektera nedbrytning av
Ceftolozan/Tazobaktam orsakad av karbapenemaser
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass
Spectrometry as a tool for detecting degradation of
Ceftolozane/Tazobactam caused by carbapenemases
Författare: Bessem Saad
Vårterminen 2020
Examensarbete: Grundnivå (G2E), 15 högskolepoäng Huvudområde: Biomedicinsk laboratorievetenskap
Biomedicinska analytikerprogrammet, inriktning laboratoriemedicin BMLV, Examensarbete, 15 högskolepoäng
Institutionen för hälsovetenskaper, Örebro universitet. Huvudhandledare: Martin Sundqvist, Med dr. Överläkare.
Laboratoriehandledare: Ellionor Rapp, Leg. Biomedicinsk analytiker. Laboratoriemedicinska kliniken, Klinisk mikrobiologi, Örebro universitetssjukhus.
ABSTRAKT
Under senare år har en särskilt hög resistensutveckling observerats hos gramnegativa bakterier inom familjen Enterobacteriaceae. Den främsta resistensmekanismen utgör produktion av så kallade ”extended-spectrum β-lactamases” (ESBL) och särskilt oroväckande är karbapenemaser (ESBLCARBA) som har förmåga att bryta ner ett flertal
olika grupper av β-laktamantibiotika. Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) har utforskats som metod för snabb detektion av karbapenemasaktivitet genom analys av nedbrytning av antibiotika. Syftet med denna studie var att utvärdera om MALDI-TOF MS kan användas som metod för att detektera enzymatisk nedbrytning av Ceftolozan/Tazobaktam samt att undersöka vilka enzymer som uppvisar nedbrytning av antibiotikan. Sju
karbapenemasproducerande isolat och en β-laktamasnegativ kontrollstam användes i studien. Isolaten inkuberades 120 min respektive 270 min med antibiotika (1mg/ml) i en buffertlösning (0,08% ammoniumbikarbonat, pH 8). Efter centrifugering analyserades supernatanten med MALDI-TOF MS. Nedbrytning av Ceftolozan detekterades hos samtliga karbapenemasproducerande stammar, utom hos E. coli med NDM-1 produktion. Nedbrytningstoppar av Tazobaktam detekterades emellertid enbart hos stammar med OXA-48 och NDM-7 produktion. Tydligast nedbrytning sågs efter 120 min. För tydligare visualisering av nedbrytningstoppar bör metoden dock optimeras med avseende på matrix, buffert och antibiotikakoncentration.
Nyckelord: MALDI-TOF MS, Ceftolozan/Tazobaktam, karbapenemaser, hydrolys,
ABSTRACT
In recent years, an alarming increase of antibiotic resistance has been observed in Gram-negative bacteria, classified in the family Enterobacteriaceae. The main resistance mechanism is the production of extended-spectrum β-lactamases (ESBL). Particularly worrisome is the production of carbapenemases (ESBLCARBA) due to their ability to
hydrolyze a broad range of β-lactams. Recently, Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) has been investigated as a method for rapid detection of carbapenemase activity through observation of antibiotic degradation.
The aim of this study was to investigate whether MALDI-TOF MS can be used as a method to detect degradation of Ceftolozane/Tazobactam as well as to examine which enzymes that possess the ability to hydrolyze the antibiotic. A total of seven
carbapenemase-producing strains were used in the study. The experiment also included a β-lactamase-negative isolate as a negative control. The strains were incubated with antibiotic (1mg/ml) in a buffered solution (0,08% ammonium bicarbonate, pH 8) for 120 min and 270 min. The supernatant, after centrifugation, was analyzed by MALDI-TOF MS. All the carbapenemase-producing strains demonstrated hydrolysis of
Ceftolozane, except for NDM-1 producing E. coli. However, mass peaks corresponding to the degradation of Tazobactam were only detected in strains producing OXA-48 and NDM-7. The degradation of Ceftolozane/Tazobactam was most apparent after 120 minutes. However, to better enable detection of mass peaks, further optimization is needed in regard to appropriate matrix, buffer and antibiotic concentration.
Keywords: MALDI-TOF MS, Ceftolozane/Tazobactam, carbapenemases, hydrolysis,
LISTA ÖVER FÖRKORTNINGAR
K. pneumoniae Klebsiella pneumoniae E. coli Escherichia coli
PBP Penicillinbindande proteiner ESBL Extended-spectrum β-lactamase
ESBLA Extended-spectrum β-lactamase Class A
ESBLM Miscellaneous Extended-spectrum β-lactamase
ESBLCARBA Extended-spectrum β-lactamase Carbapenemase
ESBLCARBA-A Extended-spectrum β-lactamase Carbapenemase Class A
ESBLCARBA-B Extended-spectrum β-lactamase Carbapenemase Class B
ESBLCARBA-D Extended-spectrum β-lactamase Carbapenemase Class D
MALDI-TOF MS Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry
PMF Peptide mass fingerprint
OXA Oxacillinase
NDM New Delhi metallo-β-lactamase
KPC Klebsiella pneumoniae carbapenemase
INNEHÅLLSFÖRTECKNING
BAKGRUND ... 1
Antibiotikaresistens hos Enterobacteriaceae ... 1
β-laktamantibiotika ... 1
Extended-spectrum β-lactamases ... 2
Ceftolozan/Tazobaktam – Egenskaper, struktur och verkningsmekanism ... 3
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry ... 4
Detektion av antibiotikanedbrytning med MALDI-TOF MS ... 6
Syfte ... 7
Frågeställningar ... 7
MATERIAL OCH METOD ... 8
Bakteriestammar ... 8
Analys av masspektra för intakt antibiotika ... 8
Inkubering av bakterier och antibiotika ... 9
Analys av nedbrytning av Ceftolozan/Tazobaktam med MALDI-TOF MS ... 9
Statistisk analys ... 10
RESULTAT ... 11
Inkubering i 120 min (1μl bakterier) ... 11
Inkubering i 270 min (1μl bakterier) ... 12
Inkubering i 120 min (5 μl bakterier) ... 13
Inkubering i 270 min (5 μl bakterier) ... 14
DISKUSSION ... 15
Nedbrytning av Ceftolozan/Tazobaktam ... 15
MALDI-TOF MS som metod för detektion av karbapenemasaktivitet ... 16
Etiska överväganden ... 18
Slutsats ... 18
1
BAKGRUND
Antibiotikaresistens hos Enterobacteriaceae
Antibiotikaresistens är ett växande problem världen över och under senare år har
förekomsten av multiresistenta gramnegativa bakterier ökat markant, vilket komplicerar behandling av svåra infektioner. En särskilt hög resistensutveckling har observerats hos gramnegativa stavar inom familjen Enterobacteriaceae, framförallt hos arterna
Klebsiella pneumoniae och Escherichia coli, som även påvisas frekvent vid
vårdrelaterade infektioner. Produktion av så kallade ”extended-spectrum β-lactamases” (ESBL) omfattar den främsta resistensmekanismen hos dessa bakteriestammar (1). β-laktamantibiotika, i form av karbapenemer, utgör förstahandsval vid behandling av svåra infektioner som orsakas av ESBL-producerande bakterier. Karbapenemer tillhör de β-laktamantibiotika som uppvisar högst aktivitet och bredast spektrum mot
gramnegativa bakterier. De benämns därför ofta som ”last line agents”, ”life-saving drugs” eller “antibiotics of last resort”. På senare tid har den ökade användningen av karbapenemer emellertid gett upphov till karbapenemresistenta bakteriestammar som erhåller resistens genom förändringar i cellväggspermeabilitet, aktivering av
effluxpumpar eller produktion av karbapenemaser (2,3).
β-laktamantibiotika
β-laktamantibiotika är en grupp antibakteriella ämnen som utövar baktericid effekt genom att hämma cellväggssyntesen hos bakterier. β-laktamantibiotika omfattar
penicilliner, cefalosporiner, karbapenemer, monobaktamer och β-laktamashämmare. De olika grupperna skiljer sig i avseende på struktur och verkningsspektrum men
gemensamt för alla laktamantibiotika är att de har en så kallad laktamring. Det är laktamringen som utgör den verksamma delen hos laktamantibiotika (4).
β-laktamringen har en liknande struktur som dipeptiden D-alanyl-D-alanin, vilket är det naturliga substratet till penicillinbindande proteiner (PBP). PBP är enzymer
(transpeptidaser) som förmedlar syntes av bakteriers cellvägg (peptidoglykan) genom att katalysera polymerisering av glykankedjor samt tvärbindningar mellan dessa (5,6).
2
β-laktamringens likhet till D-alanyl-D-alanin resulterar i att kovalent bindning uppstår mellan antibiotikan och den aktiva ytan hos PBP. Den kovalenta bindningen medför att enzymet inhiberas, vilket motverkar fortsatt syntes av peptidoglykan. När
cellväggssyntesen avtar förlorar bakterierna sitt naturliga skydd mot osmotisk och mekanisk stress, varpå bakterierna lyserar och dör (5,6).
Extended-spectrum β-lactamases
laktamaser är enzymer som har förmåga att hydrolysera laktamringen hos β-laktamantibiotika så att de blir verkningslösa (7,8). β-laktamaser grupperas vanligtvis utifrån två olika klassificeringssystem, där det ena baseras på likheter i proteinstruktur (Amblers system) medan det andra utgår från likheter i funktion
(Bush-Jacoby-Medieros system). Amblers klassificeringssystem delar upp β-laktamaser i grupperna A-D. Grupp A, C och D omfattar serin β-laktamaser medan grupp B utgörs av metallo- β-laktaktamaser (9,10).
ESBL är laktamaser som uppvisar effekt mot ett utvidgat spektrum av
β-laktamantibiotika. Generna som kodar för ESBL är vanligtvis lokaliserade på plasmider som också kodar för andra resistensmekanismer, vilket medför att ESBL-producerade bakterier ofta är multiresistenta (1). Det råder ingen enighet vad gäller exakt definition och klassificering av ESBL. En allomfattande definition har emellertid utarbetats för att underlätta kommunikationen inom hälso- och sjukvården. Denna definition omfattar tre grupper av β-laktamaser: klass A ESBL (ESBLA), miscellaneous ESBL (ESBLM) och
ESBL som inkluderar karbapenemaser (ESBLCARBA) (11,12).
ESBLCARBA är en särskilt oroväckande grupp av ESBL då de uppvisar aktivitet mot
cefalosporiner och karbapenemer samt är motståndskraftiga mot β-laktamashämmare. ESBLCARBA delas vidare in i undergrupperna klass A- (ESBLCARBA-A) , klass B-
(ESBLCARBA-B) och klass D karbapenemaser (ESBLCARBA-D). ESBLCARBA-A och
ESBLCARBA-D är serin β-laktamaser medan ESBLCARBA-B är metallo-β-laktaktamaser
(1,11). Det finns inte någon effektiv metod för att detektera karbapenemaser, vilket utgör en stor utmaning inom klinisk mikrobiologi. Karbapenemaser kan detekteras med diskdiffusionstest och modifierat Hodge-test, samt med molekylärdiagnostiska metoder. De icke-molekylära metoderna är dock tidskrävande och har låg sensitivitet respektive specificitet, medan de molekylära metoderna medför en hög kostnad (13,14).
3
Ceftolozan/Tazobaktam – Egenskaper, struktur och verkningsmekanism
Ceftolozan/Tazobaktam (tidigare benämnt som CXA-201) är ett nytt
kombinationsantibiotikum som har ett brett spektrum mot gramnegativa bakterier, inklusive de flesta ESBL-producerande Enterobacteriaceae och multiresistenta
Pseudomonas aeruginosa. Ceftolozan (tidigare CXA-101) tillhör femte generationens
cefalosporiner och utövar, liksom övriga β-laktamantibiotika, baktericid effekt genom att binda till PBPs så att cellväggssyntesen hämmas. Ceftolozan skiljer sig från andra cefalosporiner i det avseendet att dess affinitet till PBPs är högre, vilket motverkar påverkan från effluxpumpar och förändringar i cellväggspermeabilitet (2,15,16). Ceftolozan har också en pyrazol-ring och en oxim-grupp som ökar antibiotikans motståndskraft mot β-laktamaser (17) (figur 1).
Ceftolozan verkar effektivt mot ett flertal resistenta gramnegativa bakterier, dock inte mot Enterobacteriaceae som uttrycker ESBL. När Ceftolozan ges i kombination med Tazobaktam erhålls emellertid ett bredare spektrum som även omfattar
ESBL-producerande bakterier (18). Tazobaktam är en β-laktamashämmare som hämmar ett stort antal klass A β-laktamaser och även vissa klass C β-laktamaser. Tazobaktam har en sulfongrupp som främjar kovalent bindning mellan antibiotikan och den aktiva ytan hos β-laktamaser (figur 1). Bindningen till β-laktamaserna är irreversibel, vilket medför att Ceftolozan inte hydrolyseras av dessa (17).
Ceftolozan/Tazobaktam säljs som pulver till infusionsvätska där förhållandet Ceftolozan:Tazobaktam är 2:1. En flaska innehåller 1g Ceftolozan i form av Ceftolozansulfat och 0,5g Tazobaktam i form av Tazobaktamnatrium (19). Ceftolozansulfat har en molekylvikt på 764,8 Da medan dess rena form har molekylvikten 666,7 Da (20,21). Tazobaktam har i sin rena, intakta form en
molekylvikt på 300,29 Da. I natriumsaltform har Tazobaktam istället molekylvikten 322,28 Da (22,23). Ceftolozan/Tazobaktam har, tack vare sin baktericida förmåga och stabilitet mot ESBL, blivit ett nytt behandlingsalternativ vid allvarliga infektioner av multiresistenta, gramnegativa bakterier. Antibiotikan uppvisar även effekt mot
karbapenemresistenta bakteriestammar, som inte producerar karbapenemaser, och utgör därmed ett substitut till karbapenemer. Ceftolozan hydrolyseras dock av
4
Figur 1. Kemisk struktur av Ceftolozan (molekylvikt: 666,7 Da) och Tazobaktam (molekylvikt: 300,29 Da). Pyrazol-ringen och oxim-gruppen ökar stabiliteten hos ceftolozan mot β-laktamaser medan sulfon-gruppen hos Tazobaktam främjar kovalent, irreversibel bindning till klass A-, samt vissa klass C β-laktamaser, så att dessa hämmas. Figuren baseras på de kemiska strukturer som är beskrivna i PubChem (21,23). Figur av Saad B.
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) är en metod som används för att bestämma molekylvikten av olika kemiska föreningar genom att mäta förhållandet mellan massa och laddning (m/z) hos dessa efter jonisering (25). Metoden, som introducerades under 1980-talet, har på senare tid kommit att bli ett viktigt verktyg inom klinisk mikrobiologi, vad gäller analys av cellulärt proteom, för snabb artidentifiering av både bakterier och svamp (26).
Analys med MALDI-TOF MS bygger på nyttjandet av en energiabsorberande, organisk lösning som kallas matrix. Matrixen inkuberas tillsammans med provmaterialet på en stålplatta, vilket resulterar i att prov och matrix co-kristalliserar vid intorkning. Materialet bestrålas därefter med en UV-laser, som fokuserar på ett litet område (∅ 0,05-0,2 mm) i taget, vilket ger upphov till jonisering av biomolekyler i provet. Matrixen är essentiell för fullständig jonisering av molekylerna då den verkar som en protondonator till provmaterialet (27). Laserstrålens fotoner interagerar med det kristalliserade komplexet så att det sublimerar till gasform. Slumpmässiga kollisioner i gasmolnet resulterar därefter i överföring av laddning från matrixen till molekylerna i provet, vilket genererar protonerade och enkelladdade joner (25–27).
5
De enkelladdade jonerna lämnar stålplattan (desorption) och accelererar, under inverkan av ett elektrostatiskt fält, in i ett rör med vakuum (”TOF Mass analyzer”). De
protonerade molekylerna accelererar mot en jondetektor som är belägen i slutet av TOF-röret. Mindre joner rör sig fortare genom röret och följs av joner med gradvis ökande molekylvikt. Kollision med detektorn resulterar i ett masspektrum där intensiteten av kollisionerna visas på y-axeln medan molekylvikten visas på x-axeln (figur 2). Det faktiska värdet på x-axeln anger förhållandet m/z, men i och med att laddningen är 1 (z=1) erhålls massan (Dalton, Da) direkt. Förhållandet m/z för en jon erhålls utifrån den tid som förflyter innan jonen träffar detektorn (25,26). Masspektrat utgör ett så kallat ”peptide mass fingerprint” (PMF) då det är unikt för den mikroorganism som studeras. Vid artidentifiering jämförs den okända mikroorganismens PMF med referensspektra från olika databaser (28,29). Utifrån hur väl referensspektrat matchar med bakteriens PMF erhålls ett värde mellan 1,000 och 3,000, där ett värde över 2,000 innebär säker identifiering av genus och troligtvis även vad gäller artepitet (27).
Figur 2. Illustration av Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS). Prov och matrix (protondonator) inkuberas på en stålplatta, varpå bestrålning med laser orsakar jonisering av molekyler i provet. Jonerna accelererar in i ett vakuumrör (TOF mass analyzer) och kolliderar med en detektor, vilket generar ett masspektra över intensiteten av kollisionerna (arbitrary units [a.u.], y-axeln) i förhållandet till jonernas massa och laddning (m/z, x-axeln). Mindre joner accelererar snabbare genom vakuumröret och molekylvikten bestäms utifrån den tid som förflyter innan jonerna träffar detektorn. Figur av Saad B.
6
Detektion av antibiotikanedbrytning med MALDI-TOF MS
Artidentifiering har länge utgjort det huvudsakliga tillämpningsområdet för MALDI-TOF MS inom klinisk mikrobiologi. På senare tid har dock flera nya
applikationsområden utforskats, där vissa metoder eventuellt kan implementeras inom rutindiagnostiken på mikrobiologiska laboratorier (30). I samband med att förekomsten av antibiotikaresistenta bakteriestammar har ökat markant de senaste åren, har även behovet av snabba och kostnadseffektiva metoder för att detektera resistensmekanismer blivit större. Snabb detektion av antibiotikaresistens är grundläggande för att i ett tidigt skede kunna tillgodose adekvat antibiotikaterapi (31).
Ett flertal studier har publicerats där MALDI-TOF MS presenteras som verktyg för att detektera resistensmekanismer genom analys av β-laktamasaktivitet. I september 2011 publicerades de första två artiklarna där MALDI TOF MS användes som metod för att detektera karbapenemasaktivitet (14,32). Hrabák m.fl. demonstrerade att
karbapenemasaktivitet indirekt kunde observeras med MALDI TOF genom att analysera hydrolys av meropenem efter inkubering med karbapenemasproducerande
Pseudomonas aeruginosa, samt olika stammar inom familjen Enterobacteriaceae (32).
Burckhardt m.fl. utvecklade däremot ett protokoll för att detektera
karbapenemasaktivitet genom att analysera hydrolys och dekarboxylering av ertapenem in vitro med MALDI TOF MS (14). Sedan dess har flera försök utförts med olika antibiotika i syfte att utvärdera, optimera och skapa universella protokoll för metoden (33–36).
Resistens mot β-laktamantibiotika kan relativt enkelt detekteras med MALDI-TOF MS. När β-laktamaser hydrolyserar β-laktamringen uppkommer en förändring av
antibiotikans ursprungliga massa, som ökar med 18 Da genom addition av en
vattenmolekyl. Ofta sker även dekarboxylering av antibiotikans hydrolyserade form, vilket resulterar i ytterligare massförändring, där hydrolysproduktens massa reduceras med 44 Da. Fullständig hydrolys medför också att den ursprungliga mass-toppen av intakt antibiotika inte längre kan observeras. β-laktamasaktivitet kan således detekteras genom att påvisa ovan nämnda förändringar i masspektrat (31,37,38).
7
Trots att MALDI-TOF MS i återkommande försök har utforskats som metod för analys av antibiotikahydrolys, finns inte några tidigare publikationer där metoden används för att påvisa specifika mass-toppar vad gäller nedbrytning av Ceftolozan/Tazobaktam.
Syfte
Syftet med denna studie var att utvärdera om MALDI-TOF MS kan användas som en snabb metod för att påvisa enzymatisk nedbrytning av Ceftolozan/Tazobaktam, samt att utreda vilka enzymer som orsakar nedbrytning av antibiotikan. Detta för att påvisa om metoden kan användas på mikrobiologiska laboratorier för tidig detektion av
karbapenemasaktivitet.
Frågeställningar
• Kan nedbrytningsspecifika mass-toppar av Ceftolozan/Tazobaktam detekteras med MALDI-TOF MS?
8
MATERIAL OCH METOD
Bakteriestammar
Totalt användes sju karbapenemasproducerande bakterieisolat (tillhörande familjen
Enterobacteriaceae) för analys av enzymatisk nedbrytning av Ceftolozan/Tazobaktam.
Isolaten erhölls från Norges arktiska universitet i Tromsö och är väl studerade med avseende på β-laktamasproduktion (tabell 1). Utöver dessa stammar användes också en β-laktamasnegativ kontrollstam av E. coli (RS13). Isolaten inkuberades i 36 ͦ C över natt
på Columbia blodagar (3,7 % w/v Columbia blod agar bas [Oxoid, Basingstoke, England], 5,7% defibrinerat hästblod [Håtunalab, Bro, Sverige], i MilliQ-vatten). Bakterierna odlades även om varje dygn för att säkerställa att stammarna var aktiva och i tillväxtfas. Inför varje försök gjordes artidentifiering av samtliga isolat med MALDI Biotyper Compass (MBT Compass, Bruker Daltonics, Bremen, Tyskland), enligt tillverkarens beskrivning.
Tabell 1. Lista över karbapenemasproducerande bakteriestammar av Klebsiella pneumoniae och
Escherichia coli. Stammarna erhölls från Norges arktiska universitet, Tromsö.
Serienummer Bakterieart Karbapenemaser1 Andra β-laktamaser2
50572569 K. pneumoniae OXA-48 CTX-M-15, OXA-1, SHV-76, TEM-1B
50579417 E. coli OXA-48 CTX-M-14, CTX-M-15
50673720 E. coli NDM-7 CTX-M-15, OXA-1
50676002 E. coli NDM-1 CMY-6, CTX-M-15, OXA-1
50732159 K. pneumoniae KPC-3 SHV-11
50816743 E. coli OXA-181 CMY-2, CTX-M-15, OXA-1, TEM-1B
50857972 E. coli IMP-26 CTX-M-15
1 Oxacillinase (OXA), New Delhi metallo-β-lactamase (NDM), Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC), active-on-imipenem (IMP).
2 Cefotaxim-München (CTX-M), sulfhydryl variable (SHV), Temoniera (TEM), Active on cephamycins (CMY).
Analys av masspektra för intakt antibiotika
Initialt analyserades olika koncentrationer av Ceftolozan/Tazobaktam (ZerbaxaTM, MSD
Italia S.r.l., Anagni, Italien) med MALDI-TOF MS för att fastställa masspektrat av intakt antibiotika. Ceftolozan/Tazobaktam testades i koncentrationer om 1 mg/ml, 0,1 mg/ml och 0,01 mg/ml.
9
Antibiotikan löstes upp i inkuberingsbuffert (0,08% ammoniumbikarbonat i MilliQ-vatten, pH 8) till ovan nämnda koncentrationer. I samtliga efterföljande försök användes koncentrationen 1 mg/ml då tydligast masspektra av intakt antibiotika uppnåddes med denna koncentration. MALDI-TOF MS utfördes enligt beskrivning nedan.
Inkubering av bakterier och antibiotika
Cirka 1μl (en full plastinös) och 5 μl av respektive bakteriestam inokulerades i 50 μl inkuberingsbuffert, både utan och med Ceftolozan/Tazobaktam (1mg/ml). Därutöver bereddes även 50 μl av enbart inkuberingsbuffert och antibiotika. Proverna inkuberades i 36 ͦ C under omskakning (800 rpm) i 120 min respektive 270 min.
Analys av nedbrytning av Ceftolozan/Tazobaktam med MALDI-TOF MS
Efter inkubering centrifugerades samtliga prover under 2 min i 14 000 rpm, varpå 1 μl supernatant från respektive prov sattes tillsammans med 1 μl matrix (10mg/ml α-cyano-4-hydroxikinnaminsyra [α-CCA], 50% acetonitril, 0,1% trifluorättiksyra [Sigma-Aldrich, Darmstadt, Tyskland], i MilliQ-vatten.) på en MSP 96 stålplatta (Bruker Daltonics). Därutöver preparerades en position på MSP 96 plattan med enbart matrix (1 μl). Efter lufttorkning genomfördes MALDI-TOF MS med MicroflexTM
LT-masspektrometer (Bruker Daltonics), enligt följande inställningar i flexControl 3.4 (Bruker Daltonics):
AutoXecute method: Antibiotics, Ion Source 1: 18.00 kV, Ion Source 2: 16.20 kV, Lens: 5.40 kV, Pulsed Ion Extraction: 110 ns, detection gain: 1.76x, laser frequency: 60.0 Hz, laser attenuator minimum pos: 28.0%, laser attenuator maximum pos: 68.0%, mass range: 0 m/z - 1000 m/z.
Analys av respektive masspektra gjordes i mjukvaran flexAnalysis 3,4 (Bruker Daltonics). Samtliga masspektrum kalibrerades utifrån matrixens mass-toppar på 190 Da och 379 Da. Ytterligare bearbetning gjordes med verktyget ”Subtract Mass
Spectrum Baseline”. Förändringar i masspektrumen detekterades genom att jämföra det erhållna spektrat för bakterier i antibiotikalösning, med spektrat för intakt antibiotika (i inkuberingsbuffert) och matrix, samt med spektrat för enbart bakterier i
inkuberingsbuffert. Masspektrumen för de karbapenemasproducerande stammarna jämfördes även med spektrat för den β-laktamasnegativa kontrollstammen.
10
Statistisk analys
Ingen statistisk bearbetning har genomförts då metoden endast omfattar ett fåtal experiment och bakteriestammar.
11
RESULTAT
Inkubering i 120 min (1μl bakterier)
Efter 120 min inkubering med 1μl bakterier observerades tydligast nedbrytning av Tazobaktam och Ceftolozan hos K. pneumoniae med OXA-48 produktion (figur 3, C) respektive E. coli med IMP-26 produktion (figur 3, D). Därutöver detekterades även hydrolys och dekarboxylering av Ceftolozan hos NDM-7 producerande E. coli medan motsvarande mass-toppar för nedbrytning av Tazobaktam observerades hos E. coli med OXA-48 och NDM-7 produktion. Mass-toppen av intakt Ceftolozan observerades i alla masspektrum, dock med minskad intensitet.
Figur 3. Masspektrum över Ceftolozan/Tazobaktam (TOL/TAZ, 1mg/ml) efter inkubering med buffert (A) samt med en β-laktamasnegativ kontrollstam (B) respektive karbapenemasproducerande stammar (C-D). Intensiteten (arbitrary units [a.u.]) visas på y-axeln medan kvoten massa/laddning (m/z), mätt i Dalton (Da), visas på x-axeln. Klebsiella pneumoniae, med OXA-48 produktion, visar på hydrolys och
dekarboxylering av Tazobaktam (319,16 Da; [Tazobaktamhydr+H]+, 275,17 Da; [Tazobaktamdekarbox+H]+)
(C), medan Escherichia coli med IMP-26 produktion uppvisar motsvarande nedbrytning av Ceftolozan (684,77; [Ceftolozanhydr]+, 640,80; [Ceftolozandekarbox]+) (D). Därutöver detekterades ytterligare
mass-toppar, som inte kunde observeras för intakt TOL/TAZ, vars molekylvikt har markerats i masspektra C-D. Notera även intensitetsökningen på topparna 708 Da och 794 Da i masspektra C.
12
Inkubering i 270 min (1μl bakterier)
Efter 270 min inkubering med 1μl bakterier, påvisades nedbrytningstoppar av Ceftolozan hos OXA-48 producerande K. pneumoniae och NDM-7 producerande E.
coli. Dessa mass-toppar observerades tydligast hos K. pneumoniae (figur 4, C). Inga
nedbrytningstoppar detekterades för E. coli med IMP-26-produktion. Mass-toppen av intakt Ceftolozan hade emellertid lägst intensitet hos detta isolat (figur 4, D). En
nedbrytningstopp motsvarande dekarboxylering av Tazobaktam detekterades enbart hos
E. coli med NDM-7 produktion.
Figur 4. (A) Masspektrum för Ceftolozan/Tazobaktam (TOL/TAZ, 1mg/ml) efter inkubering med buffert. Intakt ceftolozan [Ceftolozan]+ och Tazobaktam ([Tazobaktam+H]+, [Tazobaktam+Na]+) kan observeras.
y-axel: intensitet (arbitrary units [a. u.]), x-axel: massa/laddning (m/z, mätt i Dalton, Da). (B)
Masspektrum för TOL/TAZ efter inkubering med en β-laktamasnegativ kontrollstam. (C) Masspektrum över TOL/TAZ efter inkubering med karbapenemasproducerande Klebsiella pneumoniae (OXA-48 produktion). Nedbrytning av Ceftolozan ses i form av mass-toppar motsvarande hydrolys (684,61 Da; [Ceftolozanhydr]+) och dekarboxylering (640,71 Da; [Ceftolozandekarbox]+). Därutöver detekterades
mass-topparna 309,26 Da, 486,90 Da och 750,70 Da, som inte kunde visualiseras i masspektrat för intakt antibiotika. (D) Masspektrum för TOL/TAZ efter inkubering med IMP-26 producerande Escherichia coli. Inga nedbrytningstoppar detekterades för denna stam. Intensiteten för mass-toppen av intakt antibiotika har dock minskat markant.
13
Inkubering i 120 min (5 μl bakterier)
När bakteriemängden ökades till 5μl kunde hydrolys av Ceftolozan detekteras hos samtliga karbapenemasproducerande isolat efter 120 min, med undantag för E. coli med NDM-1 produktion. Tydligast nedbrytning av Ceftolozan observerades emellertid hos
E. coli med IMP-26 produktion (figur 5, D). Hos E. coli med NDM-7 påvisades även
dekarboxylering av Tazobaktam (figur 5, C). Mass-toppen av intakt Ceftolozan observerades i samtliga masspektrum.
Figur 5. Masspektrum över Ceftolozan/Tazobaktam (TOL/TAZ, 1mg/ml) efter inkubering med enbart buffert (A), en β-laktamasnegativ kontrollstam (B) samt två karbapenemasproducerande Escherichia coli med NDM-7- respektive IMP-26 produktion (C-D). y-axeln visar intensiteten på mass-topparna medan x-axeln visar förhållandet massa/laddning (m/z), mätt i Dalton (Da). I masspektra A ses mass-toppar av intakt Ceftolozan ([Ceftolozan]+) och Tazobaktam ([Tazobaktam+H]+, [Tazobaktam+Na]+). I masspektra
C-D kan, förutom intakt Ceftolozan, även hydrolys av Ceftolozan (685,55 Da, 685,76 Da;
[Ceftolozanhydr+H]+) observeras. I masspektra C ses även dekarboxylering av Tazobaktam (275,14 Da;
[Tazobaktamdekarbox+H]+. Därutöver detekterades mass-toppar med molekylvikten 486,87 Da respektive
14
Inkubering i 270 min (5 μl bakterier)
Hydrolys av Ceftolozan påvisades hos isolat med IMP-26 (figur 6, D), KPC-3 och OXA-181 produktion efter 270 min inkubering med 5 μl bakterier. Hos övriga isolat detekterades inte några nedbrytningstoppar av Ceftolozan. Intensiteten för mass-toppen av inakt antibiotika hade emellertid minskat markant hos dessa, framförallt hos K.
pneumoniae med OXA-48 (figur 6, C). För Tazobaktam detekterades inte några
nedbrytningstoppar.
Figur 6. Masspektrum över Ceftolozan/Tazobaktam (TOL/TAZ, 1mg/ml) efter inkubering med buffert (A), en kontrollstam utan β-laktamasproduktion (B) samt karbapenemasproducerande Klebsiella
pneumoniae (OXA-48 produktion) och Escherichia coli (IMP-26 produktion) (C-D). Intensiteten
(arbitrary units [a.u.]) visas på y-axeln och förhållandet massa/laddning (m/z) på x-axeln. Kvoten m/z är ekvivalent med molekylvikten angett i Dalton (Da). I masspektra C-D ses en markant minskning av intensiteten på ett flertal mass-toppar, framförallt vad gäller intakt Ceftolozan ([Ceftolozan]+).
Mass-topparna för intakt Tazobaktam ([Tazobaktam+H]+, [Tazobaktam+Na]+) kunde inte heller observeras i
dessa masspektrum. Hydrolys av Ceftolozan (686,03 Da; [Ceftolozanhydr+H]+) ses emellertid i masspektra
15
DISKUSSION
Nedbrytning av Ceftolozan/Tazobaktam
Nedbrytning av Ceftolozan kunde detekteras för samtliga karbapenemasproducerande isolat, med undantag för NDM-1 producerande E. coli. Tydligast nedbrytning sågs efter 120 min inkubering när bakteriemängden höjdes från 1μl till 5μl, då flest stammar uppvisade hydrolys. Generellt medförde en längre inkuberingstid (270 min) inte till någon väsentlig förbättring vad gäller visualisering av hydrolys eller dekarboxylering. Detta indikerar således på att förhållandet mellan antibiotika och bakteriemängd hade större betydelse för resultatet än inkuberingstiden, i detta försök. En längre
inkuberingstid hade snarare motsatt effekt då vissa enzymer uppvisade nedbrytning efter 120 min men inte efter 270 min. Fler inkuberingstider med kortare tidsintervall bör dock undersökas eftersom intervallet mellan inkuberingstiderna i detta försök endast har överdrivits för att säkerställa detektion av nedbrytningstoppar.
När det gäller Tazobaktam detekterades mass-toppar motsvarande hydrolys respektive dekarboxylering hos både K. pneumoniae och E. coli med OXA-48 produktion samt hos
E. coli med NDM-7 produktion. Tazobaktam saknar således inte bara förmågan att
hämma aktiviteten hos enzymerna, utan tycks även brytas ner av dessa. Även om nedbrytningstoppar inte detekterades hos vissa isolat, kunde mass-topparna av intakt Tazobaktam inte observeras hos flertalet av stammarna. Mass-topparna av intakt Tazobaktam var emellertid svåra att detektera även hos den β-laktamasnegativa kontrollstammen, varför frånvaro av dessa toppar bör tolkas med försiktighet och inte nödvändigtvis innebär enzymatisk nedbrytning av antibiotikan. Till skillnad från Ceftolozan var nedbrytningen av Tazobaktam tydligast vid en mindre mängd bakterier. Dock kunde hydrolys- och dekarboxyleringstoppar visualiseras tydligare efter 120 min än efter 270 min, liksom för Ceftolozan.
I tidigare studier har det i vissa fall varit problematiskt att detektera
nedbrytningsprodukter av antibiotika med MALDI-TOF MS, vilket kan bero på att molekylerna bildar komplex med komponenter av lyserade celler (32,39). Detta skulle även kunna förklara varför vissa enzymer uppvisade nedbrytningstoppar efter 120 min men inte efter 270 min inkubering.
16
Lågt karbapenemasuttryck kan också försvåra visualisering av nedbrytningstoppar och ge upphov till falskt negativa resultat (32). Låg karbapenemasproduktion kan således förklara varför varken nedbrytning av Ceftolozan eller Tazobaktam kunde detekteras hos E. coli med NDM-1 produktion.
MALDI-TOF MS som metod för detektion av karbapenemasaktivitet
MALDI-TOF MS har flera fördelar över de molekylära och icke-molekylära metoderna för detektion av karbapenemasaktivitet. Metodens främsta styrka ligger i dess förmåga att snabbt generera resultat. Burckhardt m.fl. visade i sin studie att nedbrytning av ertapenem kunde detekteras som snabbast efter 1 timmes inkubering för vissa enzymer, och att den längsta inkuberingstiden för detektion av nedbrytning var cirka 2,5 timmar. Hur snabbt nedbrytning kan detekteras beror dock på enzymets nedbrytningsförmåga (14). Känslighetstest med diskdiffusion kräver minst 18 timmar innan resultatet kan granskas medan tidsåtgången för ett modifierat Hodge-test är cirka 24-48 timmar (13,14). Dessa metoder är således betydligt mer tidskrävande än MALDI-TOF MS som kan detektera karbapenemasaktivitet redan efter 1-2,5 timmar. Utöver detta är
modifierat Hodge-test även svårtolkat och har låg sensitivitet och specificitet (13,30). Med polymeraskedjereaktion (PCR) är det möjligt att erhålla resultat inom 4-6 timmar och metoden uppvisar även hög sensitivitet och specificitet. PCR utgör dock en hög kostnad för laboratorier och metoden är begränsad till detektion av kända gener som kodar för karbapenemaser. PCR kan följaktligen inte användas för att detektera okända karbapenemaser (13). Den initiala kostnaden för inköp av en masspektrometer är hög. Kostnaden per reaktion är emellertid lägre än för biokemiska tester eller
molekylärgenetiska tekniker, vilket medför att MALDI-TOF MS är mer kostnadseffektiv än dessa metoder (14,30).
MALDI-TOF MS uppvisar även relativt hög sensitivitet och specificitet. I en studie av Hrabák m.fl. påvisades nedbrytning av meropenem med MALDI-TOF MS. Totalt studerades 124 isolat, varav 30 var karbapenemasproducerande. Sensitiviteten beräknades till 96,67% medan specificiteten bestämdes till 97,87%. Därmed
demonstrerades att MALDI-TOF MS kan användas på mikrobiologiska laboratorier för analys av resistensmekanismer (32). Metoden har dock vissa begränsningar.
17
MALDI-TOF MS kan i nuläget inte användas för att detektera andra resistensmekanismer än β-laktamasproduktion, såsom förändringar i
cellväggspermeabilitet eller aktivering av effluxpumpar (14). Vid analys av nya antibiotika bör metoden också optimeras med avseende på buffert och matrix för att motverka förekomst av bakgrundstoppar, vilka kan försvåra tolkningen av resultatet (31,32).
I denna studie användes α-CCA som matrix medan bufferten omfattade
ammoniumbikarbonat. Trots att det gick att detektera nedbrytning av både Ceftolozan och Tazobaktam, försvårade bakgrundstoppar detektionen. Detta gällde framförallt för detektion av Tazobaktam och dess nedbrytningstoppar då de har en låg molekylvikt och återfinns i den del av masspektrat där flest matrix- och buffert-toppar finns. Det fanns även många bakgrundstoppar i samma område som mass-toppen för dekarboxylering av Ceftolozan, vilket försvårade tolkningen. En injektionsflaska Zerbaxa innehåller, utöver Ceftolozan och Tazobaktam, också natrium, vattenfri citronsyra, natriumklorid och arginin (19). Det är således möjligt att även dessa ämnen ger upphov till
bakgrundstoppar.
Hrabák m.fl. undersökte i en studie huruvida olika typer av buffert- och matrix-lösningar påverkade mängden bakgrundstoppar vid analys av enzymatisk nedbrytning av meropenem. Utöver α-CCA, testades dihydroxibensoesyra (DHB) och 2,5-dihydroxiacetofenon (DHAP) som matrix. Endast när DHB-matrix användes
tillsammans med Tris-HCl som buffert, erhölls masspektrum utan en signifikant mängd bakgrundstoppar (32).
Utöver att optimera metoden med avseende på buffert och matrix, är det även viktigt att förhållandet mellan mängden antibiotika och bakterier är optimalt, vilket har
demonstrerats i denna studie. När bakteriemängden ökades till 5 μl sågs en markant skillnad i antalet isolat som uppvisade nedbrytning av Ceftolozan. Mass-toppen av intakt antibiotika kunde trots detta observeras i alla masspektrum vilket tyder på att antibiotikakoncentrationen var för hög i förhållande till bakteriemängden, för att kunna observera fullständig hydrolys. Det är således nödvändigt att testa fler och större mängder bakterier för att erhålla ett optimalt förhållande mellan bakteriemängd och antibiotikakoncentration.
18
En nackdel med MALDI-TOF MS är att mass-toppar, som inte utgör hydrolys eller dekarboxylering, är svåra att tolka. Vissa mass-toppar (m/z: 309 Da, 487 Da, 751 Da) identifierades återkommande i olika masspektrum efter inkubering med
karbapenemasproducerande isolat. Dessa toppar kunde varken detekteras i masspektrat av enbart buffert och antibiotika eller i masspektrat av enbart bakterier och buffert. De observerades inte heller i masspektrat för den β-laktamasnegativa kontrollstammen. Det går dock inte att avgöra om mass-topparna utgör någon form av nedbrytningsprodukter eller om de kan härledas till andra komponenter i proverna. Därutöver försvann även ett flertal mass-toppar i området 400-500 Da, framförallt efter inkubering med en större mängd bakterier.
Etiska överväganden
I studien användes inget humanbiologiskt material och inga personuppgifter
bearbetades. Det laborativa arbetet omfattade endast användning av bakteriestammar och krävde således inget etiskt tillstånd då lagen om etikprövning endast tillämpas på forskning som avser människor (40). Den som arbetar med mikrobiologiskt material har emellertid en moralisk och etisk skyldighet att eftersträva hög biosäkerhet, både för sin egen och för samhällets säkerhet. Detta förutsätter att den som arbetar med
mikroorganismer är kompetent inom området och har kunskap om de biologiska agens som studeras samt hur smittöverföring sker. Biosäkerhet är särskilt viktigt vid studier som omfattar multiresistenta bakterier då de redan utgör ett stort problem för sjukvården och har ökat markant under de senaste åren.
Slutsats
MALDI-TOF MS är en snabb, billig och relativt enkel metod för att detektera karbapenemasaktivitet. Hydrolys av Ceftolozan kunde observeras hos samtliga karbapenemasproducerande isolat, med undantag för E. coli med NDM-1 produktion. Nedbrytningstoppar av Tazobaktam detekterades hos både K. pneumoniae och E. coli med OXA-48 produktion samt hos E. coli med NDM-7 produktion. Tydligast
nedbrytning observerades efter 120 min. Metoden bör dock optimeras med avseende på matrix, buffert och antibiotikakoncentration för att tydligare visualisera nedbrytningen. Fler försök krävs även för att kunna tillämpa statistisk bearbetning och beräkna
19
REFERENSER
1. Paterson DL. Resistance in gram-negative bacteria: Enterobacteriaceae. American Journal of Infection Control. 01 juni 2006;34(5, Supplement):S20–8.
2. Saran O, Sulik-Tyszka B, Basak GW, Wróblewska MM. Activity of Ceftolozane/Tazobactam Against Gram-Negative Rods of the Family
Enterobacteriaceae and Pseudomonas Spp. Isolated from Onco-Hematological Patients Hospitalized in a Clinical Hospital in Poland. Med Sci Monit. 10 januari 2019;25:305–11.
3. Papp-Wallace KM, Endimiani A, Taracila MA, Bonomo RA. Carbapenems: Past, Present, and Future ▿. Antimicrob Agents Chemother. november
2011;55(11):4943–60.
4. Pandey N, Cascella M. Beta Lactam Antibiotics. I: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2020 [citerad 11 april 2020]. Tillgänglig vid: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK545311/
5. Sauvage E, Kerff F, Terrak M, Ayala JA, Charlier P. The penicillin-binding proteins: structure and role in peptidoglycan biosynthesis. FEMS Microbiology Reviews. 2008;32(2):234–58.
6. Zapun A, Contreras‐Martel C, Vernet T. Penicillin-binding proteins and β-lactam resistance. FEMS Microbiology Reviews. 2008;32(2):361–85.
7. Bush K. Past and Present Perspectives on β-Lactamases. Antimicrob Agents Chemother. 24 september 2018;62(10):e01076-18.
8. Kapoor G, Saigal S, Elongavan A. Action and resistance mechanisms of antibiotics: A guide for clinicians. J Anaesthesiol Clin Pharmacol. 2017;33(3):300–5.
9. Bush K, Jacoby GA, Medeiros AA. A functional classification scheme for beta-lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob Agents Chemother. juni 1995;39(6):1211–33.
20
10. Ambler RP, Coulson AF, Frère JM, Ghuysen JM, Joris B, Forsman M, m.fl. A standard numbering scheme for the class A beta-lactamases. Biochem J. 15 maj 1991;276(Pt 1):269–70.
11. Lee JH, Bae IK, Hee Lee S. New definitions of extended-spectrum β-lactamase conferring worldwide emerging antibiotic resistance. Medicinal Research Reviews. 01 januari 2012;32(1):216–32.
12. Shaikh S, Fatima J, Shakil S, Rizvi SMohdD, Kamal MA. Antibiotic resistance and extended spectrum beta-lactamases: Types, epidemiology and treatment. Saudi J Biol Sci. januari 2015;22(1):90–101.
13. Nordmann P, Gniadkowski M, Giske CG, Poirel L, Woodford N, Miriagou V. Identification and screening of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Clinical Microbiology and Infection. 01 maj 2012;18(5):432–8.
14. Burckhardt I, Zimmermann S. Using Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry To Detect Carbapenem Resistance within 1 to 2.5 Hours. J Clin Microbiol. september 2011;49(9):3321–4.
15. Hong M-C, Hsu DI, Bounthavong M. Ceftolozane/tazobactam: a novel
antipseudomonal cephalosporin and β-lactamase-inhibitor combination. Infect Drug Resist. 29 november 2013;6:215–23.
16. Barnes MD, Taracila MA, Rutter JD, Bethel CR, Galdadas I, Hujer AM, m.fl. Deciphering the Evolution of Cephalosporin Resistance to Ceftolozane-Tazobactam in Pseudomonas aeruginosa. mBio. 11 december 2018;9(6):e02085-18.
17. Zhanel GG, Chung P, Adam H, Zelenitsky S, Denisuik A, Schweizer F, m.fl. Ceftolozane/Tazobactam: A Novel Cephalosporin/β-Lactamase Inhibitor
Combination with Activity Against Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacilli. Drugs. 01 januari 2014;74(1):31–51.
18. Skalweit MJ. Profile of ceftolozane/tazobactam and its potential in the treatment of complicated intra-abdominal infections. Drug Des Devel Ther. 04 juni
21
19. Zerbaxa - FASS Vårdpersonal [Internet]. [citerad 05 april 2020]. Tillgänglig vid: https://www.fass.se/LIF/product?userType=0&nplId=20140903000081#compositio n
20. PubChem.
(6R,7R)-3-[[3-Amino-4-(2-aminoethylcarbamoylamino)-2- methylpyrazol-1-ium-1-yl]methyl]-7-[[(2E)-2-(5-amino-1,2,4-thiadiazol-3-yl)-2-(2- carboxypropan-2-yloxyimino)acetyl]amino]-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid;hydrogen sulfate [Internet]. [citerad 05 april 2020].
Tillgänglig vid: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/11592969 21. PubChem. Ceftolozane [Internet]. [citerad 12 april 2020]. Tillgänglig vid:
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/53234134
22. PubChem. Tazobactam sodium [Internet]. [citerad 05 april 2020]. Tillgänglig vid: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/23663400
23. PubChem. Tazobactamum [Internet]. [citerad 05 april 2020]. Tillgänglig vid: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/56012
24. Wi YM, Greenwood-Quaintance KE, Schuetz AN, Ko KS, Peck KR, Song J-H, m.fl. Activity of Ceftolozane-Tazobactam against Carbapenem-Resistant, Non-Carbapenemase-Producing Pseudomonas aeruginosa and Associated Resistance Mechanisms. Antimicrob Agents Chemother. 21 december 2017;62(1):e01970-17. 25. Singhal N, Kumar M, Kanaujia PK, Virdi JS. MALDI-TOF mass spectrometry: an
emerging technology for microbial identification and diagnosis. Front Microbiol. 2015;6:791 doi: 10.3389/fmicb.2015.00791.
26. Patel R. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in clinical microbiology. Clin Infect Dis. augusti 2013;57:564–72.
27. Clark AE, Kaleta EJ, Arora A, Wolk D. Matrix-Assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry: A fundamental shift in the routine practice of clinical microbiology. Clinical microbiology reviews. juli 2013;26(3):547–603.
22
28. Fenselau C, Demirev PA. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 2001;20(4):157–71.
29. Gu M, Buckley M. Semi-supervised machine learning for automated species
identification by collagen peptide mass fingerprinting. BMC Bioinformatics. 26 juni 2018;19:241.
30. Hrabák J, Chudáčková E, Walková R. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry for Detection of Antibiotic Resistance Mechanisms: from Research to Routine Diagnosis. Clin Microbiol Rev. januari 2013;26(1):103–14.
31. Sparbier K, Schubert S, Weller U, Boogen C, Kostrzewa M. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry-Based Functional Assay for Rapid Detection of Resistance against β-Lactam Antibiotics. J Clin Microbiol. mars 2012;50(3):927–37.
32. Hrabák J, Walková R, Študentová V, Chudáčková E, Bergerová T. Carbapenemase Activity Detection by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry. J Clin Microbiol. september 2011;49(9):3222–7.
33. Lasserre C, De Saint Martin L, Cuzon G, Bogaerts P, Lamar E, Glupczynski Y, m.fl. Efficient Detection of Carbapenemase Activity in Enterobacteriaceae by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization−Time of Flight Mass Spectrometry in Less Than 30 Minutes. J Clin Microbiol. juli 2015;53(7):2163–71.
34. Papagiannitsis CC, Študentová V, Izdebski R, Oikonomou O, Pfeifer Y, Petinaki E, m.fl. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass
Spectrometry Meropenem Hydrolysis Assay with NH4HCO3, a Reliable Tool for Direct Detection of Carbapenemase Activity. J Clin Microbiol. maj
23
35. Oviaño M, Sparbier K, Barba MJ, Kostrzewa M, Bou G. Universal protocol for the rapid automated detection of carbapenem-resistant Gram-negative bacilli directly from blood cultures by matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). International Journal of Antimicrobial Agents. 01 december 2016;48(6):655–60.
36. Ota Y, Furuhashi K, Nagao Y, Nanba T, Yamanaka K, Ishikawa J, m.fl. Detection of extended-spectrum β-lactamases producing Enterobacteriaceae using a matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry based MBT STAR-BL software module with β-lactamase inhibition assay depends on the bacterial strains. Journal of Microbiological Methods. 01 december
2019;167:105734.
37. He X, Mezyk SP, Michael I, Fatta-Kassinos D, Dionysiou DD. Degradation kinetics and mechanism of β-lactam antibiotics by the activation of H2O2 and Na2S2O8 under UV-254nm irradiation. Journal of Hazardous Materials. 30 augusti
2014;279:375–83.
38. Burckhardt I, Zimmermann S. Susceptibility Testing of Bacteria Using Maldi-Tof Mass Spectrometry. Front Microbiol. 06 augusti 2018;9:1744.
39. Hrabák J, Študentová V, Walková R, Žemličková H, Jakubů V, Chudáčková E, m.fl. Detection of NDM-1, VIM-1, KPC, OXA-48, and OXA-162 Carbapenemases by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry. J Clin Microbiol. juli 2012;50(7):2441–3.
40. Riksdagsförvaltningen. Lag (2003:460) om etikprövning av forskning som avser människor Svensk författningssamling 2003:2003:460 t.o.m. SFS 2019:1144 - Riksdagen [Internet]. [citerad 02 maj 2020]. Tillgänglig vid:
