Immunokemiska analyser på Siemens
ADVIA Centaur XPT
TMStabilitet över tid och jämförelse av analyser i plasma och serum
Immunochemical assays on Siemens ADVIA
Centaur XPT
TMStability during storage and comparison of the assays in plasma and serum
Författare: Angelina Novak
Vårterminen 2021
Examensarbete: Grundnivå (G2E), 15 högskolepoäng Huvudområde: Biomedicinsk laboratorievetenskap Biomedicinska analytikerprogrammet, inriktning laboratoriemedicin
BMLV, Examensarbete, 15 högskolepoäng
Institutionen för hälsovetenskaper, Örebro universitet. Handledare: Dieter Samyn, PhD, Sjukhuskemist. Emma Oliv, Biomedicinsk analytiker. Paul Pettersson-Pablo, specialistläkare, PhD.
Laboratoriemedicinska kliniken, Klinisk Kemi, USÖ Examinator: Gabriella Lillsunde-Larsson, lektor, Örebro universitet
SAMMANFATTNING
Vid utförande av immunokemiska analyser används serum och plasma. Advia Centaur XPT är det instrument som används på Centrallaboratoriet Universitetssjukhuset Örebro inom immunokemi. Metoden baseras på kemiluminescens med mono- och/eller polyklonala antikroppar och akridiumester som utgör basen för detektion med direkt kemiluminescens. Instrumentet använder två typer av metoder: sandwichmetod och kompetitiv metod. Studien gick ut på att utföra analys av thyroideastimulerande hormon, fritt tyroxin, fritt trijodtyronin, thyroid peroxidas antikroppar, ferritin, pro B-typ natriuretisk peptid och högkänslig Troponin I på serum och plasma från 25 individer, vid 0-tidpunkt och efter 24, 48 och 72 timmar. Analysresultaten och skillnaderna mellan de två matriserna och tidpunkterna utreddes för statistiskt signifikanta och medicinskt betydelsefulla skillnader. De flesta analyterna visade stabilt resultat över tid och att de kan sparas och analyseras fram till 72 timmar, förutom TPO-antikroppar som verkar vara en instabil och känslig analys. Resultatet av jämförelsen mellan serum och plasma visade inte signifikant skillnad varför det går att övergå till alternativ matris serum/plasma i fall originalmatrisen (serum/plasma beroende på analys) saknas.
ABSTRACT
Serum and plasma are used in performing immunochemical analyzes. Advia Centaur XPT instruments are used in immunochemistry at the Central Laboratory at Örebro University Hospital. The method is based on chemiluminescence with the use of mono- and/or polyclonal antibodies, and acridium ester for direct chemiluminescence detection. The instrument uses two types of methods: sandwich method and competitive method. The study focused on performing analysis for thyroid stimulating hormone, free thyroxine, free triiodothyronine, thyroid peroxidase antibodies, ferritin, pro B-type natriuretic peptide and highly sensitive Troponin I on serum and plasma from 25 individuals, at time 0 and after 24, 48 and 72 hours. The results between the different time points and the two matrices, were examined to determine whether there was any statistically significant or medically unacceptable bias. Most analytes showed stable results over time and that they can be used and analyzed up to 72 hours, except for TPO antibodies which appear to be an unstable and sensitive analysis. Results in comparison between serum and plasma did not show a significant difference and therefore it is possible to switch to an alternative matrix serum/ plasma in cases where the original matrix (serum / plasma depending on analysis) is missing.
FÖRKORTNINGSLISTA
Akridium Ester (AE)
Bovint serum albumin (BSA) Ferritin (Ferr)
Fritt tyroxin (fT4) Fritt trijodtyronin (fT3)
Fluoresceinisotiocyanat (FITC) Högkänslig Troponin I (hs-TNI) Paramagnetiska partiklar (PMP)
Pro B-typ natriuretisk peptid (pro-BNP) Reference change values (RCV)
Thyroid peroxidas antikroppar (a-TPO) Thyroideastimulerande hormon (TSH) Korrelationskoefficienten (R)
Innehållsförteckning
1. INTRODUKTION ...1
1.1 Skillnad mellan plasma och serum ...1
1.2 Siemens Centaur XPT ...2 1.3 Immunokemi ...2 1.4 Kemiluminiscensteknik ...3 1.5 Ferritin ...6 1.6 NT-proBNP ...6 1.7 Troponin I ...7 1.8 TPO antikroppar ...7 1.9 TSH ...8
1.10 Tyroxin och trijodtyronin ...8
1.11 Kvalitetssäkring och ackreditering ...9
1.11.1 Interna kvalitetskontroller ...9
1.11.2 Externa kvalitetskontroller ...10
1.11.3 Ackreditering ...10
1.12 Syfte ...10
1.13 Frågeställningar ...11
2. MATERIAL OCH METOD ...12
2.1 Etiska aspekter ...12 2.2 Provmaterial ...12 2.3 Förberedelse av provmaterial ...12 2.4 Analysprocedur för ferritin ...12 2.5 Analysprocedur för pro-BNP ...13 2.6 Analysprocedur för hs-TNI ...13 2.7 Analysprocedur för Anti-TPO ...14 2.8 Analysprocedur för TSH ...14 2.9 Analysprocedur för T4 ...15 2.10 Analysprocedur för T3 ...16
2.11 Bearbetning av data samt statistisk analys ...16
2.11.1 Verifiering av serum eller plasma på Centaur XPT ...16
2.11.2 Hållbarhet av analyter vid olika förvarningsintervall ...17
3. RESULTAT ...18
3.2 Jämförelse av matriser ...21
4. DISKUSSION ...24
5. SLUTSATS ...29
6. TACK/ACKNOWLEDGEMENT ...30
1. INTRODUKTION
1.1 Skillnad mellan plasma och serum
Humant blod är en av de vanligaste kroppsvätskorna som analyseras på Centrallaboratoriet Universitetssjukhuset Örebro (USÖ). Förutom blodceller såsom röda blodkroppar, vita blodkroppar och blodplättar består blodet av 55 % plasma (1).
Plasma är en gulaktig flytande blodkomponent som innehåller 91% till 92% vatten och 8% till 9% blodplasmaproteiner. Det finns olika typer av plasmaproteiner, som bidrar till olika processer. Till exempel albumin och globulin hjälper till att upprätthålla det kolloidalosmotiska trycket i blodet, fibrinogen som deltar vid blodkoagulering, och immunglobuliner som hjälper till att bekämpa infektioner. Enzymer och hormoner som deltar vid kroppens olika funktioner, till exempel ämnesomsättning. Förutom proteiner innehåller plasma även vitaminer, elektrolyter som natrium, kalium, bikarbonat, klorid och kalcium. I plasma cirkulerar upplösta näringsämnen, såsom glukos, aminosyror, fettsyror och avfallsprodukter, såsom koldioxid och mjölksyra (1).
Vid biologiska och kliniska studier är inte bara humant plasma av intresse men även serum. För att kunna analysera serum eller plasma måste helblod samlas in i provrör anpassade för antingen framställning av plasma och serum. Efter insamling genomgår blodet olika biokemiska processer och innehåller olika beståndsdelar i dessa rör.
Plasma erhålls från blod som samlats upp med ett antikoagulerande medel som till exempel EDTA, heparin, citrat, som centrifugeras senare. Under centrifugering avlägsnas vita blodkroppar, röda blodkroppar och en varierande mängd blodplättar. Plasma innehåller relativt omodifierade koagulationsproteiner med varierande grader av blodplättkomponenter. Frysning av plasmaprov resulterar i lysering av blodplättar och frisättning av komponenterna från membran och intracellulära molekyler. Därför kan blodplättarnas metaboliter bidra till skillnader mellan serum- och plasmas metabolitprofiler (2, 3).
Serum erhålls från helblod som samlats in i rör utan tillsats av antikoagulant. Fibrinkoaglet bildas under koagulationen, och tillsammans med blodcellerna och en majoritet av kvarvarande cellulärt material avlägsnas genom centrifugering. Trombocyter aktiveras under denna process och frigör proteiner till exempel proinflammatoriska cytokiner och metaboliter såsom sfingosin-1-fosfat i serumet (2, 3).
Eftersom serum och plasma har både liknande och skilda komponenter kan dessa skillnader vara en viktig faktor för urval av matris som ska användas i kliniska undersökningar (2, 3).
1.2 Siemens Centaur XPT
Advia Centaur XPT immunanalyssystem, tillverkat av Siemens Healthineers, är ett helt automatiserat instrument. Det kan vara en del av ett gemensamt spårsystem för sortering, transport och analys av patientprover. Instrumenten stöder analys och diagnos för mer än 70 analyser, med en maximal kapacitet på 30 analyser ombord. En provvolym på 10-200 µl prov förbrukas per test (analysberoende), med en genomströmningskapacitet kan skalas upp till 240 test per timme. Dessa funktioner resulterar i att manuella hanteringsprover undviks, minskad arbetsbelastning för personalen och behandlingstid. En översikt över de olika analyterna presenteras i tabell 1 (4).
Figure 1. ADVIA Centaur XPT (Siemens Healthineers, Tyskland). Källa: https://www.siemens-healthineers.com/immunoassay/systems/advia-centaur-xpt
1.3 Immunokemi
Som tidigare nämnts är serum och plasma bland de vanligaste matriser som används på laboratoriet vid kliniska undersökningar. Bland annat i immunokemi.
Immunokemiska tekniker baseras på en reaktion av en antigendeterminant med immunglobuliner, eller antikroppar och bindningsställe. Antikroppar är proteiner som används av immunsystemet för att upptäcka och oskadliggöra främmande ämnen (till exempel bakterier, virus etc.). De antikroppar som rutinmässigt används i immunokemiska metoder är antigen mono- eller polyklonala former som produceras på olika sätt (5).
B-lymfocyter. Dessa är framställda i laboratoriet med hybridomteknologi, vilken är baserat på cellulär fusion av en tumörcell och B-celler hos immuniserade möss.
Monoklonala antikroppar är riktade mot enstaka epitop (vilken är en specifik del av antigen) och de alla är identiska kopior av en immunoglobulinmolekyl med samma primära struktur och specificitet av antigenbindningsstället (5).
Polyklonala antikroppar framställs genom immunisering i ett antal djurarter med antigenet, och kräver inte hybridomteknologi. Blodserum från det immuniserade djuret som innehåller antikroppar mot det antigen som används kallas ett antiserum. Eftersom varje epitop stimulerar olika kloner av B-celler och komplexa antigener har flera epitoper, innehåller antiserumet en blandning av monoklonala antikroppar, som skiljer sig åt i deras affinitet och specificitet mot specifika epitoper på antigenet som används för immunisering (5).
Monoklonala antikroppar är epitopspecifika medan polyklonala antikroppar är antigenspecifika. Denna skillnad är grundläggande för hur de kan användas för både diagnostik och terapi (5).
Immunokemi är enkel, snabb, robust men känslig och i de flesta fall lämplig att automatisera, vilket tillämpas på rutinanalyser i kliniska laboratorier. Immunokemiska metoder kräver vanligtvis inte omfattande och destruktiva förbehandlingar av prover. De flesta metoder som används är baserade på foto-, fluoro- eller luminometrisk detektion (6).
1.4 Kemiluminiscensteknik
Kemiluminiscens uppstår när ljusemissionen orsakas av produkterna från en specifik kemisk reaktion. Detektionsenhet för kemiluminescerande metoder har ett fotomultiplikatorrör som används för att detektera det emitterade ljuset. Metoden är inte i behov av interferensfilter, prisman som krävs i spektroskopi och fluorometri till exempel, vilket medför att detektionssystemet blir billigare (7, 8).
I immunanalyser kan kemiluminescerande markörer fästas till ett antigen eller en antikropp. Det finns två olika metoder: kompetitiv och sandwich metoder. Små analyter, som steroidhormoner, mäts med det kompetitiv metod. Större analyter, såsom proteinhormoner mäts med sandwich metod (7).
I en sandwich metod (tabell 1) binder provantigenet till en antikropp som är fixerad till en fast fas, sedan en annan antikropp, märkt med en kemiluminescerande ämne, binder
till antigenantikroppskomplexet på den fasta fasen och emitterar ett ljus som är direkt proportionellt mot analytkoncentrationen i sandwichmetoden (7).
I en kompetitiv metod (tabell 1) konkurrerar en bestämd mängd märkta antigen om antikroppsbindande ställen med omärkta antigen från ett patientprov. I en kompetitiv metod är mängden ljus som emitteras omvänt proportionell mot mängden analyt (antigen). ”Fasta fasen” består av paramagnetiska partiklar, som snabbt aggregeras under ett externt magnetfält. När det yttre magnetfältet tas bort kommer dem magnetiska partiklarna att åter suspenderas i en lösning, vilket medger ett tvättsteg. Paramagnetiska pratiklar kan märkas med antikroppar eller antigen (9).
För analyserna som utförs på kemiinstrumentet ADVIA Centaur XPT används dimetyl formen av akridinium ester som markör för direkt kemiluminescens. När den reagerar med väteperoxid avger akridiniumestern en intensiv blå blixt som är cirka 440 nm. Vid direkt kemiluminiscens mäts ljusenergi direkt utan tillsats av ett substrat eller katalysator (7).
Analyter som har analyserats i serum och plasma i denna studie på ADVIA Centaur var Thyroideastimulerande hormon (TSH), fritt tyroxin (fT4) och fritt trijodtyronin (fT3), Thyroid peroxidas antikroppar (TPO-ak) och serum användes som originalmatris för dessa analyter. Medan för ferritin, pro B-typ natriuretisk peptid (NT-pro BNP), högkänslig Troponin I (hs-TNI) användes plasma som originalmatris.
Tabell 1. Beskrivning av de olika metoder som används vid analys för olika analyter. Förkortningar PMP står för paramagnetiska partiklar, AE står för akridinium ester, BSA betyder bovint serumalbumin och FITC står för fluoresceinisotiocyanat.Bilderna är återgivna med tillåtelse från Dieter Samyn.
Polyklonal anti-ferritin antikropp från get märkt med AE och monoklonal anti-ferritin-antikropp från mus, som är kovalent kopplad till
paramagnetiska partiklar (12).
Biotinylerad monoklonal anti-human antikropp från får, specifik för PBNP och AE-märkt monoklonalt anti-human PBNP F(ab')2-fragment från får, specifikt för PBNP.
Biotinylerade antikroppen binds till magnetiska partiklar belagda med streptavidin (13). Magnetiska latexpartiklar konjugerade med streptavidin med bundna biotinylerade
infångade monoklonala antikroppar som känner igen en cTnI-epitop. Och ett konjugat uppbyggt av en AE och ett rekombinant anti-humant cTnI Fab från får kovalent bundet till bovint serumalbumin (14).
Anti-FITC monoklonal antikropp bunden till paramagnetiska partiklar, en FITC-märkt anti-TSH monoklonal infångningsantikropp och ett spårämne bestående av en AE och en anti-TSH mAb antikropp konjugerad till bovint
serumalbumin (16).
FT3 i patientprovet konkurrerar med en T3-analog som är kopplad till paramagnetiska partiklar för en begränsad mängd av en kombination av AE-märkta monoklonala anti-T3antikroppar från mus (18).
FT4 i patientprovet konkurrerar med AE-märkta T4 om en begränsad mängd biotinylerad polyklonal anti-T4-antikroppar från kanin. Biotin-märkt anti-T4 binder till avidin som är kovalent kopplat till paramagnetiska partiklar (17).
Autoantikroppar mot TPO i patientprovet konkurrerar med monoklonalt anti-TPO antikroppar från mus, som är kopplade till paramagnetiska partiklar för en begränsad mängd humant TPO komplexbundet med AE-märkt monoklonal anti-TPO antikropp från mus (15).
1.5 Ferritin
Ferritin är ett intracellulär protein bestående av järnmolekyler bundna till apoferritin, Ferritin har stor betydelse för absorption, lagring och frisättning av järn. Apoferritin finns normalt i låg koncentration i alla kroppens celler, dess syntes ökar vid järntillförsel för då stiger järnkoncentration i cellerna. Ferritin finns i många celler men framför allt i lever, mjälte, benmärg, i så kallad retikuloendoteliala celler. En liten mängd som finns lagrad i ferritin släpps ut i extracellulärvätskan, 25 % av det totala järnet i kroppen finns i lagrad form och största del av detta järn lagras som ferritin. På så sätt avspeglar koncentrationen av ferritin i plasma storleken på järndepåerna i kroppen och det aktuella intaget av järn. I ferritin finns järn i kolloidal Fe3+-form bundet till hydroxyfosfat, i denna form är järnet
svårtillgängligt. Genom reduktion till Fe2+ frigörs järnet och tillgängliggörs för
järnkrävande metabola processer. Järn behövs för erytropoes och när behovet av järn ökas frisläpps järnmolekylerna från apoferritin och binder till transferrin, som ett cirkulerande plasmaprotein vars funktion är att transportera järn till de erytropoetiska cellerna. Plasmaferritin är inte beroende av koncentrationen transferrinbundet järn. Ferritin i plasma ökar vid inflammatoriska tillstånd, såväl kroniska som till exempel malignitet med metastaser, men även vid akuta tillstånd som hjärtinfarkt och pneumoni och därmed kan en samtidig järnbrist döljas. Mycket höga värden ses vid hemokromatos och svåra leverskador, låga värden på ferritin ses vid järnbristanemi (10, 11, 12).
1.6 NT-proBNP
Förutom en pumpfunktion har hjärtat även en endokrin, natriuretisk funktion. Vänsterkammardysfunktion är en följd av försämrad hjärtats funktion. Natriuretiska peptider kan användas vid diagnosering av kliniska problem som är förknippade med vänsterkammardysfunktion. Till dessa natriuretiska peptider räknas: atriell natriuretisk peptid (ANP), natriuretisk peptid B-typ (BNP) och natriuretisk peptid C-typ (CNP). Båda ANP och BNP har natriuretiska och diuretiska egenskaper. De fungerar som antagonister av renin-angiotensin-aldosteron-systemet, på så sätt påverkar ANP och BNP elektrolyt- och vätskebalansen i kroppen. Hormon-förstadiet pro-BNP består av 108 aminosyror och finns framför allt i kammarens myocyter. Pro-BNP utsöndras av hjärtats vänstra kammare och i den här processen klyvs till BNP som består av 32 aminosyror och aminoterminalt NT-proBNP, båda BNP och NT-proBNP bildas parallellt. BNP är det bioaktiva fragmentet av de båda, som ökar vatten- och natrium utsöndringen i njurarna. NT-pro
BNP är inte bioaktivt. Hos patienter med vänsterkammardysfunktion ökar koncentrationerna av BNP i serum och plasma, liksom koncentrationerna av det biologiskt inaktiva pro-BNP. Mätning av BNP och NT-pro BNP har prognostiskt värde för morbiditet och mortalitet vid hjärtsjukdom, framför allt hjärtsvikt. Den är också användbar för att avgöra om sviktsymptom har kardiella eller icke kardiella orsaker (10, 11, 13).
1.7 Troponin I
Troponiner är myofibrillära proteiner som ingår i den kontraktila apparaten i tvärstrimmig muskulatur. Troponin I finns i tre olika isoformer: hjärtmuskel, långsam skelettmuskel och snabb skelettmuskel. Varje isoform är kodad av en distinkt gen med en unik aminosyrasekvens. Kardiellt troponin I (cTnI) är ett inhiberande protein i troponin-tropomyosin-komplexet. cTnI är specifik för hjärtmuskel och uttrycks inte i skelettmuskler. Dess unika struktur möjliggör specifik monoklonal antikroppsutveckling. Förhöjd koncentration av dessa hjärtmarkörer kan ses vid hjärtinfarkt. De förhöjda värdena kan ses upp till två veckor efter debut, beroende på infarktens storlek. Det finns en rekommendation att provtagning sker vid flera olika tidpunkter för att kunna detektera den typiska ökning och minskning av troponinnivåerna över tid som är utmärkande för hjärtinfarkt. Ökning och minskning av troponinnivåerna över tid kan hjälpa särskilja hjärtinfarkt från förhöjningar av troponinnivån associerade med andra tillstånd som till exempel njursvikt, arytmier, lungemboli, kronisk njursjukdom, myokardit eller kardiotoxicitet (10, 11, 14).
1.8 TPO antikroppar
Tyreoperoxidas (TPO) är ett stort membranbundet glykosylerade heminnehållande protein, som i sköldkörtelceller är lokaliserat till follikelcellernas apikala delar. Tyreoperoxidas är involverad i joderingen av tyreoglobulin och därmed i bildningen av T3 och T4. TPO-antikroppar påvisas vid autoimmuna processer i sköldkörteln. Dessa antikroppar aktiverar komplement och anses vara engagerade i sköldkörtelns dysfunktion och orsakerna till hypotyreos. TPO-antikroppar finns hos nästan alla patienter med Hashimotos tyroidit och patienterna med Graves sjukdom. Dessa antikroppar finns även hos patienter med atrofisk tyreoidit och primärt myxödem. Koncentration av TPO-antikroppar stiger med åldern och hos kvinnor är andelen större än hos män. Koncentration av TPO-antikroppar påverkas av follikelcellernas aktivitet. TSH-
stimulering av follikelcell associeras med ökad TPO antikroppskoncentration. Dock sjunker koncentrationen vid TSH-supprimerande behandling. TPO antikroppar kan ses som riskfaktor för uppkomst av autoimmun sköldkörtesjukdom men det innebär inte att patienten har påvisbar rubbning av sköldkörtelfunktion. En låg koncentration av TPO-antikroppar kan även påvisas hos friska personer (10, 11, 15).
1.9 TSH
TSH är ett glykoprotein som består av två peptidkedjor alfa- och beta-kedja. Alfa-kedjan finns även i andra glykoproteinhormoner såsom is follikelstimulerande hormon (FSH), humant koriongonadotropin (hCG) och luteiniserande hormon (LH), medan beta-kedjan är unik för TSH. TSH styr produktion av tyroxin T4 som i sin tur omvandlas till trijodtyronin T3 i perifera vävnader. TSH syntetiseras och utsöndras av adenohypofysen, dess utsöndring kontrolleras via negativ feedback eller återkoppling. Negativ återkoppling betyder att TSH-utsöndring från hypofysen minskas vid stigande T4-koncentration och tvärtom en sänkt T4-T4-koncentration leder till ökad TSH-utsöndring. Andra substanser kan också stimulera TSH-utsöndring, direkt eller via tyreotropin-frisläppande hormon (TRH). Exempel på dessa substanser är galanin, leptin, alfa-adrenerga agonister och opioider, glukagonliknande peptid 1. Substanser som kan hämma TSH-utsöndring är dopamin, glukokortikoider, serotonin, somatostatin, gastrin och kolecystokinin. TSH interagerar med specifika cellreceptorer på sköldkörtelcellernas yta och har två huvudeffekter: stimulera cellreproduktion och hypertrofi och stimulera sköldkörteln att syntetisera och utsöndra T3 och T4. Mätning av TSH är viktig vid utvärdering av sköldkörtelns funktion. Analysen hjälper med att diagnostisera och skilja mellan primär (sköldkörtel), sekundär (hypofys) och tertiär (hypotalamus) hypotyreos. Vid primär hypotyreos är TSH-nivåerna kraftigt förhöjda, medan de är låga vid sekundär och tertiär hypotyreos. Förhöjda nivåer av TSH kan även ses vid TSH-bildande hypofystumörer. Låga nivåer av TSH kan ses vid svår depression som svar på glukokortikoidbehandling som minskar bildningen av TRH (10, 11, 16).
1.10 Tyroxin och trijodtyronin
Hormonerna tyroxin T4 och trijodtyronin T3 bildas och upplagras i sköldkörteln och är involverade i kroppens metabolism. Bildningen av dessa hormoner sker genom jodering av specifika tyrosinrester i tyreoglobulin som följd blir det en koppling av två jodtyrosinrester. Denna process sker under exocytosen av tyreoglobulin genom
sköldkörtelcellernas apikala membraner in i follikellumen. När behovet av tyroideahormoner ökar i kroppen tas tyreoglobulin upp av follikelcellerna från lumen. Hormonerna frigörs genom enzymatisk klyvning av tyreoglobulin och utsöndras till blodet genom cellernas basala membran. Allt detta styrs av TSH. Största andelen av T4 cirkulerar i blodet bundet till tyroxinbindande globulin (TBG) och i mindre utsträckning bundet till albumin och tyroxinbindande prealbumin (TBPA). En mindre andel av T4 är inte bundet till något transportprotein utan cirkulerar fritt i blodet. Fritt T4 (FT4), är både metaboliskt aktivt och en föregångare till trijodtyronin T3. Vid hypotyreoidism och hypertyreoidism förändras nivåerna för FT4 på samma sätt som nivåerna för totalt T4. T3 också cirkulerar i blodet till största delen bundet till tyroxinbindande-globulin (TBG) och i mindre utsträckning albumin och prealbumin, mindre andel cirkulerar i fri form som är metaboliskt aktivt. De fria T3-nivåerna hänger ihop med T3-utsöndringen och metabolismen. Vid hypotyreos och hypertyreos förändras nivåerna för fritt T3 på samma sätt som nivåerna för totalt T3. Mätning av fritt T4 och fritt T3 är gold standard vid tyreoideasjukdomsdiagnostik eftersom man kan få förändrade nivåer av totalt T4 och totalt T3 på grund av förändringar i de T4-bindande och T3-bindande proteinerna, speciellt TBG (10, 11, 17, 18).
Tidigare studier av analyters hållbarhet avseende olika undersökta egenskaper, såsom tid till centrifugering och hållbarhet vid längre tids förvaring visar en stor variation, där vissa analyter har en kort hållbarhet och andra en längre sådan. Den viktigaste preanalytiska faktorn visar sig vara tid till centrifugering av primärröret. Efter detta ökar stabiliteten påtagligt, men man finner att vissa analyter sjunker i koncentration och andra stiger vid längre tids förvaring (19).
1.11 Kvalitetssäkring och ackreditering 1.11.1 Interna kvalitetskontroller
Alla mätserier måste innehålla interna kontroller. Dessa kontroller innefattar minst två olika nivåer (koncentrationer) av kontrollmaterial, till exempel en låg och en hög nivå. Intern kvalitetskontroll analyseras vanligen en gång per dag. För att analysresultatet ska godkännas måste de uppmätta värdena ligga inom acceptansintervallet. Acceptintervallet för de interna kontrollerna baseras på mätosäkerheten för den aktuella analysmetoden över tid och är laboratorie-, metod- och instrumentspecifik (11).
1.11.2 Externa kvalitetskontroller
Externa kvalitetskontroller används för att värdera skillnader i analysresultat mellan olika laboratorier. Prover med kända eller okända koncentrationer distribueras till de deltagande laboratorierna av ett kontrollorgan, som sedan utför mätningarna. Resultaten samlas sedan centralt och beräkningar som medelvärde och spridning utförs för deltagande laboratorier. Dessa externa kvalitetskontroller utförs en gång i veckan till var tredje månad beroende på mätningstyp. Detta system är främst till för att jämföra hur olika laboratoriers mätningar relaterar till varandra.
Flera av de utförda immunanalyserna är en del av Bio-Rads externa kvalitetsprogram. Externa kvalitetskontroller har också strikta riktlinjer för acceptabelt referensområde (11).
1.11.3 Ackreditering
Ackreditering är ett kompetensprov som utförs i enlighet med både europeiska och internationella standarder. I Sverige är Sveriges styrelse för ackreditering och teknisk kontroll (SWEDAC) en myndighet som utför ackrediteringen. Ackrediterade laboratorier åtar sig att följa myndighetens regler och regelbundet genomgå inspektioner. Reglerna är baserade på den europeiska standarden EN ISO / IEC 15189, eller den tidigare standarden EN 17025 för laboratoriedrift. Införandet av ett kvalitetssystem ingår i ackrediteringsreglerna och detta måste beskrivas i en kvalitetsmanual. I systemet måste varje del av verksamheten beskrivas i detalj, såsom organisation och ledning, mätmetoder och mätinstrument som används samt validering av dessa, organisering av kvalitetskontroller, med mera. Experter från SWEDAC utför sedan en noggrann inspektion och först när allt är godkänt utfärdas ett ackrediteringsintyg. Ackreditering gäller ett och ett halvt år och förlängs varje år i samband med en ny genomgång av laboratoriet. I Örebro län (RÖL) ackrediteras de flesta analysmetoder,dock är pro-BNP och a-TPO inte ackrediterade (11, 20).
1.12 Syfte
Syftet med denna studie var att ta reda på om det finns någon matrisskillnad, någon medicinskt betydelsefull skillnad i resultaten mellan serum och plasmaprover för att utreda huruvida det är möjligt att använda såväl plasma som serum, vilket skulle medföra logistiska fördelar. Därtill att undersöka hållbarheten för prover vid 0-tidpunkten (provinsamlingstillfället) och efter 24, 48 respektive 72 timmar.
1.13 Frågeställningar
De frågeställningar som kommer att svaras på under denna studie rör provets hållbarhet, om det går analysera prover med oförändrade resultat under 72 timmar, och om matris spelar någon roll för resultatet – det vill säga huruvida det går byta från plasma till serum vid utförande av olika analyser.
2. MATERIAL OCH METOD
2.1 Etiska aspekter
I denna studie bedöms risken för uppkomst av etiska problem som liten. Eftersom de prover som används är återstoden av prover som redan insamlats inom ramen för rutinsjukvården innebär det här projektet inga ytterligare ingrepp på patienterna. Alla prover har hanterats avidentifierade och de var kodade med provnummer för att skydda patientens identitet, så att det inte fanns någon risk att någon av individerna vars plasma/serum hade använts löper någon risk att identifieras.
2.2 Provmaterial
I denna studie användes serum och plasma från 25 individer insamlade i 6ml CAT Serum Sep Clot Activator rör och två 3ml LH Lithium Heparin Sep rör (Greiner Bio-One, Österrike). Proverna var tagna från Universitetssjukhuset Örebro.
2.3 Förberedelse av provmaterial
De venösa blodproverna centrifugerades i Rotanta 460 RS (Hettich Labinstrument, Sverige) vid 2400 x g i 7 minuter. Efter centrifugeringen överfördes plasma och serum till ett förmärkt rör och skakades med provrörsskak, Vortex-Genie (Scientific Industries, inc, USA) före utförandet av analys. Proverna analyserades på ADVIA Centaur XPT (Siemens Healthineers,Tyskland). När prover analyserades klart sparades de till nästföljande dag i kylskåpet vid 2–8°C. Vid utförande av analys efter 24 timmar, var prover rumstempererade och skakades innan utförande av analys på instrumentet. Samma procedur av besparande av prover upprepades under hela studiens gång. Total volym mängd för serum och plasma var 470 mikroliter per körning.
2.4 Analysprocedur för ferritin
Material som ingick i denna analys var ADVIA Centaur FER ReadyPack primärreagenspack; Lite-reagens som var 5,0 mL/reagenspack med polyklonal anti-ferritin-antikropp från get (~0,64 μg/mL) märkt med akridiniumester i HEPES-buffert med proteinstabilisatorer, natriumazid (< 0,1 %) och ytterligare konserveringsmedel. ADVIA Centaur FER ReadyPack primärreagenspack; Fast fas-reagens som var 22,5 mL/reagenspack med monoklonal anti-ferritin-ahntikropp från mus (~32,2 μg/mL) kovalent förenad till paramagnetiska partiklar i natriumbarbitalbuffert med proteinstabiliserare, natriumazid (< 0,1 %) och ytterligare konserveringsmedel.
Dispensering 100 μL Lite-reagens och 450 μL Fast fas-reagens, och inkubering under 7,5 minuter vid 37°C. Separation, aspiration och tvättning av kyvetterna med reagensvatten. Dispensering 300 μL av vardera syrareagensen och basreagens för att inleda den kemiluminiscenta reaktionen.
2.5 Analysprocedur för pro-BNP
Material som ingick i denna analys var ADVIA Centaur PBNP ReadyPack primärreagensförpackning;Lite-reagens som var, 5 mL/reagensförpackning med monoklonal anti-human PBNP F(ab')2-fragment antikropp från får (~0,36 μg/mL) märkt med akridinium-ester i buffert med bovint serumalbumin, bovint gammaglobulin och konserveringsmedel. ADVIA Centaur PBNP ReadyPack primärreagensförpackning; Fast fas-reagens som var 20 mL/reagensförpackning med streptavidinbelagda magnetiska partiklar (~250 mg/L) i buffert med bovint serumalbumin, bovint gammaglobulin får-gammaglobulin och konserveringsmedel. ADVIA Centaur PBNP ReadyPack primärreagensförpackning; Ancillarybrunnreagens som var 7,5 mL/reagensförpackning med monoklonal anti-human PBNP-antikropp (~2 μg/mL) märkt med akridinium-ester i buffert med bovint serumalbumin, bovint gammaglobulin, får-gammaglobulin och konserveringsmedel. ADVIA Centaur PBNP kalibratorer som var 2,0 mL/flaska med låga eller höga nivåer av NT-proBNP i buffert med bovint serumalbumin och konserveringsmedel. ADVIA Centaur PBNP Master Curve Card (masterkurvkort) och ADVIA Centaur PBNP Calibrator-kort med tilldelade värden och streckkodesetiketter. Instrumentet utförde automatiska steg. Dispensering 20 μL av provet i en kyvett och inkubering i 15 sekunder. Dispensering 200 μL Fast fas och 75 μL ancillarybrunnreagens och inkubering i 2,75 minuter vid 37°C. Dispensering 75 μL Lite-reagens och inkubering i 5,5 minuter vid 37°C. Separation av Fast fas från blandningen, och aspiration den obundna reagensen. Tvättning av kyvetten med ADVIA Centaur Wash 1. Dispensering 300 μL av ADVIA Centaur Acid-reagens och 300 μL ADVIA Centaur Base-reagens för att inleda den kemiluminiscenta reaktionen.
2.6 Analysprocedur för hs-TNI
Material som ingick i denna analys var ADVIA Centaur TNIH ReadyPack primärreagensförpackning; Lite-reagens som var 8,0 mL/reagensförpackning med BSA konjugerat till ett rekombinant monoklonal Fab anti-humant cTnI (~0,2–0,4 μg/mL) märkt med akridiniumester i HEPES-buffert med stabilisatorer och konserveringsmedel.
ADVIA Centaur TNIH ReadyPack primärreagensförpackning; Fast fas-reagens som var 13,0 mL/reagensförpackning med 0,45 mg/mL streptavidinbelagda magnetiska latexpartiklar med 2 biotinylerade (mus och får) monoklonala anti-troponin I-antikroppar i buffert med stabilisatorer och konserveringsmedel. ADVIA Centaur TNIH High Calibrator som var 1,0 mL/flaska med humant serum, humant cTnI och konserveringsmedel (frystorkat). ADVIA CentaurTNIH Low Calibrator som var 1,0 mL/flaska med HEPES-buffert med bovint serumalbumin (BSA), ytaktiva ämnen och konserveringsmedel (vätskeform). ADVIA Centaur TNIH Master Curve card. ADVIA Centaur TNIH Calibrator-kort med angivna värden och streckkodsetiketter.
Instrumentet utförde automatiska steg. Dispensering 100 μL av provet i en kyvett. Dispensering 130 μL fast fas-reagens och 80 μL Lite-reagens, och inkubering sedan i 9,45 minuter vid 37°C. Separation, aspiration och tvättning av kyvetterna med ADVIA Centaur Wash 1. Dispensering 300 μL av ADVIA Centaur Acid Reagent och 300 μL av ADVIA Centaur Base Reagent för att inleda den kemiluminiscenta reaktionen.
2.7 Analysprocedur för Anti-TPO
Material som ingick i denna analys var ADVIA Centaur aTPO ReadyPack primärreagenspack; Lite-reagens som var 10,0 mL/reagenspack med humant TPO (~200 ng/mL) komplexbundet med akridiniumestermärkt monoklonal anti-TPO antikroppar från mus (~60 ng/mL) i fosfatbuffert med BSA och konserveringsmedel. ADVIA Centaur aTPO ReadyPack primärreagenspack; Fast fas-reagens som var 20,0 mL/reagenspack med monoklonal anti-TPO-antikroppar från mus (~21 μg/mL) kovalent kopplade till paramagnetiska partiklar i fosfatbuffert med BSA och konserveringsmedel. ADVIA Centaur aTPO masterkurvkort.
Instrumentet utförde automatiska steg. Dispensering 30 μL av provet i en kyvett. Dispensering 100 μL Lite-reagens och inkubering under 2,5 minuter vid 37°C. Dispensering 200 μL Fast fas-reagens och inkubering under 5,0 minuter vid 37°C. Separation, aspiration och tvättning av kyvetterna med reagensvatten. Dispensering 300 μL av vardera syrareagens och basreagens för att inleda den kemiluminiscenta reaktionen. Resultat erhålls i arbiträra internationella enheter, kIE/L, spårbar till WHO-standarden MRC 66/387 som är angiven IE/L.
2.8 Analysprocedur för TSH
reagenspack; Lite-reagens som var 6,0 mL/reagenspack med BSA konjugerat med monoklonal anti-TSH (~0,3 μg/mL) märkt med akridiniumester i HEPES-buffrad saltlösning, IgG från mus, BSA, getserum, ytaktiva ämnen och konserveringsmedel.ADVIA Centaur TSH3-Ultra ReadyPack primärreagenspack; Fast fas-reagens som var 21,0 mL/reagenspack med anti-fluorescein monoklonal antikropp bunden till paramagnetiska partiklar (~85 μg/mL) i HEPES-fosfatbuffrad saltlösning, BSA, getserum, ytaktiva ämnen och konserveringsmedel. ADVIA Centaur TSH3-Ultra ReadyPack primärreagenspack; Hjälpreagens som var 6,0 mL/reagenspack med FITC konjugerat till monoklonal anti-TSH (~3 μg/mL) i HEPESbuffrad koksaltlösning, IgG från mus, BSA, getserum, ytaktivt ämne och konserveringsmedel. ADVIA Centaur TSH3-Ultra calibrator som var 2,0 mL/ampull med låga och höga nivåer av tyreoideastimulerande hormon (TSH), HEPES-buffrat serum från häst med natriumazid (< 0,1 %) och ytterligare konserveringsmedel. ADVIA Centaur och ADVIA Centaur CP TSH3-Ultra-masterkurvkort. Streckkodsetiketter för kalibratorer. TSH3-Ultra kalibratorvärdeskort.
Instrumentet utförde automatiska steg. Dispensering 100 μL av provet i en kyvett. Dispensering 50 μL Hjälp-reagens och 50 μL Lite-reagens, och inkubering sedan under 2,75 minuter vid 37°C. Dispensering 200 μL Fast fas-reagens och inkubering under 5,5 minuter vid 37°C. Separation, aspiration och tvättning av kyvetterna med Wash 1. Dispensering 300 μL av vardera syrareagens och basreagens för att inleda den kemiluminiscenta reaktionen. Resultat erhålls i den arbiträra enheten internationella enheter, mIE/L, spårbar till WHO-standarden IRP 81/565 som är angiven IE/L.
2.9 Analysprocedur för T4
Material som ingick i denna analys var ADVIA Centaur FT4 ReadyPack primärreagenspack; Lite-reagens som var 5,0 mL/reagenspack med T4-märkt med akridiniumester (~0,2 μg/mL) i natriumbarbitalbuffert (1,03 %) med proteinstabilisatorer, EDTA och natriumazid (< 0,1 %). ADVIA Centaur FT4 ReadyPack primärreagenspack; Fast fas-reagens som var 15,0 mL/reagenspack med biotinylerad polyklonal anti-T4-antikroppar från kanin (~0,525 μg/mL) bundet till avidin, kovalent kopplad till paramagnetiska partiklar i natriumbarbitalbuffert (1,03 %) med proteinstabilisatorer, EDTA och natriumazid (< 0,1 %). ADVIA Centaur FT4 masterkurvkort.
Dispensering 100 μL Lite-reagens och 300 μL Fast fas-reagens, och inkubering under 7,5 minuter vid 37°C. Separation, aspiration och tvättning av kyvetterna med reagensvatten. Dispensering 300 μL av vardera syrareagens och basreagens för att inleda den kemiluminiscenta reaktionen.
2.10 Analysprocedur för T3
Material som ingick i denna analys var ADVIA Centaur FT3 ReadyPack primärreagenspack; Lite-reagens som var 5,0 mL/reagenspack med monoklonala anti-T3-antikroppar från mus (~8 ng/mL) märkta med akridiniumester i HEPES-buffert med proteinstabilisatorer och natriumazid (0,1 %). ADVIA Centaur FT3 ReadyPack primärreagenspack; Fast fas-reagens som var 22,5 mL/reagenspack med T3-analog (~1,6 μg/mL) kovalent kopplad till paramagnetiska partiklar i HEPES-buffert med natriumazid (0,1 %). ADVIA Centaur FT3 masterkurvkort.
Instrumentet utförde automatiska steg. Dispensering 50 μL av provet i en kyvett. Dispensering 100 μL Lite-reagens och inkubering under 5,0 minuter vid 37°C. Dispensering 450 μL Fast fas-reagens och inkubering under 2,5 minuter vid 37°C. Separation, aspiration och tvättning av kyvetterna med reagensvatten. Dispenserade 300 μL av vardera syrareagensen och basreagens för att inleda den kemiluminiscenta reaktionen.
2.11 Bearbetning av data samt statistisk analys
De insamlade resultaten sammanställdes i programvaran Microsoft Office Excel 2018 och data presenterades medelst deskriptiv statistisk, redovisade i tabeller och diagram. Ett p-värde < 0,05 betraktades som statistiskt signifikant.
2.11.1 Verifiering av serum eller plasma på Centaur XPT
Spridningsdiagram för linjär regressionsanalys användes för att jämföra mätvärdena från plasmaproverna med serumproverna (eller serum mot plasma) för varje analyt, vid både 0, 24, 48 och 72 timmar. Den linjära regressionsanalysen utfördes genom att sätta koncentrationerna i den alternativa matrisen mot originalmatrisen, och sedan beräkna korrelationskoefficienten och determinationskoefficienten (förklaringsgrad, R2).
Som en ytterligare utvärdering för att värdera den medicinska betydelsen av skillnaderna beräknade vi Reference change values (RCV). RCV är beräknade värden i procent som används för att bedöma skillnaden mellan två mätningar. I grund och botten är RCV skillnaden som måste överskridas mellan två sekventiella resultat för att skillnad mellan
två analysresultat ska betraktas som en kliniskt
betydelsefull
förändring. Om RCV överskrids är metoden olämplig för kliniskt bruk. Beräkningen kräver kunskap om metodens analysprecision (CVA) och analytens biologiska variation (CVI): RCV = 21/2 *Z * (CVA2 + CVI2)1/2, där Z = 1,96, 2 standardavvikelser (2SD). Information och värden
för CVI hämtas från EFLM Biological Variation Database (21). Värden för CVA bestäms
av Örebro centrala kliniska laboratorium och baseras på interna kontrollnivåer och mätosäkerhet.
Bland-Altman (differensplot)-plottar användes för att visualisera den procentuella differensen i koncentrationen mellan plasma- och serumprover, för respektive analyt samt tidpunkt. Detta gjordes genom att beräkna differensen, den procentuella differensen samt medeldifferensen för samtliga resultat (bias), och därefter plotta den procentuella differensen mot koncentrationen i originalmatrisen.
Parade två-sidigt Student T-test (α = 0,05) utfördes för att undersöka skillnaderna i medelvärde mellan matriserna vid två tidpunkter, vilket gjorde det möjligt för oss att bedöma eventuell statistiskt signifikant skillnad mellan de erhållna uppmätta värdena i plasma och serum. Nollhypotesen var att det inte skulle finnas någon statistiskt signifikant skillnad mellan de uppmätta värdena i de två matriserna (det vill säga P >0,05).
2.11.2 Hållbarhet av analyter vid olika förvarningsintervall
Data samlades in och bearbetades i Excel-kalkylprogrammet (Microsoft, Washington, USA). Ett basvärde för de olika analytproverna fastställdes och användes som den initiala koncentrationen (T0). T0 subtraheras från efterföljande värden erhållna efter 24 timmar (T24), 48 timmar (T48) och 72 timmar (T72) och presenterades som procentuella skillnader. Därtill jämförs skillnaderna för varje prov med riktvärdet från den externa kvalitetsbedömningen för analyten (tabell 2). Denna jämförelse gör det möjligt att avgöra om skillnaden i koncentration över tiden ligger inom den acceptabla variationen. Provresultat plottas som diagram (koncentration över tid) för att visualisera förändringarna. Dessutom utfördes en parade 2-sidigt student T-test (α = 0,05) utfördes mellan tidpunkter, som beskrivs under 2.11.1.
3. RESULTAT
3.1 Hållbarhet och stabilitet av matris
Den statistiska bearbetningen av data för TSH, fT4, fT3, TPO-antikroppar, ferritin, pro-BNP och hs-TNI baserades på 25 individer (n=25) med okänt kön, ålder och anamnes. Resultatet med stabilitet över tid för serum och plasma sammanställdes i tabell 2.
Resultat för TSH visade negativ bias vid alla tidpunkter. Bias var medelvärdet av differenserna från parade prover (det vill säga från 24-0 timmar, 48-0 timmar och 72-0 timmar). Statistisk signifikant skillnad i hållbarhet och stabilitet efter 72 timmar observerades inte i serum, medan i plasma gjorde det.
Resultat för fT3 visade negativ bias vid alla tidpunkter. Statistisk signifikant skillnad i hållbarhet och stabilitet efter 72 timmar observerades i båda serum och plasma.
Resultat för fT4 visade negativ bias vid 0-tidpunkt i serum därefter blev den positiv, medan i plasma blev bias positiv vid alla tidpunkter. Statistisk signifikant skillnad i hållbarhet och stabilitet efter 72 timmar observerades i båda serum och plasma.
Resultat för TPO-antikroppar visade negativ bias i serum vid alla tidpunkter. I plasma blev bias negativ efter 24 timmar, därefter blev den positiv efter 48 timmar och efter 72 timmar blev den negativ igen. Statistisk signifikant skillnad i hållbarhet och stabilitet efter 72 timmar observerades inte i plasma, medan i serum gjorde det.
Resultat för ferritin visade positiv bias vid alla tidpunkter. Statistisk signifikant skillnad i hållbarhet och stabilitet efter 72 timmar observerades i båda serum och plasma.
Resultat för Troponin I visade negativ bias i serum vid alla tidpunkter. I plasma blev bias negativ efter 24 timmar därefter blev den positiv. Statistisk signifikant skillnad i hållbarhet och stabilitet efter 72 timmar observerades i serum men inte i plasma.
Resultat för pro-BNP visade negativ bias i serum vid alla tidpunkter. I plasma blev bias positiv efter 24 och 48 timmar,därefter blev den negativ efter 72 timmar. Ingen statistisk signifikant skillnad i hållbarhet och stabilitet efter 72 timmar observerades i båda serum och plasma.
Tabell 2. Resultat från 25 individer som visar stabilitet för biokemiska analyser vid 0-72 timmar, utförda på serum (-S) och plasma (-P). Medelkoncentration (intervall) visar medelkoncentration mätt vid uppsamling och centrifugering (vid 0-tidpunkten). P: P-värde (α=0,05).
Medel bias % (min-max)
Analys(-S) Enhet n Medelkoncentration (intervall) 24tim P 48tim P 72tim P
TSH mIE/L 25 1,6 (0,3-4,3) -3,6 (-15,5; 2,9) 0,003 -4,40 (-15,6; 0,6) <0,001 -1,20 (-9,2; 3,5) 0,245 fT3 pmol/L 25 5,3 (4,39-6,5) -1,8 (-6,7; 3,0) <0,001 -2,60 (-7,0; 3,4) <0,001 -5,19 (-10,0; 0,0) <0,001 fT4 pmol/L 25 14,3 (8,6-17,8) -0,4 (-10,4; 7,0) 0,570 2,90 (-2,0; 8,5) <0,001 2,40 (-6,4; 13,2) 0,034 TPO-AK kIE/L 25 57,1 (28,0-290,2) -24,7 (-51,1; 45;0) <0,001 -13,4 (-52,1; 55,7) 0,013 -18,5 (-56,3; 57,5) 0,002 Ferritin µg/L 25 150,1 (14,1-395,6) 11,9 (2,4; 22,6) <0,001 4,30 (-15,0; 17,2) 0,008 4,80 (-4,1; 15,9) 0,005 hs-TnI ng/L 25 7,7 (2,5-63,2) -1,9 (-18,2; 13,3) 0,096 -2,80 (-16,7; 14,3) 0,772 -0,83 (-15,0; 16,0) 0,037 pro-BNP ng/L 25 252,4 (35,0-1976,9) -1,5 (-17,5; 6,0) 0,040 -0,10 (-14,8; 24,0) 0,014 -5,20 (-20,6; 2,8) 0,817
Medel bias % (min-max)
Analys(-P) Enhet n Medelkoncentration (intervall) 24tim P 48tim P 72tim P
TSH mIE/L 25 1,55 (0,3-4,3) -2,1 (-9,0; 1,9) 0,002 -3,50 (-9,4; -0,3) <0,001 -1,90 (-10,9; 2,5) 0,002 fT3 pmol/L 25 4,9 (84,2-6,1) -1,8 (-3,9; 0,2) <0,001 -2,00 (-5,5; 5,1) <0,001 -4,40 (-8,4; -0,4) <0,001 fT4 pmol/L 25 15,0 (9,0-19,5) 1,3 (-6,2; 9,5) 0,195 4,30 (-6,7; 18,7) <0,001 5,00 (-5,9;18,6) <0,001 TPO-AK kIE/L 25 52,7 (28,0-271,0) -23,4 (-49,3; 22,4) <0,001 10,10 (-44,1; 125,7) 0,332 -2,30 (-48,6; 68,6) 0,619 Ferritin µg/L 25 141,4 (13,9-371,2) 14,2 (15,9; 28,0) <0,001 5,40 (-2,8; 12,7) 0,003 6,80 (-0,1; 17;8) <0,001 hs-TnI ng/L 25 7,0 (2,5-55,6) -0,2 (-13,2; 21,1) 0,308 0,70 (-8,8; 11,1) 0,963 2,40 (-6,7; 13,9) 0,384 pro-BNP ng/L 25 254,4 (35,0-1960,7) 2,2 (-12,0; 33,0) 0,810 0,90 (-9,9; 28,7) 0,781 -4,60 (-19,1; 5,3) 0,172
Tabell 3. Översiktlig data av de statistiska analyserna för samtliga 7 analyter under tidpunkterna T0 till T72. T0: tidpunkt 0h; T24: tidpunkt 24h; T48: tidpunkt 48h; T72: tidpunkt 72h; RCV: Reference change values; Bias: genomsnittliga differensen; r: korrelations koeeficient; R2: determinationskoefficient; P: P-värde (α=0,05); TSH: thyroideastimulerande hormon; fT3: fritt trijodtyronin; fT4: fritt tyroxin; TPO-AK: thyroid peroxidas antikroppar; Ferr:ferritin; hs-TNI: högkänslig Troponin I; pro-BNP: pro B-typ natriuretisk peptid.
Analyt (original matris: serum) RCV % T0 T24 T48 T72 bias (S-P) % R R2 P bias (S-P) % R R2 P bias (S-P) % R R2 P bias (S-P) % R R2 P TSH 60% 0,70% 0,999 0,998 0,272 -0,90% 0,994 0,988 0,676 -0,40% 0,997 0,993 0,833 1,40% 0,996 0,992 0,061 fT3 22% 7,70% 0,978 0,956 <0,001 7,60% 0,982 0,964 <0,001 7,00% 0,957 0,916 <0,001 6,80% 0,955 0,912 <0,001 fT4 29% -4,70% 0,976 0,952 <0,001 -6,40% 0,975 0,95 <0,001 -6,00% 0,944 0,891 <0,001 -7,20% 0,945 0,892 <0,001 TPO-AK 46% -7,80% 0,982 0,964 0,033 -4,70% 0,992 0,984 0,106 15,60% 0,983 0,966 0,003 11,90% 0,976 0,953 0,088 Analyt (original matris: plasma) RCV % T0 T24 T48 T72 bias (P-S) % R R2 P bias (P-S) % R R2 P bias (P-S) % R R2 P bias (P-S) % R R2 P Ferr 40% -6,00% 0,998 0,996 <0,001 -4,00% 0,999 0,997 <0,001 -4,90% 0,995 0,991 <0,001 -4,00% 0,997 0,993 <0,001 hs-TNI 105% -7,60% 0,999 0,998 0,034 -5,70% 0,999 0,998 0,035 -3,90% 0,999 0,999 0,086 -3,99% 0,999 0,998 0,103 proBNP 39% 1,00% 1,000 0,999 0,030 4,50% 0,999 0,998 0,023 2,00% 1,000 0,999 0,282 1,60% 0,999 0,999 0,093
Proverna som analyseras i störst antal på laboratoriet är TSH och ferritin, varför data för dessa två visas i mer detalj som exempel nedan (figur 2 A-C). En översikt av dessa provers hållbarhet kan ge en uppfattning om hur stabilt de är över tid.
Figur 2. Relativ förändring för TSH över tid i serum (A), plasma (B) och för ferritin i plasma (C), serum (D). X-axel visar tid (0,24,48 och 72 timmar) och y-axel visar bias i procent. Färgade linjer representerar olika individer, röda punktlinjer representerar medelresultat.
3.2 Jämförelse av matriser
Den statistiska bearbetningen av data för TSH, fT4, fT3, TPO-antikroppar, ferritin, pro-BNP och hs-TNI baserades på 25 individer (n=25) med okänt kön, ålder och anamnes. Resultatet av matrisjämförelsen (mellan serum och plasma) sammanställdes i tabell 3. Ferritin, fT3 och fT4 uppvisade statistiska signifikanta skillnader mellan matriserna, medan TSH, TPO-antikroppar, pro-BNP och Troponin I gjorde inte det.
Regression- och differens (Bland-Altman)-plottar användes för att visualisera korrelationen och den procentuella differensen i koncentrationen mellan originalmatrisen och den alternativ matrisen, för respektive analyt samt tidpunkt.
För TSH visar regressionsanalysen ett starkt linjärt förhållande mellan de två matriserna för alla tidpunkter (figur 3, paneler A och C). För T0 bestämdes korrelationskoefficienten (R) till 0,999 och bestämningskoefficienten (R2) vid 0,998 för T72 bestämdes R till 0,996
och R2 vid 0,992.
Bland-Altman-plot (figur 3, paneler B och D), visar en procentuell bias på 0,70% respektive 1,40%.
Biasen är positiv vilket indikerar att TSH-metoden som tillämpas på plasma matrisen mäter något lägre värden.
Figur 3. Regression analys (A,C) och Bland-Altman (B,D). TSH T0 (vid 0-tidpunkt) och T72(efter 72 timmar).
För ferritin visar regressionsanalysen ett starkt linjärt förhållande mellan de två matriserna (plasma och serum) för alla tidpunkter (Figur 4, paneler A och C). För T0 bestämdes korrelationskoefficienten (R) till 0,998 och bestämningskoefficienten (R2) vid 0,996, för
T72 R bestämdes till 0,997 och R2 vid 0,993.
Bland-Altman-plotten (figur 4, paneler B och D), visar att den observerade biasen mellan två matriser (plasma, serum), for T0 och T72, är -6,00 % respektive -4,00 %. Biasen är
negativ, vilket indikerar att ferritin-metoden som tillämpas på serum matrisen mäter högre värden.
Figur 4. Regression analys (A,C) och Bland-Altman (B,D). Ferritin T0 (0-tidpunt) och T72 (efter 72 timmar).
4. DISKUSSION
I denna studie utvärderades påverkan av lagringstiden i serum och plasma för sju analyter: thyroideastimulerande hormon, fritt tyroxin, fritt trijodtyronin, thyroid peroxidas antikroppar, ferritin, pro B-typ natriuretisk peptid och högkänslig Troponin I. Blodprover insamlades från 25 individer i serum- och plasmarör som sedan hälldes över i sekundära rör efter centrifugering. Individernas hälsotillstånd, kön och ålder var okänd. Baslinjemätning utfördes direkt efter proverna blev avhällda i sekundära rör. Efter utförande av analys sparades alla serum och plasma prover i kylskåp vid + 5°C som analyserades sedan efter 24, 48 och 72 timmar.
Analyterna som analyserades i denna studie kan delas in i tre olika paketanalyser. Thyroideastimulerande hormon, fritt tyroxin, fritt trijodtyronin, thyroid peroxidas antikroppar hänger ihop och analyseras ofta tillsammans i ett så kallad thyroideapaket. Dessa analyser analyseras mer frekvent. Dock utförs thyroid peroxidas antikroppar analys inte lika ofta jämfört med andra analyser som ingår i thyroidea paket. Högkänslig Troponin I och pro-BNP ingår i hjärtmarkörer paket, dessa analyser är akuta och därför analyseras oftast direkt efter provet har kommit in till laboratoriet och inte sparas under en längre tid. Ferritin hamnar i ett separat kemianalyspaket som analyseras vid anemifrågeställning.
4.1 Thyroidea-paket 4.1.1 TSH
Resultat för TSH-stabiliteten i serum och plasma visade en liten minskning av koncentrationen efter 24 timmar. Efter 48 timmar hade resultatet sjunkit ungefär -1% mer, och efter 72 timmar stigit. Förändringen över tid är relativt liten och har ingen signifikant klinisk betydelse. Därför kan konstateras att båda matriserna har god hållbarhet och kan därför sparas och analyseras under en längre tid som till exempel 72 timmar.
Vid analys av TSH-prover används serum som originalmatris. Vid utförande av detta arbete jämfördes resultat för båda serum och plasma vid TSH-analys. Resultatet visade ingen signifikant skillnad mellan serum och plasma. På så sätt kan plasma användas lika väl som serum vid utförande av TSH analys.
Vad gäller TSH varierar p-värdet vid olika tidpunkter men efter 72 timmar översteg det 0,05. Det betyder att det inte fanns signifikant skillnad i koncentration efter 72 timmar i serum. P-värden lägre än 0,05 vid alla tidpunkter är svårförklarat och betyder att det fanns staistiskt signifikant skillnad i koncentration över tid i plasma, men resultatet vid 72h talar för att det inte är klinisk relevant.
båda matriserna kan betraktas som acceptable för TSH-analys. P-värde visade högre resultat än 0,05 för varje tidpunkt och därför kan nollhypotesen accepteras vad gäller hållbarheten. 4.1.2 Fritt T3
Resultat för fT3 stabilitet i serum och plasma visade en liten minskning av koncentration efter 24 timmar. Konstant minskning av koncentration fortsätter under 72 timmar.
Detta kan förklaras med att proteaser som finns i provrören kan bidra till att fT3 koncentration sjunker ner med tiden. Oaktat dessa resultat visade en undersökning är den förändring av stabilitet relativ liten och har ingen signifikant klinisk betydelse därför kan det konstateras att båda matriser har god hållbarhet och kan därför sparas och analyseras upp till 72 timmar. Vid analys av fT3- prover används serum som originalmatris. Vid utförande av detta arbete jämfördes resultat för båda serum och plasma vid fT3- analys. Resultat visade att det fanns liten statistisk skillnad mellan serum och plasma men den har ingen klinisk betydelse. Det går att använda plasma som alternativ matris men det även går att behålla serum som originalmatris. P-värde för fT3 både i serum och i plasma jämfördes för varje tidpunkt och visade att p-värde var mindre än 0,05 vid alla tidpunkter. Det betyder att det fanns signifikant skillnad i koncentration över tid för båda serum och plasma. Det behöver dock inte vara klinisk relevant. Låg bias talar emot klinisk relevans.
Jämförelse mellan två matriserna för fT3 visade att p-värde var mindre än 0,05 vid varje tidpunkt. Detta betyder att det fanns en skillnad som är statistiskt signifikant på 5-procentsnivån och då kan nollhypotesen inte accepteras. Men statistiskt signifikant skillnad mellan dessa två matriser behöver inte alls betyda att den är kliniskt relevant. På så sätt kan resultatet bedömas som medicinskt acceptabel fortfarande, särskilt med hänsyn till en mycket låg bias.
4.1.3 Fritt T4
Resultat för fT4 stabilitet i serum och plasma visade en liten minskning av koncentration efter 24 timmar. Därefter stiger koncentrationen efter 48 timmar i båda serum och plasma. Efter 72 timmar hade koncentrationen sjunkit med 0,5 % i serum och har stigit med 0,7% i plasma. Båda, stigning och minskning av koncentrationerna över tid är relativ liten och därför har ingen klinisk signifikans. På så sätt kan det anses att båda matrisernas har god hållbarhet och att det går spara och analysera dessa matriser efter 72 timmar
Serum används som originalmatris vid utförande av fT3 analys. Resultat där serum jämfördes med plasma vid fT3 analys visade att det fanns statistisk skillnad mellan dessa matriser men den har ingen klinisk betydelse. Därför kan plasma anses vara acceptabel alternativmatris. P-värde för fT4 i båda serum och plasma jämfördes för varje tidpunkt och visade att P-värde varierar vid olika tidpunkterna men efter 72 timmar var mindre än 0,05. Det betyder att det
fanns signifikant skillnad i koncentration över tid i serum. Liksom tidigare är den klinisk relevansen tveksam.
Jämförelse mellan två matriserna för fT4 visade samma resultat som i fallet med fT3, att p-värde var mindre än 0,05 för varje tidpunkt. Det betyder att det fanns statistiskt signifikant skillnad och då kan nollhypotesen inte accepteras. Låg bias visar emellertid på en liten klinisk relevans.
4.1.4 TPO-antikroppar
Resultat för a-TPO-stabilitet i serum och plasma visade en påtaglig minskning av koncentrationen, mer än 20% efter 24 timmar. Den stora minskningen av koncentration är inte klinisk acceptabel och därför kan inte prov sparas under en längre tid. Därefter stiger koncentration efter 48 timmar i båda matriserna, men stigning av koncentration och dess skillnad är inte klinisk acceptabel fortfarande. Slutligen sjunker koncentration ner efter 72 timmar. Själva analysen i serum anses vara instabil och därför inte kan sparas och analyseras efter en längre period. Däremot resultat i plasma verkar vara mer stabilt efter 72 timmar, det finns en minskning med 2,3%. Dess skillnad i minskning är inte stor och därför kan plasma prover sparas och analyseras efter 72 timmar.
För att vara mer säker om det går spara serum prover under en längre tid eller inte bör fler prover än 25 analyseras.
Instabilitet av a-TPO kan förklaras med att a-TPO kan korsreagera med andra ämnen som finns i serum eller plasma och bilda komplex som kan leda till falskt resultat. Individer som regelbundet har exponerats för djur eller fått preparat av monoklonala mus-antikroppar för diagnos eller terapi kan innehålla humana anti-mus antikroppar (HAMA) som stör immunanalyser. Sådana prover kan visa falskt förhöjda värden när de testas med analyspaket som använder musens monoklonala antikroppar. Dessutom kan andra heterofila antikroppar, såsom humana anti-getantikroppar, finnas i patientprover kan orsaka avvikande värden.
Serum används som originalmatris vid utförande av a-TPO analys. Resultat där serum jämfördes med plasma visade inget värde där plasma vinner över serum som matris därför är det meningslös att övergå från serum till plasma.
P-värdet för a-TPO i serum jämfördes för varje tidpunkt och visade att P-värde var mindre än 0,05 vid alla tidpunkter. P-värde i plasma visade varierande resultat men efter 72 timmar var det högre än 0,05. Detta är svårförklarligt i relation till ett statistiskt signifikant resultat vid 24 timmar, men talar emot en klinisk relevans och en hållbarhet om minst 72 timmar.
4.2 Hjärtmarkörer 4.2.1 Högkänslig-TNI
Resultat för TNI i plasma och serum visade att det fanns en minskning av koncentrationen efter 24 timmar i båda matriserna. Därefter hade koncentration sjunkit med nästan 1% i serum, efter 48 timmar däremot har koncentration i plasma stigit med nästan 1% i plasma. Efter 72 timmar observerades en stigning av koncentration i båda matriserna. Minskning och stegring av koncentration över tiden hade liten procenthalt och hade ingen signifikant betydelse, därför kan resultat anses vara som klinisk acceptabel.
TNI är akut hjärtmarkör och analyseras vanligtvis, direkt efter provet har ankommit till laboratoriet. Men båda matriserna visade god stabilitet över tid och därför kan sparas och analyseras efter 72 timmar.
Vid utförande av TNI analys används plasma som originalmatris vanligtvis. Resultat där serum och plasma jämfördes med varandra visade inte att serum har praktisk vinst över plasma, därför kan plasma fortsätta användas som originalmatris.
P-värde för TNI i serum jämfördes för varje tidpunkt och visade att p-värde varierar men efter 72 timmar var mindre än 0,05. Prov ska inte analyseras efter 48h, vilket emellertid sällan blir aktuellt med hänsyn till att det rör sig om ett akutprov.
I jämförelse mellan två matriserna: p-värde ar mindre än 0,05 vid tidpunkt 0 och efter 24 timmar, efter 48 och 72 timmar stiger p-värde och visar resultat överstigande 0,05. Liksom ovan är det svårt att förklara mekanismen, men vi väljer att tolka det som att ingen relevant skillnad ses mellan matriserna.
4.2.2 Pro-BNP
Pro-BNP är akut hjärtmarkör som analyseras oftast så fort provet har ankommit till laboratoriet och inte sparas under en längre tid vanligtvis. Resultat för pro-BNP visade en minskning av koncentration i serum, medan i plasma visade en stegring av koncentration, efter 24 timmar. Därefter observerades en stegring av koncentration i serum, medan i plasma observerades en minskning av koncentration efter 48 timmar. Resultat efter 72 timmar visade en minskning av koncentration i båda matriserna. Procenthalt av minskning och stegring av koncentration var liten och därför kan resultatet betraktas som klinisk acceptabel, båda matriserna visade god stabilitet över tid.
Plasma används som originalmatris vid utförande av pro-BNP analys. Jämförelse av resultat mellan plasma och serum visade ingen praktisk vinst för serum och därför som i fall med TNI kan plasma fortsätta användas som originalmatris.
Ingen signifikant skillnad sågs mellan matriserna varför vi godkänner analys på både serum och plasma.
4.3 Ferritin
Resultat för ferritin i serum och plasma visade att koncentration hade stigit efter 24 timmar, men dess stigning var inte stor och har ingen klinisk betydelse. Efter 48 timmar kan en minskning av koncentration observeras i båda serum och plasma. Därefter observeras en liten stigning av koncentration efter 72 timmar i båda matriserna, skillnaden i resultat efter 48 och 72 timmar är inte stor och därför kan det konstateras att båda matriserna är relativt stabila efter 48 och 72 timmar. På så sätt kan proverna sparas och analyseras på båda, plasma eller serum, efter 72 timmar.
Vid analys av ferritin prover används plasma som originalmatris. Resultat där båda serum och plasma jämfördes visade att serum ger lite högre värden jämfört med plasma men det är klinisk acceptabel. Serum kan användas som alternativmatris i fall där tillgång till plasma är begränsad eller saknas helt.
En signifikant skillnad i koncentration i båda serum och plasma observerades. En låg bias talar emot klinisk signifikans.
En statistiskt signifikant skillnad observerades vid jämförelse mellan matriserna. Vi väljer således att fortsättningsvis analysera på plasma.
5. SLUTSATS
Jämförelse av resultaten visade ingen stor skillnad i bias mellan de två matriserna för någon av de undersökta analyterna och båda matriserna kan därför räknas som medicinskt acceptabla för analys. Hållbarheten i varje matris visade inte heller stor skillnad över tid och därför kan proverna sparas och analyseras inte bara vid ankomst till laboratoriet men även vid senare tillfälle. Ingen analys som undersöktes i denna studie översteg RCV vilket innebär att ingen av metoderna behöver förkastas på grund av en dålig precision. Den analys som uppvisade störst skillnad mellan matriserna var TPO-antikroppar som fortsättningsvis bör analyseras uteslutande i serum.
Det kan vara en fördel för laboratoriet på vårdcentral som inte hinner skicka in prover till centrallaboratoriet samma dag, då kan proverna hällas över i sekundära rör och skickas vid nästa transporttillfälle, det vill säga nästa dag. Dock borde TNI och pro-BNP skickas direkt till centrallaboratoriet för att de två är akutanalyser, men resultat på dessa två prover visade att de är relativt stabila över tiden båda i serum och plasma. I dagsläge analyseras mest serum som originalmatris på de flesta analyser i immunokemi men i framtiden är det möjligt att övergå till plasmamatris istället, för att resultat i dessa två matriser visade ingen signifikant skillnad. I Sverige övergår de flesta laboratorier mer och mer till analys på plasma, som inte kräver att provet koagulerar före centrifugering. Resultatet av detta projekt visar att det är möjligt att övergå till plasma även med den instrumentering som används på USÖ.
6. TACK/ACKNOWLEDGEMENT
Jag vill tacka mina handledare Dieter Samyn, Paul Pettersson-Pablo och Emma Oliv som jobbar på Laboratoriemedicinska kliniken USÖ för deras vägledning, hjälp och stöd under uppsatsens gång, allt detta hjälpte mig att fullborda mitt examensarbete.
7. REFERENSER
1. Physiology, Blood Plasma [Internet] StatPearls;- [uppdaterad 2020 Okt 27; citerad 2021 Mar 18]. Tillgänglig från: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK531504/
2. Yu Z et al. Differences between Human Plasma and Serum Metabolite Profiles. PLoS One. 2011; 6(7): e21230.
3. Kaluarachchi M et al. A comparison of human serum and plasma metabolites using untargeted 1H NMR spectroscopy and UPLC-MS. Metabolomics. 2018; 14(3): 32. 4. ADVIA Centaur XPT Immunoassay System [Internet] Siemens Healthineers;- [ citerad 2021 Apr 20]. Tillgänglig från:
https://www.siemens-healthineers.com/immunoassay/systems/advia-centaur-xpt
5. Wilson K, Walker J. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology. 7th edition. New York: Cambridge University Press; 2010.
6. Koivunen ME, Krogsrud RL. Principles of Immunochemical Techniques Used in Clinical Laboratories. Laboratory Medicine. 2006; 37(8):490-497.
7.Jandreski MA. Chemiluminescence Technology in Immunoassays. Laboratory Medicine. 1998; 29(9):555–560.
8.Cinquanta L et al. Chemiluminescent immunoassay technology: what does it change in autoantibody detection. Auto Immun Highlights. 2017; 8(1): 9.
9. Fu X et al. The fabrication of magnetic particle-based chemiluminescence immunoassay for human epididymis protein-4 detection in ovarian cancer. Biochem Biophys Rep. 2018; 13: 73–77.
10. Bjuväng A, Kjellberg M, Rehle H, Åkesson U. Klinisk kemi och klinisk fysiologi: analyser och undersökningar. 4 uppl. Lund: Studentlitteratur AB; 2014.
11. Nilsson-Rehle P, Berggren Söderlund M, Theodorsson E. Laurells Klinisk kemi i praktisk medicin. 9 uppl. Studentlitteratur AB; 2012.
12. Siemens Healthineers. Insert Ferritin (FER), revision 2015-02. 13. Siemens Healthineers. Insert NT-proBNP (PBNP), revision 2017-08.
14. Siemens Healthineers. Insert Högkänslig troponin I (TNIH), revision 2017-03. 15. Siemens Healthineers. Insert Anti-TPO (aTPO), revision 2014-08.
16. Siemens Healthineers. Insert TSH3-Ultra (TSH3-UL), revision 2017-07. 17. Siemens Healthineers. Insert FT4, revision 2015-02.
19. Landegren U et al. Strong impact on plasma protein profiles by precentrifugation delay but not by repeated freeze-thaw cycles, as analyzed using multiplex proximity extension assays. Clin Chem Lab Med. 2018; 56(4):582-594.
20. Ackreditering [Internet]. -: SWEDAC;- [ citerad 2021 Apr 20]. Tillgänglig från: https://www.swedac.se/tjanster/ackreditering/
21. EFLM Biological Variation Database [Internet]. -: European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. c2018 - [citerad 2021 Apr 30]. Tillgänglig från: https://biologicalvariation.eu/
