Examensarbete
15hp Malmö Universitet
Biomedicinska analytikerprogrammet Hälsa och samhälle
Februari 2021 205 06 Malmö
PROTOKOLLOPTIMERING:
IMMUNHISTOKEMISK
FÄRGNING MED EN PAX8 ANTIKROPP
MARAM MOTAR
1
PROTOKOLLOPTIMERING:
IMMUNHISTOKEMISK
FÄRGNING MED EN PAX8 ANTIKROPP
MARAM MOTAR
Motar, M. Protokolloptimering: immunhistokemisk färgning med en PAX8 antikropp (EP331). Examensarbete i Biomedicinsk laboratorievetenskap 15 högskolepoäng. Malmö Universitet: Fakulteten för hälsa och samhälle, institutionen för Biomedicinsk vetenskap, 2021.
Paired box (PAX) gener kodar för en familj av nio stycken PAX
transkriptionsfaktorer. PAX transkriptionsfaktorer är uppbyggda av en N-terminal DNA-bindande domän som utgörs av 128 aminosyror, en oktapeptid, och en C- terminal DNA-bindande domän. Studier har visat att PAX8 har en betydande roll vid utvecklingen av olika typer av tumörer. MRQ-50 är en antikropp som används inom Region Skåne för att påvisa PAX8 uttryck vid histopatologisk diagnostik.
MRQ-50 riktas mot N-terminalen av PAX8 som är homolog med N-terminalen av PAX5. Detta kan leda till en korsreaktion i B-lymfocyter samt neoplasier, vilket inte är optimalt för diagnostik. Av den anledningen fortsätter forskning för att hitta en ny klon som kan ersätta MRQ-50. EP331 är en antikropp som är anpassad för detektion av det nukleära antigenet PAX8 och korresponderar till C-terminalen av human PAX8 protein. Syftet med arbetet är att optimera ett
immunhistokemiskt färgningsprotokoll för detektion av PAX8 med hjälp av anti- PAX8 antikroppen EP331 och undersöka om godkända resultat kan erhållas.
Detta gjordes för att ta reda på om det går att optimera ett protokoll med EP331, och om det erhålls lämpligare resultat än MRQ-50. Optimeringen gjordes på kontrollvävnader njure, tuba/äggledare och appendix och testades slutligen på patientprov med tumörvävnad. För protokolloptimering testades heat induced epitope retrieval, inkuberings tid av EP331, amplifiering, Ultra Wash i olika testomgångar. Resultatet visade att kärnor i epitelceller i proximala-, distala- njurtubuli och parietala epitelceller som klär Bowmans kapsel infärgades måttligt till starkt. De sekretoriska epitelen i tuba infärgades med stark intensitet och cilierade epitel måttligt. Infärgningen på patientprover visar godkänd specificitet, med en generell måttlig till stark intensitet. Med fler forskningsstudier av EP331 är det möjligt att primärantikroppen kan ersätta MRQ-50.
Nyckelord: EP331, immunhistokemi, MRQ-50, PAX8, protokolloptimering, tumörmarkör
2
PROTOCOL OPTIMIZATION:
IMMUNOHISTOCHEMICAL STAINING WITH A PAX8 ANTIBODY
MARAM MOTAR
Motar, M. Protocol optimization: immunohistochemical staining with a PAX8 antibody. Degree project in Biomedical Science 15 Credit Points. Malmö University: Faculty of Health and Society, Department of Biomedical Science, 2021.
Paired box (PAX) genes codes a family of nine PAX transcription factors. PAX transcription factors are made up of an N-terminal DNA binding domain
consisting of 128 amino acids, an octapeptide, and a C-terminal DNA binding domain. Studies have shown that PAX8 plays a significant role in the
development of various types of tumors. MRQ-50 is an antibody used in Region Skåne to detect PAX8 expression in histopathological diagnosis. MRQ-50 is directed towards the N-terminal of PAX8 which is homologous to the N-terminal of PAX5. This can lead to a cross-reaction in B lymphocytes and neoplasms, which is not optimal for diagnosis. For that reason, research to find a new clone that can replace MRQ-50 continues. EP331 is an antibody that can detect the nuclear antigen PAX8 and corresponds to the C-terminus of human PAX8 protein.
The purpose of this study is to optimize an immunohistochemical staining protocol for the detection of PAX8, using the anti-PAX8 antibody EP331, and to investigate whether approved results can be obtained. This was done to determine if it is possible to optimize a protocol with EP331, and if the results that are obtained are more appropriate than MRQ-50. The optimization was done with control tissues; kidney, fallopian tube and appendix, and was lastly tested on patient samples with tumor tissue. For protocol optimization, heat induced epitope retrieval, incubation time of EP331, amplification, Ultra Wash were tested in different test rounds. The results showed that nuclei in epithelial cells in proximal, distal-renal tubules and parietal epithelial cells that cover the Bowman capsule were moderately to strongly stained. The secretory epithelium of the tuba was stained with strong intensity and ciliated epithelium were stained moderately. The staining on patient samples shows approved specificity, with a general moderate to strong intensity. With more research studies of EP331, it is possible that the primary antibody may replace MRQ-50.
Keywords: EP331, immunohistochemistry, MRQ-50, PAX8, protocol optimization, tumor marker
3
FÖRORD
Jag vill framföra ett stort tack till Annette Persson som är legitimerad
biomedicinsk analytiker, PhD, och som har hjälpt och givit mig den stöd som behövdes för att utföra projektet. Jag vill även ge ett stort tack till Dinusha Nilanduwage, legitimerad biomedicinsk analytiker, för den laborativa
handledning och kunskap som krävdes för att utföra projektet. Ett stort tack till Annica Jönsson, som är legitimerad biomedicinsk analytiker samt enhetschef i Patologiavdelningen i Region Skåne, för erbjudandet av detta projekt. Tack till Anette Gjörloff Wingren och Håkan Eriksson för handledningen. Och ett stort tack till min syster som stöttat mig under projektets gång.
4
INNEHÅLLSFÖRTECKNING
BAKGRUND ... 6
Karcinom och PAX8 ... 6
PAX8 Antikroppar ... 7
Kontrollvävnader ... 8
Histoteknik och Immunhistokemisk metodik ... 8
Syfte ... 9
Frågeställning ... 9
MATERIAL OCH METOD ... 10
Urval ... 10
Framställning av kontrollklossar och snittning ... 10
Immunohistokemisk metodik ... 11
Protokolloptimering ... 12
Mikroskopering och skanning ... 13
Bedömningsskala ... 12
Protokollverifiering och patientprov ... Fel! Bokmärket är inte definierat. Etisk bedömning ... 13
RESULTAT ... 14
Protokolloptimering ... 14
Testomgång 1 ... 14
Testomgång 2 ... 15
Testomgång 3 ... 15
Testomgång 4 ... 16
Testomgång 5 ... 17
Protokollverifiering ... 17
Patientprov ... 18
DISKUSSION ... 21
Metoddiskussion ... 21
Val av kontrollvävnader ... 21
Förbehandling - fixering ... 22
Antigen retrieval ... 22
Ready to use antikropp ... 23
Förekomst av bakgrund i vävnad ... 23
Resultatdiskussion ... 23
CC1 eller CC2 ... 23
Tid och temperatur för HIER ... 24
Förbehandling och kontrollmaterial ... 25
5
Primärantikroppen ... 25
Protokollverifiering ... 25
Utvärdering av EP331 ... 26
KONKLUSION ... 26
REFERENSER ... 27
BILAGA 1 ... 29
BILAGA 2 ... 30
BILAGA 3 ... 31
BILAGA 4 ... 32
6
BAKGRUND
Transkriptionsfaktorer är proteiner som lokaliseras i cellkärnan och hjälper kontrollera transkriptionen av specifika gener. Transkriptionsfaktorer uttrycks oftast inte lika mycket i mognare vävnader [1]. Paired box (PAX) gener kodar för en familj av nio stycken PAX transkriptionsfaktorer (PAX1-9) som har liknande strukturer [2]. PAX transkriptionsfaktorer är uppbyggda av en N-terminal DNA- bindande domän som utgörs av 128 aminosyror, en oktapeptid, och en C-terminal DNA-bindande domän [3]. PAX transkriptionsfaktorer är viktiga för embryogenes där vävnader och organ utvecklas vilket är nödvändigt för att upprätthålla normal funktion av celler efter födseln [1-2]. PAX-proteiner har en funktion som
regulator av organogenes och är viktig för upprätthållning av pluripotens hos stamcellspopulationer under utveckling [1]. En del PAX-grupper har delats in i subgrupper eftersom de liknar varandra strukturmässigt, dessa är PAX2, PAX5 och PAX8 [3].
PAX8-genen finns på kromosom 2 som kodar för PAX8 proteinet [4]. PAX8 är viktig för organogenesen för müllerska organ, sköldkörteln, njurar, hjärna och ögon [2]. PAX8 är bland de transkriptionsfaktorerna som kontrollerar och
aktiverar transkription av bland annat proteinerna tyroglobulin och tyroperoxidas som är ansvariga för den funktionella aktiviteten hos follikulära celler i
sköldkörteln. I utvecklingen av njurarna är PAX8 viktig för vesikel bildningen i njurarna och reglerar uttrycket WT1-genen som är viktig för njurens utveckling [5]. PAX8 finns uttryckt i höga nivåer i specifika typer av tumörer såsom sköldkörtelkarcinom, njurcellskarcinom av klarcellstyp men även i seröst
epitelialtäggstockskarcinom. Studier har visat att PAX8 har en betydande roll vid utvecklingen av olika typer av tumörer. Tillsammans med
thyroidtranskriptionsfaktorerna TTF-1 och TTF-2 är PAX8 associerad med
sköldkörtelns organutveckling. Sköldkörtelkarcinom har ett högt uttryck av PAX8 och har, i forskningsstudier, identifierats i 90% av cancerfallen.
Njurcellskarcinom av klarcellstyp färgades även de positivt för PAX8 i 90% av de studerade fallen. Även äggstockskarcinom uttrycker höga nivåer av PAX8. Detta tyder på att PAX8 detektionen kan vara användbart vid diagnostik av dessa tumörtyper inom klinisk patologi [2].
Karcinom och PAX8
Sköldkörtelskarcinom är en cancer som utvecklats från sköldkörtelns follikulära epitel. Det finns olika typer av sköldkörtelskarcinom; papillärt, follikulärt,
medullärt samt anaplatiskt, där papillärt och follikulärt är vanligast förekommande medan anaplastisk sköldkörtelkarcinom är sällsynt [6]. PAX8 färgning är en bra markör för karcinom med follikulär epitel [7] och uttrycks av de olika typerna sköldkörtelkarcinom i olika nivåer. PAX8 uttrycktes måttligt till starkt i follikulärt sköldkörtelkarcinom och papillär sköldkörtelkarcinom men uttrycktes svagare i medullärt sköldkörtelkarcinom [8]. Vid anaplastiskt sköldkörtelskarcinom uttrycks PAX8 i höga nivåer och kan därför vara en användbar markör för differentiering mellan anaplastisk sköldkörtelskarcinom och skivepitelkarcinom från struphuvud och svalg som inte uttrycker PAX8. PAX8 kan uttryckas av skivepitelcancer dock inte av typen från svalg eller struphuvud [7]. PAX8 skulle även fungera som användbar markör för att påvisa metastaser från sköldkörteln i olika organ såsom lunga, hjärna och skelett, vilket är vanliga platser för metastas från sköldkörtelskarcinom [6]. Det har tidigare hänt att patienter fel
7
diagnostiserats. I ett fall har en patient med lungkarcinom misstagits för att primärt ha ett anaplastiskt sköldkörtelkarcinom. Detta hände då patologen utifrån morfologin leddes att tro att tumören metastaserats från sköldkörteln, när det egentligen var en lymfkörtelmetastas från en primärlungcancer. PAX8 hade hjälpt i detta sammanhang då PAX8 uttrycks av sköldkörteln men uttrycks inte av normalvävnad och karcinom från lungorna [8].
Njurcellkarcinom (RCC) uppstår från njurbarken eller renala tubulära eptielceller.
Det finns olika klasser av RCC, bland dem är njurcellskarcinom av klarcellstyp (ccRCC) som är en vanligt förekommande primär njurcancer [9]. Vaskulära invasioner samt metastaser är typiskt för RCC. RCC metastaser kan vara svåra att diagnostisera på grund av dess mångfaldiga histologi. Detta kräver
immunhistokemisk analys med markörer för konfirmation av cancertypen. PAX8 uttrycks i normalvävnad med olika nivåer i vissa njurepitelsegment; proximal tubuli, distal tubuli och parietalceller som klär Bowmans kapsel. PAX8 uttrycks även i neoplastisk njurvävnad där nästan alla ccRCC studerade fall uttryckte PAX8. Då RCC vanligtvis metastaserar blir PAX8 lämplig som markör för att bekräfta tumörer med sitt ursprung från njurepitel [10].
Äggstockarna utgörs av olika typer av celler; germinalceller, stromaceller och epitelceller. Äggstockscancer kan uppkomma från alla dessa typer av celler.
Äggstockscancer är en av de mest dödliga cancerformerna hos kvinnor och man saknar bra markörer vid diagnostik. Seröst epitelialt äggstockskarcinom är den vanligast förekommande äggstockscancern. PAX8 har visat sig vara lämplig som markör för detektion och diagnostik av äggstockskarcinom då den uttrycks i höga nivåer [2,11]. Den är också användbar som markör vid kartläggning av
metastasers ursprung. Hos kvinnor är det svårt att differentiera mellan äggstocks- och bröstcancer, båda typerna utvecklas från hormonellt känsliga vävnader.
Metastaserade bröstkarcinom efterliknar morfologiskt primär äggstockskarcinom, vilket resulterar till svårigheter att skilja mellan cancertyperna. Studier visar att PAX8 inte infärgar primär bröstkarcinom, men infärgar äggstockskarcinom.
Därför går det att skilja typerna även vid metastasering [2].
PAX8 Antikroppar
MRQ-50 är en monoklonal antikropp (mAb) som används inom Region Skåne för att påvisa PAX8 uttryck vid histopatologisk diagnostik. Antikroppen kan
användas som primär antikropp för immunhistokemisk färgning av vävnad som är formaldehyd fixerad och inbäddad i paraffin [12]. MRQ-50 riktas mot N-
terminalen av PAX8 som är homolog med N-terminalen av PAX5 [3,13]. Detta kan leda till en korsreaktion i B-lymfocyter samt neoplasier [14]. NordiQC är en organisation som arbetar för att förbättra kvalitén av IHK genom att granska och sammanställa resultat av IHK-färgningar utförda på olika laboratorier i Norden och utifrån detta tillhandahålla förslag på färgningsprotokoll. NordiQC
rekommenderar MRQ-50 för att påvisa PAX8-uttryck. Dock har antikroppen frambringat ett icke optimalt resultat eftersom MRQ-50 korsreagerar med PAX5 uttryckt på B-lymfocyter [13]. I och med det fortsätter forskning för att hitta en ny klon som kan ersätta MRQ-50.
EP331 är en kanin monoklonal antikropp (rmAb) av isotypen IgG. Antikroppen är anpassad för detektion av det nukleära antigenet PAX8 genom immunhistokemisk metodik, se figur 1. EP331 kan användas som primär antikropp för detektion i formaldehyd fixerad och paraffininbäddad vävnad. EP331 korresponderar till C-
8
terminalen av human PAX8 protein [14]. Tidigare laborativa försök med rmAb EP331 har visat att antikroppen inte korsreagerar med PAX5 proteinet som finns uttryckt på B-lymfocyter eftersom EP331 riktas mot C-terminalen. Detta innebär att antikroppen EP331 har en bra specificitet [13].
Figur 1. En PAX8 kärninfärgning (bruna kärnor) av sköldkörteln med antikroppen EP331, taget från CELLMARQUE [14].
Kontrollvävnader
Kontrollvävnader används för att validera resultat genom att observera om en reaktion skett på positiv kontroll respektive utebliven reaktion på negativ kontroll.
På så sätt går det att kontrollera om metoden utförts rätt, samt om maskiner och reagens fungerat korrekt [15]. NordiQC rekommenderar appendix och tonsill som negativ kontroll, eftersom dessa vävnader saknar PAX8-uttryck. Tonsiller
rekommenderas speciellt som negativ kontroll för PAX8 för att utesluta kärnfärgning i lymfocyter vilket tyder på en korsreaktion med PAX5. Njure respektive äggledare rekommenderas av NordiQC som positiv kontroll. Olika delar av njuren visar olika nivåer av uttryckt PAX8. Svag till måttlig kärnfärgning ska synas i majoriteten av epitelceller i proximala, distala njurtubuli och parietala epitelceller som klär Bowmans kapsel. I äggledare/tuba innersta lager uttrycks olika epitelceller, där ska en svag till måttlig kärnfärgning synas på majoriteten cilierade epitelceller medan sekretoriska epitelceller ska visa en stark
kärnfärgning [13, 16].
Histoteknik och Immunhistokemisk metodik
Histoteknik innebär att vävnader prepareras för att bevara sin ursprungliga
struktur och för att möjliggöra patologiska undersökningar av vävnadens utseende och tillstånd samt för visualisering av vävnadskomponenter. Detta görs genom fixering, dehydrering, inbäddning, snittning och färgning. Vävnad tillvaratagen för analys inom Klinisk patologi fixeras vanligtvis med formaldehyd, för att avbryta livsprocesserna och förhindra postmortala förändringar som autolys, bakterienedbrytning och förruttnelse. Detta sker genom att kemiska egenskaperna hos vävnadskomponenter ändras, där den tredimensionella protein
konformationen ändras genom cross-linking. Därmed går det att bevara vävnadens utseende och cellkomponenter till att efterlikna den levande vävnaden i kroppen så mycket som möjligt [17].
9
Immunhistokemi (IHK) används för att lokalisera olika antigen i celler i vävnader.
Denna metod utnyttjar antikroppar som kan vara riktade mot antigen i cellkärnor, cytoplasma eller cellmembran. Med IHK går det bland annat att detektera
tumörers ursprung genom att specifika markörer påvisas, vilket kan styra val av behandling [15, 18].
Indirekt metod, där både primär och sekundär antikropp används, är vanligast vid IHK. Denna metod är av högre sensivitet än direkt metod där enbart enzymmärkta primärantikroppar används. Vid indirekt metod binder primär antikroppen med komplementärt antigen/epitop, sedan tillsätts en enzymbunden sekundär antikropp som binder på primärantikroppens Fc region så att ett komplex bildas. Oftast är det enzymet horse radish peroxidase (HRP) som används. Med tillsats av substratet väteperoxid (H2O2) och ett kromogen, 3,3'-
diaminobensidintetrahydroklorid (DAB), kan reaktionen katalyseras så att en färgfällning bildas där primär antikropp bundit till antigen/eptiop, på så sätt går det att detektera att det undersökta antigen finns [15].
Svagt antigenuttryck leder till en svag infärgning, dvs svag signal, vilket kan bidra till svårigheter vid diagnostik. Amplifiering är då lämplig för att intensifiera färgningen och öka signalen för antigen. För att amplifiera ett antigen utnyttjas flera antikroppar. Då krävs det att primärantikroppen först binder till
komplementärt antigen i vävnaden, därefter kan amplifieringsantikroppar binda in och bilda stora komplex med primärantikroppen. Vid tillsats av detektionskit kan antigenen visualiseras och pga antikroppskomplexens storlek leder det till en intensivare färgning dvs specifik starkare signal [19-20].
Vid formaldehydfixering produceras metylenbryggor som sätter sig som ett nätverk över vävnaden. Dessa metylenbryggor maskerar antigen. En antigen retrieval (AR) måste utföras för att bryta dessa metylenbryggor och möjliggöra ett komplex mellan primärantikropp och antigen. Antigen retrieval kan göras genom enzyme induced epitope retrieval (EIER) eller med heat induced epitope retrieval (HIER). Vid HIER används buffertlösningar med olika pH och med olika
sammansättning. Vid EIER används olika proteolytiska enzym vilka behöver olika lång tid för att katalysera reaktionen [15].
Syfte
Syftet med arbetet är att optimera ett IHK-färgningsprotokoll för detektion av PAX8 med hjälp av anti-PAX8 antikroppen EP331.
Frågeställning
Går det att optimera ett protokoll med anti-PAX8 antikroppen EP331 genom att ändra på följande parametrar; heat induced epitope retrieval, antikroppsinkubering, amplifiering och tvätt med Ultra Wash?
Ger EP331 ett säkrare/tydligare resultat än anti-PAX8 antikroppen MRQ- 50?
10
MATERIAL OCH METOD
Nedan presenteras material som använts och metoder som tillämpats samt en tabell som sammanställer inställningar/justeringar för testomgångar av protokolloptimeringen. Tabellen är gjord i Microsoft Office 365 Excel.
Framställning av kontroller, snittning samt immunhistokemisk metodik och mikroskopering utfördes på patologilaboratoriet i Centralsjukhuset Kristianstad (CSK). Där användes befintligt samt inköpt material och maskiner.
Urval
All vävnad som användes i studien har sedan tidigare förbehandlats genom
formaldehydfixering, dehydrering och inbäddning i paraffin. Positiva och negativa vävnadskontroller av normalvävnad valdes ut enligt rekommendationer från NordiQC [13]. Dessa kontroller var befintliga paraffinklossar med vävnad tillvaratagen vid operation, framplockade från Klinisk patologis biobank i CSK.
Appendix (6st) användes som negativ kontroll och njure (5st) samt tuba/äggledare (6st) användes som positiv kontroll. Från detta kontrollmaterial skapades totalt 9st multiklossar som användes vid protokolloptimeringen. Vid testomgång 1-3
användes multikloss 1-3, dvs totalt 3 appendix, 3 njure och 3 tuba. Multikloss 4-6 användes för omgång 4 och 5, dvs 3 appendix, 1 njure och 3 tuba (se
framställning av kontrollklossar och snittning). Multikloss 7-9 användes för protokollverifieringen där 1 njure användes, tuba samt appendix från tidigare testomgångar återanvändes vid protokollverifieringen. Avidentifierade patientprover/klossar, totalt 23 stycken, med tumörvävnad från endometrie-, cervix-, tuba, adnexa och njurmaterial framplockades för senare verifiering av slutgiltigt protokoll. Dessa patientprov, framletade med datasystemet LIMS, hade ett sedan tidigare känt uttryck av PAX8 identifierat med IHK-färgning och MRQ50-antikropp. Patientklossarna hämtades från klinisk patologis biobank i CSK.
Framställning av kontrollklossar och snittning
Positivt och negativt kontrollmaterial grovsnittades 20 μm tjockt för att få med hela vävnaden i snitten. Därefter finsnittades kontrollklossarna 3,5 μm tjockt. All snittning gjordes med mikrotom Leica HistoCore MultiCut (Leica, Biosystems, USA) med mikrotomkniv MX35 Ultra (Thermo Scientific, USA). Snitten
placerades på objektglas Superfrost Microscope slides (Thermo Scientific, USA) tillsammans med destillerat vatten för att sedan sträckas ut på värmeplatta (Kunz instruments, Danmark). Glasen bakades/torkades i 10 min vid 65 C med en automatiserad färgmaskin DAKO CoverStainer (DAKO, Agilent pathology stainer, Danmark). Därefter översiktsfärgades glasen med hematoxylin och eosin (H&E) i samma maskin och mikroskoperades för att undersöka om samtliga vävnader godkändes som representativt kontrollmaterial. Därefter framställdes totalt 9st multiklossar med godkänt kontrollmaterial från originalklossar med kontrollvävnad. Varje multikloss utgjordes av normalvävnaderna; njure,
tuba/äggledare respektive appendix. Vävnaden stansades med Sakura Tissue-Tek Quick-Ray Microarray System (Sakura Finetek, Japan) med diametern 5mm och bäddades in på nytt med smält paraffin och fick stelna på en kylplatta (Kunz instruments, Danmark). Vid testomgång 4 och 5 stansades en njurvävnad till 3 bitar som användes i multikloss 4-6. Vid protokollverifieringen stansades en njurvävnad till 3 bitar som användes i multikloss 7-9, därmed 5 njurvävnader totalt, se urval. Inför IHK-färgning snittades multikloss 7 samt klossar med
11
patientprov enligt beskrivning ovan, dock placerades snitten på objektglas som är specifikt anpassade för IHK, Superfrost Plus Microscope slides (Thermo
Scientific, USA). För protokolloptimeringen placerades snitt från 3 multiklossar i ett glas. Totalt var det 3 snitt i ett glas, där 2 identiska glas skapades för varje testomgång. Detta gjordes för att prova båda protokoll på identisk vävnad för varje testomgång. Alla glas med patientmaterial hade även ett snitt från en multikloss för att kontrollera att maskiner, reagens samt infärgning fungerat.
Preparaten lades i Termaks värmeskåp (Termaks, AS, Norge) för att torka i 60 C i en timme, som avlägsnar vattnet och får snitten att fästa bättre på glasen.
Immunohistokemisk metodik
PAX8 (EP331) Rabbit Monoclonal Primary Antibody (CELL MARQUE, Tissue Diagnostics, USA) samt detektionskitet ”Ultra View DAB Kit” (Roche Ventana, Medical Systems, USA), som utgjordes av olika dispenser med reagens, användes för immunhistokemisk färgning. Kit med primär antikropp är en ”ready to use”
antikropp med koncentrationen 1,19µg/ml och behövdes inte spädas före användning. Objektglas med snitt samt dispensrar med primär antikropp och övriga reagenser placerades i en automatiserad färgmaskin anpassad för IHK, Ventana Bench Mark Ultra (Roche Ventana, Medical Systems, USA). Glasen bakades/torkades ytterligare i färgmaskinen i 4 min vid 65 C, sedan
avparaffinerades preparaten med EZ Prep reagens i 72 C i 4 min. Ultra Liquid Coverslip (LCS) är en olja som droppades på mellan varje steg för att förhindra uttorkning. Reaction buffer med pH 7,4-7,8 användes för att skölja glasen efter varje steg [19]. För HIER användes Cell Conditioning 1 (CC1) och Cell
Conditioning 2 (CC2) där CELL MARQUE rekommenderar CC1 [14]. CC1 och CC2 har olika pH och olika innehåll. CC1 är en tris/borate/EDTA buffert och är mer basisk (pH 8,0-8,5). CC2 innehåller citratbuffert och är mer sur (pH 6,0).
Reagenserna nämnda ovan köptes från Roche Ventana, Medical Systems, USA.
Vid användning av automatiserade maskiner från Roche Ventana, Sakura, och DAKO följdes maskinernas medföljda manual samt patologilaboratoriets rutiner i CSK [19].
Efter HIER tillämpades tillsatsen av antikroppen EP331 och visualiseringssteget med ”Ultra View DAB kit” som utgjordes av olika dispensers. Varje dispenser nedan applicerar en droppe vilket motsvarar en reagensdispernering och glasen inkuberades i olika tider vid 36 C. Ultra View inhibitor är den första dispensern av ”Ultra View DAB kitet” där lösningen applicerades och inkuberades i 4 min vilket inhiberar endogent peroxidas. Därefter tillsattes primär antikropp, EP331, som binder med komplementär antigen/epitop och inkuberas efter utvald tid, se tabell 1, i 36 C. Ultra View HRP Multimer (andra dispensern) applicerades sedan och inkuberades i 8min, då binder sekundära antikroppar konjugerade med flera HRP enzym med primära antikroppar. Multimer antikroppar i kitet utgjordes av Goat anti-Mouse sekundära antikroppar av IgG och IgM samt Goat anti-rabbit IgG. Ultra View DAB Chromogen (tredje dispensern) försåg reaktionen med DAB kromogenet, tillsammans med Ultra View H2O2 (fjärde dispensern). Först
applicerades en droppe DAB kromogen, sedan en droppe av Ultra View H2O2 och inkuberades i 8 min. Ultra View H2O2 innehåller substratet väteperoxid som tillsammans med enzymet HRP och kromogenet DAB bildar fällning vid IHK reaktionen med ljusare brun/röd färg. I nästa steg applicerades Ultra View DAB Copper och inkuberades i 4 min för att ge fällningen en förstärkt mörkbrun färg [19].
12
Vid vissa testomgångar tillämpades en amplifiering, se tabell 1, där Amplification Kit A&B (Roche Ventana, Medical Systems, USA) som utgjordes av anti-mouse antikropp (amplifier A) och anit-rabbit atikropp (amplifier B) användes.
Amplifieringen utfördess innan tillsattsen av Ultra View HRP Multimer, dvs efter att EP331 antikroppen applicerades. Amplifieringen inkuberades totalt 16 min vid 36 C där amplifier A inkuberades i 8 min och amplifier B inkuberades i 8 min.
Vid slutet av reaktionen (efter Ultra View DAB Copper) tillsattes Ultra Wash buffert (Roche Ventana, Medical Systems, USA) vid alla testomgångar förutom sista, se tabell 1. Ultra Wash buffert tvättar bort eventuell bakgrund på vävnaden från ”Ultra View DAB kit” dvs överskottsfällning.
För visualisering av den generella morfologin hos vävnaden gjordes en
kontrastfärgning med hematoxylin i 8 min vid 36 C och en post-kontrastfärgning med blueing reagens i 4 min vid 36 C. Hematoxylinen färgade kärnorna blå och blueing reagens gav kärnorna en mörkare blå färg och den generella morfologin en svag blå färg. Efter IHK färgning placerades glasen i en behållare under
rinnande ljummet vatten och diskmedel i 1 min för att lösa upp LCS oljan. Glasen dehydrerades i 6 min med 95 % etanol och i 6 min med 99,5 % etanol och
förbereddes för montering i xylen 6 min som avlägsnade alkoholen. Glasen monterades sedan med pertex (Histolab Products AB, Göteborg). Dehydrering, clearing och montering gjordes i maskinen Sakura Tissue-TEK Prisma Plus (Sakura Finetek, Japan), glasen lufttorkades efter monteringen.
Protokolloptimering
För protokolloptimeringen testades HIER med Ultra CC1 och CC2, där
inkubationstiden samt temperatur för CC1 och CC2 justerades. Inkuberingstiden för PAX8 (EP331) Rabbit Monoclonal Primary Antibody samt amplifiering med Amplification kit A&B och Ultra Wash buffert testades och justerades i olika omgångar enligt tabell 1. Dessa inställningar/justeringar gjordes med Ventana Bench Mark Ultra. För optimeringen användes två grundprotokoll, 1377 och 1378, som justerades för varje omgång, se tabell 1.
Bedömningsskala
Bedömningsskalor för specificitet av antikroppsinmärkning (kärninmärkning), intensitet på infärgning, jämnheten på antikroppinfärgningen över vävnaden samt specifik bakgrundsfärgning tillämpades som ett kriterium för att bedöma de resultat som erhållits. Specificitet bedömdes som godkänd eller underkänd.
Jämnheten bedömdes som jämn eller ojämn. Intensitet av positiv infärgning samt ospecifik bakgrundsinfärgning bedömdes enligt en fyrgradig skala (0= negativ, 1=svag, 2=måttlig, 3=stark), i enighet med en annan studie [1].
Protokollverifiering och patientprov
För att verifiera protokoll 1377E från test 5, som vid protokolloptimeringen betraktades ge bäst resultat gjordes ytterligare två test. Då användes multiklossar (7-9) för att validera att protokollet fungerat med andra vävnader. Patientprover snittades och tillsammans med ett kontrollsnitt, från multikloss 7 som användes vid protokollverifieringen, så infärgades preparaten med det verifierade
protokollet 1377E från test 5.
13
Tabell 1. Protokolloptimering i olika test omgångar (1-5). Valet av antigen retrieval samt antikroppsinkuberingen, Amplifiering, Ultra Wash och kontrastfärgningen presenteras.
Kontrastfärgning gjordes med Hematoxylin i 8min och Blueing i 4 min som tillämpades vid alla protokoll tester.
Mikroskopering och skanning
Preparaten bedömdes genom mikroskopering (Mikroskop LRI, Olympus, Lund) efter varje testomgång. Tillsammans med en legitimerad Biomedicinsk Analytiker undersöktes resultaten av PAX8 infärgning på kontrollvävnad och patientprov enligt bedömningsskalan. Resultaten noterades och nödvändiga justeringar inför nästa testomgång för protokolloptimering diskuterades och fastställdes. Samtliga patientpreparat och kontrollpreparat skannades med programmet Nano Zoomer Digital Pathology (Hamamatsu Photonics, Japan).
Etisk bedömning
En etikprövning utfördes inte då provmaterial som användes i studien, bestående av paraffin-inbäddade vävnadsklossar framplockade från Klinisk patologins biobank, avidentifierades. Patienters integritet skyddades därmed förblir patienter anonyma.
Test omgång
Protokoll Antigen retrieval, temperatur och tid
Antikroppsinkubering Tid, och temperatur
Amplifiering/Ultra Wash
Test 1 1377A CC1, 95C, 20min
32min, 36C Ultra Wash 1378A CC2, 95C,
24min
32min, 36C Ultra Wash Test 2 1377B CC1, 95C,
52min 32min, 36C Ultra Wash
1378B CC1, 95C, 76min
32min, 36C Ultra Wash Test 3 1377C CC1, 95C,
92min 36min, 36C Ultra Wash
1378C CC1, 95C,
92min 32min, 36C Ultra Wash
Test 4 1377D CC1, 100C, 92min
36min, 36C Ultra Wash
1378D CC1, 100C, 92min
36min, 36C Amplifiering, Ultra Wash
Test 5 1377E CC1, 100C, 92min
36min, 36C Amplifiering, ingen Ultra Wash
1378E CC1, 100C, 92min
40min, 36C Amplifiering och Ultra Wash
14
RESULTAT
Erhållna resultat från studiens olika stadier inom immunhistokemisk metodik för optimering av protokoll redogörs enligt följande. Inledningsvis presenteras protokolloptimering med kontrollmaterial i olika testomgångar, därefter protokollverifiering och patientprovtest. Skannade bilder samt tabeller gjorda i Microsoft Office 365 Excel som sammanställer erhållna resultat presenteras.
Protokolloptimering
För protokolloptimeringen med kontrollvävnad vald utifrån rekommendationer av NordiQC [13] användes multiklossarna 1-6, se material och metod -”urval” och
”framställning av kontrollklossar och snittning”. Resultat för protokolloptimering gjord på multiklossar är sammanställd och uppdelad i tabell 2-4, se bilaga 1-3.
Resultat för appendix (negativ kontroll) är inte medskriven i tabellerna då appendix visade negativt för PAX8 infärgning för alla bedömningskriterier vid alla testomgångar. Eftersom cilierade epitelkärnor infärgades måttligt bedömdes intensiteten som mest efter sekretoriska epitelkärnorna.
Testomgång 1
Resultatet visade en måttlig infärgning av tubans innerepitel från multiklossar 1-3 infärgad med protokoll 1377A och 1378A, se tabell 1. En ojämn infärgning över hela tubans epitel visades men varken bakgrund eller ospecificitet förekom för tuba infärgningen. Det fanns inga stora skillnader på resultatet mellan protokollen då en måttlig infärgning erhölls totalt, dock upplevdes en jämnare och bättre infärgning på tubans cilierade- och sekretoriska epitelceller med CC1 i jämförelse med CC2. Vävnaden med tuba behandlat med 1378A uppvisade vävnadsektioner som lossnat från glaset, se figur 2. Njure, i alla tre multiklossar, visade ingen infärgning överhuvudtaget för båda protokoll och ansågs därför som icke- bedömbart utifrån tidigare bestämda kriterier, se bilaga 1-3.
Figur 2. IHK färgning av PAX8 med normalvävnad gjort på kloss 1. Figuren presenterar en negativ PAX8 infärgning av appendix med 1377A (A) och njure med 1377A (B). En måttlig infärgning av tuba med protokoll 1377A (C) och 1378A (D), där pilarna visar ojämn kärninfärgning samt en skillnad mellan vävnaden. Bilderna togs med 10x förstorning.
15 Testomgång 2
För denna omgång visades det en lite mer intensiv kärninfärgning i vissa delar av tubavävnaden för alla multiklossar och för båda protokoll jämfört med testomgång 1. Med protokoll 1377B och 1378B infärgades tuba i multikloss 3 med en svagare intensitet i en del områden av vävnaden vilket inte syndes i de andra två
multiklossar. Dock klassades multikloss 3 som måttlig infärgning vad gäller intensitet. Protokoll 1378B med längre CC1 tid gav tubakontrollerna lite mer intensiv och jämnare infärgning än 1377B som visas i figur 3. Men båda
protokollen gav ett måttligt resultat med ojämn infärgning för alla multiklossar, se bilaga 1-3. Resultatet för omgång 2 gav ingen ospecificitet eller bakgrund för all tubavävnad. Njure visade ingen infärgning för alla tre kontrollerna med båda protokollen och bedömdes därför som icke-bedömbar vad gäller specificitet, bakgrund samt intensitet.
Figur 3. IHK färgning av PAX8 med normalvävnad. Figuren visar resultat för testomgång 2 (kloss 1) där tubavävnader infärgade med 1377B (A) och 1378B (B) presenteras. Bilderna togs med 10x förstoring.
Testomgång 3
Resultatet för denna testomgång visade en mycket svag njurinfärgning för ett fåtal kärnor i njuren i alla 3 multiklossar med båda protokoll, se figur 4. Då
infärgningen inte uppnått svag intensitet enligt bedömningsskalan, klassades intensiteten för njurvävnaden fortfarande som icke-bedömbar som presenteras i tabeller 2-4 i bilaga 1-3. Tuba uppvisade en jämnare infärgning med båda protokoll för denna testomgång jämfört med tidigare omgångar. Det förekom ingen skillnad på färgintensiteten för tuba infärgad med 1377C och 1378C, men en måttlig till stark intensitet erhölls. Specificitet för 1377C och 1378C godkändes samt ingen bakgrund observerades för tubavävnader. De cilierade epitelcellerna infärgades måttligt medan de sekretoriska epitelcellerna färgades måttligt till intensivt.
16
Figur 4. IHK färgning av PAX8 med normalvävnad. Figuren presenterar resultat för testomgång 3 (kloss 1) där njurvävnader är infärgade med 1377C (A) och 1378C (B). Pilarna pekar på svagt infärgade kärnor från Bowmanskapsel samt njurtubuli. Bilderna togs med 10x förstoring.
Testomgång 4
En jämn och stark infärgning på tubans sekretoriska epitel och en måttlig infärgning förekom med protokoll 1378D. Sekretoriska epitelkärnor från tuba, infärgat med protokoll 1377D, gav en jämn och måttlig till stark infärgning, medan cilierade epitelceller infärgades måttligt. En godkänd specificitet samt ingen bakgrund erhölls för tubavävnaden med protokoll 1377D och 1378D.
Morfologiskt sågs en negativ effekt på tubavävnad med båda protokollen då kärnor och vävnadsstrukturer var inte lika tydliga som för tidigare omgångar.
Kärnor för de olika njursegment blev svagt infärgade i denna omgång, se figur 5.
Med protokoll 1377D blev njurvävnadens kärninfärgning svag men uppvisade specificitet samt ingen till svag bakgrund i olika delar av njurvävnaden. För protokoll 1378D erhölls det svag kärninfärgning för alla tre njurvävnader dock var dem något intensivare än njurarna infärgade med protokoll 1377D, men bedöms ändå som svag, se tabeller i bilaga 1-3. En specifik kärninfärgning och svag bakgrund observerades för alla tre njurkontrollmaterial med protokoll 1378D.
Dock var infärgningen som starkast vid kanterna av vävnadssnittet och var inte jämnt infärgad över hela vävnaden med klossarna 4-6 infärgade med båda protokollen.
Figur 5. IHK färgning av PAX8 med normalvävnad. Figuren presenterar resultat för tesomgång 4 (kloss 4) där tubavävnad är infärgad med 1377D (A) och 1378D (B) och visar negativ morfologisk effekt. Njurvävnaden är infärgad med 1377D (C) och 1378D (D). Bilderna togs med 10x
förstoring.
17 Testomgång 5
Resultatet för tuba visade en stark infärgning på sekretoriska celler och måttlig infärgning på cilierade celler. För alla tubavävnader från klossar 4-6, infärgades epitelet med båda protokoll med en jämninfärgning. Dock visades negativ morfologi som för testomgång 4 på hela tubavävnaden för alla klossar.
Specificiteten för tuba godkändes för alla klossar och visade ingen till väldigt svag bakgrund, se bilaga 1-3. Kloss 4 infärgades njurvävnadens ojämnt samt svagt till måttligt, och uppvisade lite mer infärgning med 1377E än 1378E, se figur 6.
Njuren från kloss 4, färgad med 1378E, visade även svagt till måttligt
kärninfärgning och upplevdes ha lite mer bakgrund än 1377E vid vissa delar av vävnaden. Bakgrunden för njuren i kloss 4 bedömdes däremot som svag för båda protokoll (bilaga 1-3). Njurvävnaden i kloss 5 infärgad med protokoll 1377E och 1378E färgades svagt med en del bakgrund. Kärninfärgningen för njurvävnaden i kloss 6 visade svag intensitet med 1377E och 1378E. Lite mer bakgrund för njuren färgad med 1377E förekom vid vissa områden men bedömdes som svag.
Generellt färgades alla njurkontrollerna ojämnt dvs inte alla kärnor färgades, och enbart vid vävnadssnittets kanter färgades det tydligt. Trots det visade
infärgningen en specifik kärninfärgning av de kärnor som färgades i njuren. Efter denna omgång bestämdes det att 1377E skulle verifieras samt användas för patientprov.
Figur 6. IHK färgning av PAX8 med normalvävnad. Figuren presenterar resultat för testomgång 5 där njurvävnad (kloss 4) infärgad med 1377E (A) och 1378E (B). Pilarna pekar på parietala epitelceller som klär Bowmanskapsel. Bilderna är togs med 10x förstoring.
Protokollverifiering
En verifiering av protokollet 1377E, som visade sig vara mest optimal för PAX8 infärgning med EP331 i denna studie, utfördes för att validera protokollets förmåga att infärga all vävnad som uttrycker PAX8. Verifieringen gjordes med kontrollklossarna 7-9 och färgades med protokoll 1377E. Resultatet
sammanställdes i tabell 5. Appendix visade negativt för alla kontroller, eventuellt visades färg som inte tvättats bort ordentligt. Kärnor i epitelceller i proximala-, distala-njurtubuli och parietala epitelceller som klär Bowmanskapsel infärgades måttligt till starkt för multiklossar 7-9. Av kloss 7 erhålls godkänd specificitet och jämninfärgning, dock fanns det en del bakgrund. Av kloss 8 förekom svag
bakgrund, specificiteten godkändes och en jämninfärgning över vävnaden
uppvisades. Njursegmentens kärnor i kloss 9 infärgades inte lika intensivt som för de andra klossarna men gav en måttlig till stark intensitet över hela njurvävnaden.
En svag bakgrund men godkänd specificitet framstod av njuren i kloss 9. De sekretoriska epitelen i tuba i multiklossar 7-9 uppvisade en stark infärgning och cilierade uppvisade måttlig infärgning. Tubavävnaden i kloss 8 var inte lika jämnt infärgad som de andra två klossar men färgades ändå intensivt vid vissa delar av
18
vävnaden. Specificiteten godkändes för all tubamaterial och en svag bakgrund förekom hos alla tubavävnaderna, samt en negativ morfologisk effekt på tuban uppvisades se figur 7. Erhållet resultat stämde överens med data från NordiQC, med undantag för måttlig till stark intensitet på njursegment och negativ
morfologi av tubavävnaden [13].
Tabell 5. Sammanställning av bedömning för kontrollverifiering med multikloss 7-9. Appendix visar negativt. Specificiteten anges som underkänd eller godkänd. Jämnheten av infärgningen över hela vävnaden anges som jämn eller ojämn. Bakgrunden och intensiteten graderas som 0= negativ, 1=svag, 2=måttlig och 3=stark infärgning.
Klossnummer Specificitet Bakgrund Intensitet Jämnhet Kloss 7 Njure:
Godkänd Tuba: Godkänd
Njure: 1-2 Tuba: 1
Njure: 2-3 Tuba: 3
Njure: jämn Tuba: jämn Kloss 8 Njure:
Godkänd Tuba: Godkänd
Njure: 1 Tuba: 1
Njure: 2-3 Tuba: 3
Njure: jämn Tuba: ojämn Kloss 9 Njure:
Godkänd Tuba: Godkänd
Njure: 1 Tuba: 1
Njure: 2-3 Tuba: 3
Njure: jämn Tuba: jämn
Figur 7. IHK färgning av PAX8 med normalvävnad. Figuren presenterar resultat för
protokollverifiering (kloss 7) med appendix (A), njure (B) och tuba (C). Bilderna togs med 10x förstoring.
Patientprov
Efter protokolloptimering med kontrollmaterial, samt en protokollverifiering, testades 1377E på patientprov för att verifiera slutprotokollet. Totalt var det 23 patientklossar som plockades fram från Klinisk patologis biobank i CSK. Dock var det 22 klossar (95,7%) av dessa 23 som kunde analyseras och visade
positivitet för PAX8 samt hade tillräckligt vävnadsmaterial kvar för bedömning, se tabell 6. Resultatet för multikloss 7 med tubavävnad som positiv kontroll visade en tydlig och stark kärninfärgning med ingen till svag bakgrund och en godkänd specificitet. Tuban uppvisade dock en negativ morfologisk påverkan, se figur 7. Njurvävnaden från multiklossen användes som positivkontroll, resultatet
19
som erhölls uppvisade stark kärninfärgning med svag till måttlig bakgrund och godkänd specificitet. Appendixvävnaden användes som negativkontroll och var negativt för PAX8 infärgning men visade svag bakgrund. Kontrollmaterialet presenterades inte i tabell 6 då allt kontrollmaterial fick godkänt resultat.
Tabell 6 redovisar resultatet för patientproverna med utvalt protokoll 1377E.
Patientpreparaten med olika tumörvävnader fick generellt måttlig till stark infärgning. Figur 8 presenterar 3 fall som visar infärgningen av patientprov.
Specificitet för infärgat material med PAX8 antikroppen EP331 godkändes.
Dock uppvisades det en svag bakgrund i de flesta preparat samt en negativ morfologi för tuba som tidigare tubavävnader. Fallnummer 23 utgjordes av mellannålsbiopsi från njure, se tabell 6. Vid analys visade det sig att vävnadsmaterialet inte var tillräcklig för bedömning och provet utgick från studien.
Figur 8. En PAX8 infärgning utförd på patientprov. Figuren presenterar ovarialcancer från fall 6 (A), klarcellig njurcancer från fall 20 (B) och endometrialcancer från fall 8 (C). Bilderna togs med 20x förstoring.
20
Tabell 6. En samanställning av resultatet för patientmaterial. Tumörvävnad från endometrie, cervix, tuba, adnexa och njure (n=23) infärgades med protokoll 1377E. Provtyp, specificitet, bakgrund och intensitet redogörs. Specificitet anges som underkänd eller godkänd, bakgrund och intensitet graderas som 0=negativ, 1=svag, 2=måttlig och 3=stark infärgning. Resultat som presenteras med ett bindestreck ansågs som icke bedömbart. MNB: Mellannålsbiopsi.
Fallnummer Provtyp Specificitet Bakgrund Intensitet
1 Cervix skrap Godkänd 1 3
2 Cervix skrap Godkänd 1 3
3 Cervix skrap Godkänd 1 3
4 Cervix skrap Godkänd 1 3
5 Cervix skrap Godkänd 1 3
6 Adnexa
resektat
Godkänd 1 2
7 Endometrie
skrap
Godkänd 1 3
8 Endometrie
skrap
Godkänd 0-1 3
9 Endometrie
skrap
Godkänd 0-1 3
10 Ovarie/tuba
resektat
Godkänd 0-1 2
11 Corpus skrap Godkänd 1 3
12 Njure MNB Godkänd 0-1 3
13 Njure MNB Godkänd 1 3
14 Njure MNB Godkänd 0-1 3
15 Njure MNB Godkänd 0 3
16 Njure MNB Godkänd 1 3
17 Njure MNB Godkänd 0 2
18 Ovarie MNB Godkänd 1 2
19 Njure MNB Godkänd 0 3
20 Njure MNB Godkänd 1 2-3
21 Njure MNB Godkänd 0 2
22 Njure MNB Godkänd 0 2
23 Njure MNB - - -
21
DISKUSSION
Syftet med studien var att optimera ett protokoll för PAX8 med antikroppen EP331. Optimeringen gjordes med immunohistokemisk metodik som tillämpades på kontrollmaterial och validerades med avidentifierad patientmaterial. Resultatet bedömdes efter bedömningskriterierna under material och metod. Detta gjordes för att undersöka om EP331 ger godkänt resultat och därmed kan framöver gynna cancerdiagnostiken. PAX8 är en viktig markör som kan användas som ett redskap för patologen via diagnostik av cancerdiagnoser [8]. Markören kan bland annat användas för att påvisa primär cancer i bland annat sköldkörtelskarcinom, njurcellskarcinom av klar celltyp och äggstockskarcinom. En tydlig och specifik infärgning av PAX8 kan därför hjälpa cancerdiagnostiken enligt tidigare
refererade studier [2,7-8,10]. Nedan diskuteras metodiken samt resultatet för denna studie.
Metoddiskussion
Immunhistokemi en användbar metod som tillämpas inom laboratorier överallt i världen, dock finns det olika faktorer som kan påverka den IHK processen som i sin tur påverkar resultatet för optimeringen. Faktorer som val av kontroller, fixering, antigen retrieval, val av antikropp samt preparation av antikropp reagens och inkubering av reagenser är kritiska för att uppnå bra IHK resultat [21-22].
Val av kontrollvävnader
Valet och tolkningen av vävnadskontroller kan vara en av de mest viktiga parametrarna för att säkerställa en optimering av immunhistokemisk analys.
Essentiell information om sensitivitet och specificitet av analysen kan erhållas genom val av lämpligt kontrollmaterial. IHK resultat kan inte valideras utan godkänt kontrollmaterial [23]. Användning av negativ kontroll och positivkontroll är billigt, snabbt och enkelt att utföra [21]. Inom NordiQCs data, som
sammanställer IHK laborativa tester är 90% av de otillräckliga resultaten
karaktäriserade av svag till fullkomligt falskt negativt resultat, 10% var orsakad av falsk positiv färgning. Denna data indikerar att valet av lämpligt kontrollmaterial är bland de flera faktorer som utgör en lyckad IHK analys [23]. För denna studie är därför förarbetet väldigt viktigt. Det innebär att valet av representativt
kontrollmaterial som har väsentliga strukturer som uttrycker protein av intresse, samt negativ uttryck av proteinet, är det första viktiga steg för optimeringen.
NordiQC rekommenderar tonsill och appendix som negativkontroll, då PAX8 inte utrycks av dessa vävnader. Båda vävnaderna anses också lämpliga för att utesluta korssreaktioner med PAX5 som uttrycks i lymfocyter. Lymfocyter finns i större mängd i tonsill än i appendix men i studien valdes ändå appendix [13]. Detta eftersom appendixmaterial fanns tillgängligt vid laboratoriet i CSK. Som positiv kontroll för PAX8 rekommenderar NordiQC njure respektive äggledare/tuba. För val av njurbitarna var det viktigt att strukturer i vissa njurepitelsegment som proximal tubuli, distal tubuli, parietalceller i Bowmans kapsel fanns med då PAX8 uttrycks i dessa segment. Vid val av tubavävnad var det viktigt att det innersta lagret som utgörs av cilierad kolumnepitel och sekretoriska celler var med eftersom de uttrycker PAX8 [13, 16]. Eftersom lämpligt kontrollmaterial utgör en viktig del för analys med IHK [21, 23], rutininfärgades valda
kontrollvävnader först med H&E för att undersöka strukturer och morfologi vad gäller användbarhet.
22 Förbehandling - fixering
Fixering avbryter livsprocesserna så att vävnaden kan bevara dess ursprungliga histologiska struktur. Vid fixering förändras de kemiska egenskaperna hos vävnadskomponenter och ändrar den tredimensionella protein konformationen genom cross-linking, vilket har en stor påverkan på affinitet samt selektivitet av antikroppar [17, 24]. Den tid då vävnaden/organen avlägsnas vid operation och syretillförsel bryts, fram till att vävnaden fixerats kallas ischemi tid. Vid ischemi degraderas protein, RNA och DNA samt att enzymer aktiveras och orsakar autolys [21]. Ischemi orsakar därför förändringar på antigen av intresse, vilket resulterar till minskad signal från antigen dvs orsakar maskering av specifika signaler efter IHK bearbetning. Vävnadsbearbetning som dehydrering kan även ha negativ påverkan på antigenicitet. Detta har en stor påverkan på IHK resultat [24].
Klossarna som användes för detta projekt var befintliga klossar som redan förbehandlats. Därför var det inte möjligt att veta hur förbehandlingen utförts.
Njurar från testomgång 1-3 uppvisade ingen färgning enligt bedömningsskalan.
Misstankar om icke effektiv förbehandling uppstod då njurarna inte infärgades och var tvungna att ersättas. Vid ersättning av njurarna i testomgång 4-5
infärgades njurarna med svag intensitet. Detta kan antyda på att förbehandlingen inte var optimal, eller att njurarna krävde kraftigare IHC behandling, se
resultatdiskussion. Enligt tidigare studie beror en negativ infärgning, av vävnad som ska uttrycka antigen, inte alltid på att antikroppen är olämplig på grund av brist på affinitet eller specificitet för målantigen. En avsaknad av infärgning kan som sagt bero på förlust av antigen vid vävnadsfixering eller andra
förbehandlingar som dehydrering, som kan ha en skadlig effekt på antigen om den inte är utförd korrekt. Det går inte alltid att förutse att vävnaden skadats på grund av förbehandling, därför bör flera vävnader testas för att säkerställa resultat [24].
Antigen retrieval
Valet av HIER, där tid, temperatur samt buffert justerades, hade en väldigt betydande roll för denna studie eftersom med HIER kan en stark IHK infärgning erhållas. Detta beror på att fixering med formaldehyd kan ge upphov till
metylenbryggor som sätter sig som ett nätverk i vävnaden. Nätverket maskerar antigen/epitop som resulterar till minskad antigenicitet [15, 21]. Därför utförs en antigen retrieval (AR), med HIER eller EIER. HIER är den mest använda AR bland de två metoderna. Det finns olika AR variabler såsom tid, temperatur, pH, och val av AR lösning, som kan påverka resultatet för IHK färgning. För kort AR tid kommer leda till ingen till svag infärgning samt ojämnhet vid kärninfärgning.
Detta kunde ses vid tidigare testomgångar i studien, se tabeller i bilaga 1-3 och resultat diskussion. För lång AR med hög temperatur kan fördärva
vävnadensmorfologi och skada antigenen så att en icke optimal infärgning erhålls [18, 23]. Tecken på en avvikande morfologisk effekt på tubavävnad uppvisades vid testomgång 4-5 samt protokollverifieringen och patientoptimeringen, se resultat och resultatdiskussion. Lämplig pH för HIER där EDTA- eller citrat buffer används har en stor påverkan på resultatet. Citrat buffer rekommenderas som första val, dock rekommenderas EDTA för AR med vävnader där det är svårt att detektera antigen [25]. Vilket var fallet för AR med njurvävnad är en kraftigare HIER krävdes, se resultat och resultatdiskussion. Därför tillämpades tester med båda buffertar CC1 och CC2 för att undersöka vad som passade med använda vävnader. En lämplig AR protokoll för optimal IHK infärgning är beroende av
23
både primärantikropp samt målproteinet dvs antigen, och måste därför bli optimerad för varje antikropp som används [21].
Ready to use antikropp
För en bra IHK infärgning måste en lämplig primärantikropp väljas samt lämplig koncentration av antikroppen. Data samlad från NordiQC visar att en vanlig orsak till otillräcklig infärgning där svag eller falsknegativ infärgning uppstår, beror på icke optimal koncentration av primärantikropp eller icke optimal antikropp med dålig affinitet för målantigen. Primärantikroppen EP331 som tillämpades i denna studie är en ”ready to use” antikropp. Detta innebär att EP331 ska kunna användas direkt utan att behöva spädas. Nackdelen med ”ready to use” är att det inte går att justera själva antikroppskoncentrationen. Om en vävnad utrycker låg antigen kan det krävas en högre antikroppskoncentration för en intensiv infärgning. Det är en fördel att kunna titrera. Med en ”ready to use” antikropp begränsas detta eftersom andra justeringar på bland annat HIER samt tid för primärantikroppsinkubering måste utföras för att en intensiv infärgning ska erhållas. En kraftig HIER kan påverka vävnaden negativt. EP331 måste även inkuberas en längre period för att en intensiv PAX8 kärnfärgning ska erhållas. En fördel med ”ready to use”
antikroppar är att det enkelt går att använda samma koncentration för varje användning och inköp av antikroppen som därför ger samma resultat för varje användning. Det kräver som sagt att ett optimalt protokoll med optimala justeringar ska forskas fram, därav denna studie [18, 23].
Förekomst av bakgrund i vävnad
Bakgrund är färg som uppkommer i vävnaden vid andra områden än var målantigenet uttrycks. En huvudorsak till uppkomsten av bakgrund är den ospecifika bindningen av Fc-regionen av primär eller sekundärantikroppar.
Endogena proteiner/enzym kan orsaka denna ospecifika bindning. Endogent peroxidase förekommer i celler som granulocyter och erytrocyter. Därför används Ultra View inhibitor för att blockera endogent peroxidase. Men vid kraftig HIER kan annat än målantigen demaskeras och bli immunoreaktiv. Amplifiering bidrar till att en intensivare färg uppkommer, dvs starkare signal. Nackdelen är att en kraftig HIER och amplifiering kan skapa bakgrund [18, 22, 26-27]. Med Ultra Wash buffert sköljs eventuell överskottsfärg bort från vävnaden dock sköljs inte infärgad vävnad lika bra pga tidigare nämnda faktorer, därmed uppvisades bakgrund vid njurar samt andra vävnader, se bilaga 1-3 och tabell 5 och 6.
Resultatdiskussion
För detta projekts protokolloptimering påverkades resultatet av flera olika
faktorer. Nedan diskuteras samtliga orsaker för erhållet resultat, påverkad av dessa faktorer.
CC1 eller CC2
Vid första testomgången testades HIER buffertarna CC1 för protokoll 1377A och CC2 för protokoll 1378A (tabell 1). Tubans epitel infärgades måttligt och ojämnt.
Detta kan bero på tiden för HIER inkuberingen, antikroppsinkubering, fixering, men även val av buffert för HIER. Det var inte stora resultat skillnader i
testomgång 1. Dock observerades det att strukturer lossnat från glaset för
vävnader färgade med 1378A. Orsaken till att vävnader lossnar är många, det kan orsakas av icke optimal HIER buffert för en viss typ av vävnad. Det kan bero på gamla glas där affiniteten för vävnaden inte är stark, det kan bero på att vatten inte avlägsnats vid bakning [18]. En jämnare tuba infärgning upplevdes med CC1
24
vilket kan bero på användningen av EDTA buffert som är en kraftig buffert och rekommenderades som AR för vävnader där det är svårt att detektera antigen [25].
Njurar uppvisade ingen infärgning för CC1 eller CC2 med multiklossar 1-3, därför var det resultatet från tuban som avgjorde protokollvalet. Enligt
produktinformationsblad från CELLMARQUE rekommenderas CC1 för HIER med EP331 [14]. HIER måste dock testas med båda buffertar för att en egen bedömning ska göras på vad som funkar bra med primärantikropp [25]. Erhållna resultat från testomgång 1 samt rekommendation från CELLMARQUE ansågs som avgörande till varför protokoll 1377A var optimalare än 1378A och valdes till alla testomgångar framöver.
I en tidigare utförd studie av en PAX8 infärgning med en polyklonal PAX-8 antikropp, från Proteintech Group Inc, användes citratbuffert med pH 6 vilket motsvarar CC2 för HIER. Primärantirkoppen inkuberades i 40 min vid 25 C Resultatet för studien visade en stark infärgning av bland annat endometrie, cervix och sekretoriska epitel av tuba. Stark infärgning uppvisades även i proximal- och distalnjurtubuli. Dessa var normalvävnader. Liknande resultat erhölls i detta projekt där tubans sekretoriska epitelkärnor infärgades starkt och proximal distalanjurtubuli infärgades måttligt till starkt, trots att HIER och
antikroppsinkubation skiljer sig [28].
Tid och temperatur för HIER
Tuba vävnader från testomgångar 1 och 2 visade en måttlig samt ojämn infärgning över vävnaden, se resultat. Den måttliga intensiteten och ojämna infärgningen för cilierade samt sekretoriska epitelkärnor kan bland annat bero på att en icke kraftig HIER tillämpades vid dessa testomgångar. En svag HIER innebär att
metylenbryggor som täcker antigen i vävnaden bryts inte fullständigt vilket hindrar primärantikroppen från att komma åt antigen [18, 23]. Däremot uttrycker inte cilierade epitelkärnor en hög nivå av PAX8 som för sekretoriska
epitelkärnorna, vilket förklarar den måttliga infärgningen för dessa cellkärnor [13]. Vid testomgång 3 utökades tiden till 92 min för HIER, vilket resulterade till en intensivare samt jämnare kärninfärgning i tuba vävnaden jämfört med
testomgång 1 och 2. Detta beror på att mer metylenbryggor i vävnaden har brutits eftersom en längre HIER tid användes, vilket möjliggör för primärantikroppen att bilda komplex med fler antigen [18, 23]. Dock utökades antikroppsinkuberingen, se tabell 1, vilket även kan bidra till den ökade färgintensiteten.
För testomgång 4 och 5 samt kontrollverifiering tillämpades en kraftigare HIER då temperaturen ökades till 100 C. Då observerades mer bakgrundsfärg i njurcellernas cytoplasma samt vid olika ställen av tubavävnaden. En negativ effekt på morfologin på kontroll tubavävnad samt tubavävnad för patientprov syndes även. Kärnor och vävnadsstrukturer var inte tydliga som tidigare
omgångar, se tuba i figur 2-3, 5 och 7. Detta kan bero på att tillämpad HIER med hög temperatur tillsammans med vald inkuberingstid samt buffert har varit för kraftig för tubavävnaden vilket orsakar denna negativa effekt [18, 23]. Trots en för kraftig HIER för tuba uppvisade njuren en svag infärgning och ingen negativ morfologi med undantag kloss 4 i testomgång 5 som visade svag till måttlig infärgning, se figur 5 och 6. Vid omgång 1-3 visade njurarna ingen färg.
Infärgningen av njurar vid senare omgångar kan bero på bland annat en kraftig HIER som får njuranas antigenicitet öka som diskuterats tidigare [18, 27].
25 Förbehandling och kontrollmaterial
Troligtvis beror inte den svaga infärgningen som förekom i senare omgångar att HIER inte var tillräckligt kraftig. Detta då utbyte av njurvävnader vid
protokollverifiering erhölls en måttlig till stark infärgning. Denna infärgning gjordes med samma protokoll (1377E) som tillämpades vid testomgång 5 och protokollverifieringen. Vid testomgång 4 och 5 byttes multiklossar, då infärgades samtliga njurkärnor med svag intensitet, se figur 5. Infärgningen kan dock ha orsakats av den kraftiga protokoll som tillämpades. Det är möjligt att njurar använda från omgång 1-3 hade infärgats med protokoll för testomgång 1-4.
Tubavävnaden från kloss 8 i protokolloptimeringen var ojämnt infärgad, detta beror nog inte på att HIER inte var tillräckligt kraftig eller att
anitkroppsinkuberingen inte var tillräcklig eftersom de andra tubavävnaderna färgades jämnt, se tabell 5. Avsaknaden av infärgningen i sådana fall beror möjligtvis på förbehandlingen av vävnaden. Faktorer som ischemi tid, fixering, dehydrering spelar en stor roll till varför njurarna inte infärgades trots att samma protokoll tillämpades. Njurvävnaden infärgades som mest vid kanterna enligt erhållet resultat. Detta kan ha orsakats av otillräcklig fixering. Fixeringslösningen hinner inte tränga in i hela vävnaden och bevara dess struktur. Om en otillräcklig fixering utförts fixeras inte vävnadens insida lika bra. Detta leder till att protein, RNA och DNA degraderas, vilket minskar antigen signalen som påverkar IHK resultatet [17, 21, 24]. Av den anledningen är det viktigt att utföra en IHK optimering med flera kontrollmaterial.
Primärantikroppen
Justeringar av inkuberingen med primärantikroppen kan ha en påverkan på färgintensiteten av kärnorna. Vid testomgång 3 ökades inkuberingstiden för primärantikroppen EP331 i protokoll 1377C, men inte 1378C, se tabell 1. Detta leder till att primär antikropp kan binda in mer och därmed resultera till starkare infärgning. Det blev ingen större skillnad på färgintensiteten av tubans
epitelkärnor med båda protokoll, men en jämnare infärgning över hela
vävnadssnittet förekom. Eftersom HIER blev kraftigare i testomgång 3 jämfört med 2 kan detta vara orsaken till en jämnare infärgning för tubansepitel men det går inte att utesluta primärantikroppens påverkan. Njurens kärnor upplevdes som lite intensivare med 1377C vilket presenteras i figur 4. EP331 är en ”ready to use”
antikropp där justeringar i bland annat HIER, amplifiering och
antikroppsinkuberingen var det enda som möjliggjorde ökning på färgintensiteten.
Detta är en nackdel för ”ready to use” antikroppar då en kraftig HIER påverkade tubans morfologi negativt men var nödvändigt för att möjliggöra en intensiv njurinfärgning, I sådana fall hade det varit optimalt om en mindre kraftig antigenretrieval- och en koncentrationsökning av primärantikroppen tillämpats [18, 23].
Protokollverifiering
Trots all bakgrund som uppvisades och den negativa effekten på tubansmorfologi, valdes 1377E. Detta, eftersom njurens kärninfärgning upplevdes som lite mer intensiv med protokoll 1377E jämfört med protokoll 1378E och protokoll från tidigare testomgångar. Dessutom infärgades njuren måttligt till starkt samt tuban infärgades starkt vid protokollverifieringen.
26 Utvärdering av EP331
Primärantikroppen som används måste vara specifik för målantigen eftersom en specifik signal ska kunna detekteras. Resultat erhållen med anti-PAX8 antikropp EP331 ger en godkänd specificitet som kan bero på EP331 riktas mot C-
terminalen av human PAX8 protein [14]. Tubavävnadens sekretoriska samt cilierade kärnepitel färgades med stark intensitet och uppgav en svag bakgrund.
Njurkärnor från parietalceller runt bowmanskapsel, distala och proximala tubuli färgades med måttligt till stark intensitet men uppgav svag bakgrund, med undantag kloss 7, i cellernas cytoplasma. Bakgrunden innebär inte att EP331 är ospecifik och korsreagerar med PAX5, Tumörvävnader från Patientprov
infärgades måttligt till starkt, med ingen till svag bakgrund, se tabell 6. Enligt data från NordiQC erhölls en otillräcklig infärgning med MRQ-50, specifikt med Ventana Bench Mark och Dako Omnis platformer. Som nämnts tidigare i
bakgrunden riktas MRQ-50 mot N-terminalen av PAX8 vilket var homologt med N-terminalen av PAX5, därav korsreaktionen och ospecificitet vid infärgning [3,13]. Denna korsreaktion sker ofta i lymfocyter och neoplasier och är
anledningen till att forskning fortsätter [13-14]. Bilaga 4 (se Figur 9) presenterar infärgning av normalvävnaderna njure, tuba, tonsill och en ovarialcancer med
”ready to use” antikroppen MRQ-50. Resultatet för infärgning med MRQ-50 var inte optimal då en svag till måttlig intensitet förekom i de positiva PAX8
vävnaderna, samt att en infärgning på negativa kontrollen, tonsill, uppstod som tyder på korsreaktion. Därmed presterar EP331 i jämförelse med MRQ-50 bättre resultat i denna studie.
KONKLUSION
Denna studie har visat att EP331 ger goda resultat jämfört med MRQ-50 som enligt tidigare studier visat icke-optimal infärgning. Resultat med EP331 uppvisar att en specifik och måttlig till stark intensitet har generellt erhållits för njurar och patientprov. Samt en stark intensitet på tuban. Däremot hade ytterligare
testomgångar önskats för att erhålla ett optimalt protokoll där temperatur för HIER sänkts från 100 till 95 C, och förkortad HIER tid för en mer skonsam behandling av vävnaden. En fortsatt optimering bör utföras, där MRQ-50 och EP331 infärgas för att säkerställa ytterligare att EP331 är mer gynnsam för framtida cancerdiagnostiken.
